Agentes deletéreos para Trypanosoma cruzi: Patogenia de la infección de placenta humana en la enfermedad congénita de Chagas, in vitro. Deleterious agents to Trypanosoma cruzi: Pathogenia of the human placenta infection in the congenital Chagas disease.

Trypanosoma cruzi, agente causal del Chagas, atraviesa la barrera placentaria y produce la enfermedad congénita. Objetivo general: Analizar si el T. cruzi, agente causal del Chagas, produce alteraciones trofoblásticas de las vellosidades coriónicas mediadas por óxido nítrico (principal agente deletéreo contra T. cruzi) y estrés oxidativo con variaciones que pudieran depender de la disponibiidad de L-arginine, sobre placentas en modelos in vitro de co-cultivos de explantos de vellosidades coriónicas, de sinciciotrofoblasto aislado y de células derivadas del trofoblasto de placentas humanas en interacción con distintas cepas del Trypanosoma cruzi, que pudieran dar alguna luz en la explicación de mecanismos involucrados en la infección placentaria y en algunos síndromes clínicos de la transmisión congénita del Chagas. Objetivos Específicos: a) Describir alteraciones estructurales y presencia de T. cruzi en vellosidades coriónicas de placentas humanas procedentes de co-cultivos con Trypanosoma cruzi in vitro (y sus respectivos controles), mediante técnicas histológicas y PCR analizando secuencias de ADN específicas del parásito.b) Establecer la localización y expresión proteica y la expresión transcripcional de las isoformas II y III de la Öxido Nítrico Sintasa sobre la misma población muestral de (a) mediante técnicas inmunohistoquímica, RT-PCR y semicuantificación con software adecuado. c) Analizar la susceptibilidad a la infección por el T. cruzi del citotrofoblasto (CTB) y sinciciotrofoblasto (STB) placentario aislado in vitro. d) Determinar concentraciones de óxido nítrico y estrés oxidativo del sinciciotrofoblasto (STB) aislado ante la infección por T. cruzi. e) Relacionar concentraciones de L-arginina con infección del trofoblasto aislado. f) Relacionar inhibiciones de la eNOS y de la arginasa con infección trofoblástica y óxido nítrico producido.Se emplearán métodos y técnicas de Biología celular y molecular, mediciones hormonales, enzimáticas, proteicas, parasitarias y bioquímicas en medios sobrenadantes de cultivo, de inmuno-detección de epitopes proteicos en tejidos, expresión de ARN por RT-PCR, Western blot, detección de DNA en tejidos por PCR, Cuantificaciones morfométricas. En general, el presente proyecto podría redundar en beneficios para un sector de la población de las áreas endémicas para esta enfermedad de bajos recursos económicos, sociales y culturales, mediante la obtención de datos que pudieran explicar algunos mecanismos de síndromes clínicos descriptos en esta patología y que pudieran participar en la transmisión congénita de la enfermedad de Chagas.

Isolamento de amostras do Trypanosoma cruzi por xenodiagnóstico e hemocultura de pacientes na fase crônica da doença de Chagas

Cinquenta e nove pacientes chagásicos crônicos foram submetidos a xenodiagnósticos e hemocultura concomitantes para isolamento de amostras de Trypanosoma cruzi. O xenodiagnóstico foi composto de 40 ninfas de Panstrongylus megistrus, Triatoma infestans e Dipetalogylus megistus, Triatoma infestans e Dipetalogaster maximus num total de 120 triatomíneos. Os insetos foram dissecados em grupo de 10 por espécie e o conteúdo intestinal, agrupado, examinado após prévia trituração e homogeneização. O material negativo ao microscópio foi semeado em meio LIT e examinado após 20 dias. Vinte e nove pacientes foram parasitologicamente comprovados, sendo 15 apenas no xenodiagnóstico, quatro apenas com a hemocultura e 10 por ambos os métodos. Discutem-se as dificuldades para a comprovação parasitológica dos pacientes chagásicos crônicos, o valor da utilização simultânea de diferentes espécies de triatomíneos no xenodiagnóstico e a hemocultura, numa associação positiva favorável ao aumento da sensibilidade para o diagnóstico da doença de Chagas. A positividade de 49,2% obtida neste grupo de pacientes visualiza abordagens do tipo ensaio clínico-terapêutico e/ou epidemiológico (tipo caso-controle) com a finalidade de investigar uma possível associação entre amostras do T. cruzi e diferentes formas clínicas da doença de Chagas.

Avaliação das quimiocinas e da expressão de seus receptores em células mononucleares de pacientes portadores da doença de Chagas submetidas à infecção in vitro com Trypanosoma cruzi e tratamento com benzonidazol

Atualmente o Brasil apresenta 3 milhões de indivíduos portadores da cardiomiopatia chagásica. Porém, tratamento etiológico com o fármaco Benzonidazol (BZ) na fase crônica da doença ainda não está elucidado. Acredita-se que a recomendação do BZ nessa fase, pode prevenir ou retardar a evolução clínica da cardiomiopatia na Doença Chagas (DC). Assim o objetivo do estudo é avaliar a produção de quimiocinas e expressão de seus receptores em Células mononucleares do sangue periférico - PBMC (de portadores crônicos da doença de Chagas) submetidas in vitro ao tratamento com BZ, após a infecção com T.cruzi. Foram selecionados 11 pacientes na fase crônica da doença. Amostras de sangue desses pacientes foram coletadas para obtenção de PBMC, em que foram cultivadas em placas de cultivo na concentração de 106 células/ml por poço. Após a adesão das células aderentes (principalmente macrófagos), as células não aderentes (principalmente linfócitos) foram removidas e as formas tripomastigotas foram adicionadas ao cultivo para infecção das células aderentes. Subsequente a incubação, as células não aderentes foram adicionadas novamente ao cultivo juntamente com o fármaco Bz (1µg/mL), ficando um co-cultivo de células aderentes infectadas com T.cruzi, células não aderentes e o BZ (C+T+BZ). As placas de cultura foram incubadas por períodos de 24h e 5 dias. Para uma análise fidedigna da ação do BZ nas células aderentes e não aderentes foi necessário a criação dos controles: células (C), células e tripomastigotas (C+T) e células e o BZ (C+BZ). Após o cultivo, foram coletados os sobrenadantes das culturas, para avaliação da produção de quimiocinas (CCL2, CXL9, CXL10, CCL5 e CXCL8) por CBA (Cytometric Bead Array). Posteriormente foi realizada a imunofenotipagem, avaliando a expressão dos receptores CCR3, CCR4, CXCR3, CXCR5, CCR1, CXCR4, CXCR2 e CCR5, em linfócitos T CD3+ e monócitos CD14+. Os resultados obtidos na avaliação dos linfócitos mostraram que o receptor CXCR5 esteve aumentado na condição C+T+BZ; e os receptores CCR4 e CCR1 estavam diminuídos nessa mesma condição. Nos monócitos observamos uma diminuição de CCR4 e um aumento do CCR5 nas mesmas condições. Com relação a dosagem de quimiocinas no sobrenadante, foi evidenciado que CCL2 e CXCL8 apresentaram uma diminuição na condição C+T+BZ. Assim podemos concluir que devido ao caráter inflamatório modulado, que o BZ conduziu, podemos afirmar que o fármaco demonstrou benefícios relevantes na expressão de receptores e na produção de quimiocinas

Avaliação do efeito do benzonidazol sobre linfócitos, de portadores crônicos da doença de Chagas, submetidos experimentalmente à exposição ao Trypanosoma cruzi

O único medicamento disponível para o tratamento da doença de Chagas (DC) no Brasil é o benzonidazol (Bz). O beneficio da medicação aos portadores crônicos da doença ainda demonstra controvérsias, mas seu uso nessa fase pode ter a finalidade de prevenir/retardar a evolução da DC para formas mais graves. Os fenômenos imunológicos que ocorrem após a terapia com o Bz ainda não estão elucidados. Assim, este estudo propôs avaliar o efeito do Bz sobre o perfil imunológico de linfócitos T e a produção de citocinas por células da resposta imune expostas in vitro ao T. cruzi. Amostras de sangue de portadores crônicos da DC foram coletadas para obtenção de células mononucleares de sangue periférico com posterior infecção com tripomastigotas de T. cruzi, seguida de adição do Bz às culturas. Após o tempo de cultivo, os sobrenadantes foram estocados para posterior análise das citocinas IFN-gama, TNF, IL-10, IL-6, IL-4 e IL-2 por CBA e as células foram avaliadas por citometria de fluxo, quanto à expressão das moléculas CD28+ e CTLA-4+ e a produção de citocinas (IL-10 e IFN-gama) em linfócitos T CD4+ e CD8+. Nossos resultados mostraram que o tratamento com o Bz aumentou a expressão da molécula CTLA-4+ em linfócitos T CD8+, indicando que o Bz pode induzir uma modulação da resposta imune e, consequentemente, diminuir a ativação exacerbada dessas células. Além disso, verificamos uma diminuição da produção da citocina IL-10 por linfócitos T CD4+ na presença do Bz. Com relação à produção global de citocinas por células aderentes e não aderentes, observamos que o Bz causou uma diminuição da citocina pró-inflamatória TNF e da citocina anti-inflamatória IL-10, enquanto que as outras citocinas (IFN-gama, IL-6, IL4 e IL-2) permaneceram com níveis elevados de produção na presença desse fármaco. Nossos resultados sugerem que o Bz induz uma regulação da ativação de linfócitos T CD8+ e a produção de citocinas do perfil Th1 modulado por citocinas do perfil Th2, em células de portadores crônicos da DC. Assim, acreditamos que a administração do Bz aos portadores de formas clínicas brandas da DC pode ser benéfica a esses pacientes, visto que o Bz não promoveu um perfil inflamatório exacerbado

Prevalencia de infeccion humana por Trypanosoma cruzi en bancos de sangre en Venezuela

Las primeras investigaciones realizadas a nivel de bancos de sangre, durante la década 50, indican que la seroprevalencia por infecciones a T. cruzi entre hemodadores fue de 12%. Un estudio posterior, entre 1963-64, efectuado en varios bancos de sangre, así como otros centros, registró una seroprevalencia global de 6.0% (1.1-10.1%). La donación de sangre en Venezuela es gratuita. El control de los bancos de sangre recae en el Departamento de Transfusiones y Bancos de Sangre del Ministerio de Sanidad y Asistencia Social. A partir de 1988, se emplea uniformemente la técnica de ELISA para el diagnóstico de infecciones a T. cruzi en los Bancos de Sangre. La seropositividad promedio interanual, entre 1984-1992, fue de 1.20% (1.09-1.94%). Existen variaciones geográficas entre las localidades de varias entidades federales. Los estados con mayor prevalencia se ubican en las regiones del occidente y centro del país, a saber: Portuguesa, Barinas, Lara, Trujillo, Cojedes y Carabobo. Por las dificultades en obtener tasas de incidencia para el Mal de Chagas, resulta adecuado emplear tasas de prevalencia para uso en salud pública, en función de su mayor estabilidad; y en el caso de Venezuela, dada la severidad menor y una sobrevivencia mayor por esta patologia hoy día. La especificidad, como parámetro de las pruebas serológicas, debería considerarse en función de la baja seroprevalencia detectada a nivel nacional. Convendría emplear varias pruebas diagnósticas en paralelo para buscar un equilibrio entre sensibilidad y especificidad.

Estudos sobre a existência de correlação entre os dados biométricos e o grau de patogenicidade de amostras humanas do Trypanosoma cruzi Chagas, 1909

Trabalhando com dez amostras do T. cruzi isoladas de casos humanos de doença de Chagas, em condições tão padronizadas quanto o possível, realizamos um estudo morfo-blométrico e biológico das diversas amostras visando a verificação da existência de correlação entre os mesmos. Para tanto, tomamos como critérios de avaliação: a) os dados biométricos; b) a patogenicidade para animais de laboratório; c) a infectividade para triatomineos e d) a cultivabilidade em meios liquido (Warren) e difásico (NNN). Os resultados obtidos foram confrontados e mostraram a inexistência de correlação estreita entre os caracteres morfológicos, biológicos e patogênicos das diversas amostras estudadas.

Estudos sobre a epidemiologia da doença de Chagas no Ceará XX - ecologia de triatomíneos em russas

Foi escolhida para demolição, no Município de Russas, território do Triatoma braziliensis, uma casa borrifada 104 dias antes com BHC. Na área - a Fazenda Boa Vista - resisdem 250 habitantes; a taxa de infecção humana é 7,7% (imunofluorescência indireta) e a de cães é 9,1% (xeno). A captura prévia na área revelou 171 T. braziliensis (46,8%) infectados e raros Triatoma pseudo maculata (5). Na casa havia um habitante com teste de imunofluorescência positivo e de 26 T. braziliensis capturados nenhum revelou infecção. Durante a demolição foram capturados 1 rato infectado pelo Trypanosoma cruzi e 104 triatomíneos, (89,4% T. pseudomaculata e 10,6% T. brazieliensis); havia R. nasutus infectado no galinheiro. Exemplares de T. pseudomaculata infectados foram encontrados no teto 10,6 por m²) e nas paredes externas e internas da sala (0,8 por m²); ao teste de precipitina revelaram acentuada antropofilia. Concluiu-se que numa casa normalmente habitada por T. braziliensis, após a borrifação, houve substituição dessa espécie por uma população de T. pseudomaculata, numa área com razoável antropofilia e taxa de infecção suficiente para a transmissão.

Estudos sobre a epidemiologia da doença de Chagas no Ceará XXI - ecologia de triatomíneos no Icó

Foi escolhida uma casa, de um conjunto de 61 que constituem um encrave de Triatoma pseudomaculata, num território de Triatoma braziliensis; nessa área o T. pseudomaculata é 95,3% das duas espécies e apresenta-se 7,9% infectado. No território e apreciável a infecção de gatos e cães 10,6% e a infecção humana é de 2,9%. Na área-encrave a infecção de gatos e cães (xenodiagnóstico) é de 6,5% A casa escolhida havia sido borrifada com BHC e foi demolida 39 dias após, com prévia pesquisa para verificar a presença de triatomíneos, com resultado negativo. Durante a demolição foram capturados 19 T. pseudomaculata no teto e paredes internas da sala (infectados 15,8%). Na casa foram observados os seguintes animais: 1 rato, 2 cães, 2 gatos, 4 lagartixas, 1 rã e 3 "cobras de duas cabeças"; e no peri-domicílio: 2 cabras, 2 porcos e 15 galinhas. Conclui-se pela probabilidade de transmissão de Trypanosoma cruzi em casa recentemente desinsetizada, em área de T. pseudomaculata, resistindo os triatomíneos em ecótopos habitados pelo homem.

Efeito da dessecação das fezes de triatomíneos na sobrevivência de formas metacíclicas de Trypanosoma cruzi

Estudou-se a taxa de dessecação das fezes de triatomíneos à temperatura ambiente e diferentes umidades relativas e à temperatura média da pele humana (33 °C). O tempo necessário para evaporar a água contida nas fezes de barbeiro é inversamente proporcional ao déficit de saturação atmosférica e é acelerado a temperaturas mais altas. Estudou-se a motilidade dos flagelados fecais diretamente ao microscópio e a infectividade dos mesmos após introdução na cavidade peritoneal de camundongos. A baixa umidade ambas, motilidade e infectividade, foram perdidas antes de 30 minutos. Em altas umidades esses parâmetros foram preservados, em grau variado, por mais de 30 minutos. A 33 °C, 100% dos camundongos foram infectados depois de 15 minutos, mas somente 3,3% após 30 minutos de exposição. As condições ambientais no interior de uma casa em Mambai variaram acentuadamente no período de estudo. Entretanto, foram geralmente similares àqueles observados experimentalmente em laboratório.

Doença de Chagas na Amazônia: esboço da situação atual e perspectivas de prevenção

A tripanossomíase por Trypanosoma cruzi na Região Amazônica tem sido motivo de preocupação ao longo dos tempos, dada a grande dispersão de vetores infectados e crescentes migrações humanas. Um seminário internacional da ECLAT em julho/2002 analisou a situação e perspectivas quanto à dispersão da doença humana concluindo ser a mesma ainda esporádica e com potencial de ampliação na área, requerendo objetivo e integrado esforço de vigilância, compartido por todos os Países da Região.

Infecção natural de Triatoma vitticeps (Stal, 1859) por flagelados morfologicamente semelhantes a Trypanosoma cruzi (Chagas, 1909) no Estado do Espírito Santo

Espécimes adultos de Triatoma vitticeps são capturados freqüentemente por moradores em áreas rurais do Estado do Espírito Santo, Brasil. Com o objetivo de determinar o índice de infecção natural desta espécie, examinamos os dejetos de 116 espécimes silvestres, capturados em 27 municípios do estado, após repasto sanguíneo em ave e dejeção espontânea. Destes, 100 (86,2%) estavam infectados por flagelados morfologicamente semelhantes a Trypanosoma cruzi. Detectamos índices de infecção natural de Tritoma vitticeps superiores ao de estudos anteriores. A baixa incidência da doença de Chagas no estado se deve provavelmente a dejeção tardia deste vetor visto que trabalhos sobre especificidade alimentar demonstraram presença marcante de Tritoma vitticeps no intradomicilio e contato freqüente com o homem. O elevado índice de infecção natural observado reforça a necessidade de se manter a vigilância entomológica sobre este triatomíneo.

Estudio de Fosfatasa Alcalina Placentaria en un modelo que reproduce in vitro la infección placentaria humana con Trypanosoma cruzi</i>

La enfermedad de Chagas Mazza, endémica en América Latina, afecta a 20 millones de personas y 50.000 muertes anuales están asociadas. La transmisión connatal de la enfermedad está relacionada con nacimientos prematuros, abortos, placentitis y con la presencia de diversas patologías del recién nacido. La actividad de la fosfatasa alcalina humana (EC 3.1.3.1) ha sido utilizada con fines diagnósticos por más de 60 años. Un aumento en el nivel de Fosfatasa Alcalina es observado en la segunda mitad del embarazo en función del tiempo de gestación y es un índice de la actividad placentaria. Messer demostró que una disminución en la actividad específica de esta enzima es un signo de disfunción placentaria, siendo de utilidad en el diagnóstico clínico de diversas patologías. Se ha demostrado disminución de la enzima en placentas preeclámpsicas. Mediante microscopía electrónica se detectó una disminución de la actividad de la fosfatasa alcalina placentaria en el sinciciotrofoblasto en placentas de madres chagásicas. En una reproducción de la infección de placenta humana in vitro se observa un significativo descenso de la actividad de fosfatasa alcalina en el medio de cultivo, lo cual sugiere que el T. cruzi</i> produciría en el plasma de la embarazada chagásica un efecto análogo. Trabajos anteriores permiten postular que la actividad de la fosfatasa alcalina placentaria disminuye en el suero de pacientes chagásicos entre las 36 a 40 semanas de gestación y que esta disminución se asocia con el nacimiento de niños chagásicos. Se ha sugerido además que la fosfatasa alcalina placentaria es un receptor de IgG y que el transporte transplacentario de la IgG de la madre al feto dependería del genotipo fetal de fosfatasa alcalina placentaria. Estos hechos permiten suponer que en la interacción placenta- T. cruzi</i> la actividad de fosfatasa alcalina placentaria jugaría un rol importante pues podría condicionar según su polimorfismo la posibilidad de una determinada incidencia de la infección fetal. (...) No existen estudios analíticos ni sistemáticos de la actividad de fosfatasa alcalina placentaria en la enfermedad de Chagas en el plasma y placenta durante el transcurso del embarazo que permitan dilucidar el rol de la enzima en la interacción placenta-parásito-feto a través de las formas que se le atribuyen a la enzima en condiciones normales. Teniendo en cuenta estos antecedentes, en el presente proyecto se proponen: Objetivo General Caracterizar la fosfatasa alcalina placentaria de las placentas normales cultivadas e infectadas con T. cruzi</i> y del medio de cultivo en la infección in vitro con el objeto de dilucidar los posibles mecanismos de la infección placentaria en la enfermedad de Chagas congénita. Objetivos específicos: 1- Analizar los cambios de la actividad de fosfatasa alcalina placentaria en la placenta cultivada con Trypanosoma cruzi</i> mediante análisis enzimático, electroforético e inmunocitoquímico. 2- Correlacionar las modificaciones bioquímicas de la fosfatasa alcalina placentaria, mediante el análisis de captación de IgG, en el sistema in vitro. 3- Analizar las propiedades bioquímicas de la fosfatasa alcalina placentaria en vellosidades cultivadas con Trypanosoma cruzi</i> y corroborarla con la actividad de la enzime en cultivo con neuraminidasa o fosfolipasa sin T. cruzi</i>.