海州湾前三岛海域栉孔扇贝生态增养殖原理与关键技术

以海州湾前三岛周围海域为研究地点，开展了栉孔扇贝岛屿生态增养殖理论和关键技术研究。调查了海区的地理、水文、水化学环境以及饵料供应能力；现场测定了栉孔扇贝的滤水率，根据扇贝实际生长情况结合水动力学因子评估了该海域的养殖容量；监测了不同养殖模式情况下栉孔扇贝的存活、生长以及污损生物附着情况；利用免疫学指标揭示了各种养殖方式下栉孔扇贝的健康状态；研究了不同水温、扇贝规格对敌害生物捕食的影响；优化了该海域栉孔扇贝的养殖模式和关键技术。主要研究结果如下： 1．查明了前三岛海域理化环境、生物资源等现状。前三岛海域水质优良，生物资源丰富，虽然饵料浓度相对较低，但是该海域海流畅通，水交换条件好，较高的流速可以弥补饵料浓度的不足，适合开展栉孔扇贝增养殖。由于各项理化因子随着时间和水深的变化而发生变化，必须根据实际情况，对养殖模式等进行相应调整，才能获得更高经济和生态效益。 2．较为系统地研究了前三岛海域深水筏式养殖栉孔扇贝生理生态学特征，评估了养殖容量。周年监测了海域的环境因子和栉孔扇贝的生长情况，利用生物沉积法，现场研究了各时期扇贝的滤食作用。结果表明：该海域养殖栉孔扇贝在当年秋、冬季和次年春季生长迅速，夏季生长相对缓慢，周年平均软组织生长速度为11.29 mg/d，平均干贝壳生长速度为48.84 mg/d，扇贝能够于次年年初达到商品规格（6cm）。不同时期栉孔扇贝的滤水率之间差异显著，滤水率随水温的升高和扇贝规格的增大而增加。利用改进的Incze等（1981）的养殖容量模型，评估了该海域养殖容量，结果表明：在现有条件下，各时期沿着海流方向适养区域长度分别为：4.0，4.6，4.7，5.1，4.5和3.2 km，平均为4.35 km。 3．揭示了不同养殖水层栉孔扇贝存活、生长以及免疫指标特征。于2007年夏、秋高温季节监测了5个不同水层（2, 5, 10, 15, 与 20 m）筏式养殖栉孔扇贝的存活、生长以及免疫指标特征。研究表明各水层栉孔扇贝成活率差异显著，其中15 m（78.0%）和20 m（86.7%）成活率要明显高于2 m（62.9%），5 m（60.8%），和10 m（66.8%）；夏季（7~9月）各水层壳高生长速度有较大差异，其中10m （205.0 μm/d）与20 m（236.9 μm/d）要显著高于2，5，和15 m，而秋季（9~11月份）20m生长速度最低，5m水层（262.9 μm/d）要显著高于其他水层；不同水层扇贝软组织生长情况与壳的生长情况类似；扇贝血淋巴SOD活性随着水深的加深而增大，15 和 20 m 养殖的栉孔扇贝ACP活性要高于其他水层，这表明深水养殖栉孔扇贝健康状态要优于浅水层。 4．比较研究了筏式和底播两种养殖方式情况下栉孔扇贝的存活、生长以及免疫指标的周年变化。结果表明夏季栉孔扇贝的生长、免疫酶活性要低于其他季节，扇贝死亡也基本集中于夏季高温季节。除了2008年春季壳高以外，筏式养殖栉孔扇贝的生长、免疫酶活性都要高于底播养殖。实验结束时筏式养殖的成活率（54.6 ± 12.3 %）要显著地低于底播养殖（86.8 ± 3.5 %）。由此可见，在夏季高温季节采取底播养殖提高成活率，然后转为筏式养殖以提高生长速度，这样可以获得更高的产量。 5．研究了日本蟳和多棘海盘车对栉孔扇贝的捕食机制。现场研究表明，成年日本蟳可以捕食壳高小于5.0 cm的栉孔扇贝，捕食强度随着水温的升高而增大，而壳高大于5.9 cm的栉孔扇贝则可以免遭日本蟳的捕食；与栉孔扇贝相比，日本蟳更倾向于捕食贻贝；室内模拟研究表明水温低于10 ℃时，日本蟳对大规格扇贝的捕食作用不明显。相同温度条件下，室内实验日本蟳的捕食强度要低于现场，但其温度系数（Q10）差别不大。室内试验表明多棘海盘车对栉孔扇贝也有很强的捕食作用。提出了提高底播栉孔扇贝成活率的方法，即选择大规格的扇贝在水温较低的秋、冬季进行底播。

栉孔扇贝CfLITAF基因的克隆与表达分析

关于无脊椎动物中是否存在细胞因子一直都存在着异议。从细胞因子本身入手，运用细胞生物学和免疫学手段，已经在软体动物、节肢动物和棘皮动物等无脊椎动物中证实了高等动物细胞因子样活性物质的存在，然而利用分子生物学手段至今没有得到任何核苷酸或蛋白序列信息，而从与细胞因子相关的分子如调控其表达的转录因子入手来研究无脊椎动物中的细胞因子样物质的存在，或许会得到意想不到的惊喜。 最近从人的单核细胞系THP-1中分离纯化出一种新型的转录因子，它可以被LPS诱导表达，产生的蛋白在TNF-α的表达过程中起着非常重要的作用，因而命名为LPS-induced TNF-α factor（LITAF）。随后该基因在小鼠和鸡中也被克隆分离出来，其编码的蛋白已经证实在TNF-α的表达过程中起着不可或缺的作用。迄今为止，在无脊椎动物中还没有相关同源基因的报道。 本研究采用大规模EST测序方法，结合锚定PCR技术从栉孔扇贝体内克隆到了高等动物LITAF基因的同源基因CfLITAF的全长cDNA序列。该cDNA全长为1240bp，其中5' 非编码区（UTR）为112 bp；开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）包括450 bp，编码149个氨基酸残基，该多肽的理论分子量为16.08 kDa，等电点为6.77；3' UTR为678bp，包含一个poly A尾巴。SMART结构域预测发现CfLITAF蛋白含有一个保守的LITAF结构域。实时定量PCR检测CfLITAF基因在栉孔扇贝主要免疫器官中的表达分布情况，发现在所检测的六种组织血细胞、外套膜、肌肉、心、腮、性腺中均能检测到CfLITAF基因转录本的不同丰度的表达。血淋巴和肌肉中的表达量相差不大，而在心、外套膜、腮和性腺中的表达量要高于血淋巴和肌肉中的表达量，分别是血中表达量的2.45、2.82、9.23和24.93倍。 为了验证其表达量是否会受到LPS的诱导，利用QRT-PCR（quantitative real time PCR）检测了CfLITAF基因在受到LPS和PGN刺激后在血细胞中的表达规律。结果如下：在LPS刺激后3h，CfLITAF的表达量显著上调，达到了原初水平的1.5倍，随着时间的延长，其表达量逐渐恢复到刺激前水平；在用PGN刺激血细胞后的9个小时内均没有检测到CfLITAF基因mRNA表达量的显著变化。实验中所用血细胞为同一批原代培养的栉孔扇贝血淋巴细胞，细胞活力通过台盼蓝拒染实验测定。 CfLITAF基因的克隆与表达分析，不仅为进一步认识栉孔扇贝的免疫防御机制提供了实验参考，更重要的是为无脊椎动物中细胞因子样物质的研究提供了一个分子水平上的线索，为无脊椎动物中细胞因子样物质的研究奠定了理论基础。

栉孔扇贝抗氧化酶基因的克隆与表达分析

扇贝是我国海水养殖的重要品种，但自1994年以来，养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡，不但造成了巨大的经济损失，而且直接威胁到现有产业的生存和发展。扇贝病害的不断爆发以及病因的多样性迫切要求制定新的疾病防治措施和开发新型的抗菌物质。因此，深入研究扇贝免疫防御机制，探讨提高机体抗病力的有效途径和方法，改良种质和培育抗病品系，无疑是解决目前困扰扇贝养殖业健康可持续发展的必经之路。 抗氧化酶可以清除活性氧，是维持机体内氧环境平衡，抵抗外界环境影响的重要免疫因子。本研究采用大规模 EST 测序方法和同源克隆的方法，结合 cDNA 末端快速扩增（RACE）技术，从栉孔扇贝中克隆到了超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）等抗氧化酶基因的全长 cDNA序列，并对其基因结构进行了分析。同时，用实时定量PCR方法对这三个基因在健康扇贝血淋巴细胞、肾、鳃、肌肉、性腺等组织和在分别用鳗弧菌，溶壁微球菌和假丝酵母处理扇贝后不同时间段的表达差异情况进行了研究。 超氧化物歧化酶基因CfSOD的cDNA 全长为1022 bp，其中开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）含有 459 bp，编码 153个氨基酸残基，无信号肽，为胞内蛋白。经BLASTP分析发现，CfSOD与其它动物具有较高的同源性。CfSOD中存在两个Cu/Zn-SOD的签名序列；另外Cu结合必须氨基酸(His-45，-47，-62 和-119)和Zn结合必须氨基酸(His-62，-70，-79和Asp-82)在CfSOD中保守。实时定量PCR 检测发现，CfSOD在鳃、血细胞和肾中有较高的表达。在鳗弧菌和溶壁微球菌刺激后，CfSOD的相对表达量逐渐下降，然后分别在32小时和16小时的时候恢复到刺激前的表达水平。在假丝酵母刺激后，CfSOD的mRNA表达没有显著差异。 栉孔扇贝过氧化氢酶基因CfCAT的cDNA全长为3146 bp，其中开放阅读框含有1521bp，编码507个氨基酸残基，无信号肽，为胞内蛋白。经BLASTP分析发现，CfCAT与其它动物具有较高的同源性。 CfCAT中存在过氧化氢酶近端活性位点和过氧化氢酶近端血红素配体签名序列，另外存在两个糖基化位点 NFS和 NFT，同时在CfCAT 的C末端存在过氧化物酶体定位信号AQL，为典型过氧化氢酶。实时定量PCR 检测发现，健康的扇贝中CfCAT在鳃和性腺中有较高的表达。CfCAT基因在鳗弧菌刺后表达升高，在4小时达到最高，约是刺激前表达量的6.8倍（P<0.05），后随着时间的变化而逐渐下降。在8小时表达量达到为刺激前表达量的1.3倍（P<0.05），在16和32小时略高于刺激前的水平。在溶壁微球菌刺激后CfCAT基因表达量也呈上升趋势，在刺激后4小时达到刺激前表达量的约2倍，然后有所下降，在16 小时又上升到刺激前表达量的2.9倍。CfCAT基因在假丝酵母刺激后的表达略有升高，4小时约是刺激前的1.2倍（P<0.05），在其他时间段变化不明显。 栉孔扇贝谷胱甘肽过氧化物酶基因CfGPX的cDNA 全长为1290 bp，其中开放阅读框含有705bp，编码235个氨基酸残基，有一个24核苷酸的信号肽序列。经BLASTP 分析发现，CfSOD与其它动物具有较高的同源性。CfGPX中发现谷胱甘肽过氧化物酶活性位点的签名序列， 另外发现硒半胱氨酸和硒半胱氨酸插入序列，为含硒型谷胱甘肽过氧化物酶。实时定量PCR 检测发现，未经处理的扇贝中CfGPX在性腺、肌肉、血和肾中有较高的表达。CfGPX基因在鳗弧菌刺后表达量快速上升，在6 小时的时候表达量达到最高，为刺激前的4.0倍（P>0.05），后随着时间的变化而逐渐下降。在溶壁微球菌刺激后CfGPX在前6小时表达略有降低，在6小时的时候表达量为刺激前的0.5倍（P<0.05），后随着时间的变化而逐渐升高。在16小时的时候表达量为刺激前的2.1倍（P<0.05）。在假丝酵母刺激后， CfGPX的表达量略有下降在8小时的时候表达量为刺激前的0.8倍（P<0.05）。 实验证明栉孔扇贝的超氧化物歧化酶基因CfSOD，过氧化氢酶基因CfCAT，谷胱甘肽过氧化物酶基因CfGPX基因在机体抵抗外界微生物刺激中起到了重要的作用。

扇贝、对虾基因组BAC文库构建及其重要功能基因的初步筛选和分析

基因组大片段BAC文库是进行生物遗传学和基因组学研究必不可少的基础工具。为了深入开展栉孔扇贝（Chlamys farreri）和凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）基因组学研究、阐明其基因组的结构与功能、图位克隆重要功能基因、构建高密度物理图谱并最终实现与已有遗传连锁图的整合，本研究在植物基因组BAC文库构建技术的基础上，针对海洋生物的特点进行了大胆的改革与尝试，最终成功构建了C. ferrari和L. vannamei两种重要海水养殖动物的基因组BAC文库。 本文构建的栉孔扇贝基因组BAC文库，由BamHI文库和MboI文库构成。其中BamHI文库含有73,728个BAC克隆，空载率约为1%，平均插入片段约为110 kb，覆盖栉孔扇贝单倍体基因组约8倍；MboI文库共有7,680个克隆组成，平均插入片段大小约为145 kb，插入率为100%，覆盖栉孔扇贝单倍体基因组约1.1倍。两个栉孔扇贝基因组BAC文库共由81,408个克隆组成，平均插入片段约为113 kb，覆盖率约为栉孔扇贝单倍体基因组大小的9.1倍。 将栉孔扇贝基因组BAC文库的192个384微孔培养板中的73,728个BAC克隆以4 x 4点阵形式制备了高密度DNA薄膜，用于对感兴趣的基因及DNA序列的筛选。高密度DNA薄膜的覆盖率约为栉孔扇贝单倍体基因组的8.3倍。针对栉孔扇贝先天免疫系统通路的6个重要功能基因，根据栉孔扇贝cDNA序列以及异缘物种DNA序列设计了Overgo探针。利用Overgo探针对高密度DNA薄膜杂交筛选的结果显示，平均每个基因检测到7.3个潜在阳性克隆。 本研究所构建的凡纳滨对虾基因组HindIII酶切BAC文库共有102,528个BAC克隆，存放于267个384微孔培养板中，平均插入片段大小约为101 kb，空载率约为5%，覆盖L. vannamei单倍体基因组约5倍。将其中240个384微孔培养板中的92,160个BAC克隆以4 x 4的矩阵排列形式制作了5张高密度凡纳滨对虾DNA薄膜，约覆盖整个对虾单倍体基因组的4.5倍。针对6个与对虾免疫、生殖生理有关的重要功能基因设计了Overgo探针，杂交筛选出20个阳性克隆，平均每个基因有3.3个潜在阳性克隆。 以上筛选结果不仅为进一步研究这些功能基因的结构与功能、表达与调控，揭示它们在扇贝和对虾以及其他近缘种的免疫系统、抗逆和生殖生理过程中的作用机理打下了基础，同时也间接验证了栉孔扇贝和凡纳滨对虾基因组BAC文库将成为基因筛选、基因的结构与功能分析、基因图位克隆、物理图谱构建以及大规模全基因组测序等方面的有力工具。

栉孔扇贝免疫致敏（immune priming)现象及其机制的初步研究

栉孔扇贝是我国重要的海水养殖品种，自1997年以来陆续爆发的大规模死亡，不仅造成了巨大的经济损失，而且直接威胁到现有产业的生存和发展。本研究通过比较扇贝在连续刺激条件下的不同免疫反应，推测栉孔扇贝中有无免疫致敏和记忆现象，观察短期免疫刺激对扇贝再次遇到相同病原物刺激时死亡率的影响，探讨栉孔扇贝的免疫致敏作用，并对其机制进行初步探讨，以期更好地了解扇贝的免疫防御机制，为扇贝病害防治提供参考。 利用荧光实时定量PCR技术检测了扇贝受到鳗弧菌连续等量刺激后两种重要病原识别受体（PRR）基因的表达。结果显示，在受到连续两次刺激后CfPGRP-S1、LGBP基因的表达量均有不同程度的增加。其中CfPGRP-S1基因在受到第二次刺激后表达量增加的幅度高于第一次，且基因表达显著性增加的时间比第一次提前；LGBP基因在第二次刺激后，表达量显著性增加的时间也比第一次提前。同时，对同批处理的扇贝进行重要免疫指标的检测分析发现两次刺激后吞噬率变化不显著，而第二次刺激后吞噬指数的最大峰值高于第一次，并且最大峰值出现的时间比第一次提前；血淋巴中的抗菌活力和肝胰腺中SOD、MDA含量在两次刺激前后的变化不显著。在脊椎动物中，识别能力和抗菌能力的提高是免疫记忆的两个重要特点，栉孔扇贝在第二次免疫刺激后PRR识别能力的提高和吞噬作用的增强，说明扇贝中可能存在类似脊椎动物免疫记忆的免疫致敏作用。对扇贝进行两次鳗弧菌浸泡刺激，第一次为短期浸泡刺激，第二次为长期浸泡刺激。结果发现，第一次浸泡过的扇贝在遭受相同病原第二次刺激时，在一定时间段内其死亡率比未受第一次刺激的扇贝极显著降低，表明第一次的短期病原刺激增强了扇贝对第二次刺激的抵抗能力。同时比较第二次刺激过程中扇贝免疫指标的变化发现经过短期刺激扇贝的吞噬作用、ACP和AKP活性比未受过刺激的扇贝显著增强，而其他指标包括POL、SOD则差异不显著，说明增强的吞噬作用、ACP和AKP活性与扇贝的死亡率下降有关。研究结果表明栉孔扇贝中存在免疫致敏（immune priming）现象，短期刺激可以提高扇贝的免疫反应能力，增强扇贝机体对相同病原物的抵抗能力。

Studies on hybridization effects of different geographic populations of Chlamys farreri - II. The medium-term growth and development of Chlamys farreri populations from China and Russia and their reciprocal crosses

Based on the research of juvenile (2, 3, 4 months) growth and survival of three populations of two different geographic areas in Chlamys farreri from Russian and China and their F, hybrids derived from Chinese cultural population (CC) female x Russian population (RW) male, Chinese wild population (CW) female x Russian population (RW) male, Russian population (RW) female x Chinese wild population (CW) the study of the medium-term (6, 8, 10, 12 months) growth and development of Chlamys farreri was carried out. The four determined results indicated that there existed different extent heterosis (3% similar to 52 %) for the growth in three types of F-1 hybrids, and the offspring derived from CC female X Rmale had a stronger heterosis among the crosses at the medium-term; the uptrend among traits are wet weight > shell width > shell length > shell height, Chinese cultural population could be recognized as excellent parent, and seasonal variations influence very much on the daily increment and growth rate of each trait of Chlamys farreri and it is only able to survive and could barely grow in winter (6 similar to 8 months), but grows fast in temperate season (10similar to12 months).

栉孔扇贝(Chlamys farreri)Toll样受体及其信号传递相关基因的克隆与表达

扇贝是我国海水养殖的重要品种，但自1994年以来，养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡，不但造成了巨大的经济损失，而且直接威胁到现有产业的生存和发展。引起扇贝大规模死亡原因是多方面的，其主要原因是养殖环境恶化、扇贝种质衰退和抗病力下降。因此，深入研究扇贝免疫防御机制，探讨提高机体抗病力的有效途径和方法，改良种质和培育抗病品系，无疑是解决目前困扰扇贝养殖业健康可持续发展的必经之路。 Toll样受体（TLRs）家族是新近发现的模式识别受体（PRRs），参与识别病原体相关的分子模式（PAMPs），在天然免疫系统中起着非常重要的作用。哺乳动物中Toll样受体信号通路还参与诱导树枝状细胞成熟、参与免疫耐受、参与凋亡发生发展、介导非感染性因素的识别等，被视为联系天然免疫和获得性免疫的桥梁。同时果蝇的Toll信号通路也是不具备获得性免疫的果蝇赖以抵御病毒、细菌和真菌感染，介导天然免疫反应的重要信号通路。 本研究采用大规模EST测序方法，结合Genome Walker库的构建和cDNA末端快速扩增技术，从栉孔扇贝克隆得到CfToll-1、CfMyd88、CfTRAF6和CfCactus这四个Toll样受体信号通路基因的全长cDNA，同时用荧光实时定量PCR技术检测了这些基因的组织分布及在脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）刺激下的表达规律。 栉孔扇贝Toll样受体（CfToll-1）的cDNA序列全长4308 bp，包含5’非翻译区（UTR）211 bp，3597 bp的开放阅读框，500 bp的3’UTR，最后为18个腺嘌呤的ploy A 尾巴。开放阅读框编码1198个氨基酸的多肽，该多肽的估计分子量为137.41kd，估计的等电点为5.62，该多肽有信号肽，具有一个预测的跨膜区，因此是一种跨膜蛋白。经BLAST比对，CfToll-1基因与节肢动物多种Toll蛋白高度的相似性。SMART（Simple Modular Architecture Research Tool）软件分析，CfToll-1包含典型的Toll样受体的结构：富含亮氨酸的重复序列的胞外区（leucine-rich repeats, LRR），一段跨膜结构域，以及胞内区的TIR结构域（Toll/IL-1 receptor homologous region）。利用Real-time RT-PCR发现CfToll-1mRNA在扇贝体内普遍存在于血细胞、肌肉、外套膜、心、性腺和鳃组织中。利用体外培养的原代血细胞系研究不同浓度LPS刺激后CfToll-1的表达变化，结果显示低剂量（100ng.mL-1 ）LPS 使CfToll-1 mRNA表达量减小，该变化在1.5h、3h 和9h组差异显著，虽然在6h组表达量稍有恢复，但尚未达到对照水平；用1μg.mL-1LPS处理细胞时， 6h组CfToll-1表达量明显上调，约为对照水平的2倍。证实细菌结构脂多糖对CfToll-1基因的表达有影响，且这种影响有剂量依赖效应。 栉孔扇贝Myd88同源基因（CfMyd88）的cDNA序列全长1554bp，包含5’UTR 427 bp，1101bp的开放阅读框，最后为18个腺嘌呤的ploy A 尾。CfMyd88的开放阅读框可编码367个氨基酸的多肽，该多肽的估计分子量为42.37kD，估计的等电点为5.71。利用SMART程序分析发现CfMyd88编码了Death和TIR结构域, 这两个结构域是Myd88特征结构。BLAST程序发现扇贝的序列与数据库哺乳动物的Myd88基因高度同源。原代培养的扇贝血细胞在受到PGN刺激后，CfMyd88 mRNA表达在1.5小时开始下调，直到9小时下调至对照表达量的1/10，证实肽聚糖结构对CfMyd88基因的表达有影响。 栉孔扇贝TRAF6同源基因（CfTRAF6）的cDNA序列全长2510bp，包含5’UTR 337 bp，1965bp的开放阅读框，3’UTR 208bp，最后为21 个腺嘌呤的ploy A 尾巴。CfTRAF6开放阅读框编码655个氨基酸的多肽，该多肽的估计分子量为74.09kD，估计的等电点为6.01。InterPro Scan在线分析发现CfTRAF6有典型的TRAF蛋白家族的特征结构，包括的一个指环结构，两个锌指结构，一个MATH （the meprin and TRAF homology）结构域以及Coiled-coil区域。CfTRAF6的序列与数据库多物种的TRAF6高度同源，同源性最高的是乌贼序列（Identity＝68）和鼠类（Identity＝45%）。利用Real-time RT-PCR，发现CfTRAF6在各组织普遍存在，在性腺中的表达最高。原代培养的扇贝血细胞在受到不同浓度PGN刺激后，与CfMyd88的情况一样，CfTRAF6的表达量变化减少，且这种变化随剂量的增加更加明显。 栉孔扇贝Cactus同源基因（CfCactus）的cDNA序列全长2488bp，包含5’UTR 181 bp，840bp的开放阅读框， 3’UTR 1467bp，最后为19个腺嘌呤的ploy A 尾巴。CfCactus的开放阅读框编码279个氨基酸的多肽，该多肽的估计分子量为31.37 kD；估计的等电点为4.74，与果蝇的Cactus基因的等电点相近（4.5）。利用SMART程序分析发现CfCactus主要编码了ANK结构域（ankyrin repeats）。Cactus基因为哺乳动物NF-κB抑制蛋白IκB的同源分子，BLAST 程序发现扇贝的序列与数据库多物种的Cactus或IκB基因高度同源。同源性最高的是太平洋牡蛎（Identity=35%）和圆尾鲎（Identities = 44%）。对CfTCactus mRNA在扇贝的血细胞、性腺、 肠的组织表达进行分析，并同时与CfTRAF6和CfMyd88的表达量进行了对比，发现CfCactus的表达水平明显高于这两个基因，而且CfTRAF6的基因表达量也高于CfMyd88，表现出级联放大效应。正常情况下，三个基因在性腺的表达量最高，推测这条通路可能和发育等功能密切相关。 通过本研究我们首次在双壳类软体动物找得到与果蝇Toll蛋白家族高度同源的CfToll-1基因，同时发现其他三个在Toll样受体信号传递过程中起重要作用的基因，其中包括在软体动物中获得的第一个Toll样受体的接头分子－CfMyd88基因，该结果直接证明软体动物具有与哺乳动物和节肢动物高度类似Myd88依赖的Toll样受体信号通路。同时通过这些基因组织分布的研究以及细菌结构LPS和PGN对这条通路上基因表达的影响，证明扇贝Toll信号通路可能与在果蝇中一样，参与扇贝的发育和免疫防御等多种功能。

栉孔扇贝Chlamys farreri生态免疫机制的基础研究

针对目前栉孔扇贝Chlamys farreri养殖亟待解决的种质、病害、环境和产品质量等日趋严重的问题，从栉孔扇贝本身的防御机制和神经内分泌机制入手，较为系统地研究了环境胁迫，应激激素与血细胞免疫功能之间的相互作用机制；从生态免疫学角度，探讨了栉孔扇贝大规模死亡的原因，为栉孔扇贝病害防治和种质优化提供了一些理论依据。主要研究结果如下： 1.较为系统地综述了贝类生态免疫机制的研究进展。分析了应激激素对贝类细胞免疫活性的抑制作用，以及生态免疫过程中免疫成本的投入与其他生态因子之间的内在联系，分析了病原体与宿主之间的相互作用机制，提出了贝类生态免疫机制研究新见解和新思路。 2.筛选出一种较适用的抗凝剂配方：Glucose 20.8 gL-1，EDTA 20mM, Sodium chloride 20 gL-1，Tris-HCl 0.05M，pH=7.4。 3.模拟研究了栉孔扇贝养殖过程中的主要环境胁迫因子，包括露空胁迫（5°C，17°C和25°C露空最长持续24小时），急性温度胁迫（从17°C分别直接升至23°C和28°C或降至11°C），急性盐度胁迫（从盐度31直接升至盐度35或降至盐度25和20），饥饿胁迫（持续40天）和密度胁迫（分为低、中和高密度），对栉孔扇贝血细胞免疫功能的影响，养殖过程中的露空胁迫对栉孔扇贝的血细胞免疫功能具有抑制作用，从而削弱了扇贝胁迫后恢复的最初24小时中抗击病原体的能力。高温下（25°C）的露空胁迫能够显著地降低扇贝的成活率。急性升温胁迫（从17°C突变至28°C）会严重的破坏栉孔扇贝的内稳态，损伤其血细胞免疫功能，从而增加了扇贝对病原体的易感性。而扇贝对快速的降温胁迫（从17°C突变至11°C）则具有较高的耐受性。盐度20的低盐胁迫能够显著抑制栉孔扇贝的血细胞防御功能，同时低盐有利于许多病原体的繁殖，两方面的协同作用，将大大增加扇贝大规模死亡的几率。饥饿胁迫（40天）能够显著地抑制血细胞的免疫活性，然而在实验室饵料充足的条件下，养殖密度除了对血细胞的吞噬活性有一定的抑制作用外，对血细胞其他的免疫活性影响不明显。 4.揭示了环境胁迫因子，包括露空胁迫（17°C 露空24小时），温度胁迫（从17°C分别直接升至28°C或降至11°C持续7天），低盐胁迫(从盐度31直接降至盐度20持续7天)和饥饿40天胁迫，对栉孔扇贝血细胞超微结构的影响，露空胁迫（17°C 露空24小时），低盐胁迫(盐度20持续7天)和饥饿40天胁迫严重损伤了血细胞的膜系统及各种细胞器的结构。 5.利用酶联免疫法测定了栉孔扇贝血淋巴中应激激素（肾上腺素，去甲肾上腺素和多巴胺）的基础浓度，分别为0.088±0.11, 18.63±1.96 和 2.59±0.46ng/ml。研究了血淋巴中应激激素对环境胁迫（包括露空，急性升温和急性降盐）的响应水平，急性露空，升温和降盐能够显著提高血淋巴中肾上腺素和去甲肾上腺素的浓度，而多巴胺浓度变化却呈现出完全相反的趋势。 6.肾上腺素和去甲肾上腺素体外诱导栉孔扇贝血细胞研究结果表明：浓度为30ng/ml或50ng/ml的去甲肾上腺素能够显著抑制血细胞的吞噬活性，浓度为50ng/ml的去甲肾上腺素能够显著抑制血细胞的活性氧产物，而肾上腺素对血细胞免疫功能的影响则不显著。

温度盐度对栉孔扇贝Chlamys farreri胚胎和幼虫的影响

本文在实验室条件下，系统地研究了温度盐度对栉孔扇贝胚胎和幼虫的单一和组合效应。受精卵孵化的适宜温度范围为16.0-22.0 ℃，适宜盐度范围为27.5-32.5‰。随着胚胎发育，胚体对度盐度的适应范围增广。胚胎孵化的适宜温－－盐区域为16.0 ℃／27.2‰-24.4 ℃/33.6‰。水温超过26.0 ℃时，幼虫存活率显著下降，其生长的适宜温度范围为16.0-26.0℃。幼虫存活的适宜盐度范围为27.0-42.0‰，生长的适宜盐度范围为27.0-39.0‰。在120小时实验中，幼虫存活的适宜温－－盐区域是10.0 ℃/16.3‰-27.0 ℃/42.0‰，生长的适宜的温－－盐区域是21.5 ℃/26.1‰-27.0 ℃/36.0‰。在240小时实验中，幼虫存活的适宜温－－盐区域是10.0 ℃/23.4‰-26.9 ℃/42.0‰，生长的适宜的温－－盐区域是14.2 ℃/20.5‰-27.6 ℃/38.8‰。温度盐度对胚胎和幼虫的影响都很大，相比较而言，盐度的影响大于温度。温－－盐对胚胎发育和幼虫存活的组合效应极其显著。随着幼虫的生长发育，温－－盐对幼虫生长的组合效应逐渐表现出显著性，幼虫生长的适应范围增大。

Concentrations of Cadmium and Zinc in Seawater of Bohai Bay and Their Effects on Biomarker Responses in the Bivalve Chlamys farreri

Both in-field chemical investigation and in the laboratory toxic tests were carried out to systematically understand the pollution status of cadmium (Cd) and zinc (Zn) in Bohai Bay. Samples collected from surface seawater were determined to describe the distributions of Cd and Zn in Bohai Bay. The average values in our study of Cd and Zn were 0.15 mu g/L and 19.68 mu g/L, respectively. Both of them were lower than the first class limit of seawater quality standard in China. In the laboratory, antioxidant enzymes [SOD (Cu/Zn-SOD, Mn-SOD), CAT], lipid peroxidation (MDA), phase I and phase II enzymes (CYP4501A and GST) were investigated in the bivalves Chlamys farreri exposed to Cd and Zn at the concentration levels of Bohai Bay seawater, which were obtained from our in-field investigation. The reduced SOD, CAT, and EROD (7-ethoxyresorufin-O-deethylase) activities (with the inhibitory rate of 16.8%, 31.5%, and 51.6%, respectively) in Cd treatment were observed and resulted in obvious lipid peroxidation damage. However, treatment of Zn showed elevations in SOD and GST by 13.3% and 29.9%, respectively, and with no influence on lipid peroxidation. In summary, seawater quality in Bohai Bay seawater was ranked as good in general, but it seemed that Cd might possess a potential environmental risk by effecting pro-oxidant/antioxidant balance and phase I detoxification in C. farreri.

Characterization and application of monoclonal antibodies against turbot (Scophthalmus maximus) rhabdovirus

Five monoclonal antibodies (mAbs), 1G8, 1H9, 2D2, 2D3, and 2F5, against Scophthalmus maximus rhabdovirus (SMRV) were prepared. Characterization of the mAbs included indirect enzyme-linked immunosorbent assay, isotyping, viral inhibition assay, immunofluorescence staining of virus-infected cell cultures, and Western blot analysis. Isotyping revealed that 1G8 and 1H9 were of the IgG2b subclass and that the other three were IgM. 2D2, 2D3, and 2F5 partially inhibited SMRV infection in epithelioma. papulosum cyprinid (EPC) cell culture. Western blotting showed that all five mAbs could react with two SMRV proteins with molecular masses of approximately 30 kDa (P) and 26 kDa (M). These two proteins were localized within the cytoplasm of SMRV-infected EPC cells by immunofluorescence assay. Also, progressive foci of viral replication in cell cultures were monitored from 6 to 24 h, using mAb 2D3 as the primary antibody. A flow cytometry procedure was used to detect and quantify SMRV-infected (0.01 PFU/cell) EPC cells with mAb 2D3, and 10.8% of cells could be distinguished as infected 36 h postinfection. Moreover, mAb 2D3 was successfully applied for the detection of viral antigen in cryosections from flounder tissues by immunohistochemistry tests.

栉孔扇贝大规模死亡病原学研究

用平板画线法从患病栉孔扇贝（Chlamys farreri）体内分离到了一种原核生物（简称QDP）。QDP可以在改进的液体培养基MEM（含2.2%NaCl，5%小牛血清）和脑心浸液（含2.2% NaCl）中生长；菌落在显微镜下（150×）为无色、透明的小点状；革兰氏染色阴性；菌体为圆形或近似圆形。QDP在发育过程中有两种状态，一种为未成熟阶段，直径小于100nm；另一种为成熟阶段，直径变化很大，最小约60nm，最大可达4µm以上。较小的个体有拟核、核糖体和新月状的空泡，未见细胞壁；较大的个体有细胞壁，胞内大部分被空泡充满，未见拟核和核糖体。栉孔扇贝组织超簿切片电镜观查证实QDP的存在。QDP的密度随着生长发育时间的不同而有所变化，繁殖高峰期密度较大。 建立了密度梯度离心结合滤膜过滤分离技术，优化人工培养条件。最适生长温度为23℃，最适生长pH值为7.4，最适生长盐度相当于细胞培养液所需的盐浓度（0.85%NaCl）。 提取的QDP核酸能被RNase A 降解，且没有检测到DNA。以PCR、RT-PCR扩增其16SrRNA基因序列片段，PCR反应没有扩增出扩增子，而RT-PCR则扩增出了16S rRNA基因序列片段，经测定其序列全长度为1430bp，经与GENEBANK中的16S rRNA片段比较分析，与6种不同科的微生物的同源率最高的为95%-95.47%。 采用温度梯度和病原浓度梯度回归感染实验方法，较为系统地研究了QDP的致病性。研究结果表明：QDP对栉孔扇贝有强烈的致病作用，高温（23℃以上）是其致病的必要条件，证实DQP是栉孔扇贝大规模死亡的病原体之一。

Food sources of three bivalves living in two habitats of Jiaozhou Bay (Qingdao, China): Indicated by lipid biomarkers and stable isotope analysis

Food Sources of three filter-feeding bivalves from two habitats (intertidal oyster Crassostrea gigas, mussel Mytilus galloprovincialis. and subtidal cultured scallop Chlamys farreri) of Jiaozhou Bay (Qingdao,China) were determined by fatty acid and stable isotope in analysis. Cultured scallop was characterized by significant diatom markets such as 16:1/16:0 close to 1 and high ratio of 20:5(n - 3)/22:6(n - 3), hence we assume that the scallop mainly feeds on diatoms. Fatty acid biomarkers specific to bacteria and terrestrial materials were also found in considerable amounts in scallop tissue, which suggested that there were Substantial bacterial and terrestrial input into the food of the species. Intertidal oyster and mussel, however, exhibited significant flagellate marker. 22:6(n - 3). and lower level of diatom markers. which indicated that flagellates are also part of intertidal bivalves' Planktonic food Sources: meanwhile, high level of Chlorophyta fatty acid marker, Sigma 18:2(n - 6) + 18:3(n - 3), suggested that Ulva pertusa (Chlorophyta) seaweed bed supplied important food sources to intertidal bivalves. Additionally, result of stable isotope analysis showed that phytoplankton contributed 86.2 to 89.0% to intertidal bivalves' carbon budget; macroalga U. pertusa origin source had a contribution of MIX, to 11.0%, which indicated its role Lis in important supplemental food source to intertidal bivalves. From this study. it is concluded that the dietary difference of three bivalves probably relates to the different potential food sources in the scallop farm and intertidal zone in Jiaozhou Bay.