Proteinograma sérico de bezerros recém-nascidos alimentados com colostro de vacas com mastite

The aim of this study was to evaluate the serum protein concentration in newborns fed with colostrum derived from healthy cows (n = 10), cows with subclinical mastitis (n = 10) and cows with clinical mastitis (n = 10). 30 Holstein cows were assigned to their respective groups according to macroscopic examination of colostral secretion, somatic cell count, CMT and presence of bacteria in colostrum samples. Blood samples of the calves were collected immediately after birth, at 24 and 48 hours after ingestion of colostrum. The total protein was measured by the biuret method and the concentrations of immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin G (IgG), transferrin, albumin and haptoglobin was determined by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). No differences were obser- ved amongst groups in the concentrations of albumin, total protein and IgA. In animals from cows with subclinical and clinical mastitis haptoglobin concentrations were higher than those of healthy animals. The concentrations of IgG and transferrin were significantly lower in calves from cows with mastitis. We concluded that the ingestion of colostrum from infected and uninfected glands from cows with mastitis (GII e GIII) is unlikely to be an important contributor to the high rate of failure of passive transfer of immunoglobulins in calves.

Morfologia das células intersticiais de ovários policísticos de ratas: um estudo experimental

OBJETIVOS: Avaliar a histomorfometria das células intersticiais dos ovários, bem como analisar a concentração sanguínea de esteroides sexuais de ratas portadoras de ovários policísticos induzidos pela luz contínua. MÉTODOS: Vinte ratas foram divididas em dois grupos: ratas na fase de estro (GCtrl ) e ratas portadoras de ovários policísticos induzidos pela iluminação contínua (GOP). Os animais do GCtrl permaneceram com período de luz das 7:00 s 19:00 horas, e os animais do GOP, com iluminação contínua (400 Lux), durante um período de 60 dias. Ao final desse período todos os animais foram anestesiados, foi coletado o sangue, para determinação dos níveis séricos de estradiol (E2), progesterona (P4) e testosterona (T), seguido da retirada dos ovários que foram fixados em formol a 10% e processados para inclusão em parafina. Cortes histológicos com 5 µm corados pela hematoxilina e eosina foram utilizados para análise histomorfométrica. As análises morfológicas, contagem de cistos, determinação da concentração e do volume nuclear das células intersticiais foram realizadas com o auxílio de microscópio de luz adaptado a uma câmera de alta resolução (AxioCam), cujas imagens foram transmitidas e analisadas em computador com software AxioVision Rel 4.8 (Carl Zeiss). Os dados obtidos foram submetidos ao teste t de Student (p<0,05). RESULTADOS: A morfologia mostrou a presença de cistos nos ovários pertencentes ao Grupo OP e de corpos lúteos no GCtrl, mostrando ainda evidências da origem das células intersticiais a partir das células da teca interna desses cistos. Com relação aos níveis hormonais o GOP apresentou níveis séricos de estradiol (pg/mL) aumentados em relação ao GCtrl (GOP=124,9±4,2>GCtrl=73,2±6,5; p<0,05), o mesmo ocorrendo com os níveis de testosterona (pg/mL) (GOP=116,9±4,6>GCtrl=80,6±3,9; p<0,05). Entretanto os níveis de progesterona (ng/mL) foram mais elevados no GCtrl em relação ao GOP (GCtrl=16,3±2,0>GOP=4,2±1,5; p<0,05). A morfometria mostrou haver aumento significante do volume nuclear no grupo GOP (GOP=102,1±5,2>GCtrl=63,6±16,5; p<0,05), assim como da área ocupada (%) pelas células intersticiais (GOP=24,4±6,9>GCtrl=6,9±3,2; p<0,05) em relação aos animais do GCtrl. CONCLUSÃO: As células intersticiais do ovário policístico da rata provavelmente provêm dos cistos ovarianos devido degeneração das células da granulosa e diferenciação das células da teca interna. As elevações dos níveis séricos de testosterona e de estradiol provavelmente provêm do aumento significativo da atividade celular e da área ocupada pelas células intersticiais.

Global methylation of bovine cells derived from amniotic fluid, adipose tissue and skin fibroblastos and its use in nuclear transfer in the presence or absence of Trichostatin A.

2016

Composition, functional properties and sensory characteristics of Mozzarella cheese manufactured from different somatic cell counts in milk

In the present study, composition, functional properties and sensory characteristics of Mozzarella cheese produced from milk with somatic cell counts (SCC) at low (<200,000 cells/mL), intermediate (≈400,000 cells/mL) and high (>800,000 cells/mL) levels were investigated. Three batches of cheese were produced for each SCC category. The cheeses were vacuum packed in plastic bags and analysed after 2, 9, 16, 23 and 30 days of storage at 4ºC. SCC level did not affect the moisture, fat, total protein and ash content, mesophilic and psychrotrophic bacteria, and sensory parameters of Mozzarella cheese. However, meltability increased in cheese manufactured from high SCC milk. Results indicated that raw milk used to produce Mozzarella cheese should not contain high SCC (>800,000 cells/mL) in order to avoid changes in the functional properties of the Mozzarella cheese.

Influência do transporte e mudança de local de manejo nas variáveis fisiológicas e produtivas de cabras Alpinas

Estudaram-se o efeito do transporte e a mudança de local de manejo sobre a produção e a composição do leite e sobre as variáveis fisiológicas, utilizando-se 12 cabras da raça Alpina em final de lactação. Semanalmente, foram mensuradas a produção e composição do leite e a contagem de células somáticas, além do volume do leite residual após administração de ocitocina. Foram colhidas amostras de sangue para dosagem hormonal (cortisol) e enzimática (glicose) no plasma no dia do transporte: antes (7h10min) e após (8h20min, 8h30min e 10h30min) o transporte. Nas três semanas subsequentes ao transporte, também foram colhidas amostras de sangue às 8h20min. Obtiveram-se teores mais elevados (P<0,05) de cortisol e glicose após o transporte e a mudança de local de manejo, e menor produção de leite (P<0,05) um dia após o evento. Porcentagem de gordura (P<0,05) e contagem de células somáticas apresentaram diferenças significativas (P<0,05) após o transporte. Os resultados permitem concluir que o transporte é um agente estressor que pode, momentaneamente, influenciar a produção animal.

Efeitos da administração de monensina por meio de cápsulas de liberação controlada no desempenho de vacas Holandesas no início da lactação

Com o objetivo de estudar o efeito da monensina sobre a produção e composição de leite, a contagem de células somáticas, a condição corporal e os parâmetros sangüíneos e reprodutivos de vacas da raça Holandesa de alta produção no início de lactação, foram utilizadas 44 vacas com produção diária de 33,44 ± 4,93 litros de leite, em delineamento inteiramente casualizado, com dois tratamentos: um controle (C) e outro com cápsulas de liberação controlada de monensina com eficácia de 100 dias (300 mg/vaca/dia). A administração individual de monensina foi realizada 30 dias antes da data provável do parto. A monensina não alterou a produção, a composição do leite e a contagem de células somáticas do leite nem a condição corporal e a concentração de glicose e BHBA (beta-hidroxibutirato) no soro das vacas, no entanto, diminuiu a concentração de AGNE (ácidos graxos não-esterificados) no soro das vacas com 60 dias de lactação. O período de serviço e o número de serviços por concepção não diferiram entre os tratamentos, porém, a administração de monensina diminuiu o número de animais que apresentaram retenção de placenta e laminite. A administração de monensina para vacas Holandesas de alta produção no início de lactação não modifica a produção e a composição do leite, contudo, diminui a concentração de AGNE 60 dias após o parto e a incidência de laminite e retenção de placenta nas vacas no pós-parto.

Efeito de medicamentos indicados para a prevenção da mastite bovina no período seco sobre a função fagocítica in vitro de leucócitos do leite de caprinos

O uso de medicamentos antimamíticos específicos para vacas no período seco é indicado para prevenção de infecções na lactação seguinte. Não obstante, a ação das células envolvidas no período de secagem tem fundamental importância para a involução da glândula mamária e seu restabelecimento para a lactação subseqüente. A indisponibilidade de tais medicamentos para uso em cabras tem resultado na extrapolação do uso de produtos recomendados para vacas sem que se considerem as particularidades e diferenças anátomo-fisiológicas entre as espécies bovina e caprina. O presente estudo teve por objetivo avaliar a influência de cinco antimamíticos específicos para vacas secas sobre a função dos fagócitos provenientes de leite caprino. Para tal, fez-se o isolamento de células somáticas de 20 amostras de leite provenientes de 10 cabras lactantes, sem antecedentes de tratamento de mamite nos últimos 30 dias, sob condições higiênico-sanitárias de colheita e com resultados negativos ao cultivo microbiológico do leite. As células aderidas a lamínulas de vidro foram confrontadas com formulações contendo princípios ativos disponíveis no mercado como Gentamicina (M1), Cefalônio Anidro (M2), Ampicilina (M3), Cloxacilina Benzatínica (M4) e Cefapirina Benzatínica (M5). Avaliou-se, por microscopia, a fagocitose de partículas de Zymosan. As médias dos índices de fagocitose das células submetidas ao tratamento com M2 (15,12% ± 16,22), M3 (6,02% ± 7,96), M4 (4,54% ± 5,45) e M5 (2,47% ± 4,64) foram menores (p<0,001) que a média dos índices de fagocitose do grupo controle (40,67% ± 19,68). A média dos índices de fagocitose das células submetidas ao tratamento com M2 foi maior (p<0,05) que as médias dos tratamentos com M3, M4 e M5 enquanto estas foram estatisticamente iguais entre si. As amostras celulares submetidas ao medicamento M1 exibiram adesão insuficiente ou ausente às lamínulas, inviabilizando a avaliação da fagocitose por meio da técnica utilizada. Os resultados obtidos permitem concluir que os medicamentos estudados exerceram influência negativa sobre os fagócitos do leite, porém, esta interferência sobre as funções das células somáticas não pode por si só determinar o insucesso da terapia proposta para o período seco, pois deve ser considerada, outrossim, a eficácia do princípio ativo sobre o patógeno causador do processo infeccioso.

Effect of the kappa-casein gene polymorphism, breed and seasonality on physicochemical characteristics, composition and stability of bovine milk

The objective of this study was to evaluate the effect of genetic polymorphism of kappa-casein, breed and seasonality on the physicochemical characteristics, composition and stability of milk in commercial dairy herds. A total of 879 milk and blood samples were collected from 603 Holstein and 276 Girolando cows, obtained during rainy and dry seasons. Milk samples were analyzed to determine the physicochemical characteristics, composition and ethanol stability, while blood samples were subjected to polymerase chain reaction to identify the kappa-casein genotype. The frequencies of genotypes AA, AB and BB of k-casein were respectively, 66.83, 31.84 and 1.33% for Holstein, and 71.38, 27.90 and 0.72% for the Girolando cows, respectively. The A allele was more frequent than the B allele, both for Holstein (0.827 and 0.173) and Girolando cows (0.853 and 0.147), respectively. Cows of AB and BB genotypes showed a higher milk fat content compared to the AA genotype. There was an interaction between breed and seasonality on the concentration of milk urea with higher values for Holstein and Girolando cows in the rainy and dry season, respectively. The levels of lactose, total solids, crude protein, true protein, casein and the casein:true protein ratio were higher during the dry season, while during the rainy season, the somatic cell count and milk urea concentration were higher. There was no association between milk stability and k-casein genotypes, but Holstein cows showed higher milk stability than Girolando cows, and milk was more stable during the rainy season than during the dry season.

Apoptosis and necrosis of polymorphonuclear leukocytes in goat milk with high and low somatic cell counts

The purpose of the present trial was to compare the percentages of necrotic and apoptotic polymorphonuclear leukocytes (PMNL) in goat milk with low and high somatic cell count (SCC). Twenty eight milk samples were collected from 20 lactating goats, determined to be negative in bacteriological examination, and divided in three groups, according to their SCC: samples with SCC lower than 500 x 10(3) cells/mL; between 500 and 1500 x 10(3) cells/mL; and higher than 1500 x 10(3) cells/m L. SCC was performed in an automatic somatic cell counter. Apoptosis and necrosis were quantified using dual-color flow cytometry with fluorescein labeled annexin-V and propidium iodide (PI). Results of the present study showed a significant positive correlation between the percentage of the viable PMNL and milk SCC(r = 0.495, P=0.008), as well as a significant negative correlation between apoptotic PMNL and milk SCC(r = -0.486, P = 0.009). Results also pointed out lower PMNL viability rates due to higher apoptosis rates in milk samples with SCC lower than 5 x 10(5) cells/mL. (C) 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.

Avaliação da qualidade do leite e caracterização de laticínios do estado do Espírito Santo

O leite é um alimento de grande importância na alimentação humana e amplamente consumido. Desta forma, justifica-se o estudo de suas características e a avaliação de procedimentos higiênicos durante toda a sua cadeia produtiva, desde a ordenha até o seu processamento. O objetivo do trabalho foi caracterizar laticínios localizados no estado do Espírito Santo, bem como avaliar as características de qualidade do leite cru e do leite pasteurizado de quatro estabelecimentos. O estudo foi dividido em quatro etapas: 1) seleção de dois laticínios com Selo de Inspeção Federal (SIF) e dois laticínios com Selo de Inspeção Estadual (SIE); 2) Elaboração de questionário para coleta de dados; 3) coleta de amostras de leite cru refrigerado e leite pasteurizado nos laticínios selecionados e avaliação da qualidade da matéria-prima e; 4) caracterização dos quatro laticínios e avaliação das condições higiênico-sanitárias dos estabelecimentos (aplicação questionário elaborado e da Lista de Verificação de Boas Práticas de Fabricação - check-list – presente na RDC nº 275 / 2002 da Anvisa).Os resultados obtidos com as análises de composição centesimal, acidez titulável, pH e Contagem de Células Somáticas (CCS) das amostras dos laticínios SIF 1, SIF 2, SIE 1 e SIE 2 indicaram conformidade com o padrão exigido pela Instrução Normativa nº 62/2011 do MAPA. Com relação ao teste do alizarol, todas as amostras analisadas apresentaram coloração parda avermelhada sem coagulação, indicando conformidade com a exigência da legislação. Para o teste de detecção de antibiótico da classe β-lactâmicos, todas as amostras de leite dos quatro laticínios analisadas nas três coletas tiveram ausência pelo método utilizado. Em uma das amostras coletadas da indústria SIF 1 foi verificada a presença da enzima fosfatase alcalina em leite pasteurizado, indicando que o tratamento térmico não foi adequado e que, portanto, poderia haver presença de microrganismos patogênicos na amostra, ou que a enzima se renaturou, apresentando um resultado falso positivo para o teste. Além disso, foi verificado que duas amostras de leite coletadas do laticínio SIE 1 apresentaram ausência da enzima lactoperoxidase,O leite é um alimento de grande importância na alimentação humana e amplamente consumido. Desta forma, justifica-se o estudo de suas características e a avaliação de procedimentos higiênicos durante toda a sua cadeia produtiva, desde a ordenha até o seu processamento. O objetivo do trabalho foi caracterizar laticínios localizados no estado do Espírito Santo, bem como avaliar as características de qualidade do leite cru e do leite pasteurizado de quatro estabelecimentos. O estudo foi dividido em quatro etapas: 1) seleção de dois laticínios com Selo de Inspeção Federal (SIF) e dois laticínios com Selo de Inspeção Estadual (SIE); 2) Elaboração de questionário para coleta de dados; 3) coleta de amostras de leite cru refrigerado e leite pasteurizado nos laticínios selecionados e avaliação da qualidade da matéria-prima e; 4) caracterização dos quatro laticínios e avaliação das condições higiênico-sanitárias dos estabelecimentos (aplicação questionário elaborado e da Lista de Verificação de Boas Práticas de Fabricação - check-list – presente na RDC nº 275 / 2002 da Anvisa).Os resultados obtidos com as análises de composição centesimal, acidez titulável, pH e Contagem de Células Somáticas (CCS) das amostras dos laticínios SIF 1, SIF 2, SIE 1 e SIE 2 indicaram conformidade com o padrão exigido pela Instrução Normativa nº 62/2011 do MAPA. Com relação ao teste do alizarol, todas as amostras analisadas apresentaram coloração parda avermelhada sem coagulação, indicando conformidade com a exigência da legislação. Para o teste de detecção de antibiótico da classe β-lactâmicos, todas as amostras de leite dos quatro laticínios analisadas nas três coletas tiveram ausência pelo método utilizado. Em uma das amostras coletadas da indústria SIF 1 foi verificada a presença da enzima fosfatase alcalina em leite pasteurizado, indicando que o tratamento térmico não foi adequado e que, portanto, poderia haver presença de microrganismos patogênicos na amostra, ou que a enzima se renaturou, apresentando um resultado falso positivo para o teste. Além disso, foi verificado que duas amostras de leite coletadas do laticínio SIE 1 apresentaram ausência da enzima lactoperoxidase,O leite é um alimento de grande importância na alimentação humana e amplamente consumido. Desta forma, justifica-se o estudo de suas características e a avaliação de procedimentos higiênicos durante toda a sua cadeia produtiva, desde a ordenha até o seu processamento. O objetivo do trabalho foi caracterizar laticínios localizados no estado do Espírito Santo, bem como avaliar as características de qualidade do leite cru e do leite pasteurizado de quatro estabelecimentos. O estudo foi dividido em quatro etapas: 1) seleção de dois laticínios com Selo de Inspeção Federal (SIF) e dois laticínios com Selo de Inspeção Estadual (SIE); 2) Elaboração de questionário para coleta de dados; 3) coleta de amostras de leite cru refrigerado e leite pasteurizado nos laticínios selecionados e avaliação da qualidade da matéria-prima e; 4) caracterização dos quatro laticínios e avaliação das condições higiênico-sanitárias dos estabelecimentos (aplicação questionário elaborado e da Lista de Verificação de Boas Práticas de Fabricação - check-list – presente na RDC nº 275 / 2002 da Anvisa).Os resultados obtidos com as análises de composição centesimal, acidez titulável, pH e Contagem de Células Somáticas (CCS) das amostras dos laticínios SIF 1, SIF 2, SIE 1 e SIE 2 indicaram conformidade com o padrão exigido pela Instrução Normativa nº 62/2011 do MAPA. Com relação ao teste do alizarol, todas as amostras analisadas apresentaram coloração parda avermelhada sem coagulação, indicando conformidade com a exigência da legislação. Para o teste de detecção de antibiótico da classe β-lactâmicos, todas as amostras de leite dos quatro laticínios analisadas nas três coletas tiveram ausência pelo método utilizado. Em uma das amostras coletadas da indústria SIF 1 foi verificada a presença da enzima fosfatase alcalina em leite pasteurizado, indicando que o tratamento térmico não foi adequado e que, portanto, poderia haver presença de microrganismos patogênicos na amostra, ou que a enzima se renaturou, apresentando um resultado falso positivo para o teste. Além disso, foi verificado que duas amostras de leite coletadas do laticínio SIE 1 apresentaram ausência da enzima lactoperoxidase,indicando a sua desnaturação devido à superpasteurização do leite. Para as análises microbiológicas de contagem bacteriana total e bactérias psicrotróficas, foi verificado uma contagem acima do estabelecido pela legislação. Além disso, os maiores valores médios de Contagem Bacteriana Total (CBT), contagem de microrganismos psicrotróficos e coliformes totais nas amostras de leite cru refrigerado foram verificados entre os laticínios com SIF, podendo ter como causa o uso de tanques comunitários pelos produtores, tempo de transporte para coleta de leite maior do que a média dos laticínios com SIE, a falta de adoção das Boas Práticas de Ordenha e o maior volume de leite coletado de diferentes produtores. Com relação à CBT e à contagem de coliformes totais em leite pasteurizado, os maiores valores médios foram verificados também nos laticínios SIF 1 e SIF 2. Os laticínios que apresentaram maior porcentagem de adequação aos requisitos das BPF foram os laticínios SIF 1 (87,82 %) e SIF 2 (80,66 %), os quais já possuíam os POP’s (Procedimento Operacional Padronizado), CIP (Controle Integrado de Pragas) e BPF (Boas Práticas de Fabricação) implantados ou em fase final de implantação. A análise dos resultados das análises microbiológicas, da aplicação do check-list e da aplicação do questionário permitiu a conclusão de que as empresas que possuíam SIF, apesar de apresentarem uma maior porcentagem de adequação aos requisitos de boas práticas de fabricação, possuíam uma qualidade da matéria-prima menor do que as indústrias com SIE. A partir dos resultados obtidos, pode-se concluir que o estudo de laticínios no estado do Espírito Santo possibilitou o conhecimento do setor e de seus problemas, contribuindo para o emprego de ações de melhoria e prevenção de futuros problemas.

Impacto econômico da implantação das boas práticas agropecuárias relacionadas com a qualidade do leite

Objetivou-se, neste estudo, avaliar o impacto econômico da implantação das boas práticas agropecuárias (BPA), relacionadas com a qualidade higiênica sanitária do leite. A pesquisa consistiu na simulação de nove cenários, compostos por três diferentes níveis de BPA para a melhoria da qualidade do leite (baixo, médio e alto), em três diferentes situações (somente aplicação das BPAs; aplicação das BPAs e construção da sala do leite; e aplicação das BPAs, construção da sala do leite e aquisição do tanque de expansão). O rebanho leiteiro hipotético constava de 30 vacas em lactação, com média de dez litros de leite/animal/dia, ordenhadas duas vezes ao dia, em ordenhadeira tipo "balde ao pé". A receita consistiu na média da bonificação/penalização, praticadas por dez laticínios da região sudeste, considerando-se diferentes intervalos de contagem de células somáticas (CCS) e contagem bacteriana total (CBT). A inclusão das BPAs para a melhoria da qualidade do leite, quando praticadas em seu nível máximo, mostrou-se com rápido retorno do capital investido (payback) e ótima taxa interna de retorno (TIR) apenas para aqueles pecuaristas que já possuíam a sala do leite e o tanque de expansão.

Complexos de escorpionato: papel biológico como potenciais agentes anti-tumor

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Cellular reprogramming strategies for degenerative disorders involving the retinal pigment epithelium

RESUMO: A reprogramação celular permite que uma célula somática seja reprogramada para outra célula diferente através da expressão forçada de factores de transcrição (FTs) específicos de determinada linhagem celular, e constitui uma área de investigação emergente nos últimos anos. As células somáticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula somática. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substituição celular e modelos de doença, funcionando também como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem várias doenças degenerativas hereditárias e adquiridas da retina que causam deficiência visual devido a uma disfunção no tecido de suporte da retina, o epitélio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doenças é a Coroideremia (CHM), uma doença hereditária monogénica ligada ao cromossoma X causada por mutações que implicam a perda de função duma proteína com funções importantes na regulação do tráfico intracelular. A CHM é caracterizada pela degenerescência progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da coróide. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patogénese da CHM, o que parece indicar uma possível vantagem terapêutica na substituição do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patogénese desta doença. Assim, este trabalho focou-se principalmente na exploração das potencialidades das técnicas de reprogramação celular no contexto das doenças de degenerescência da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a expressão forçada dos 4 factores clássicos de reprogramação, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equivalência morfológica, molecular e funcional a células estaminais embrionárias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferenciação com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a conversão directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi também abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estratégia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrionário e especificação do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e expressão de alguns marcadores específicos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activação de regiões promotoras de genes específicos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em conclusão, avanços significativos foram atingidos no sentido da implementação de tecnologias de reprogramação celular já estabelecidas, bem como na concepção de novas estratégias inovadoras. Metodologias de reprogramação, quer para pluripotência, quer via conversão directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substituição celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doenças degenerativas da retina com disfunção do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM.

Efecto de los ácidos grasos poliinsaturados y sus metabolitos en la modulación de factores de transcripción sobre la carcinogénesis. Effects of Polyunsaturatd fatty acids and their metabolites on transcriptional factors modulation in carcinogenesis.

El cáncer se origina por mutaciones, competición y selección natural en células somáticas de tejidos de diferentes órganos,siendo un proceso complejo y multifactorial que ocurre en una secuencia de etapas: iniciación, promoción y progresión (1). Factores hereditarios,genéticos y epigenéticos como los lípidos dietarios, estrés oxidativo, hormonas, pesticidas y otros, influyen tanto en el desarrollo como en la inhibición de esta enfermedad (2). Datos epidemiológicos y experimentales tanto nuestros como de otros laboratorios han demostrado que el consumo de dietas ricas en ácidos grasos de la familia n-3, n-6 o n-9 cambian la fluidez, la actividad de enzimas, el nivel de proteínas y favorecen la formación de moléculas bioactivas derivadas de los lípidos como los eicosanoides y endocanabinoides que modulan el proceso carcinogénico (3-15). Estos derivados lípídicos activan vias de señalización produciendo cambios especificos en la expresión génica, un proceso fundamental durante la transformación neoplásica (1-2).También ha sido demostrado que estos cambios en la expresión génica inducidos por derivados lipídicos modulan funciones en células cancerosas como proliferación y muerte celular, migración y producción de matriz extracelular (16-17). A pesar de estos conocimientos, la identidad de los derivados lipídicos implicados en la modulación de la expresión génica durante la transformación neoplásica asi como los mecanismos utilizados por estas moléculas permanecen aun poco conocidos. HIPOTESIS: En los modelos a utilizar en el presente proyecto, la variación lipídica de las membranas que se induzca por manipulación dietaria deberán generar también variaciones en los eicosanoides . endocanabinoides y otros peróxidos que afecten factores de transcripción nucleares como el p53 y GLI incidiendo en los mecanismos responsables de la muerte y proliferación de células cancerosas. OBJETIVOS: Nos proponemos establecer el impacto de dietas enriquecidas con ácidos grasos de las familias n-3, n-6 o n-9 sobre modelos experimentales in-vivo e in-vitro. Se estudiarán los ácidos grasos de membrana plasmática, la generación de eicosanoides y endocanabinoides derivados de las vias COX y LOX Además se determinará el efecto de los peróxidos en la expresión y actividad de los factores nucleares de transcripción p53 y GLI como mecanismos responsables de la muerte y proliferación celular. MATERIALES Y MÉTODO: Se utilizará un modelo in-vivo de cáncer de mama empleando ratones C57BL6J inducidos con DMBA que se alimentarán con una dieta base semi-sintética suplemetada con diferentes PUFAs (Chia: n-3, Maíz: n-6 y Oleico: n-9 , empleada en estudios previos (8).Modelos in vitro: se utilizarán lineas celulares cancerígenas humanas de mama MCF-7 y MDA, las cuales se tratarán exógenamente con diferentes PUFAS (GLA:n-6,EPA:n-3, Oleico n-9)(9). Se determinarán ácidos grasos de membranas por Cromatografía de gas (CG)(10-11). El análisis de eicosanoides en células tumorales se realizará por HPLC (9-11). Los endocanabinoides por GC-Espectometría de Masa (18).La formación de peróxidos intracelulares se determinará por análisis de Glutation reducido (GSH)(16).La apoptosis se medirá por actividad caspasas y por Citometria de flujo usando Annexina V FICT (19).La expresión celular de Tp53 y GLI se realizará por Western Blot, PCR e inmunohistoquímica (20-21).RESULTADOS ESPERADOS: Se espera que los lípidos añadidos en las dietas de ratones inyectados con DMBA o al medio de cultivo de células tumorales de mama o páncreas modifiquen los ácidos grasos de membrana y sus derivados lipídicos los eicosanoides y endocanabionoides que suponemos afectarán la activación y expresión de factores de transcripción regulando la carcinogénesis. IMPORTANCIA: Diseñar nuevos modelos experimentales para implementar en terapias génicas y aplicar los resultados sobre factores nutricionales que pudieran actuar como inhibidores o promotores del desarrollo del cáncer en humanos.

Procesos oxidativos en matrices alimentarias complejas. Oxidative processes in complex food matrices.

Las reacciones bioquímicas que ocurren como consecuencia del tratamiento y almacenamiento de los alimentos, mejoran la seguridad alimentaria, las propiedades sensoriales y la vida útil. Sin embargo, el tratamiento térmico, la exposición a la luz y el oxígeno pueden causar daño oxidativo a los lípidos y proteínas. Los procesos oxidativos de matrices complejas tienen características distintivas que no se manifiestan cuando los componentes son sometidos a oxidación individualmente. La hipótesis de trabajo es que la oxidación de proteínas en matrices alimentarias complejas altera la estructura y las propiedades funcionales de las proteínas y, que las modificaciones que se producen varían según las condiciones de procesamiento y de la composición química del alimento. Nuestros estudios intentan demostrar que el estado oxidativo de las proteínas de un alimento es un parámetro importante para la evaluación de las propiedades funcionales, sensoriales y nutricionales de un producto lácteo. El objetivo general del proyecto es el estudio de los procesos de oxidación de matrices alimentarias complejas (la leche, miel) y su relación con distintos procesos y materiales utilizados en la industria. Es decir, nos proponemos estudiar las consecuencias funcionales y biológicas (calidad nutricional, coagulación) de la oxidación proteica en modelos experimentales “in vitro” y en productos comerciales. 1. Estudiar los fenómenos de peroxidación proteica en leche entera y descremada sometida a los distintos procesos tecnológicos de la producción de leche y queso a escala laboratorio. Se realizarán las mismas experiencias con albúmina sérica y con proteínas aisladas de suero de leche para comparar diferencias entre una matriz compleja y una simple. 2. Determinar la relación entre oxidación y composición proteica de la leche, y los cambios en las fracciones proteicas aisladas (caseínas y beta-lactoglobulina). 3. Analizar el impacto de los procesos tecnológicos a nivel de producción primaria (composición proteica y estado de oxidación) en los indicadores de inflamación (contenido de células somáticas y proteína C Reactiva) y de estado redox (capacidad antioxidante de los productos lácteos y nivel de carbonilos de proteinas). 4. Comparar las características de composición química y el estado de oxidación de leche provenientes de las tres regiones (Buenos Aires, Santa Fe y Córdoba) que conforman la cuenca láctea Argentina. Este objetivo se realizará conjuntamente con los integrantes de nuestro grupo de investigación que trabajan en el Laboratorio de Control de Calidad de la Escuela Superior de Lechería. 5. Determinar los metabolitos secundarios de mieles uniflorales propuestos como responsables de la capacidad antioxidante de estas (polifenoles) y como indicadores de su origen botánico. 6. Valorar la capacidad antioxidante total de mieles uniflorales. 7. Validar los métodos analíticos y semicuantitativos utilizados y a utilizar en el presente proyecto teniendo en cuenta lo efectos de matrices típico de los fluidos biológicos y las mezclas. El estudio de las modificaciones oxidativas de matrices complejas es un tema que es importante tanto desde el punto de vista del conocimiento básico como del aplicado. Nosotros creemos que el presente proyecto aportará conocimiento sobre las características de las vías oxidativas de proteínas en matrices complejas y que podrá ser utilizado para diseñar estrategias productivas tendientes a disminuir el deterioro de la calidad de la leche debido a la exposición a energía radiante. Parte de la experiencia ganada por el grupo ha sido ya volcada a subsanar dificultades y problemas de oxidación y deterioro de la calidad de alimentos. Además, se contribuirá a discernir la paradoja que existe en el área sobre las propiedades oxidantes/antioxidantes de los polifenoles y la relación entre estas y el estado oxidativo de un alimento. The biochemical reactions that occur as a result of food treatment and storage, improve food security, sensory properties and shelf life. Heat treatment, exposure to light and oxygen can cause oxidative damage to lipids and proteins. Oxidative processes in complex matrices display distinctive features that do not appear when the components are individually subjected to oxidation. The hypothesis is that protein oxidation in complex food matrices alters the structure and functional properties of proteins and that the modifications vary according to process conditions and food composition. The main goal is to study oxidation of complex food matrices (milk, honey) with different processes and materials used in the industry. The specific aims are: 1. To study protein oxidation in whole milk and skim subject to various technological processes. The same experiences will be done with serum albumin and isolated whey proteins to compare complex and simple matrices. 2. To determine the relationship between oxidation and milk protein composition, and changes in casein and beta-lactoglobulin. 3. Analyze the impact of technological processes at the level of primary production on markers of inflammation and redox (antioxidant capacity and protein carbonyls). 4. Compare characteristics of chemical composition and oxidation state of milk. 5. Determine secondary metabolites of honey responsible for the antioxidant capacity of these. 6. To evaluate the total antioxidant capacity unifloral honey. This project will provide knowledge about characteristics of oxidative pathways of proteins in complex matrices that can be used to design production strategies aimed at reduce the deterioration of milk quality. Also, it would help to discern the paradox that exists on the oxidants/antioxidants properties of polyphenols and the relationship between these and the oxidative status of a food.