生长素水平以及光敏色素基因表达与水稻生殖生长的关系

第一部分 光敏核不育水稻农垦58S花药IAA的免疫组织化学分析 光周期敏感核不育水稻农垦58S是研究光周期调节花发育作用机理的好材料。在此方面已取得很大进展。有关植物激素的研究已发现长日照诱导农垦58S不育的信号传导环节之一是IAA的亏缺。本文首次应用免疫组织化学分析方法对长日和短日处理后的农垦58S和对照农垦58花药中的IAA进行了定位研究和相对水平的比较。结果表明此方法可反映游离态IAA在花药中的分布及其相对水平的变化。从雌雄蕊原基形成期至单核晚期的五个时期中，经长日照处理的农垦58S花药中的IAA水平都低于短日照处理的农垦58S及在不同光周期处理下的家垦58花药。对花药中生长素的亏缺与育性的关系以及IAA亏缺的原因也进行了讨论。 第二部分 不同水稻品种成花诱导阶段光周期敏感性及光敏色素mRNA丰度的比较 对光敏核不育水稻十多年的研究表明，光敏色素是感受光周期信号调节水稻成花诱导和育性转换的主要光受体。同时还发现光敏核不育基因导入不同遗传背景后，其基因表达条件，如临界光长、光敏温度范围、光温互补作用强弱等都表现明显差异。为了进一步探讨水稻光周期反应的作用机理，了解不同品种遗传背景对光周期信号感受的特点，我们选取籼稻、粳稻、早熟、晚熟共11个品种，比较光照阶段在长同、短同条件下叶片光敏色素B mRNA含量的差异。初步结果表明，光敏色素B的转录不受光调控，在长日、短日处理条件下没有明显差别。在多数品种间光敏色素B表达没有明显差异，说明其与品种感光性、籼粳性无明显相关。只有早熟粳稻铁粳23的光敏色素B mRNA含量较高，是一个例外。实验结果尚需进一步重复。这方面的工作可以为水稻发育光温互作本质的研究积累一些初步资料。

水稻I型酪蛋白激酶的分离及生理功能研究

（第二部分的摘要） 酪蛋白激酶在许多物种的细胞分裂及分化过程中都有重要作用。在水稻中，以经过油菜素内酯处理的水稻幼苗为材料，通过cDNA微矩阵的方法得到了一个全长1939bp的基因OsCKI1（Accession number AJ487966）。该基因编码的蛋白产物属I型酪蛋白激酶（CKIs），含463个氨基酸。RT-PCR及Northern blot结果显示，基因OsCKI1在水稻各组织中表现为组成型表达，并且其表达受油菜素内酯（BR）及脱落酸（ABA）的诱导。在大肠杆菌中对该基因进行原核表达，并用表达后的蛋白粗提物进行酶活测定，显示该蛋白产物可磷酸化CKIs的特异性底物酪蛋白。通过构建OsCKI1的反义载体并转化水稻，对该基因的生理功能进行了研究。对转基因植株的纯系表型进行了观察，显示其根部发育异常，表现为具有较短的初生根、侧根及不定根数目少于对照。进一步研究显示初生根的变短是由于细胞延伸受抑制引起的。以CKI的特异性抑制剂，CKI-7处理野生型植株，也对OsCKI1缺失引起的表型进行了确认。值得注意的是，以外源生长素（IAA）处理转基因及经CKI-7处理过的野生型植株，都能恢复根部表型，使其生长正常。对反义植株初生根及次生根的游离生长素含量测定结果显示，OsCKI1可能在IAA的代谢途径中发挥作用。转基因植株的种子在萌发时对ABA及BR的处理都表现为不敏感，暗示该基因可能在各种激素信号转导途径中都有作用。OsCKI1-GFP双元表达载体的亚细胞定位的研究显示该基因主要定位于核中，可能参与了基因表达的调节。同时，以该反义转基因植株为材料，通过cDNA芯片的技术研究了受OsCKI1调节的基因的表达谱，结果显示该基因的缺失的确影响了参与信号转导及激素代谢途径的许多基因的表达。 （第四部分的摘要） 以OsCKI1反义转基因植株对照植株为材料，研究它们处于4℃低温胁迫下的反应情况。植株种子在室温下萌发并生长一段时间后，移入4℃低温下进一步生长。取对照及低温处理后的材料，对其表型进行观察，显示低温下转基因植株初生根生长受抑制程度小于对照，其生长的延缓程度低;相对电导率测定结果显示，经低温处理后，转基因植株相对电导率变化较小，质膜受害程度小;微管观察结果也显示在短期低温处理下对照根部延伸区细胞的皮层微管解聚，而转基因植株其根部延伸区细胞的皮层微管仍能保持正常状态。基因OsCKI1在低温下的表达模式表现为先升高之后又降低，推测其在低温信号的转导途径中发挥作用。通过总结以上结果，我们认为基因OsCKI1的反义转基因植株虽然在短期冷害下具有一定的抗冷能力，但其不具备形成长期稳定的冷适应的能力。

I.小麦非叶器官碳酸酐酶活性与定位分析II.镉毒害导致芦苇胚性细胞死亡的激素调控研究

第一部分： 通过生理测定和化学染色分析了冬小麦品种小堰54和京411的叶片和非叶片组织的碳酸酐 酶活性。叶片碳酸酐酶活性(CA)在挑旗时期达到最大值，之后减少到最小，而在饱粒期又呈 增加趋势。从灌浆期到饱粒期，颖片和内稃的CA活性均减少，而外稃和种皮的CA活性均增加。在饱粒期，小堰54的叶片、颖片、外稃和种皮CA活性均高于京411。组织化学染色表明，CA主要分布在旗叶的叶肉细胞叶绿体中，也分布在非叶片组织颖片、外稃和内稃的叶肉和维管束鞘细胞的胞质中。这些结果表明，小麦非叶组织叶肉和维管束鞘细胞的胞质中的CA可能对饱粒期冬小麦的C4光合途径起作用。饱粒期小堰54的C02传递到Rubisco酶速率和抗旱性较京411高。 第二部分： 以继代培养的芦苇胚性细胞为材料，利用台盼兰拒染法检测了悬浮细胞死亡过程，并利用石蜡切片法及苏木精染色法观察了不同浓度镉对芦苇细胞的毒害作用。1000μM的CdCl2迅速导致芦苇悬浮细胞死亡，200μM的CdClz在接种后第5天引起悬浮细胞死亡，100μM的CdCl2在接种后第7天引起悬浮细胞死亡，≤50μM的CdClz在接种后7天不引起悬浮细胞死亡。同时对不同浓度镉处理的芦苇胚性细胞的内源植物激素和可溶性蛋白质进行分析，≤50μM的镉浓度显著地降低胚性细胞内IAA、ZR、GA3和GA4的含量，却提高ABA的含量，抑制可溶性蛋白质的合成：≥100μM的镉浓度显著地提高IAA、ZR、GA3和GA4的含量，却降低ABA的含量，促进可溶性蛋白质的合成。这些结果表明，镉的毒害至少包括镉浓度决定的两种细胞死亡机制，高浓度的镉(1000μM)引起的细胞死亡应当为坏死，而100μM的镉引起植物悬浮细胞发生程序性死亡。在较高浓度(≥100μM)的镉处理下，芦苇细胞内内源IAA、ZR、GA3和GA4的浓度较高，可能调控可溶性蛋白质的合成而促进细胞发生程序化死亡。

水稻小G蛋白Arf GTPase激活蛋白OsAGAP功能研究

　　锌指蛋白在植物生长发育中具有重要功能，它们可以识别并结合特定的DNA序列进行转录调控，还能够参与蛋白之间相互作用的调节。我们根据锌指蛋白等转录因子特征结构域的序列特点，从来自10 K水稻芯片的EST数据库中筛选出编码58个EST序列。通过对器官表达特异性的比较分析，从中选出七个只在单一器官表达的基因，并对这七个基因的功能进行研究。对其转基因水稻的表型分析发现，C1基因调节水稻的株高和穗的发育;LIM 家族的F9影响小花的形态，主要体现在雌蕊与雄蕊的发育;锌指蛋白S34调控叶倾角的变化;F14基因编码一个核定位的TFIIIA类锌指蛋白，具体功能尚不清楚;锌指蛋白F35转基因水稻主根缩短，侧根数目显著减少。它编码一个推测的ArfGAP (Arf GTPase activating protein)，据此我们将其命名为OsAGAP，并对其进行深入研究。 　　OsAGAP的cDNA全长为1328bp，编码的蛋白由320个氨基酸组成，含有两个保守结构域：锌指结构域和C2 结构域。其中锌指结构域属于CX2CX16CX2C类，即ArfGAP domain的特征结构。GTP酶活性测定试验表明，OsAGAP蛋白能够激活水稻Arf的GTP酶活性，另外，OsAGAP还能够恢复酵母ArfGAP缺失突变体的表型。说明OsAGAP编码的蛋白是水稻中的一个ArfGAP。 　　OsAGAP在水稻各器官中均有表达，但强弱有所不同。RNA原位杂交结果显示，它在茎尖分生组织与侧生原基及侧根部位表达强烈;它在根尖主要分布于中央维管组织、分生区、皮层细胞，最有趣的是恰好与生长素在根尖极性运输路径相吻合。在亚细胞水平，OsAGAP广泛分布于细胞膜、细胞质、细胞核。 　　OsAGAP超表达水稻主根、不定根长度缩短，侧根数目显著减少表现出类似于生长素极性运输突变体的表型。其主根伸长对TIBA的抑制作用不敏感，这暗示OsAGAP超表达水稻的生长素极性运输被破坏;另外，其对各种生长素的作用敏感性也发生变化，对IAA、2,4-D的不敏感，而对NAA的反应与野生型一致，根据各类生长素进出细胞机制不同，可以推测超表达水稻的输入能力存在缺陷。极性运输实验结果表明，超表达水稻极性运输能力被破坏;对生长素输入能力的测定进一步表明，超表达水稻根载体的介导的生长素输入能力显著下降。另外，NAA处理能够恢复超表达水稻中侧根发育受抑的表型缺陷。由此可见，OsAGAP在水稻中超表达破坏了生长素极性运输的输入能力。 　　FM1-43是一类特异标记囊泡运输的荧光染料。经其染色标记后，OsAGAP超表达水稻细胞内囊泡成片聚集，形成“BFA区间”，表现出囊泡运输被破坏的典型特征。透射电镜观察发现，超表达水稻细胞内有大量的小液泡，其中积累了电子密度很高的颗粒物质。由此推测，可能由于细胞的囊泡运输被破坏，导致胞内的代谢物质不能被正常运送或分泌，而在液泡中暂时贮存以维持细胞环境的稳定。 　　在酵母和动物细胞中的研究表明， ArfGAP是调控囊泡运输的一个重要因子，然而目前还没有关于ArfGAP在植物细胞中生理作用的报道。我们的结果说明，OsAGAP作为的一个ArfGAP，它通过调控水稻中的囊泡运输，而影响了生长素的极性运输，具体表现在对生长素输入能力的调控。由此，我们推测ArfGAP可能在生长素的极性运输中也起着重要的调控作用。 　　但OsAGAP在拟南芥中却通过调控植株生长素的水平，而影响了转基因拟南芥根的发育。每种生物都有多个ArfGAP，它们之间的分工存在联系，但各不相同。OsAGAP是拟南芥的外源基因，它在拟南芥中可能以不同于水稻的机制起作用。

一种小G蛋白TaRAN1在植物细胞周期和发育过程中的功能研究

　　小G蛋白作为信号转导中重要的分子开关， 进化相当保守，与许多不同的调控因子和效应器分子相互作用，产生细胞功能的多样性。近年来，人们不断发现植物中小G蛋白家族的新成员，也不断揭示小G蛋白的新功能，许多植物特有的信号途径和功能需要小G蛋白这个重要的分子开关来完成，使它越来越成为人们研究的热点问题。但是，有关植物中Ran GTPase及其编码基因的研究工作报道很少，对与之相互作用的调控蛋白研究进展也刚刚开始。 　　TaRAN1 (AF488730) 是小麦来源的Ran同源蛋白编码基因，全长1055 bp, 编码221个氨基酸，它在植物发育过程中的功能还没有任何报道。本论文在验证了它是小G蛋白Ran家族的成员后，从分子水平上还发现它在植物细胞周期调控、对生长素以及胁迫应答信号转导过程中都起着重要作用，这也说明了它可能作为信号转导过程中重要的转换因子，参与了很多细胞的基本生理过程。 　　利用原核表达系统及亲和色谱的方法纯化了TaRAN1融合蛋白，并用放射性标记的GTP和竞争实验证实了它具有特异的GTP结合活性。TaRAN1的转录产物在小麦幼茎和花芽等分生组织活动旺盛的器官表达较多，而在老叶中表达较少。利用洋葱表皮瞬时表达系统分析表现，TaRAN1蛋白主要定位于细胞核，但其没有典型的核定位信号。 　　细胞周期一直是生物学领域中的热门问题，人们虽然在动物细胞中取得了很大进展，但在植物细胞中的研究远落后于动物。裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）是研究细胞形态和细胞周期的良好系统，利用此系统发现超表达TaRAN1的酵母细胞表现出许多新的细胞学表型，例如G2细胞周期延滞、染色体对紫外线敏感、细胞超长或多隔细胞的出现等;反义表达TaRAN1的酵母细胞呈近圆型、具有高度凝集的核并且生长速度缓慢、核质混合和无核细胞的数目明显增加。流式细胞仪检测实验也证实其细胞周期的异常。这些结果推测TaRAN1蛋白可能参与细胞周期的有丝分裂过程和发育的调控机制，并且在维持染色体结构稳定和完整性方面起着重要的作用。通过免疫荧光实验观察表明，超表达转基因酵母的微管多呈异常的狭小扇形结构，反义表达TaRAN1的酵母微管不能形成丝状结构，推测TaRAN1还可能参与微管（包括纺锤体）的结构形成过程。最后，我们用超表达TaRAN1的转基因拟南芥和水稻也证实了它的功能，其生长点表现出分生组织增多的原基、根生长点的有丝分裂指数有所改变、出现异常的细胞分裂时相等有关细胞周期异常的现象，更进一步说明了TaRAN1确实参与着细胞周期的调控过程，推测其与细胞周期从G2期进入M期的过程有关。 　　TaRAN1基因受IAA的诱导表达，且随着浓度的增加表达量增强。超表达的TaRAN1植株（包括拟南芥和水稻）的根表现出对外源生长素异常敏感，侧根显著变少，地上部分表现出生长素过量的表现型，顶端优势减弱，分蘖增多，生长周期延长等。HPLC测定转基因植物的IAA含量，明显高于对照。所以，TaRAN1可能还参与了复杂的生长素信号转导过程。TaRAN1基因还受各种胁迫处理的诱导表达，并且超表达植株对胁迫的忍受能力有明显提高，这说明TaRAN1还参与了胁迫信号应答的相应机制。Ran蛋白这些新功能目前还未见到其它报道。

药蒲公英(Taraxacum officinale Weber)体外再生体系的建立、耐盐愈伤组织筛选和抗盐基因转化

药蒲公英(Taraxacum officinale Weber)是菊科蒲公英属的模式种，主要分布于欧洲和北美，在我国新疆也有少量分布。与Taraxacum mongolicum Hand-Mazz(我国中药市场的主流种和主要自然分布种)相比，药蒲公英的生物量更大，作为营养保健蔬菜具有更大的市场价值。药蒲公英的组织培养工作是开展基础研究的有力工具，本工作中，药蒲公英叶片外植体在含0.2mg/L IAA和1.0mg/L TDZ的MS培养基中培养2周后便产生大量的丛生芽，在含有0.5mg/L 2,4-D和2mg/L6-BA的MS培养基中培养30天后，形成明显的愈伤组织，愈伤组织块在含1.0mg/L 6-BA的MS培养基中成功再生。 体细胞无性系变异是植物愈伤组织培养中的普遍现象，我们将继代6次的愈伤组织接种于含盐培养基，得到了能够耐受1.0%NaCl的细胞系。耐盐细胞系在含盐培养基中的相对生长率和细胞活力明显高于对照（非耐盐细胞系接种于含盐培养基），由耐盐细胞系在含盐培养基中获得再生植株的工作正在进行。 直接不定芽再生途径对遗传物质具有高度保真性，是遗传转化的理想体系。我们利用此再生系统，将来源于耐盐植物山菠菜(Atriplex hortensis L.)BADH基因通过农杆菌介导的叶盘转化法导入药蒲公英，获得了PCR检测成阳性的转基因植株5株，从而建立了药蒲公英的转化体系。转基因植株的其他分子检测和耐盐性鉴定工作正在进行。

大车前（Plantago major L. "Giant Turkish."）体外优化再生体系的建立及Na+/H+逆向转运蛋白基因SeNHX1 和TtNHX1 的功能鉴定

大车前（Plantago major L. "Giant Turkish."）不仅有很高的药用价值，在生态学研究方面也是重要模式植物。大车前的组织培养工作，目前报道很少。对其组织培养体系的建立，为筛选大车前耐盐突变体和基因转化建立高效的体外再生系统和实验平台体系。通过愈伤组织诱导和直接不定芽再生途径， 建立了大车前（Plantago major L. "Giant Turkish."）的快速高效再生系统。叶片外植体在含有1.0 mg/L NAA的MS培养基中培养3周后，形成愈伤组织，愈伤组织在含4.0 mg/L 6-BA的MS培养基中成功再生，得到完整植株。种子外植体在含0.2 mg/L IAA和1.0 mg/L TDZ的MS培养基中培养4周后产生大量的丛生芽，对9株再生植株进行RAPD检测表明，部分植株在DNA水平上发生了变异。 植物抵御盐胁迫的一个重要机制是在液泡中积累Na+，从而使细胞质内Na+保持在较低水平，并且降低细胞渗透势。Na+运输到液泡是由液泡Na+/H+逆向转运蛋白完成的。本实验室已从盐生植物盐角草（Salicornia europaea）和番杏（Tetragonia tetragonioides）中分别克隆得到SeNHX1和TtNHX1基因。本文研究了SeNHX1和TtNHX1基因在酵母突变体里的作用。TtNHX1和SeNHX1蛋白在缺陷型酵母菌株里的表达能够提高这些菌株对NaCl、LiCl和潮霉素的抗性，提高到与野生型相当的抗性水平。说明TtNHX1和SeNHX1有着与酵母ScNHX1相似的细胞定位和作用机制，是ScNHX1的功能类似蛋白。

拟南芥有性生殖模式和叶片特性对大气CO2浓度变化的响应

预计到本世纪末，大气CO2浓度将会增加到540～970ppm，大气CO2浓度升高所引起的全球气候变化已经受到广泛的关注。植物生长依赖CO2，并且对大气CO2浓度升高在结构和生理上产生响应。目前已有大量报道，从生态系统、群落、种群、个体、器官、组织、生理以及生化等水平上研究高浓度CO2所对植物产生的影响。但是有关高浓度CO2对植物有性生殖影响的报道却很少，同时多数实验均建立在短期的生殖响应，忽视了植物在长期高CO2浓度下具有的反馈作用和CO2浓度变化对植物的驯化作用。植物有性生殖与其生态适应性和农作物籽粒产量的关系极为密切;同时，植物有性生殖特性的变化，也可作为预测植物对全球气候变化响应的重要指标之一。为此，利用高浓度CO2对植物进行长期选择实验将很有必要。研究结果将为预测未来大气CO2浓度增加的条件下陆地生态系统的演变趋势、全球变化对植物有性生殖响应的方式和机制提供新的思路和有效方法。 　　在本研究中，我们以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)作为实验材料，利用370和700ppm CO2对其进行连续8个世代处理，首先研究高浓度CO2对每一个世代的拟南芥有性生殖特性的影响，然后比较各个世代中各种生殖特性指标变化的规律，从细胞、组织和个体尺度上揭示拟南芥有性生殖对全球变化的响应模式。此外，在700ppm CO2处理下，我们对拟南芥叶片生理、生化以及结构的变化进行了相关研究。两部分研究结果及主要结论如下： 　　首先，在每一个世代中，与370ppm CO2相比较，700ppm CO2处理显著促进了拟南芥开花，缩短生长周期，增加花、角果及种子等生殖的产量，降低种子N含量，提高种子C/N比、种子千粒重以及生殖生物量所占总生物量的比例等，而对种子萌发率、角果所含种子数目以及角果长度则无显著影响。但是， 通过对相同CO2浓度处理条件下，不同世代之间的研究结果比较发现，不同世代之间相关的生殖生物学指标并无显著差异。 　　其次，高浓度CO2显著降低叶片气孔密度、气孔指数、气孔导度以及蒸腾速率。在高浓度CO2处理下，叶肉细胞中叶绿体数目、叶绿体宽度和表观面积、淀粉粒大小和数量、叶片和细胞壁厚度等都显著增加，但是基粒内囊体膜的数量却显著下降。叶片中碳水化合物如可溶性总糖、淀粉以及纤维素含量在高浓度CO2下分别显著增加71.9%、78.7% 和 22.3%。此外，在高浓度CO2处理下，叶片中多数激素如如吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)、赤霉素(gibberellin, GA)、玉米素核苷(zeatin riboside, ZR)、二氢玉米素核苷(dihydrozeatin riboside, DHZR)和异戊烯基腺苷(isopentenyl adenosine, iPA)均都显著地增加，而脱落酸(abscisic acid, ABA)含量却有所下降。最后，叶片中各种矿物质元素含量如N、P、K、Ca和Mg等含量在高浓度CO2处理下也都显著下降，而C/N比增加24.8％。 　　以上结果表明： 　　(1) 在每一个世代中，700ppm CO2处理对拟南芥各种有性生殖特性具有显著的影响，但是高浓度CO2处理对植物所引起的效应在多个世代以内并不能够传递给后代，所以在多个有性生殖世代内，高浓度CO2处理对植物生长、生殖没有驯化作用。 　　(2) 在高浓度CO2处理下，拟南芥叶片中叶绿体超微结构的变化，可能主要是由于叶绿体中淀粉粒数量和体积大小显著增加而引起。 　　(3) 在高浓度CO2处理下，由于拟南芥叶片内与促进细胞分裂与伸长的激素含量显著增加，从而对拟南芥植株生长发育速率的提高起了重要的作用。 　　(4) 拟南芥生长在高浓度CO2条件下，其叶片中各种矿质元素含量（如N、P、K、Ca和Mg）均显著降低，究其原因可能是，第一由于叶片中碳水化合物含量的显著增加而对矿物质元素具有稀释作用;第二由于蒸腾速率下降，引起矿质元素从根部随着蒸腾流运输到地上部分的含量相应减少。 　　

小麦TaRanBP基因功能的初步分析

小G蛋白（small GTPases）是真核生物中广泛存在的一类调节各种生命活动的信号分子。根据结构与功能的不同，小G蛋白家族成员可分成五个亚家族，分别为Ras，Rab，Rho，Arf和Ran。五类小G蛋白通过其活化态（GTP结合态）和非活化态（GDP结合态）的相互转换行使着各种功能。Ras GTPases在酵母和哺乳动物中调节细胞增殖过程; Rho GTPases调控肌动蛋白重组过程，并参与MAP 激酶的细胞信号转导过程等; Rab GTPases和Arf GTPases分别在膜转运过程中起着不同的重要作用;而Ran GTPases则在核孔位置调节着蛋白和RNA分子的运输过程。 小G蛋白附属蛋白调节着小G蛋白活化态与非活化态之间的转换，其中鸟核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors, GEFs)可以催化小G蛋白转换为GTP结合形式，即活化态;而GTPase 激活蛋白(GTPase-activating proteins, GAPs)和小G蛋白结合蛋白(small GTPases binding proteins)可以激活小G蛋白自身的水解活性，从而将其转变成非活化态形式。 相比其它小G蛋白，Ran GTPases及其附属蛋白在真核生物中的研究相对较少。已有的成果表明它们主要在核质运输过程中及对相应的信号转导途径起调节作用。而针对Ran GTPases及其附属蛋白在真核生物尤其是高等植物个体发育过程中的作用，目前报道还很少。 为了揭示Ran结合蛋白(Ran binding protein, RanBP)在植物发育过程中的作用，本文通过转基因手段对其功能进行 了研究。在此之前，本实验室已从小麦cDNA文库中成功克隆Ran结合蛋白基因：TaRanBP。该基因cDNA全长1035 bp，编码207个氨基酸。通过农杆菌介导叶圆片法，分别用正义、反义及TaRanBP与GFP融合蛋白等表达载体转化烟草，并成功获得转基因植株。亚细胞定位观察发现TaRanBP蛋白主要定位于细胞质内，尤其是在核膜附近富集。生理学和细胞学等方面的研究分析发现，TaRanBP基因在烟草个体发育过程中产生重要作用。过量表达TaRanBP基因的转基因植株在一定数量上表现出愈合的花冠筒上出现不同程度开裂，花冠筒上有附生舌状花瓣，及带有花瓣状颜 色的花萼等异常花表型。同时，转反义基因在一定程度上促进了转基因植株初生主根的生长（为对照烟草的2.3倍），而转正义基因烟草与对照烟草的初生主根长度差异不明显。用碘化丙锭(Propidium Iodide, PI)进行根部细胞染色。观察发现，不同的转基因烟草与对照烟草之间在根的各个不同形态区域的细胞大小差异不明显，推测根长的差异可能是由于整体细胞数目变化的原因导致。向重力性实验发现，转反义基因烟草幼苗较对照烟草的向重力性反应增加，而转正义基因的则表现为降低。激素吲哚乙酸(Indoleacetic Acid, IAA)的添加处理可以恢复转反义基因烟草的向重力性异常表型，而对转正义基因烟草几乎无影响。添加激动素(Kinetin, KT)的处理发现不同转基因烟草和对照烟草的向重力性均有减弱。观测后期，转正义基因的向重力敏感性较对照烟草得到恢复。测量不同转基因株系T1代幼苗鲜重，发现不同转基因烟草和对照烟草的幼苗鲜重动态变化在各个时间点有差异，且差异情况不尽相同。而不同转基因幼苗T1代幼苗可溶性蛋白含量较对照烟草有不同程度的下降。这种下降并没有影响转基因烟草的整体生长进程，开花期和结实情况与对照烟草相比也无明显变化。

Integrated aquaculture-agriculture adoption and impact in rainfed farming systems in Sakata, Malawi

ICLARM introduced integrated aquaculture-agriculture (IAA) in Sakata, Malawi three years ago. Since that time, and without extension support, the number of farmers with ponds increased from 4 in 1993/94 to 12 in 1995/96. To learn why and how IAA is spreading, a study of impact and adoption was conducted in the 1995/96 production season. Interviews were conducted with farmers to discuss lAA and collect data on farm function through the use of bioresource flow diagrams. Motivations given by farmers as to why they adopted IAA were to improve household nutrition and income. Constraints to adoption identified by farmers were availability of labor and capital to purchase inputs

水稻G蛋白偶联受体OSGPCR1功能的研究

水稻是世界上最重要的粮食作物，也是单子叶植物的模式植物，它为全球近一半的人口提供食物，但是低温、高盐、干旱等非生物胁迫，每年都会在全世界范围内造成水稻大面积减产。G蛋白介导的信号途径是传递胞外信号比较保守的作用机制之一。动物细胞对于G蛋白及其受体(GPCRs)的研究已经取得了很大的进展。而植物细胞中对它们的研究刚刚起步。本文从越冬稻低温响应芯片上筛选到一个膜蛋白，它编码一个推测的G蛋白偶联受体(G protein-coupledreceptor, GPCR)，据此我们将其命名为OsGPCR1，并对其进行深入研究。 OsGPCR1的cDNA全长为1407bp，编码468个氨基酸，在蛋白水平上的同源性比较结果显示，该基因与动物中研究的比较多的异源三聚体G蛋白偶联受体(G Protein- Coupled Receptor)同源性达到44%。经过跨膜结构域预测表明OsGPCR1具有9TMs结构，以GFP为标签的亚细胞定位表明OsGPCR1定位在膜上。GTP酶活性测定试验表明，OsGPCR1蛋白能够激活水稻RGA的GTP酶活性，此外，以泛素裂解体系为基础的酵母双杂交实验表明，OsGPCR1能够与RGA相互作用。说明OsGPCR1编码的蛋白是水稻中的一个G蛋白偶联受体。 OsGPCR1的表达受低温、干旱、高盐的诱导，但不受ABA，GA，ACC，IAA的诱导。在『F常生长条件下，OsGPCR1在水稻各器官中均有表达，但强弱有所不同。 在拟南芥和水稻中超表达OsGPCR1都能显著增强转基因植物对干旱、高盐、低温的耐受性。而在水稻中抑制OsGPCR1的表达，转基因水稻呈现出干旱、高盐、低温的敏感性。对转基因拟南芥下游基因的分析表明，超表达OsGPCR1能够在非胁迫条件下激活CBF途径中相关基因的表达。结合OsGPCR1不受ABA诱导的表达模式，我们推测OsGPCR1可能是通过不依赖于ABA这条途径而传递信号的。借助超表达和转反义水稻材料，利用水稻全基因组芯片研究OsGPCR1靶基因的结果表明，不论OsGPCR1基因表达量的降低或上升，都导致大约30%的与转运相关的基因的表达量发生改变。这暗示OsGPCR1可能通过囊泡运输传递胞外信号。此外FM4-64对超表达和转反义水稻幼根细胞染色标记后，OsGPCR1反义抑制水稻细胞内囊泡在细胞两端呈聚集状，即形成“BFA区间”，而超表达OsGPCRI水稻细胞内囊泡呈密集状。这些结果都表明OsGPCR1可能通过调控囊泡运输而将胞外胁迫信号传递进胞内。

显花植物器官形成激素调控的分子机理研究

本论文以显花植物水稻和拟南芥为对象，研究植物器官形成激素调控的分子机理。发现拟南芥干细胞决定基因WUS和ABA信号关键调节因子ABI3间存在相互调节关系，它们对质体和根毛发育等具有调控作用；运用细胞学手段对OsAGAP和OsRMC调控根发育的机理进行了研究。这些结果为了解ABA、生长素和JA等激素对分生组织或根等器官的形成的调控机理提供了新资料。 拟南芥WUS基因是一个重要的干细胞决定基因。在茎尖分生组织和花分生组织的动态平衡调节中各存在一个反馈调节环：WUS促进CLV3的表达，而CLV3 反馈抑制WUS表达，它们共同决定干细胞的数目；在WUS+LFY 和AG之间也存在一个类似的反馈环，负责花器官的正常启动和终止。本工作发现在外源ABA 存在下，拟南芥WUS功能获得突变体sef (stem ectopic flowers)子叶黄化过程受到抑制，即sef突变体对ABA 的敏感性降低，而且在sef突变体中ABI3转录水平下调，说明WUS 抑制ABI3的表达。另一方面，在abi3突变体中WUS转录水平下降，启动子分析发现WUS是ABI3所在的B3结构域家族基因的靶基因，酵母单杂交实验表明B3家族蛋白FUS3可以与WUS调控区结合；外源ABA 处理pWUS::GUS植株发现ABA可使WUS异位表达，暗示受ABA信号诱导的B3类转录因子可与WUS调控区结合，从而促进WUS的表达。这些结果支持ABI3/WUS间的反馈调节机理，该调节环可能参与调控拟南芥质体和根毛发育等过程。 双子叶和单子叶植物的发育和器官形成高度依赖生长素极性运输（PAT）， 生长素输入和输出载体的准确定位对于极性运输的正常进行是必要的。在双子叶模式植物拟南芥中，生长素输出载体PIN1的转运和定位受小G蛋白ARF鸟苷酸转换因子GNOM介导。本实验室克隆到一个水稻ARF GAPase激活蛋白OsAGAP， 其超表达引起PAT改变且干扰主根和侧根的发生及发育。前期生理实验显示超表达植株侧根的表型可被膜渗透性生长素NAA恢复，但不能被载体依赖型生长素IAA和2, 4-D恢复。为了解释OsAGAP过表达引起根系发育受到抑制的表型，本工作主要从细胞学角度继续深入分析OsAGAP介导生长素运输的机理。实验发现，OsAGAP超表达植株中AUX1在细胞中分布改变；生长素输出载体PIN1和PIN2的定位不受影响；该基因的超表达使囊泡聚集，形成类似囊泡运输抑制剂BFA处理后的结构；OsAGAP与细胞转运系统中的高尔基体存在部分共定位。以上结果表明OsAGAP调节小G蛋白Arf的活性，参与调控生长素极性运输过程，进而调控根系发育。通过对JA诱导的OsRMC蛋白的膜定位分析及转基因植株根中JA合成水平的测定，为研究此蛋白参与JA信号、调控根系发育提供了直接证据。 此外，论文还对拟南芥STAR2基因的功能进行了一定的初探。

外源褪黑激素对野芥菜(Brassica juncea)生长的影响

褪黑激素（N-乙酰基-5-甲氧基色胺）是一种广泛存在于生物体内的吲哚类活性分子。本文以野芥菜（Brassica juncea）为例，初步研究了外源褪黑激素对植物生长生殖的影响。我们选取了发芽2天和发芽4天的野芥菜幼苗，用不同浓度的褪黑激素对其处理24小时，然后测量根的伸长量。结果表明，对于发芽2天的野芥菜，0.1 µM的外源褪黑激素能够显著提高野芥菜幼苗根的生长，而100 µM的外源褪黑激素处理则能够显著抑制根的生长;对于发芽4天的野芥菜，低浓度的外源褪黑激素处理对根生长的影响不明显，而高浓度的褪黑激素处理（如100 µM）能够显著抑制根的伸长。结果表明发芽晚期的野芥菜幼苗的根可能对褪黑激素的处理不敏感。由于褪黑激素对植物的生理作用类似于生长素的作用，因此选用了发芽2天的野芥菜幼苗为植物材料，用外源褪黑激素处理其根24小时后，通过间接酶联免疫吸附测定(ci-ELISA)的方法测定了内源吲哚乙酸（IAA）含量的变化。结果表明低浓度的褪黑激素处理时，内源IAA的含量增高，而在高浓度的褪黑激素处理时，内源IAA含量的变化不大。 关于褪黑激素对野芥菜生殖的影响，我们在花蕾期用褪黑激素涂抹野芥菜的花蕾，并在开花授粉后用褪黑激素涂抹柱头，然后在结实时测量果荚长度，种子千粒重，平均每荚种子数，发芽率等指标。结果表明：对于在花蕾期用褪黑激素处理的植株来说，褪黑激素处理对其的果荚长度，千粒重，平均每荚种子数都没有显著的影响。对于开花后用褪黑激素处理授粉后的柱头，1 µM的褪黑激素处理过的主枝具有较长的果荚长度，而褪黑激素处理对千粒重，平均每荚种子数，发芽率，发芽势和发芽指数均没有显著的影响。在花粉萌发实验中，外源褪黑激素的处理浓度和时间均对花粉萌发有一定的影响，表现为随时间的增加，花粉萌发数目增加，在4 h时，低浓度的褪黑激素处理（10 µM）下花粉的萌发较多。

新疆紫草细胞培养产生紫草宁衍生物的代谢调控

本文对新疆紫草培养细胞的生长及紫革宁衍生物形成的调节与控制进行了研究．结果表朗：在不同时期照射白光、蓝光，对紫草培养细胞生长及紫草宁衍生物的积累均有明显的抑制作用;而第三周照红光一天、第二周以及整个培养过程均照远红光、第19天照紫外光等，都对生产培养基中紫草宁衍生物的积累有促进作用;其中，远红光与紫外光的最佳照射时间长度都为30分钟，且细胞内苯丙氨酸解氨酶的活性与紫草宁衍生物的含量有明显的正相关性．研究了不同照光条件下，紫草培养细胞生长，紫草宁衍生物积累以及苯丙氨酸解氨酶活性变化的动态，基本上找出了它们的变化规律以及它们之间的相互关系． 通过试验发现，紫草细胞培养的适宜温度为25℃，适宜pH值为5.3—5.8：在培养基中加入O,l%-0.30%的活性炭、用磁水器处理培养基等，对紫草宁衍生物的积累有良好的促进作用。 提高培养基中的Cu2+，Mg2+，Zn2+．K+浓度，有利于紫草宁衍生物的积累，而在生产培养基中加入NH：，则显著抑制了紫草宁衍生物的产生;培养基中蔗糖浓度为50g／L时，对紫草细胞生长及紫草宁衍生物的积累最有利，而生产培养基中不加IAA，KT对紫草宁衍生物的积累有利．以密环菌为诱导子，促进了紫草细脆生长及紫草宁衍生物的积累。 此外，对Cu2+、密环菌发酵液处理条件下，紫革宁衍生物积累与苯丙氨 酸解氨酶活性的关系以及不同蔗糖浓度条件下，生长培养基中紫草细胞生长、 紫草宁衍生物的积累，细胞内可溶性糖含量变化的动态进行了研究．

水稻抗旱性与光合特征的资源评价及其根系抗旱生理基础的研究

为了挖掘和利用野生资源抗旱和高光效的有益基因性状，本研究针对野生种的抗旱生理性状、光合作用和抗旱关系进行了测定，同时利用野生稻和栽培稻远缘杂交获得不同光合特点的后代材料进行了胁迫反应试验，并以栽培稻（陆稻和水稻）为材料研究了抗旱反应中根系的激素信号变化。旨在明确水分胁迫条件下，水稻不同野生种对干旱反应的差异及其机理，以及进一步鉴定有效的抗旱指标，为今后育种和生产实践提供理论依据和指导。主要结果如下： 1．通过对具有不同抗旱性状的四个野生种O.Granulata、O.Alta、O,Officinalis、O.Latifolia水分胁迫处理的抗旱相关生理性状的变化特点的研究表明：(1)在胁迫早期，野生种间黎明前叶片水势没有明显的差别，随着胁迫加剧，种间差异显示明显。耐旱性弱的野生种（O.Granulata、O.Latifolia）黎明前叶片水势和中午水势下降幅度大于耐旱性强的野生种( O.Alta、O.Officinalis)。这表明在一定的干旱处理程度下，黎明前叶片水势和中午水势可以反映出不同种间植株忍受干旱胁迫的能力。(2)四个野生种的植株在轻微胁迫时，膜稳定性呈现出增强的趋势，这可能与干旱胁迫的适应性相关。随着胁迫时间的延长，胁迫程度的加重，叶片膜稳定性破坏，植株叶片渗漏率增加。(3)在胁迫条件下，不同野生种表现出茎杆中糖分增加，叶片的光合酶和光合速率下降，且抗旱性弱的品种这种变化比抗旱性强的品种更加明显。这可能是由于干旱处理降低了同化物的运转和淀粉合成，导致了糖分积累。(4)在水分胁迫条件下，植株中的ABA浓度增加而IAA浓度下降，其中ABA的浓度增加与种间的抗旱性相关。抗旱性差(O.Granulata、O.Latifolia)的野生种叶片ABA浓度增加幅度高于抗旱性强的野生种（O.Alta、O.Officinalis）。Officinalis和Alta在水分胁迫下，仍比Granulata 和Latifolia具有较高的分蘖，这可能与其在胁迫下具有较高GA3浓度有关。 2．通过对20个野生种叶片膜电解质泄漏率的比较，研究其叶片细胞膜稳定性的特点表明，46℃的温度，水浴时间24小时是较适宜的条件。在适宜的处理条件下，Longistaminata、Punctata渗漏率较低，表明其具有良好的膜稳定性：O. Officinalis、O.Glumaepatula、O.Glaberrima，O.Latifolia、Meridionalis、Rufipogon (105697)、100889、Nivara (80683)、Sativa( IR-36)电解质泄漏率居中在60-80%;O.Alta、Rampur6、Azucena、Rufipogon (105599)、Bartlic、Rufipogon(104640)、105429、Minuta (101099)、HP4的渗漏值均较高，表明其膜稳定性较差，尤其是Minuta。此外，叶片光合速率和叶片膜稳定性的关系并不完全一致，在育种时应选择光合速率较高而叶片膜稳定性好的品种，O.Longistaminata因其具有较高的光合速率和较好的膜稳定性，是一个值得关注的材料。 3．研究了栽培稻（Oryza sativa）和普通野生稻（Oryza rufipogon）的杂种后代F3，即：Azucena×Rampur6杂交得到的Fi植株(25007-10)，通过自交得到其F3代植株，在水分胁迫下不同光合速率类型植株以及相关的抗旱生理特点。结果表明， (1)光合速率高的株系黎明前叶片水势下降较大，而中午叶片水势下降却较小：光合速率低的株系黎明前叶片水势下降幅度较小，而中午叶片水势下降幅度却较大，这表明水分胁迫下，植株中午叶片水势与植株的光合速率密切相关。(2)在轻微水分胁迫下（缓慢干旱0-40天），所有株系经受抗旱锻炼的植株，其叶片渗漏率均下降，膜稳定性增强;随着胁迫时间延长（胁迫后40-80天）其叶片泄漏值上升，这可能是由于：水分胁迫下通过植株的渗透调节能力，使得叶片中累积的有机溶质增加：且干旱胁迫使得叶片的质膜破坏，电解质外渗，相对电导率提高。 (3)水分胁迫下，从不同光合速率类型的植株，其光合速率的变化看：高光合速率类型的植株，在水分胁迫下光合速率的下降幅度，要大于光合速率较低类型的植株。在水分胁迫下，SHPl-2株系后代比SHPl-1株系具有较强的抗旱性，能维持较高的光合速率。 (4)在水分胁迫下，不同光合速率的株系，其气孔阻抗均增加：低光合速率的株系，气孔阻抗上升幅度大于高光合速率类型的株系，并且其气孔阻抗上升的时间要早于高光合速率的株系。 4．研究了两个陆稻品种Azucena、IRAT104和两个水稻品种IR64、Salumpikit，在干旱胁迫下根系木质部汁液中内源激素的变化。(1)干旱复水后不同时间进程中，各品种木质部汁液内源激素的变化看，IRAT104和Salumpikit木质部汁液中ABA含量迅速降低，其下降幅度较大。说明ABA作为胁迫信号，通过木质部汁液传递干旱信息;在干旱胁迫解除后，ABA的浓度亦发生相应的变化。(2)在对根系施加不同压力后，测定其木质部汁液内源激素变化，结果表明：在不同的根系压力下，不同品种间（IR64、Salumpikit、IRAT104和Azucena） 木质部汁液中GA3含量变化较大，其中两个陆稻品种IRAT104和Azucena均较高，两个水稻品种IR64和Salumpikit均较低。这表明，在不同的压力下，陆稻品种（Azucena和IRAT104）比水稻品种（IR64和Salumpikit）具有较高的GA3含量;在胁迫条件下，维持较高的GA3含量，这有利于其维持正常的生长发育。(3)在干旱胁迫及复水过程中，根据木质部汁液中ABA和GA3含量变化的结果表明，虽然Azucena和IRAT104均属于陆稻品种，但二者的抗旱性不同。(4)水稻品种木质部汁液的pH值高于陆稻品种。木质部汁液中pH在干旱胁迫下升高，复水后又降低，其可作为干旱胁迫的一个信号，它与木质部汁液中ABA联合调节植株对干旱的生理生化反应。 上述结果表明，叶片水势与水分胁迫密切相关，可作为植株抗旱性的鉴定指标;抗旱性强的品种，叶片水势下降幅度小，有利于维持较高的水势，保证植株生长发育的需要。严重干旱使得所有品种的质膜稳定性降低，电解质外渗，相对电导率提高;抗旱性强的品种的质膜伤害程度小，电导率上升幅度小，表明其质膜稳定性好，对干旱的忍耐能力强。质膜稳定性的变化实际上反映了品种的耐旱性，所以是一种综合而又比较准确的抗旱鉴定指标。对于酶和激素的测定方法，由于操作比较烦琐，且数据分析和产量比较复杂等原因，不太适合于常规的大田选育工作中。水稻的抗旱性是多种生理生化变化综合作用的结果，因此进行水稻抗旱性鉴定时，不能使用单一的生理生化指标，而应对多个指标进行综合分析，依据综合值对水稻品种的抗旱性进行评价较为科学。