Diseño de un vector no viral basado en nanopartículas lipídicas para el tratamiento de la hepatitis C mediante ARN de interferencia

199 p.

La peste porcina africana en el este de Europa: evolución de los aislados circulantes y evaluación de las herramientas diagnósticas para su control

La Peste Porcina Africana (PPA) es una enfermedad porcina de etiología vírica muy compleja, de carácter infecto-contagioso, para la que actualmente no existe vacuna. Por su gran importancia económica y sanitaria aparece incluida dentro del grupo de enfermedades de declaración obligatoria de la lista de la OIE y de la Unión Europea y su presencia conduce a restricciones inmediatas sobre el comercio de cerdo y productos derivados. Está causada por el virus de la Peste porcina africana (vPPA), un virus ADN de gran tamaño y estructura compleja, que presenta una envuelta lipoprotéica y una elevada variabilidad genética y antigénica, con 22 genotipos diferentes descritos hasta la fecha. Pertenece a la familia Asfarviridae, genero Asfivirus, de la que es el único integrante. Actualmente está presente en 22 países del África subsahariana, en la isla de Cerdeña, Italia, y desde su introducción en Georgia en 2007, tanto en la región transcaucásica como en el centro y sur de la zona occidental de la Federación Rusa (FR). La compleja situación epidemiológica de la PPA en el este de Europa, con focos continuados en la FR y afectando también a otros países vecinos de la UE como Bielorrusia y Ucrania, originó finalmente la entrada de la enfermedad en varios países de la UE en 2014, Lituania, Polonia, Letonia y Estonia en los que, hasta agosto de 2015, se realizaron más de 1000 notificaciones principalmente en jabalí, y en mucha menor medida en cerdo doméstico. Únicamente las especies de la familia Suidae y a las garrapatas blandas del género Ornithodoros son infectadas de forma natural por el vPPA. En cerdos domésticos y jabalíes europeos las manifestaciones clínicas de la enfermedad son variables. Por el contrario, los suidos silvestres africanos son resistentes a la infección, habitualmente con cursos clínicos de tipo inaparente...

Caracterización biológica y molecular de geminivirus que afectan el cultivo del tomate (Lycopersicon esculentum Mill) en Nicaragua

El objetivo del presente trabajo consistió en la caracterización biológica y molecular de geminivirus que afectan el cultivo del tomate (Licopersicon esculentum Mili.), el estudio se realizó en la Universidad Nacional Agraria (UNA), en el período de enero 2001 a enero 2002. Se efectuó en tres fases: la primera fase de invernadero, donde se utilizaron plantas de tomate de la variedad UC-82, crías de mosca blanca (Bemisia tabaci Genn), fuente original del aislado del geminivirus de Condega, con el objetivo de caracterizar biológicamente el geminivirus, a través de periodos de adquisición, inoculación y retención, previamente para la realización de estos periodos, se determinó el porcentaje de transmisibilidad de la colonia de mosca blanca, el cual fue de 45% Jo que indicó que para asegurar la transmisibilidad del virus fue necesario usar 5 moscas por planta. Los períodos de adquisición e inoculación fueron los tiempos de 2, 5, 10 y 30 minutos, 1, 2, 4, 8, 10, 12, 18, 24 y 48 horas con 3 repeticiones de cada periodo, los datos obtenidos de estos periodos fueron analizados mediante un análisis de regresión logístico binario, resultando que el vector fue capaz de adquirir y transmitir el virus tanto en 1 O minutos (40% y 33%) como en 48 horas (60% y 66.66%) respectivamente, respecto al periodo de retención se estableció realizándose un promedio de los porcentajes de severidad de las 3 repeticiones mostrando como resultado que el vector conservó su capacidad de transmisión del virus hasta el sexto día con 45.07% de transmisibilidad, también se evaluaron 5 especies de la familia solanáceas injertándolas con plantas afectadas con el genminivirus de Condega, para conocer cuáles son hospederas del virus, resultando la especie Nicotiana tabacum cv. Benthamiana con síntomas del virus. En esta misma fase se evaluaron 4 materiales de tomate (55, 111, 148, 112) usando como testigo la variedad UC-82, se utilizó un Diseño Completamente al Azar (DCA) y se evaluó la variable severidad de la enfermedad a los datos obtenidos a través de ANDEVA y separación de medias según Duncan, estos materiales se evaluaron mediante cuatro tratamientos (inoculaciones), el primero a los 7 ddt, el segundo a los 14 ddt, el tercero a los 21 ddt y el último tratamiento fueron las plantas sin inocular (testigos), el análisis indicó que la variedad UC-82 fue la más susceptible ante el complejo mosca blanca-geminivirus presentando mayores porcentajes de severidad y el material 112 resultó el más resistente, con menos porcentajes de severidad. La segunda fase se realizó fuera del invernadero, evaluándose ante el complejo mosca blanca-geminivirus 3 materiales, incluyendo la variedad UC-82 como testigo. Se utilizó un Diseño completamente al Azar, tomando en cuenta las variables severidad, incidencia y población de mosca blanca, A los datos obtenidos se les realizó ANDEVA y separación de medias según Duncan, el que mostró que el material 55 fue el mejor, ya que presentó menos porcentaje de severidad (40%), el peor material fue lavar. UC-82 ya que mostró 58.75% de severidad, con relación a la incidencia todos los materiales evaluados resultaron al final de los muestreos con igual porcentaje de incidencia (!00%) y en el caso de la población de mosca blanca la variedad UC-82 fue la que presentó más adultos por planta en comparación con el resto de materiales. La tercera fase fue realizada en el laboratorio de biología molecular en la UNA y Suecia con el propósito de caracteri7ar molecularmente los geminivirus de Condega., Santa Lucía y Sébaco, secuenciando un fragmento de 1200 pares de bases del componente A para comparar a través de las secuencias de nucleótidos los porcentajes de similitud que existen entre ellos, dando como resultado que el geminivirus de Sébaco con el de Santa Lucía alcanzó mayor porcentaje de similitud con un 95.2 con respecto al geminivirus de Condega que obtuvo un 89.0%.

Insecticides evaluated for control of fall armyworm (Lepidóptera: Noctuidae) on Sorghum)

El gusano cogollero [Spodoptera fnugiperda (J.E. Smith) (lnsecta: Lepidoptera: Noctuidae)], es uno de los principales insectos que afectan el cultivo de sorgo en El Salvador. En vista de lo anterior, durante los meses de septiembre de 2001 y enero de 2002, se realizó una investigación en la estación experimental dos del Centro Nacional de Tecnología Agropecuaria y Forestal (CENTA), ubicado en el valle de San Andrés, departamento de La Libertad. El objetivo de la investigación fue determinar la efectividad de productos químicos, botánicos y biológicos para el control del gusano cogollero. Se utilizó un diseño de bloques completos al azar, con nueve tratamientos y cuatro repeticiones. Los tratamientos fueron: insecticida botánico (Agrolnagor), Aceite de Nim, Beauveria bassiana, Virus de la Poliedrosis Nuclear (VPN), Lufenuron, Teflubanzuron, Agua azucarada, testigo relativo ( clorpirifos) y testigo absoluto (sin aplicación). Los datos de mortalidad se obtuvieron 24 horas y cuatro días después de las aplicaciones. Los resultados muestran diferencias significativas entre tratamientos en los porcentajes de mortalidad de la plaga. Los insecticidas inhibidores de la quitina, lufeneron y tetlubenzuron, mostraron mayor efectividad (superior al 90 por ciento) comparados con los otros tratamientos insecticidas, los cuales mostraron niveles de mortalidad interior al 65 por ciento cuatro días después de su aplicación. El porcentaje de mortalidad obtenido en parcelas tratadas con chlorpyrifos fue de 63.3 por ciento durante el primer muestreo. La mortalidad fue superior en larvas de los primeros estadios, comparada con larvas de los últimos estadios. Los tratamientos con Neem, productos biológicos (Beauveria bassiana y el virus de la poliedrosis nuclear) y agua azucarada presentaron los más bajos niveles de mortalidad. Hubo diferencias significativas en el rendimiento del cultivo, sin embargo, dichas diferencias no siempre estuvieron relacionadas a los niveles de mortalidad presentados por los tratamientos insecticidas.

New Oncogenic Drivers in Hepatocellular Carcinoma: Role of the RNA Binding Protein Hu antigen R

156 p. : graf.

Vertical transmission efficiency and insecticidal properties of Spodoptera exigua Nucleopolyhedrovirus (SeMNPV) genotypes for their use in biological control

El nucleopoliedrovirus de Spodoptera exigua (SeMNPV) es un patógeno natural de las poblaciones larvarias de S. exigua que constituye la base de un bioinsecticida comercializado en España para el control biológico de esta plaga en pimiento. Recientes estudios han demostrado que la transmisión del virus a la descendencia (transmisión vertical) se da con frecuencia y podría ser una característica deseable para su uso en aplicaciones de campo. En el presente trabajo se discute la conveniencia de utilizar una mezcla de dos genotipos SeAl1 (transmisión vertical) y SeG25 (transmisión horizontal) en determinadas proporciones para mejorar las características que cada uno de ellos presenta por separado y así explotar cada una de las vías de transmisión. La patogenicidad (CL50) del genotipo SeG25, y de cualquiera de las mezclas que contienen un 25, 50 o 75 % del mismo, fue más alta que la del aislado SeAl1. Sin embargo, en términos de virulencia (TMM) y productividad (OBs/larva) no se observaron diferencias significativas entre genotipos ni entre sus mezclas. Además se evaluó la capacidad de producir infecciones encubiertas de cada genotipo y sus mezclas sometiendo larvas de S. exigua a infecciones subletales del virus. Se encontraron transcritos del virus para el gen temprano ie0 mediante RT-PCR en los adultos supervivientes a infecciones provocadas por el genotipo SeG25 y todas las mezclas. También se testaron otros dos genes virales que se expresan de manera temprana y tardía en la infección de baculovirus (DNA-polimerasa y polihedrina) para los que en ningún caso se detectaron transcritos.

Development of metabolic labeling strategies to study changes in protein expression

Résumé : Les progrès techniques de la spectrométrie de masse (MS) ont contribué au récent développement de la protéomique. Cette technique peut actuellement détecter, identifier et quantifier des milliers de protéines. Toutefois, elle n'est pas encore assez puissante pour fournir une analyse complète des modifications du protéome corrélées à des phénomènes biologiques. Notre objectif était le développement d'une nouvelle stratégie pour la détection spécifique et la quantification des variations du protéome, basée sur la mesure de la synthèse des protéines plutôt que sur celle de la quantité de protéines totale. Pour cela, nous volions associer le marquage pulsé des protéines par des isotopes stables avec une méthode d'acquisition MS basée sur le balayage des ions précurseurs (precursor ion scan, ou PIS), afin de détecter spécifiquement les protéines ayant intégré les isotopes et d'estimer leur abondance par rapport aux protéines non marquées. Une telle approche peut identifier les protéines avec les plus hauts taux de synthèse dans une période de temps donnée, y compris les protéines dont l'expression augmente spécifiquement suite à un événement précis. Nous avons tout d'abord testé différents acides aminés marqués en combinaison avec des méthodes PIS spécifiques. Ces essais ont permis la détection spécifique des protéines marquées. Cependant, en raison des limitations instrumentales du spectromètre de masse utilisé pour les méthodes PIS, la sensibilité de cette approche s'est révélée être inférieure à une analyse non ciblée réalisée sur un instrument plus récent (Chapitre 2.1). Toutefois, pour l'analyse différentielle de deux milieux de culture conditionnés par des cellules cancéreuses humaines, nous avons utilisé le marquage métabolique pour distinguer les protéines d'origine cellulaire des protéines non marquées du sérum présentes dans les milieux de culture (Chapitre 2.2). Parallèlement, nous avons développé une nouvelle méthode de quantification nommée IBIS, qui utilise des paires d'isotopes stables d'acides aminés capables de produire des ions spécifiques qui peuvent être utilisés pour la quantification relative. La méthode IBIS a été appliquée à l'analyse de deux lignées cellulaires cancéreuses complètement marquées, mais de manière différenciée, par des paires d'acides aminés (Chapitre 2.3). Ensuite, conformément à l'objectif initial de cette thèse, nous avons utilisé une variante pulsée de l'IBIS pour détecter des modifications du protéome dans des cellules HeLa infectée par le virus humain Herpes Simplex-1 (Chapitre 2.4). Ce virus réprime la synthèse des protéines des cellules hôtes afin d'exploiter leur mécanisme de traduction pour la production massive de virions. Comme prévu, de hauts taux de synthèse ont été mesurés pour les protéines virales détectées, attestant de leur haut niveau d'expression. Nous avons de plus identifié un certain nombre de protéines humaines dont le rapport de synthèse et de dégradation (S/D) a été modifié par l'infection virale, ce qui peut donner des indications sur les stratégies utilisées par les virus pour détourner la machinerie cellulaire. En conclusion, nous avons montré dans ce travail que le marquage métabolique peut être employé de façon non conventionnelle pour étudier des dimensions peu explorées en protéomique. Summary : In recent years major technical advancements greatly supported the development of mass spectrometry (MS)-based proteomics. Currently, this technique can efficiently detect, identify and quantify thousands of proteins. However, it is not yet sufficiently powerful to provide a comprehensive analysis of the proteome changes correlated with biological phenomena. The aim of our project was the development of ~a new strategy for the specific detection and quantification of proteomé variations based on measurements of protein synthesis rather than total protein amounts. The rationale for this approach was that changes in protein synthesis more closely reflect dynamic cellular responses than changes in total protein concentrations. Our starting idea was to couple "pulsed" stable-isotope labeling of proteins with a specific MS acquisition method based on precursor ion scan (PIS), to specifically detect proteins that incorporated the label and to simultaneously estimate their abundance, relative to the unlabeled protein isoform. Such approach could highlight proteins with the highest synthesis rate in a given time frame, including proteins specifically up-regulated by a given biological stimulus. As a first step, we tested different isotope-labeled amino acids in combination with dedicated PIS methods and showed that this leads to specific detection of labeled proteins. Sensitivity, however, turned out to be lower than an untargeted analysis run on a more recent instrument, due to MS hardware limitations (Chapter 2.1). We next used metabolic labeling to distinguish the proteins of cellular origin from a high background of unlabeled (serum) proteins, for the differential analysis of two serum-containing culture media conditioned by labeled human cancer cells (Chapter 2.2). As a parallel project we developed a new quantification method (named ISIS), which uses pairs of stable-isotope labeled amino acids able to produce specific reporter ions, which can be used for relative quantification. The ISIS method was applied to the analysis of two fully, yet differentially labeled cancer cell lines, as described in Chapter 2.3. Next, in line with the original purpose of this thesis, we used a "pulsed" variant of ISIS to detect proteome changes in HeLa cells after the infection with human Herpes Simplex Virus-1 (Chapter 2.4). This virus is known to repress the synthesis of host cell proteins to exploit the translation machinery for the massive production of virions. As expected, high synthesis rates were measured for the detected viral proteins, confirming their up-regulation. Moreover, we identified a number of human proteins whose synthesis/degradation ratio (S/D) was affected by the viral infection and which could provide clues on the strategies used by the virus to hijack the cellular machinery. Overall, in this work, we showed that metabolic labeling can be employed in alternative ways to investigate poorly explored dimensions in proteomics.

Coevolution of restriction factors and retroviruses

Les virus exploitent la machinerie cellulaire de l'hôte pour se répliquer. Ils doivent s'adapter pour infecter la cellule hôte de manière optimale tout en échappant à la vigilance du système de défense de l'hôte. Ainsi l'hôte et les virus se livrent à de constantes batailles évolutives. Mon travail de thèse a porté sur l'étude des signatures évolutives de facteurs de l'hôte agissant comme des 'facteurs de restriction' en bloquant la réplication rétrovirale chez les primates. Plus spécifiquement, mon travail a visé à utiliser des données évolutives pour renseigner les analyses fonctionnelles et la biologie. Nous avons étudié le facteur anti-VIH-1 nommé TRIM5a (i) chez les prosimiens pour mieux comprendre son rôle dans le contrôle d'un lentivirus endogène, (ii) dans son activité contre d'autres anciennes infections représentées par des rétrovirus endogènes humains et (iii) en tant que protéine capable de générer des mutants de la capside. Premièrement nous nous sommes intéressés à TRIM5a chez deux espèces de lémuriens dont Microcebus murinus qui porte le lentivirus endogène PSIV dans son génome depuis plusieurs millions d'années,. Nous avons observé que TRIM5a chez M. murinus a un spectre d'activité antivirale réduit à l'opposé de TRIM5a chez le Lemur catta - non porteur du PSIV endogène - qui bloque une large variété de rétrovirus dont le PSIV. De ce fait TRIM5a aurait pu contribuer à protéger certaines espèces de lémuriens vis-à-vis d'anciennes infections par le PSIV. A l'inverse du PSIV, des virus dérivés des rétrovirus endogènes humains HERV-K and HERV-H se sont révélés largement résistants à l'inhibition par TRIM5a. Ces données illustrent une absence de protection par TRIM5a face à d'autres anciennes infections rétrovirales. Puis, pour évaluer l'impact de la protéine TRIM5a humaine sur le VIH-1, nous avons testé l'effet de mutations des résidues sous sélection positive dans la capside du VIH-1 sur l'inhibition par TRIM5a. Nos résultats montrent que TRIM5a ne jouerait pas un rôle significatif dans l'évolution de la capside du VIH-1. Enfin notre travail a porté sur le facteur anti-VIH-1 SAMHD1 récemment découvert, que nous avons séquencé chez 25 espèces de primates. L'analyse évolutive des sites sous sélection positive et des expériences fonctionnelles ont permis d'identifier le domaine de SAMHD1 interagissant avec la protéine lentivirale Vpx. De même que d'autres protéines virales contrecarrent les facteurs de restriction en les menant à la dégradation, nous avons observé que Vpx induit la dégradation de SAMHD1 de manière spécifique à l'espèce. Ces découvertes contribuent à comprendre comment les facteurs de restriction et les virus co-évoluent pour se neutraliser l'un l'autre. - Viruses hijack the host cellular machinery to replicate. They adapt to infect optimally host cells while escaping host defense systems. Viruses and the host coevolve in an evolutionary struggle. My thesis work has been devoted to study the evolutionary signatures of host factors acting as restriction factors that block retroviral replication in primates. Specifically, my work aimed at using evolutionary data to inform functional analyses and biology. We studied the anti-HIV-1 factor TRIM5a (i) in prosimians to better understand its possible role in the control of an endogenous lentivirus, (ii) in its activity against other ancient infections - as represented by HERVs, and (iii) as a protein capable of generating escape mutants in the viral capsid. First, my work focused on two lemur species, one of which was the gray mouse lemur that carries the endogenous lentivirus PSIV integrated in its genome for several million years. TRIM5a from gray mouse lemur exhibited a limited antiviral spectrum as opposed to TRIM5a from ring-tailed lemur - not a host of PSIV - that is able to block diverse retroviruses notably PSIV. These results support the possible contribution of TRIM5a in protecting lemur species from ancient infection by PSIV. In contrast, chimeric viruses derived from two human endogenous retroviruses were broadly resistant to TRIM5a-mediated restriction, suggesting TRIM5a lack of activity against other types of ancient infections. To evaluate the recent impact of human TRIM5a on HIV-1 evolution, we tested whether variants at positively selected sites in the HIV-1 capsid affected the ability of human TRIM5a alleles to restrict HIV-1. Our results indicate that TRIM5a does not play a significant role in the evolution of HIV1 capsid. At last, our work concentrated on the newly discovered anti-HIV-1 restriction factor SAMHD1. We determined its coding sequence in a panel of 25 species of primates. Evolutionary analyses of positively selected sites in SAMHD1 domains and functional assays identified the domain of SAMHD1 interacting with the lentiviral protein Vpx. Similar to other viral countermeasures targeting cellular restriction factors, Vpx was responsible of the degradation of SAMHD1 orthologs in a species-specific manner. These findings contributed to understanding how restriction factors and viruses evolve to counteract each other.

Creatine deficiency syndomes : a new model of partial GAMT deficiency affecting brain cell development

Les syndromes de déficiences cérébrales en créatine (CCDS) sont dus à des mutations dans les gènes GATM et G AMT (codant pour les enzymes AGAT et G AMT de la voie de synthèse de créatine) ainsi que SLC6A8 (transporteur de créatine), et génèrent une absence ou une très forte baisse de créatine (Cr) dans le cerveau, mesurée par spectroscopic de résonance magnétique. Les patients CCDS développent des handicaps neurologiques sévères. Les patients AGAT et GAMT peuvent être traités avec des doses importantes de Cr, mais gardent dans la plupart des cas des séquelles neurologiques irréversibles. Aucun traitement efficace n'existe à ce jour pour la déficience en SLC6A8. Bien que de nombreux modèles aient été développés pour comprendre la Cr cérébrale en conditions physiologiques, les pathomécanismes des CCDS ne sont pas encore compris. Des souris transgéniques pour les gènes Gatm, Gamt et Slc6a8 ont été générées, mais elles ne miment que partiellement la pathologie humaine. Parmi les CCDS, la déficience en GAMT est la plus sévère, en raison de l'accumulation cérébrale de l'intermédiaire guanidinoacétate (GAA). Alors que la toxicité cérébrale du GAA a été étudiée par exposition directe au GAA d'animaux adultes sains, les mécanismes de la toxicité du GAA en condition de déficience en GAMT dans le cerveau en développement sont encore inconnus. Le but de ce projet était donc de développer un modèle de déficience en GAMT dans des cultures 3D primaires de cellules nerveuses de rat en agrégats par knock-down du gène GAMT, en utilisant un virus adéno-associé (AAV) induisant le mécanisme d'interférence à l'ARN (RNAi). Le virus scAAV2, à la multiplicité d'infection de 1000, s'est révélé le plus efficace pour transduire tous les types de cellules nerveuses des cultures (neurones, astrocytes, oligodendrocytes), et générer un knock-down maximal de la protéine GAMT de 85% (jour in vitro 18). Cette déficience partielle en GAMT s'est révélée insuffisante pour générer une déficience en Cr, mais a causé l'accumulation attendue de GAA, à des doses comparables aux niveaux observés dans le LCR des patients GAMT. Le GAA a induit une croissance axonale anarchique accompagnée d'une baisse de l'apoptose naturelle, suivis par une induction tardive de mort cellulaire non-apoptotique. Le co-traitement par la Cr a prévenu tous les effets toxiques du GAA. Ce travail montre que l'accumulation de GAA en absence de déficience en Cr est suffisante pour affecter le développement du tissu nerveux, et suggère que des formes de déficiences en GAMT supplémentaires, ne présentant pas de déficiences en Cr, pourraient être découvertes par mesure du GAA, en particulier à travers les programmes récemment proposés de dépistage néonatal de la déficience en GAMT. -- Cerebral creatine deficiency syndromes (CCDS) are caused by mutations in the genes GATM and GAMT (respectively coding for the two enzymes of the creatine synthetic pathway, AGAT and GAMT) as well as SLC6A8 (creatine transporter), and lead to the absence or very strong decrease of creatine (Cr) in the brain when measured by magnetic resonance spectroscopy. Affected patients show severe neurological impairments. While AGAT and GAMT deficient patients can be treated with high dosages of Cr, most remain with irreversible brain sequelae. No treatment has been successful so far for SLC6A8 deficiency. While many models have helped understanding the cerebral Cr pathways in physiological conditions, the pathomechanisms underlying CCDS are yet to be elucidated. Transgenic mice carrying mutations in the Gatm, Gamt and Slc6a8 genes have been developed, but only partially mimic the human pathology. Among CCDS, GAMT deficiency is the most severe, due to the CNS accumulation of the guanidinoacetate (GAA) intermediate. While brain toxicity of GAA has been explored through direct GAA exposure of adult healthy animals, the mechanisms underlying GAA toxicity in GAMT deficiency conditions on the developing CNS are yet unknown. The aim of this project was thus to develop and characterize a GAMT deficiency model in developing brain cells by gene knockdown, by adeno-associated virus (AAV)-driven RNA interference (RNAi) in rat 3D organotypic primary brain cell cultures in aggregates. scAAV2 with a multiplicity of infection of 1000 was shown as the most efficient serotype, was able to transduce all brain cell types (neurons, astrocytes, oligodendrocytes) and to induce a maximal GAMT protein knockdown of 85% (day in vitro 18). Metabolite analysis showed that partial GAMT knockdown was insufficient to induce Cr deficiency but generated the awaited GAA accumulation at concentrations comparable to the levels observed in cerebrospinal fluid of GAMT-deficient patients. Accumulated GAA induced axonal hypersprouting paralleled with inhibition of natural apoptosis, followed by a later induction in non-apoptotic cell death. Cr supplementation led to the prevention of all GAA-induced toxic effects. This work shows that GAA accumulation without Cr deficiency is sufficient to affect CNS development, and suggests that additional partial GAMT deficiencies, which may not show the classical brain Cr deficiency, may be discovered through GAA measurement including by recently proposed neonatal screening programs for GAMT deficiency.

吳醫彚講Wu yi hui jiang.Collection de traités des médecins de Wu.

Contient : I, livre 1禱告藥王誓疏Dao gao yue wang shi su.Prière au dieu de la médecine ; II, livre 1溫證論治Wen zheng lun zhi.Du traitement en cas de diagnostic par le tiède ; III, livre 1人身一小天地論Ren shen yi xiao tian di lun.Traité des analogies entre le corps humain (microcosme) et l'univers ; IV, livre 1書方宜人共識說Shu fang yi ren gong shi shuo.Traité sur l'exécution des ordonnances ; V, livre 2日講雜記Ri jiang za ji.Notes sur des leçons quotidiennes ; VI, livre 2金匱上工治未病一節辯Jin gui shang gong zhi wei bing yi jie bian.Discussion d'un point du Jin gui yao lüe lun ; VII, livre 3石芝醫話Shi zhi yi hua.Notes médicales de Shi zhi ; VIII, livre 3管見芻言Guan jian chu yan.Vues étroites et paroles humbles ; IX, livre 3核骨踝脛腨辨He gu hua xing shan bian.Discussion relative à la cheville, au tibia, au mollet ; X, livre 3爛喉丹痧論Lan hou dan sha (?) lun.Traité des inflammations et ulcérations de la gorge.Zang fu shou sheng bian.Discussion du contenu des organes internes.Bian zi rong zhi wei.Pour distinguer le faux zi rong, etc ; XI, livre 3大豆黃卷辯Da dou huang juan bian.Discussion au sujet du médicament da dou huang juan.Wen yi zhui yan.Notes sur les maladies épidémiques ; XII, livre 3合論丹溪景岳相火大意He lun dan qi jing yue xiang he da yi.Sur le sens de l'expression xiang he, d'après Dan qi et Jing yue ; XIII, livre 4人身一小天地亦有南北兩極論Ren shen yi xiao tian di yi you nan bei liang ji lun.Le corps humain, étant un microcosme, a un pôle nord et un pôle sud.Ming men mo zhen bian.De l'examen de la veine du rein droit ; XIV, livre 4治肝補脾論Zhi gan bu pi lun.Traitement du foie et de la rate ; XV, livre 4四維相代陽氣乃竭解Si wei xiang dai yang qi nai jie jie.Explication de la phrase : par la succession des quatre wei, le souffle mâle s'épuise ; XVI, livre 4辯素問濁氣歸心之訛Bian su wen zhuo qi gui xin zhi wo.Discussion de l'assertion erronée du Su wen que le souffle trouble revient au cœur ; XVII, livre 4祖氣論Zu qi lun.Sur l'influence productrice du ciel et de la terre ; XVIII, livre 5痘毒藏脾經說Dou du cang pi jing shuo.Le virus de la petite vérole est contenu dans la rate.Dou chu tong shi lun.Sur l'apparition simultanée de la petite vérole.Dou you tai yin zhuan shu yang ming lun.La petite vérole, du principe femelle, évolue vers le principe mâle ; XIX, livre 5擬張令韶傷寒直解辨證歌Yi zhang ling shao shang han zhi jie bian zheng ge.Sur le diagnostic de la fièvre typhoïde ; XX, livre 6三皇藥王考San huang yue wang kao.Sur la divinité de la médecine ; XXI, livre 6脈訣正訛Mo jue zheng wo.Correction au Mo jue ; XXII, livre 6趨庭雜記Qu ting za ji.Notes d'après Qu ting ; XXIII, livre 6辨醫書音義Bian yi shu yin yi.Discussion sur le son et le sens de termes employés dans les livres de médecine.Xia yue ji zhi shuo.Traité sur l'oranger épineux qui doit être évité pendant l'été ; XXIV, livre 6喜傷心恐勝喜解Xi shang xin kong sheng xi jie.Traité sur les maladies provenant de l'excès ou du défaut du souffle vital ; XXV, livre 6百合病贅言Bai he bing zhui yan.Notes sur la maladie appelée bai he ; XXVI, livre 7辨脾胃升降Bian pi wei sheng jiang.Discussion sur un traitement de la rate et de l'estomac ; XXVII, livre 7氣有餘便是火解Qi you yu bian shi he jie.Explication de la phrase : s'il y a excès d'esprit, c'est l'influence du feu.Dong yuan jing yue lun xiang he bian.Discussion des opinions de Zhang Jing yue et de Li Gao sur l'examen du principe feu ; XXVIII, livre 7幼科似驚非驚辨You ke si jing fei jing bian.Discussion sur une affection qui ressemble à la maladie dite jing (trouble, effroi) ; XXIX, livre 7司馬運氣贅言Si tian yun qi zhui yan.Notes sur les influences exercées par les principes célestes.Zhou shen jing luo zong jue.Traité du système des vaisseaux ; XXX, livre 8木鬱達之論Mu yu da zhi lun.Traité relatif à une phrase du Nei jing ; XXXI, livre 8保護元陽說Bao hu yuan yang shuo.Traité sur la protection du principe mâle ; XXXII, livre 8讀傷寒論附記Du shang han lun fu ji.Notes à propos du traité de la fièvre typhoïde ; XXXIII, livre 8論白痘Lun bai phei.Dissertation sur la maladie appelée pei blanche (ulcères laissant des croûtes ou cicatrices blanches) ; XXXIV, livre 8爛喉痧論Lan hou sha (?) lun.Traité des inflammations et ulcérations de la gorge ; XXXV, livre 8爛喉丹痧治宜論Lan hou dan sha (?) zhi yi lun.Sur le traitement des inflammations et ulcérations de la gorge ; XXXVI, livre 8痧疹今昔不同治法亦異說Sha (?) zhen jin xi bu tong zhi fa yi yi shuo.La maladie appelée sha (?) n'étant pas la même aujourd'hui qu'autrefois, le traitement aussi doit différer ; XXXVII, livre 8攝生雜話Sha sheng za hua.Notes pour régler la vie ; XXXVIII, livre 9四大家辯Si da jia bian.Discussion à propos de quatre personnages célèbres ; XXXIX, livre 9攷正古方權量說Kao zheng gu fang quan liang shuo.Traité sur la correction des poids des anciennes formules ; XL, livre 9生氣通天論病因章句辯Sheng qi tong tian lun bing yin zhang ju bian.Discussion de quatre paragraphes de l'ouvrage de Dan qi intitulé : Ge zhi yu lun ; XLI, livre 10虛勞論Xu lao lun.Traité de la maladie appelée xu lao (consomption ?) ; XLII, livre 10讀先祖保陰煎謹記Du xian zu bao yin jian jin ji.Notes sur la formule Bao yin jian, composée par son aïeul ; XLIII, livre 10六味地黃丸方解Liu wei di huang huan fang jie.Explication de la formule des pilules dites à six ingrédients et à base jaune ; XLIV, livre 10司天運氣徵驗Si tian yun qi zheng yan.Preuves des influences exercées par les principes célestes ; XLV, livre 11三焦說San jiao shuo.Traité des trois jiao

Élaboration d’un anticorps chimère anti-gp350 comme traitement prophylactique éventuel des syndromes lymphoprolifératifs B chez les greffés

Le virus Epstein-Barr (VEB) est fortement associé au développement de syndromes lymphoprolifératifs (SLP) en greffe pédiatrique. Ce virus a la capacité d’immortaliser les lymphocytes B et de provoquer leur prolifération incontrôlée chez l’hôte immunodéprimé. Plusieurs études démontrent que le cycle lytique du virus jouerait un rôle primordial dans la genèse des SLP en produisant des particules virales pouvant infecter les cellules B adjacentes. Chez un individu immunodéprimé, ces cellules B nouvellement infectées peuvent donner naissance à une expansion lymphocytaire. Le projet présenté dans ce mémoire fait partie d’un programme de recherche visant à élucider le rôle de l’infection productive par le VEB dans le développement des SLP. L’objectif précis de ce projet est de développer un anticorps monoclonal chimère contre la glycoprotéine gp350 du VEB dans le but de neutraliser le virus et d’ainsi prévenir son entrée dans les cellules B. Notre laboratoire a construit une version chimère de l’anticorps monoclonal murin 72A1, lequel se lie à la gp350 et bloque l’infection. Les premiers essais ont révélé la présence de chaînes non fonctionnelles (aberrantes) dans l’hybridome produisant l’anticorps 72A1. La construction de la chaîne légère authentique est maintenant complète alors que celle de la chaîne lourde est toujours en cours. Le processus de caractérisation de l’anticorps chimère inclura des essais de cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Dans cette optique, une lignée cellulaire exprimant de façon stable la gp350 a été établie. Notre anticorps chimère anti-gp350 pourrait éventuellement être utilisé comme thérapie préventive chez les greffés présentant un risque élevé de SLP en empêchant l’infection des cellules B adjacentes.

The Role of Second Generation Antiretroviral Drugs in HIV-1 Subtype B and non-B Variants Harboring Natural Polymorphisms and Drug Resistance Mutations.

Cette thèse traite de la résistance du VIH-1 aux antirétroviraux, en particulier de l'activité antivirale de plusieurs inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI) ainsi que des inhibiteurs de protéase (IP). Nous avons exploré l’émergence et la spécificité des voies de mutations qui confèrent la résistance contre plusieurs nouveaux INNTI (étravirine (ETR) et rilpivirine (RPV)) (chapitres 2 et 3). En outre, le profil de résistance et le potentiel antirétroviral d'un nouvel IP, PL-100, est présenté dans les chapitres 4 et 5. Pour le premier projet, nous avons utilisé des sous-types B et non-B du VIH-1 pour sélectionner des virus résistants à ETR, et ainsi montré que ETR favorise l’émergence des mutations V90I, K101Q, E138K, V179D/E/F, Y181C, V189I, G190E, H221H/Y et M230L, et ce, en 18 semaines. Fait intéressant, E138K a été la première mutation à émerger dans la plupart des cas. Les clones viraux contenant E138K ont montré un faible niveau de résistance phénotypique à ETR (3,8 fois) et une diminution modeste de la capacité de réplication (2 fois) par rapport au virus de type sauvage. Nous avons également examiné les profils de résistance à ETR et RPV dans les virus contenant des mutations de résistance aux INNTI au début de la sélection. Dans le cas du virus de type sauvage et du virus contenant la mutation unique K103N, les premières mutations à apparaître en présence d’ETR ou de RPV ont été E138K ou E138G suivies d’autres mutations de résistance aux INNTI. À l’inverse, dans les mêmes conditions, le virus avec la mutation Y181C a évolué pour produire les mutations V179I/F ou A62V/A, mais pas E138K/G. L'ajout de mutations à la position 138 en présence de Y181C n'augmente pas les niveaux de résistance à ETR ou RPV. Nous avons également observé que la combinaison de Y181C et E138K peut conduire à un virus moins adapté par rapport au virus contenant uniquement Y181C. Sur la base de ces résultats, nous suggérons que les mutations Y181C et E138K peuvent être antagonistes. L’analyse de la résistance au PL-100 des virus de sous-type C et CRF01_AE dans les cellules en culture est décrite dans le chapitre 4. Le PL-100 sélectionne pour des mutations de résistance utilisant deux voies distinctes, l'une avec les mutations V82A et L90M et l'autre avec T80I, suivi de l’addition des mutations M46I/L, I54M, K55R, L76F, P81S et I85V. Une accumulation d'au moins trois mutations dans le rabat protéique et dans le site actif est requise dans chaque cas pour qu’un haut niveau de résistance soit atteint, ce qui démontre que le PL-100 dispose d'une barrière génétique élevée contre le développement de la résistance. Dans le chapitre 5, nous avons évalué le potentiel du PL-100 en tant qu’inhibiteur de protéase de deuxième génération. Les virus résistants au PL-100 émergent en 8-48 semaines alors qu’aucune mutation n’apparaît avec le darunavir (DRV) sur une période de 40 semaines. La modélisation moléculaire montre que la haute barrière génétique du DRV est due à de multiples interactions avec la protéase dont des liaison hydrogènes entre les groupes di-tétrahydrofuranne (THF) et les atomes d'oxygène des acides aminés A28, D29 et D30, tandis que la liaison de PL-100 est principalement basée sur des interactions polaires et hydrophobes délocalisées à travers ses groupes diphényle. Nos données suggèrent que les contacts de liaison hydrogène et le groupe di-THF dans le DRV, ainsi que le caractère hydrophobe du PL-100, contribuent à la liaison à la protéase ainsi qu’à la haute barrière génétique contre la résistance et que la refonte de la structure de PL-100 pour inclure un groupe di-THF pourrait améliorer l’activité antivirale et le profil de résistance.

Antigen and superantigen presentation as defined by the MHCII-accessory proteins and associated-peptides

MHCII molecules expose a weave of antigens, which send survival or activation signals to T lymphocytes. The ongoing process of peptide binding to the MHC class II groove implicates three accessory molecules: the invariant chain, DM and DO. The invariant chain folds and directs the MHCII molecules to the endosomal pathway. Then, DM exchanges the CLIP peptide, which is a remnant of the degraded invariant chain, for peptides of better affinity. Expressed in highly specialized antigen presenting cells, DO competes with MHCII molecules for DM binding and favors the presentation of receptor-internalized antigens. Altogether, these molecules exhibit potential immunomodulatory properties that can be exploited to increase the potency of peptide vaccines. DO requires DM for maturation and to exit the ER. Interestingly, it is possible to monitor this interaction through a conformation change on DOβ that is recognized by the Mags.DO5 monoclonal antibody. Using Mags.DO5, we showed that DM stabilizes the interactions between the DO α1 and β1 chains and that DM influences DO folding in the ER. Thus, the Mags.DO5+ conformation correlates with DO egress from the ER. To further evaluate this conformation change, directed evolution was applied to DO. Of the 41 unique mutants obtained, 25% were localized at the DM-DO binding interface and 12% are at the solvent-exposed β1 domain, which is thought to be the Mags.DO5 epitope. In addition, I used the library to test the ability of HLA-DO to inhibit HLA-DM and sorted for the amount of CLIP. Interestingly, most of the mutants showed a decrease inhibitory effect, supporting the notion that the intrinsic instability of DO is a required for its function. Finally, these results support the model in which DO competes against classical MHCII molecules by sequestering DM chaperone’s function. MHCII molecules are also characterized by their ability to present superantigens, a group of bacterial or viral toxins that coerces MHCII-TCR binding in a less promiscuous fashion than what is observed in a canonical setting. While the mechanism of how bacterial superantigens form trimeric complexes with TCR and MHCII is well understood, the mouse mammary tumor virus superantigens (vSAG) are poorly defined. In the absence of a crystal structure, I chose a functional approach to examine the relation between vSAG, MHCII and TCR with the goal of uncovering the overall trimolecular architecture. I showed that TCR concomitantly binds both the MHCII α chain and the vSAG and that TCR-MHCII docking is almost canonical when coerced by vSAGs. Because many peptides may be tolerated in the MHCII groove, the pressure exerted by vSAG seems to tweak conventional TCR-MHCII interactions. Furthermore, my results demonstrate that vSAG binding to MHCII molecules is conformation-dependent and abrogated by the CLIP amino-terminal residues extending outside the peptide-binding groove. In addition, they also suggest that vSAGs cross-link adjacent MHCIIs and activate T cells via a TGXY motif.

Ansiedad, depresión y calidad de vida en personas adultas con VIH/SIDA y deterioro cognitivo leve

El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) y el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) han tenido a lo largo de los años un comportamiento epidemiológico que muestra la tendencia al aumento, de tal forma que ha llegado a considerarse como un problema de salud pública a nivel mundial. Sin embargo los tratamientos antiretrovirales han permitido que las personas con esta infección tengan una tasa de supervivencia mayor; pero ligado a esto, se han presentado efectos secundarios tales como problemas con la memoria y el funcionamiento cognitivo de estas personas. Además se ha encontrado que las personas con VIH/SIDA tienen algunas alteraciones en su área afectiva y generalmente ven afectada su calidad de vida. Este es un estudio exploratorio descriptivo que tuvo por objeto describir la ansiedad, depresión y percepción de calidad de vida en 35 pacientes con VIH/SIDA con deterioro cognitivo leve, seleccionados por conveniencia. Se aplicaron tres cuestionarios, el BDI-II para evaluar la sintomatología depresiva; el BAI para evaluar la sintomatología ansiosa y el MOS-SF30 para evaluar la calidad de vida. Además, se realizó una entrevista semiestructurada para profundizar en la evaluación de estas tres variables. Dentro de los resultados se evidenció que todos los paciente presentan algún nivel de ansiedad y de depresión, evalúan su calidad de vida en un punto medio; ni óptima ni baja. Se discuten estos y otros resultados.

Perfil neuropsicológico de personas adultas con VIH/SIDA

Los déficit neurológicos en el virus de inmunodeficiencia humana VIH, específicamente las alteraciones en el funcionamiento cognitivo, han estado presentes desde el inicio de su propagación y han sido una de las principales manifestaciones a lo largo de todas las etapas del virus. No obstante, gracias a los avances de la terapia antirretroviral se ha dado un aumento de la expectativa de vida de los pacientes, dándose de la misma manera un incremento en los déficits anteriormente mencionados. El objetivo del presente estudio es describir el perfil neuropsicológico de los pacientes con VIH y establecer si existen relaciones entre las funciones que se encuentren deterioradas, el tiempo de diagnóstico y la terapia antiretroviral. Para esto se llevo a cabo un estudio descriptivo de tipo exploratorio con el fin de medir las características de las funciones neuropsicológicas en un grupo de 24 pacientes pertenecientes al programa especial B24 del Hospital Universitario Mayor y Hospital de Barrios Unidos MÉDERI en Bogotá, Colombia. Para esto, se utilizó un protocolo de pruebas neuropsicológicas: Mini Mental StateExamination (MMSE), WAIS-III (sub-pruebas dígitos, letras y números, aritmética y semejanzas), Curva de aprendizaje auditivo verbal de Rey (RAVLT), WMS-III (sub-pruebas de recobro de historias y Localización), TMT A y B, Set Test de Isaacs, Figura Compleja de Rey y Test de Stroop. Dentro de los resultados se encontró que la medida de edad fue de 50 con un total de 19 hombres y 5 mujeres. Las funciones con mayor predominio de deterioro fueron la atención sostenida y alternante, la memoria declarativa, las funciones ejecutivas (específicamente en el control inhibitorio) y la velocidad de procesamiento, los pacientes presentan un rango de deterioro cognitivo leve (GDS 3). Se concluyó que el perfil de deterioro es mixto y que es necesario ampliar la muestra para obtener resultados más precisos en cuanto a las diferencias de acuerdo al tiempo de diagnóstico y la terapia antiretroviral.