Characterization of Two Novel Type I Ribosome-Inactivating Proteins from the Storage Roots of the Andean Crop Mirabilis expansa1

Two novel type I ribosome-inactivating proteins (RIPs) were found in the storage roots of Mirabilis expansa, an underutilized Andean root crop. The two RIPs, named ME1 and ME2, were purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitation, cation-exchange perfusion chromatography, and C4 reverse-phase chromatography. The two proteins were found to be similar in size (27 and 27.5 kD) by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, and their isoelectric points were determined to be greater than pH 10.0. Amino acid N-terminal sequencing revealed that both ME1 and ME2 had conserved residues characteristic of RIPs. Amino acid composition and western-blot analysis further suggested a structural similarity between ME1 and ME2. ME2 showed high similarity to the Mirabilis jalapa antiviral protein, a type I RIP. Depurination of yeast 26S rRNA by ME1 and ME2 demonstrated their ribosome-inactivating activity. Because these two proteins were isolated from roots, their antimicrobial activity was tested against root-rot microorganisms, among others. ME1 and ME2 were active against several fungi, including Pythium irregulare, Fusarium oxysporum solani, Alternaria solani, Trichoderma reesei, and Trichoderma harzianum, and an additive antifungal effect of ME1 and ME2 was observed. Antibacterial activity of both ME1 and ME2 was observed against Pseudomonas syringae, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, and others.

Estudos de proteômica, estruturais e funcionais de proteínas envolvidas na degradação da biomassa lignocelulósica: expansinas microbianas e hidrolases de glicosídeos termofílicas

O Brasil possui uma posição privilegiada quando se refere à produção de etanol. Por questões históricas e geográficas o país é responsável por mais de 30 % da produção mundial de etanol, com uma produção nacional de mais de 28 bilhões de litros em 2014. Para maximizar o rendimento desse processo, está em desenvolvimento a tecnologia associada ao etanol de segunda geração ou etanol lignocelulósico. Os principais desafios desta tecnologia são: melhorar a eficiência de conversão do substrato em produto e a produção em grande escala utilizando substratos de baixo custo. Com o objetivo de melhorar a eficiência do processo de conversão foram estudadas proteínas auxiliares (expansinas) que, em conjunto com celulases, melhoram a despolimerização de biomassa lignocelulósica em açúcares fermentescíveis. Além disso, realizou-se também a caracterização de enzimas ativas de carboidratos (CAZymes) de origem termofílica do organismo Thermogemmatispora sp. T81, devido a capacidade que estas proteínas apresentam de manter a atividade e conformação estrutural em altas temperaturas por um prolongado período de tempo. A partir de análises utilizando bioinformática, os genes que codificam para expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei foram clonados e expressos em E. coli, e seus produtos gênicos (as expansinas) tiveram seus índices de sinergismo (devido atuação conjunta com coquetéis comerciais) e atividade catalítica determinados. Adicionalmente, dispondo de alinhamentos estruturais, foi proposto um mecanismo hidrolítico para elas. Em relação à bactéria Thermogemmatispora sp. T81, foram realizadas análises genômicas e proteômicas, a fim de selecionar enzimas superexpressas em meio celulósico. Seus genes foram clonados heterologamente em E. coli e o produto de expressão caracterizado bioquimicamente (cromatografia, ensaios de atividade e perfil de hidrólise) e estruturalmente (SAXS e dicroísmo circular). Os índices de sinergismo determinados foram de 2,47; 1,96 e 2,44 para as expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei, respectivamente. A partir dos alinhamentos estruturais foi proposto a díade Asp/Glu como sitio catalítico em expansinas. As análises de proteômica possibilitaram a seleção de quatro alvos de clonagem, por apresentarem alto índice de expressão quando a bactéria foi cultivada em meio celulósico. Estas proteínas foram caracterizadas quanto a atividade e apresentaram um perfil comum: temperatura ótima de ação (de 70 a 75 °C), pH ótimo de 5, e hidrolisam preferencialmente substratos hemicelulósicos (xilano). A porcentagem de estruturais secundárias das proteínas em estudo foram confirmadas com predições teóricas ao se utilizar a técnica de dicroísmo circular. Desta maneira, os objetivos iniciais propostos neste projeto foram concluídos com a determinação do grau de sinergismo das proteínas expansinas em estudo e a proposição de um mecanismo de hidrólise para as mesmas, considerando que tais proteínas por mais de 20 anos tiveram sua atividade definida exclusivamente como acessória. Além disso, este estudo contribui com a identificação e seleção de genes para CAZymes termofilícas com aplicação biotecnológica devido às propriedades termoestáveis apresentadas.

Degradação de Ocratoxina a: estudo de processo e toxicidade

A ocratoxina A (OTA), micotoxina encontrada em diferentes níveis e em diversas matrizes, apresenta efeitos carcinogênicos, nefrotóxicos e teratogênicos. O desenvolvimento de métodos capazes de diminuir esta contaminação a níveis permitidos pela legislação é incentivado e os processos biológicos utilizados envolvem o uso de enzimas e/ou microrganismos para degradação da OTA e são preferenciais pela especificidade, bem como pelas condições brandas para a detoxificação. O objetivo do trabalho foi estudar a ação de carboxipeptidase A nos níveis e na toxicidade de OTA, visando aplicar a técnica para detoxificar farinhas de trigo. Primeiramente foi estimado o risco de exposição à ocratoxina A pelo consumo de farinhas de trigo. Para isso foram estabelecidas condições de determinação de OTA em farinhas de trigo, empregando técnicas de estatística multivariada para definir os principais interferentes na extração de OTA pelo método de QuEChERS e detecção em CLAE-FL. O método validado permitiu a avaliação da ocorrência natural em 20 amostras de farinha de trigo, estando estas contaminadas na faixa de 0,22 a 0,85 µg.kg-1 , apresentando um valor de ingestão diária de 0,08 ngOTA.dia-1 .kgmassacorpórea -1 e uma disponibilidade de 94,4%. Em seguida foi realizada a padronização da extração de carboxipeptidase A em biomassa de Rhizopus oryzae que consistiu em agitação ultrassônica durante 30 minutos numa potencia fixa de 150 W e 40 kHz e a triagem de agentes biológicos para degradação de OTA. Para o estudo da degradação in vitro de OTA, método de extração e detecção de OTA e OTα em CLAEFL foi validado e o processo de degradação foi realizado com Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei, obtendo-se uma redução máxima de 63,5% e 57,7%, respectivamente. A degradação apresentou uma correlação alta (R>0,9) e significativa (p<0,05) com a produção de Otα, indicando que ocorreu a produção de enzimas capazes de hidrolisar a micotoxina, por exemplo, a carboxipeptidase A. O estudo da toxicidade de OTA e seu metabólito OTα foi realizado em neutrófilos humanos, onde foi observado a ausência de efeito tóxico de OTα. Também foi determinado o mecanismo de toxicidade de OTA pelo aumento de Ca2+ intracelular pela liberação a partir das reservas internas. Esta liberação, subsequentemente, provoca uma cascata de eventos, nomeadamente: a produção de espécies reativas, depleção de ATP, perda de ΔΨm, levando à morte por necrose. Para reduzir o risco de exposição à micotoxina pela ingestão de matéria prima contaminada, carboxipeptidase A extraída de diferentes fontes foi aplicada na hidrólise de OTA em farinha de trigo para posterior determinação do conteúdo residual de OTA e OTα, empregando método validado. O estudo mostrou uma redução de OTA entre 16,8 e 78,5% e produção de OTα entre 2 a 8,2 ng.g-1 . As carboxipeptidases mais promissoras para degradação foram as provenientes de Rhizopus e Trichoderma e a carboxipeptidase comercial. Ficou demonstrado que se pode recomendar a aplicação de enzimas proteolíticas, tipo carboxipeptidase, para reduzir o risco de exposição à micotoxina quando utilizada matéria prima contaminada, por exemplo, farinha de trigo para diferentes processos. A transformação de OTA para OTα e seus efeitos na redução da toxicidade da micotoxina corroboram com esta afirmação.

Computationally-guided thermostabilization of the primary endoglucanase from Hypocrea jecorina for cellulosic biofuel production

The creation of thermostable enzymes has wide-ranging applications in industrial, scientific, and pharmaceutical settings. As various stabilization techniques exist, it is often unclear how to best proceed. To this end, we have redesigned Cel5A (HjCel5A) from Hypocrea jecorina (anamorph Trichoderma reesei) to comparatively evaluate several significantly divergent stabilization methods: 1) consensus design, 2) core repacking, 3) helix dipole stabilization, 4) FoldX ΔΔG approximations, 5) Triad ΔΔG approximations, and 6) entropy reduction through backbone stabilization. As several of these techniques require structural data, we initially solved the first crystal structure of HjCel5A to 2.05 Å. Results from the stabilization experiments demonstrate that consensus design works best at accurately predicting highly stabilizing and active mutations. FoldX and helix dipole stabilization, however, also performed well. Both methods rely on structural data and can reveal non-conserved, structure-dependent mutations with high fidelity. HjCel5A is a prime target for stabilization. Capable of cleaving cellulose strands from agricultural waste into fermentable sugars, this protein functions as the primary endoglucanase in an organism commonly used in the sustainable biofuels industry. Creating a long-lived, highly active thermostable HjCel5A would allow cellulose hydrolysis to proceed more efficiently, lowering production expenses. We employed information gleaned during the survey of stabilization techniques to generate HjCel5A variants demonstrating a 12-15 °C increase in the temperature at which 50% of the total activity persists, an 11-14 °C increase in optimal operating temperature, and a 60% increase over the maximal amount of hydrolysis achievable using the wild type enzyme. We anticipate that our comparative analysis of stabilization methods will prove useful in future thermostabilization experiments.

Enrichment of cellulosic waste hemp (Cannabis sativa) hurd into non-toxic microfibres

In this study a largely available lignocellulose feedstock hemp (Cannabis sativa), obtained as an industrial waste, was used for cellulose extraction. The extraction of cellulose microfibres from hemp biomass was conducted by alkaline treatment and an acidification process. The extracted cellulose microfibres were characterised using Fourier-transformed infrared spectroscopy (FTIR), Scanning electron microscopy (SEM), thermogravimetric analysis (TGA) and X-ray diffraction (XRD).The viability of the study was determined by growing human fibroblasts on the preparation which resulted in being non-toxic; indicating its potential in preparing biological scaffolds. Upon enzymatic hydrolysis of the cellulose microfibre using cellulase from Trichoderma reesei, a maximum of 909 mg/g of reducing sugars were obtained, which endorses its suitability for biofuel production.

Enzyme Optimization for Lignocellulose Hydrolysis using Mechanistic Modeling

A novel mechanistic model for the saccharification of cellulose and hemicellulose is utilized to predict the products of hydrolysis over a range of enzyme loadings and times. The mechanistic model considers the morphology of the substrate and the kinetics of enzymes to optimize enzyme concentrations for the enzymatic hydrolysis of cellulose and hemicellulose simultaneously. Substrates are modeled based on their fraction of accessible sites, glucan content, xylan content, and degree of polymerizations. This enzyme optimization model takes into account the kinetics of six core enzymes for lignocellulose hydrolysis: endoglucanase I (EG1), cellobiohydrolase I (CBH1), cellobiohydrolase II (CBH2), and endo-xylanase (EX) from Trichoderma reesei; β-glucosidase (BG), and β-xylosidase (BX) from Aspergillus niger. The model employs the synergistic action of these enzymes to predict optimum enzyme concentrations for hydrolysis of Avicel and ammonia fiber explosion (AFEX) pretreated corn stover. Glucan, glucan + xylan, glucose and glucose + xylose conversion predictions are given over a range of mass fractions of enzymes, and a range of enzyme loadings. Simulation results are compared with optimizations using statistically designed experiments. BG and BX are modeled in solution at later time points to predict the effect on glucose conversion and xylose conversion.

Purification, and Biochemical and Biophysical Characterization of Cellobiohydrolase I from Trichoderma harzianum IOC 3844

Because of its elevated cellulolytic activity, the filamentous fungus Trichoderma harzianum has a considerable potential in biomass hydrolysis applications. Trichoderma harzianum cellobiohydrolase I (ThCBHI), an exoglucanase, is an important enzyme in the process of cellulose degradation. Here, we report an easy single-step ion-exchange chromatographic method for purification of ThCBHI and its initial biophysical and biochemical characterization. The ThCBHI produced by induction with microcrystalline cellulose under submerged fermentation was purified on DEAE-Sephadex A-50 media and its identity was confirmed by mass spectrometry. The ThCBHI biochemical characterization showed that the protein has a molecular mass of 66 kDa and pi of 5.23. As confirmed by small-angle X-ray scattering (SAXS), both full-length ThCBHI and its catalytic core domain (CCD) obtained by digestion with papain are monomeric in solution. Secondary structure analysis of ThCBHI by circular dichroism revealed alpha-helices and beta-strands contents in the 28% and 38% range, respectively. The intrinsic fluorescence emission maximum of 337 nm was accounted for as different degrees of exposure of ThCBHI tryptophan residues to water. Moreover, ThCBHI displayed maximum activity at pH 5.0 and temperature of 50 degrees C with specific activities against Avicel and p-nitrophenyl-beta-D-cellobioside of 1.25 U/mg and 1.53 U/mg, respectively.

Controle biológico de Moniliophthora perniciosa, agente causal da vassoura de bruxa do cacaueiro, por diferentes espécies e linhagens de Trichoderma spp

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia Aplicada) - IBRC

Trichoderma harzianum expressed sequence tags for identification of genes with putative roles in mycoparasitism against Fusarium solani

The plant pathogen Fusarium solani causes a disease root rot of common bean (Phaseolus vulgaris) resulting in great losses of yield in irrigated areas of the Southeast and Midwest regions of Brazil. Species of the genus Trichoderma have been used in the biological control of this pathogen as an alternative to chemical control. To gain new insights into the biocontrol mechanism used by Trichoderma harzianum against the phytopathogenic fungus, Fusarium solani, we performed a transcriptome analysis using expressed sequence tags (ESTs) and quantitative real-time PCR (RT-qPCR) approaches. A cDNA library from T. harzianum mycelium (isolate ALL42) grown on cell walls of F. solani (CWFS) was constructed and analyzed. A total of 2927 high quality sequences were selected from 3845 and 37.7% were identified as unique genes. The Gene Ontology analysis revealed that the majority of the annotated genes are involved in metabolic processes (80.9%), followed by cellular process (73.7%). We tested twenty genes that encode proteins with potential role in biological control. RT-qPCR analysis showed that none of these genes were expressed when T. harzianum was challenged with itself. These genes showed different patterns of expression during in vitro interaction between T. harzianum and F. solani. (C) 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.

Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of endoglucanase III from Trichoderma harzianum

Endoglucanases are enzymes that hydrolyze cellulose and are important components of the cellulolytic complex. In contrast to other members of the complex, they cleave internal beta-1,4-glycosidic bonds in the cellulose polymer, allowing cellulose to be used as an energy source. Since biomass is an important renewable source of energy, the structural and functional characterization of these enzymes is of interest. In this study, endoglucanase III from Trichoderma harzianum was produced in Pichia pastoris and purified. Crystals belonging to the orthorhombic space group P212121, with unit-cell parameters a = 47.54, b = 55.57, c = 157.3 angstrom, were obtained by the sitting-drop vapour-diffusion method and an X-ray diffraction data set was collected to 2.07 angstrom resolution.

Manejo de mal seco (Pythium myriotylum) en quequisque (Xanthosoma sagittifolium L. Schott) mediante la siembra tardia, control de arvenses, enmiendas organicas y trichoderma spp. en Nueva Guinea, Nicaragua

El quequisque (Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott.) pertenece a la familia Aráceas, es una de las raíces y tubérculos más importantes a nivel mundial. El principal problema que afecta el rendimiento es el mal seco ( Pythium myriotylum). Con el objetivo de evaluar el efecto de enmiendas orgánicas, Trichoderma y la siembra tardía en el manejo de mal seco ( Pythium myriotylum) en quequisque cv Blanco ( Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott) en Nueva Guinea, se establecieron dos ensayos arreglados en diseño de bloques completos al azar. Ensayo I: Efecto de enmiendas orgánicas y Trichoderma spp. para el manejo de mal seco en vitroplantas establecidas en bancos con riego y control de arvenses, con tres bloques, seis tratamientos cada uno, ocho plantas por tratamiento por bloque. Ensayo II: Efecto de enmiendas orgánicas y trichoderma para el manejo de mal seco en vitroplantas establecidas en surcos sin riego y sin control de arvenses, con tres bloques, siete tratamientos, 15 plantas por tratamiento por bloque. Se evaluaron variables morfológicas y de rendimiento. Se realizó un análisis de varianza y prueba de separación de medias (Tukey, α = 0.05) a las variables morfológicas y de rendimiento. La siembra tardía de los ensayos I y II redujo el efecto de Pythium myriotylum sobre las plantas independientemente de los tratamientos evaluados. Las plantas tratadas con Trichoderma registraron mejor comportamiento morfológico y de rendimiento. La sobrevivencia de las plantas del Ensayo I fue de 70 % y en el Ensayo II fue de 83%, las plantas tratadas con Trichoderma registraron un porcentaje de sobrevivencia de 83% en el Ensayo I y 94 % en el Ensayo II. El testigo (sin aplicación) en el Ensayo I registró un 63% de sobrevivencia y el Ensayo II un 67%. Dry + humega y Trichoderma spp. registraron mejor comportamiento morfológico y de rendimiento.

Efecto de enmiendas organicas, trichoderma, microorganismos eficientes y metalaxil en el manejo de mal seco (Pythium myriotylum Drechs) en quequisque (Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott) en suelo infectado en maceteras, mayo 2009-octubre 2010

El mal seco (Pythium myriotylum Drechs) reduce 90-100% la producción de quequisque. Con intención de aportar a la solución del problema se establecieron dos ensayos en maceteras, mayo 2009-octubre 2010, en esquema de diseño completo al azar (DCA). El objetivo fue evaluar el efecto de compost, humus de lombriz, dry, dry + humega, humega, trichoderma, microorganismos eficientes y metalaxil sobre el comportamiento agronómico de las plantas de quequisque (Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott) infectadas con Pythium myriotylum. Ensayo I: Efecto de enmiendas orgánicas y trichoderma en vitroplantas (compost, humus de lombriz, dry, dry + humega, humega, trichoderma, testigo negativo (-) (suelo esterilizado a 105 oC por 24 horas) y testigo positivo (+) (suelo infectado sin ninguna aplicación)). Se emplearon 20 observaciones por tratamiento. Se utilizaron vitroplantas del cultivar Quequisque Blanco. Se empleó suelo con antecedentes de mal seco proveniente de Nueva Guinea. Ensayo II: Efecto de trichoderma, microorganismos eficientes y metalaxil en plantaspropagadas convencionalmente (trichoderma, EM, metalaxil, testigo (-) (suelo esterilizado a 220 ºC por 48 horas) y testigo (+) (suelo infectado sin ninguna aplicación)). Se emplearon 11 observaciones por tratamiento. Se evaluaron variables morfológicas, de rendimiento, raíz y sobrevivencia de las plantas. En el Ensayo I los tratamientos compost y testigo (-) fueron significativamente superiores en las variables morfológicas excepto el número de hijos. No hubo diferencias significativas entre los tratamientos en rendimiento, a excepción del largo de cormos donde humus de lombriz registró los cormos demenor longitud. Las plantas en compost, humus de lombriz y testigo (-) presentaron raíces al momento de la cosecha, las plantas de los demás tratamientos estaban muertas. En el Ensayo II el tratamiento metalaxil registró plantas significativamente superiores en altura, ancho y largo de la hoja y diámetro del pseudotallo a 32 y 74 dds. En las dos evaluaciones finales (127 y 193 dds) no hubo diferencias significativas entre los tratamientos en las variables morfológicas. Todas las plantas presentaron escaso crecimiento, producción y pocas raíces. A la cosecha las plantas presentaban un rango de sobrevivencia de 70-100%.

Uso de aislamientos endofíticos de Trichoderma spp., para el biocontrol del Mal de Panamá (Fusarium oxysporum f. sp. cubense) Raza 1 en vitroplantas de banano) del cultivar Gros Michel (AAA) en condiciones de invernadero

El objetivo de la presente investigación fue seleccionar aislamientos endofíticos de Trichoderma spp., para el biocontrol de Fusarium oxysporum f. sp. cubense raza 1. Se evaluaron los tres aislamientos más patogénicos FOC2, FOC4, FOC8 obtenidos del criobanco del Laboratorio de Fitopatología del CATIE, en una prueba de antibiosis y posteriormente se procedió a realizar la prueba de biocontrol con veinte aislamientos endofíticos de Trichoderma spp. y dos aislamientos FOC2 y FOC4 en vitroplantas de Gros Michel (AAA)en condiciones de invernadero. Por medio de la técnica de cocultivo veinte aislados de Trichoderma spp., inhibieron el crecimiento radial de FOC hasta en un 53,46%. En el bioensayo de biocontrol,los aislamientos endofíticos de Trichoderma spp., presentaron un mínimo porcentaje de incidencia con 37,5% del tratamiento TJ5, en comparación al testigo absoluto que no presentó incidencia. Así mismo los tratamientos TC9, TP3 y TCL1 redujeron desde un 92% hasta 90% los síntomas externos en comparación a los testigos referenciales. Los síntomas internos del cormo se redujeron hasta un 74% por el tratamiento TC9. Adicionalmente se detectó que plantas protegidas con los aislamientos endofíticos de Trichoderma spp., promovieron el crecimiento vegetativo de la planta en peso de la raiz y follaje.

Desenvolvimento de uma formulação granulada a base de Trichoderma harzianum para controle de fitopatógenos.

2005