NDK Interacts with FtsZ and Converts GDP to GTP to Trigger FtsZ Polymerisation - A Novel Role for NDK

Introduction Nucleoside diphosphate kinase (NDK), conserved across bacteria to humans, synthesises NTP from NDP and ATP. The eukaryotic homologue, the NDPK, uses ATP to phosphorylate the tubulin-bound GDP to GTP for tubulin polymerisation. The bacterial cytokinetic protein FtsZ, which is the tubulin homologue, also uses GTP for polymerisation. Therefore, we examined whether NDK can interact with FtsZ to convert FtsZ-bound GDP and/or free GDP to GTP to trigger FtsZ polymerisation. Methods Recombinant and native NDK and FtsZ proteins of Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis were used as the experimental samples. FtsZ polymersation was monitored using 90 degrees light scattering and FtsZ polymer pelleting assays. The gamma 32P-GTP synthesised by NDK from GDP and gamma 32P-ATP was detected using thin layer chromatography and quantitated using phosphorimager. The FtsZ bound P-32-GTP was quantitated using phosphorimager, after UV-crosslinking, followed by SDS-PAGE. The NDK-FtsZ interaction was determined using Ni2+-NTA-pulldown assay and co-immunoprecipitation of the recombinant and native proteins in vitro and ex vivo, respectively. Results NDK triggered instantaneous polymerisation of GDP-precharged recombinant FtsZ in the presence of ATP, similar to the polymerisation of recombinant FtsZ (not GDP-precharged) upon the direct addition of GTP. Similarly, NDK triggered polymerisation of recombinant FtsZ (not GDP-precharged) in the presence of free GDP and ATP as well. Mutant NDK, partially deficient in GTP synthesis from ATP and GDP, triggered low level of polymerisation of MsFtsZ, but not of MtFtsZ. As characteristic of NDK's NTP substrate non-specificity, it used CTP, TTP, and UTP also to convert GDP to GTP, to trigger FtsZ polymerisation. The NDK of one mycobacterial species could trigger the polymerisation of the FtsZ of another mycobacterial species. Both the recombinant and the native NDK and FtsZ showed interaction with each other in vitro and ex vivo, alluding to the possibility of direct phosphorylation of FtsZ-bound GDP by NDK. Conclusion Irrespective of the bacterial species, NDK interacts with FtsZ in vitro and ex vivo and, through the synthesis of GTP from FtsZ-bound GDP and/or free GDP, and ATP (CTP/TTP/UTP), triggers FtsZ polymerisation. The possible biological context of this novel activity of NDK is presented.

Functional expression and purification of Anabaena PCC 7120 XisA protein

Anabaena PCC 7120 xisA gene product mediates the site-specific excision of 11,278 bp nifD element in heterocysts formed under nitrogen starvation conditions. Although XisA protein possesses both site-specific recombinase and endonuclease activities, till date neither xisA transcript nor XisA protein has been detected. Gene encoding XisA protein was isolated from plasmid pMX25 and overexpressed in Escherichia coli BL21 DE3 yielding 7.7 mg enzyme per L of growth culture in soluble fraction. His-tagged XisA was purified using Ni-NTA affinity chromatography with 95% recovery. The purified XisA showed a single band on SDS-PAGE with molecular mass of 52 kDa. Identity of XisA was confirmed by MALDI-TOF analysis and functionality of enzyme was confirmed using restriction digestion. A PCR based method was developed to monitor excision by XisA, which displayed near 100% activity in E. coli within 1 h at 37 degrees C on LB under static condition. (C) 2015 Elsevier Inc. All rights reserved.

Differential proteomic and genomic profiling of mouse striatal cell model of Huntington's disease and control; probable implications to the disease biology

Huntington's disease (HD) is an autosomal dominant disorder of central nervous system caused by expansion of CAG repeats in exon1 of the huntingtin gene (Htt). Among various dysfunctions originated from the mutation in Htt gene, transcriptional deregulation has been considered to be one of the most important abnormalities. Large numbers of investigations identified altered expressions of genes in brains of HD patients and many models of HD. In this study we employed 2D SDS-PAGE/MALDI-MS coupled with 2D-DIGE and real-time PCR experiments of an array of genes focused to HD pathway to determine altered protein and gene expressions in STHdh(Q111)/Hdh(Q111) cells, a cell model of HD and compared with STHdh(Q7)/Hdh(Q7) cells, its wild type counterpart. We annotated 76 proteins from these cells and observed differential expressions of 31 proteins (by 2D-DIGE) involved in processes like unfolded protein binding, negative regulation of neuron apoptosis, response to superoxides etc. Our PCR array experiments identified altered expressions of 47 genes. Altogether significant alteration of 77 genes/proteins could be identified in this HD cell line with potential relevance to HD biology. Biological significance: In this study we intended to find out differential proteomic and genomic profiles in HD condition. We used the STHdh cells, a cellular model for HD and control. These are mouse striatal neuronal cell lines harboring 7 and 111 knock -in CAG repeats in their two alleles. The 111Q containing cell line (STHdh(Q111)/Hdh(Q111)) mimics diseased condition, whereas the 7Q containing ones (STHdh(Q7)/Hdh(Q7)), serves as the proper control cell line. Proteomic experiments were performed earlier to obtain differential expressions of proteins in R6/2 mice models, Hdh(Q) knock -in mice and in plasma and CSF from HD patients. However, no earlier report on proteomic alterations in these two HD cell lines and control was available in literature. It was, therefore, an important objective to find out differential expressions of proteins in these two cell lines. In this study, we annotated 76 proteins from STHdh(Q7)/Hdh(Q7) and STHdh(Q111)/Hdh(Q111) cells using 2D-gel/mass spectrometry. Next, by performing 2D-DIGE, we observed differential expressions of 31 proteins (16 upregulated and 15 downregulated) between these two cell lines. We also performed customized qRT-PCR array focused to HD pathway and found differential expressions of 47 genes (8 gene exptessions increased and 39 genes were decreased significantly). A total of 77 genes/proteins (Htt downregulated in both the studies) were found to be significantly altered from both the experimental paradigms. We validated the differential expressions of Vim, Hypk, Ran, Dstn, Hspa5 and Sod2 either by qRT-PCR or Western blot analysis or both. Out of these 77, similar trends in alteration of 19 out of 31 and 38 out of 47 proteins/genes were reported in earlier studies. Thus our study confirmed earlier observations on differential gene/protein expressions in HD and are really useful. Additionally, we observed differential expression of some novel genes/proteins. One of this was Hypk, a Htt-interacting chaperone protein with the ability to solubilize mHtt aggregated structures in cell lines. We propose that downregulation of Hypk in STHdh-Qm (Q111)/Hdh(Q111) has a causal effect towards HD pathogenesis. Thus the novel findings from our study need further research and might be helpful to understand the molecular mechanism behind HD pathogenesis. (C) 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.

Producción de la proteína recombinante Kre9 del hongo patógeno Candida albicans con actividad proinflamatoria y protumoral.

Candida albicans es un hongo dimórfico capaz de desencadenar una respuesta proinflamatoria mediada por citocinas que incrementa la adhesión de células tumorales al endotelio hepático, favoreciendo así el proceso de metástasis. La proteína Kre9 de C. albicans está relacionada con la citocina IL-1β, la cual participa en la cascada proinflamatoria. Para estudiar el efecto de la proteína Kre9 en la actividad prometastática de C. albicans, esta se clonó en Escherichia coli mediante el vector comercial pETBlue-2; seguidamente se expresó y purificó mediante cromatografía. Los resultados indican que el procedimiento se llevó a cabo correctamente ya que se identificó la presencia de la proteína mediante SDS-PAGE y Western Blot. Por último, se retiraron las endotoxinas de la muestra mediante tratamiento con agarosa-polimixina y se determinó la concentración final de proteína y endotoxinas.

Fischartbestimmung von Caviar durch Protein- und DNA-Analyse

Deutscher Caviar, made from roe of lumpfish or capelin, gives species specific patterns in protein electrophoresis. The same techniques can be used to differentiate caviar from salmon and trout. The differentiation of sturgeon caviar (beluga, osietra, sevruga) is possible by isoelectric focusing, but not by SDS-PAGE. PCR-based methods of DNA-analysis for identification of the origin of sturgeon caviar are under development.

Papel das hemaglutininas 67-72p de Corynebacterium diphtheriae na ligação a proteínas plasmáticas, superfícies celulares, invasão e indução de apoptose

Corynebacterium diphtheriae pode ser isolado tanto de quadros de difteria clássica, quanto de infecções sistêmicas, como endocardite. O fibrinogênio (Fbn) e a fibronectina (Fn) são glicoproteínas presentes na matriz extracelular de tecidos conjuntivos. A influência destas proteínas na patogênese das infecções locais e invasivas causadas por C. diphtheriae é objeto de estudo devido ao fato do bacilo diftérico poder ser encontrado em lesões nas quais o Fbn e a Fn são predominantes, incluindo a pseudomembrana diftérica e vegetações cardíacas presentes na endocardite infecciosa. São crescentes as evidências de que o C. diphtheriae pode, além de aderir, ser internalizado por células em cultura. No presente estudo, investigou-se a participação de C. diphtheriae e das proteínas de superfície 67-72p na aderência à Fn e ao Fbn de plasma humano e a eritrócitos. A aderência às células HEp-2 e internalização também foram analisadas. A participação de 67-72p nos mecanismos de morte celular foi avaliada através das colorações por Azul de Tripan e 46-diamidino-2-fenil indol (DAPI), pelo ensaio de redução utilizando dimetil-tiazol-difenil tetrazólio (MTT) e por citometria de fluxo. As 67-72p foram extraídas da superfície da amostra toxigênica C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 através de processos mecânicos e precipitação com sulfato de amônio saturado. Análises por SDS-PAGE e immunoblotting detectaram a presença das bandas protéicas de 67 e 72kDa nas amostras toxinogênicas e atoxinogênicas analisadas, as quais pertenciam aos biotipos fermentador e não fermentador de sacarose. C. diphtheriae foi capazes não só de formar agregados na presença de plasma de coelho, mas também de converter Fbn em fibrina independentemente da presença do gene tox. No entanto, a amostra atoxinogênica ATCC 27010 (tox-) foi menos aderente ao Fbn do que a homóloga ATCC 27012 (tox+). A interação bacteriana com eritrócitos foi inibida somente pela Fn. Ligações entre Fn e/ou Fbn com 67-72p foram demonstradas por dot blotting, ELISA e/ou ensaios utilizando fluorescência. As 67-72p foram capazes de inibir as interações bacterianas com o Fbn, indicando que 67-72p podem participar do processo de aderência do patógeno aos tecidos do hospedeiro. Através da microscopia óptica, demonstrou-se a ligação de 67-72p adsorvidas em microesferas de látex com células HEp-2. Anticorpos de coelho do tipo IgG anti 67-72p interferiram somente com a expressão do padrão de aderência do tipo difuso, normalmente apresentado pela amostra CDC-E8392. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e a inibição da internalização bacteriana pela IgG anti 67-72p ou por 67-72p indicaram o papel de 67-72p como invasina. Alterações do citoesqueleto de células HEp-2 com acumulação de actina polimerizada, induzida por microesferas sensibilizadas com 67-72p, foi observada pelo fluorescent actin staining (FAS) test. Foi visualizado um aumento no número de bactérias viáveis no compartimento intracelular após tratamento de células HEp-2 ou dos microrganismos com Fn. A presença de partículas de látex adsorvidas com 67-72p no interior de vacúolos frouxos em células HEp-2 sugeriu que estas proteínas podem causar efeito citotóxico. A avaliação através das colorações com Azul de Tripan, DAPI e os ensaios de redução utilizando MTT demonstraram um decréscimo na viabilidade de células tratadas com 67-72p. As mudanças morfológicas observadas 3 horas após o início do tratamento com 67-72p incluíram vacuolização, fragmentação nuclear e formação de corpúsculos apoptóticos. A citometria de fluxo revelou um decréscimo de 15,13% no volume/tamanho de células tratadas com 67-72p. Além disso, o ensaio utilizando Iodeto de Propídio (IP) e Anexina V (AV)-FITIC demonstrou que havia 66,1% de células vivas (IP-/AV-), 16,6% de células em apoptose inicial (IP-/AV+) e 13,8% de células em apoptose tardia ou necrose secundária. Em conclusão, as 67-72p estão diretamente envolvidas na interação com Fn e Fbn. As proteínas não fimbriais 67-72p são hemaglutininas implicadas na aderência a células respiratórias e na internalização. Além disso, estas proteínas podem atuar como fatores de virulência em potencial para induzir apoptose de células epiteliais nos estágios iniciais da difteria e nas infecções invasivas causadas pelo C. diphtheriae

Identification of the main allergen sensitizers in an Iran asthmatic population by molecular diagnosis

Background: There has been a significant growth in the prevalence of allergy, mainly associated to IgE-mediated disorders such as asthma and rhinitis. The identification of atopy in asthmatic patients through the measurement of specific IgE can help to identify risk factors that cause asthmatic symptoms in patients. The development and use of individualized allergen-based tests by the Component Resolved Diagnosis has been a crucial advance in the accurate diagnosis and control of allergic patients. The objective of this work was to assess the usefulness of molecular diagnosis to identify environmental allergens as possible factors influencing the development and manifestation of asthma in a group of asthmatic patients from Iran. Methods: Studied population: 202 adult asthmatic patients treated at the Loghman Hakim Hospital and Pasteur Institute of Teheran (Iran) from 2011 to 2012. Specific IgE determined by the ImmunoCAP system were used to both evaluate the patients' atopic condition and the molecules involved in the allergic sensitization. SDS-PAGE IgE-immunoblotting associated with mass spectrometry was carried out to study the cockroach IgE-binding sensitizing proteins. Results: Forty-five percent of all patients could be considered atopic individuals. Eighty-two percent of atopic patients were sensitized to pollen allergens. The Salsola kali (Sal k 1) and the Phleum pratense (rPhl p 1 and/or rPhl p 5) major allergens were the most common sensitizers among pollens (71% and 18%, respectively). Thirty-five percent of the atopic population was sensitized to cockroach. Four different allergens, including a previously unknown alpha-amylase, were identified in the cockroach extract. No significant associations could be demonstrated between the severity of asthma and the specific IgE levels in the atopic population. Statistical analysis identified the Sal k 1 as the main protein allergen influencing the development and expression of asthma in the studied population. Conclusions: Pollen and cockroach were the most relevant allergen sources in the asthmatic population. The Salsola kali major allergen was the main cause for sensitization in the atopic patients suffering asthma. Using the Component Resolved Diagnosis, it was possible to identify a new Blattella germanica cockroach allergen (Blattella alpha amylase 53 kDa) that could sensitize a relevant percentage of this population.

Detecção de anticorpos séricos produzidos contra as proteínas do bacteriófago 17 do Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) é uma bactéria associada à Periodontite Agressiva (PA). Ela invade tecidos moles, com ocorrência de lisogenia e bacteriófagos presentes em até 69% das subespécies. Estudos in vitro sugerem que a indução do bacteriófago (Aa17) ocorre numa co-cultura de Aa lisogênico com fibroblastos humanos. Se esta interação ocorre in vivo, com liberação do vírus, uma reação imunológica contra o Aa17 aconteceria. O objetivo deste estudo é constatar se anticorpos (AC) contra proteínas do Aa17 existem e estão associados à doença periodontal. Um objetivo adicional foi testar a resposta de AC contra os sorotipos do Aa. 52 indivíduos participaram: 31 com PA, 5 com Periodontite Crônica (PC) e 16 com Periodonto Saudável (PS). Soro foi coletado após a classificação clínica. As proteínas do Aa17 foram obtidas de preparações purificadas. As subespécies do Aa utilizadas para amostras de proteínas através de sonicação foram: 43717(American Tissue Culture Collection - ATCC) sorotipo A, 43718 (ATCC) sorotipo B, 33384 (ATCC) sorotipo C, IDH781 sorotipo D, NJ9500 sorotipo E and CU1000 sorotipo F. As proteínas foram separadas em géis de poliacrilamida e transferidas para membranas de nitrocelulose. As reações de Western-blotting ocorreram com o AC primário sendo o soro de cada indivíduo. Todas as membranas foram lidas pelo sistema Odyssey que captura sinais no AC secundário (antihumano). A resposta de AC contra ao menos uma proteína do Aa17, assim como pelo menos um sorotipo do Aa foi observado em todos, com exceção de dois indivíduos (com PS), participantes. Um indivíduo do grupo PC e três do PA tiveram resposta de AC contra alguns, mas não todos os sorotipos do Aa. A resposta de AC contra todos os sorotipos foi o achado mais comum nos grupos PA (28/31), PS (14/16) e PC (4/5). A resposta de AC contra o complexo de proteínas do Aa17 foi observado em 7 indivíduos com PA, 2 com PC e 6 com PS. A presença de AC contra qualquer proteína do Aa17 tem significância estatística (p= 0,044), assim como a resposta de AC contra o sorotipo C (p= 0,044). Reações intensas foram vistas quando o soro reagiu contra proteínas do sorotipo C; em alguns casos um sinal tão forte que cobriu a maioria da faixa. Essa resposta intensa esteve presente em 17, 3 e 1 dos indivíduos com PA, PC e PS e tem significância estatística entre os grupos PA e PS (p= 0,001). A resposta de AC contra uma proteína do Aa17 ou seu complexo foi observado em todos os grupos. Esse achado sugere que a indução in vitro do Aa17 poderia também ocorrer in vivo, embora não sendo necessariamente associada à periodontite. A resposta de AC contra vários sorotipos do Aa foi um achado comum e não associado com a doença. Entretanto, a presença e a intensidade da resposta de AC contra o sorotipo C está associada à PA.

Formação de biofilmes por Enterococcus faecium sensível e multirresistente aos antimicrobianos: características à proteômica

Enterococcus faecium tem se destacado no cenário das infecções hospitalares, particularmente, amostras portadoras de características de multirresistência. Apesar de serem responsabilizados como agentes etiológicos em diferentes quadros clínicos, fatores associados a patogênese das infecções ainda não estão esclarecidos. Entretanto, sabe-se que a capacidade de formação de biofilmes pode ser responsabilizada como um dos atributos capazes de promover o papel patogênico desses microrganismos. Assim sendo, este estudo se propôs a investigar a capacidade de formação de biofilmes por duas amostras de E. faecium: SS-1274 (derivada da amostra tipo da espécie) e CL-6729 (multirresistente e pertencente a um complexo clonal globalmente disperso). As amostras foram caracterizadas fenotipica e genotipicamente para confirmação da identificação, determinação da susceptibilidade a 17 antimicrobianos, caracterização da concentração mínima inibitória para ampicilina, gentamicina e vancomicina, determinação do genótipo vanA e detecção de genes associados a expressão dos genes asa1, cylA, esp, gelE e hyl. A análise quantitativa da formação por 24h e 72h dos biofilmes foi realizada por metodologia do cristal violeta, em placas de microtitulação de poliestireno. Foram construídas curvas de formação pela avaliação da DO570nm das preparações coradas por cristal violeta em períodos de tempo de 2h a 74h. A influência de subCMIs de ampicilina, gentamicina e vancomicina na formação de biofilmes de E. faecium foi também caracterizada em ensaios de quantificação da biomassa. A presença de DNA e proteínas foi avaliada em ensaios de destacamento e por fluorimetria. A arquitetura, distribuição espacial e reação aos fluorocromos Syto9 e SYPRO Ruby Protein foram evidenciadas por microscopia confocal de varredura a laser. Análises proteômicas através da avaliação por SDS-PAGE e por ESI-Q-TOF também foram empregadas para avaliação de biofilmes versus crescimento planctônico. Nossos resultados demonstraram que a amostra CL-6729 apresentou uma maior biomassa nos tempos analisados. Apesar da menor quantidade de biomassa da amostra SS-1274, o perfil da curva de formação foi semelhante a CL-6729. As análises da matriz por ensaios quantitativos e microscopia confocal revelaram que proteína parece ser um importante constituinte para ambas as amostras, entretanto biofilmes formados na presença de da CMI e durante 24h, parecem sofrer alterações na constituição. Os resultados relativos às espectrometrias de massa sugerem que células de biofilmes de E. faecium podem também estar metabolicamente ativas, devido a identificação de um considerável número de proteínas relacionadas ao metabolismo e divisão celular, similarmente às células planctônicas. No entanto, investigações complementares são necessárias para quantificar as diferenças relacionadas a sua expressão. Foi observado que ambas as amostras independente das variações fenotípicas e genotípicas são capazes de formar biofilmes maduros exibindo constituição e arquitetura similares. Entretanto, nossos resultados sugeriram que cada amostra responde as diferentes situações de acordo com seus determinantes de virulência e resistência.

Análise comparativa do reconhecimento celular de antígenos dos subgêneros de Leishmania na leishmaniose tegumentar americana

Células Mononucleares do sangue periférico (CMSP) oriundas de 28 pacientes que residem em áreas endêmicas para Leishmania braziliensis foram estudados. Destes, 10 encontravam-se na fase ativa da doença e 18 curados clinicamente para as lesões de leishmaniose. As células foram cultivadas frente à antígenos de 6 espécies de Leishmania: Leishmania: L. (V.) braziliensis (LbAg), L. (V.) guyanensis (LgAg), L. (V.) lainsoni (LlAg), L. (V.) naiffi (LnAg), L. (L.) amazonensis (LaAg), L. (L.) chagasi (LcAg) e antígeno de concanavalina A como mitógeno. Os resultados foram expressos em índices de estimulação (IE). Temendo uma possível degradação protéica, os antígenos foram preparados com PBS e com PBS tampão antiproteolítico e o perfil eletroforético foi analisado através de SDS-PAGE. Os sobrenadantes das culturas foram estocados para os ensaios de ELISA para detecção de IFN-γ. A análise do perfil eletroforético dos antígenos de diferentes espécies de Leishmania demonstrou um padrão distinto e heterogêneo e aparentemente, não foi observada degradação assim que os antígenos foram preparados e 10 meses de estoque. Entretanto bandas parecem ser compartilhadas entre as espécies, que podem estar associadas a uma conservação de antígenos entre as espécies de Leishmania. A resposta proliferativa dos linfócitos (RPL) dos pacientes da forma ativa foi mais intensa para LbAg (1710,3), seguido de LnAg (177,6), LaAg (16,89,8) e LlAg (1410,1), e menos intenso para LgAg (11,46,6). Quando os IE obtidos para LbAg foram comparadas com outras espécies observou-se diferenças para LgAg (p<0.004) e LlAg (p<0.03). Não foram encontrados diferenças no perfil protéico dos extratos antigênicos produzidos com e sem inibidores de protease. Os estímulos obtidos de CMSP de indivíduos curados clinicamente não demonstraram diferenças quando comparados com aqueles da fase ativa da doença. O índice de estimulação (médiadesvio padrão) frente estímulos antigênicos pouco variou entre as espécies: LbAg - 22,222,2, LnAg - 15,911,5, LgAg - 20,720,6, LlAg - 14,710,1, LaAg - 15,1114,5 e L. chagasi - 13,78). A produção de IFN-γ quantificada nos sobrenadantes das culturas frente aos antígenos totais e solúvel mostrou níveis da citocina mais elevados quando utilizou-se antígenos total de L. guyanensis (568,1544,5; mediana: 518,5 pg/mL) quando comparadas às outras espécies analisadas. Porém quando analisadas o antígeno solúvel, podemos observar que tanto para os antígenos da espécie L. braziliensis quanto para L. naiffi, a fração total obteve os maiores índices de estímulos quando comparadas com a fração solúvel. Estes estudos sugerem que há uma reatividade cruzada entre as espécies dos subgêneros Viannia e Leishmania.

无根萍生物学特性研究

无根萍属（Wolffia ）隶属于浮萍科天南星目，是世界上最小的被子植物。该属植物繁殖速度快;易于培养;结构简单，只具有一个雄蕊和一个雌蕊;自然状态下通常为克隆繁殖，遗传结构高度一致，具备特定研究目的模式植物的特点，正在或已经成为一些实验室研究光合作用、生物反应器、毒理学、生态修复和环境监测等的重要模式生物材料;同时还被作为建造航天生活仓和地外生命支撑系统的首选植物。该属植物蛋白含量高且氨基酸组分平衡，营养价值可与大豆相媲美。但该属植物一直是分类学界的疑难类群，不同的学者对该属的分类处理比较混乱;其次，对该属的生物地理研究也很不够，尤其是对国产类群的研究;另外，W. globosa 作为该属中国分布的物种，其生理学特性和形态结构发育还缺乏研究。为此，本文通过mat K 基因测序、RAPD 标记等手段，结合野外和室内的长期观测，对其分类和中国的地理分布以及生理学特性进行了研究。针对浮萍科植物作为水生植物，其对重金属和芳香烃衍生物的耐受逆境能力大小，和对淡水水体环境生态的指示作用。本文研究了W. globosa 具解毒功能的谷胱甘肽转硫酶的活性;最后，探索了从黄鳝（Monpterus albus Zuiew ）中分离纯化GSTs 的技术与方法并对maGST 的部分特性进行了研究。主要研究结果如下： 1. Wolffia 系统分类学研究 前人认为，Wolffia 柱头的颜色是重要的分组、分种检索性状。我们对其长期、活体、原位、实时跟踪观测结果表明，柱头颜色是Wolffia 个体发育上的变化过程，不是一个稳定性状，用作Wolffia subgroup 内组的划分特征和种的鉴别特征是不适合的。在此基础上我们重新修定了该属的分种检索表。利用形态分类学性状——气孔、长/宽、高/宽以及最大宽度在水面上还是水面下等性状，认为中国分布的类群应是W. globosa，但亦有W. neglecta 存在的证据。mat K 基因片段结果支持形态学的结论。通过广泛的野外采集，在我国北京、河北和吉林发现Wolffia 的新分布。 2. 中国Wolffia 居群遗传学研究 以RAPD 分子标记对广泛分布的居群遗传多样性研究表明，无根萍属植物主要以无性繁殖方式繁育，居群主要由单一克隆后代组成，如海河流域以及松花江流域居群;但一些居群亦兼有性繁殖方式，并具较高的遗传多样性，如武汉、海南居群。利用MVSP, Popgene 和Ntsys 等分析方法探讨了中国产Wolffia 居群遗传多样性和地理分布格局间关系。 3. W. globosa 的生理学研究 建立了较为完善的W. globosa 的无菌培养和保存体系。W. globosa 在逆境中，会形成休眠体;同时，发现不同居群甚至不同克隆系之间其抗逆性和生长速度存在着显著差异，差异最大的如海南文昌居群的生长速率，是长春居群的4.19 倍;不同的时间统计生长周期存在着不同结果，生长节律每天有两个生长高峰呈双“S”型;W. globosa 的耐受温度范围和pH 范围广;低浓度的IAA，GA，6-BA， EDDHA-Fe 以及EDTA 等物质具有促进W. globosa 生长的特性;但是，所有这些处理均没能促使W. globosa 从营养生长转入生殖生长。 4. W. globosa 的解剖学研究 W. globosa 通常是进行克隆繁殖，通过组织切片发现无性分枝子体还未伸出母株之前就已经完成分化，与此同时分枝子体中又分化出新的子体，分枝呈聚伞状，子体生长方向彼此相对;另外，生殖生长结构的分化也是在母体中完成的;生殖生长点与营养生长点不是同一生长点。 5. 浮萍科植物的毒理学研究 以重金属Cr3+和芳香烃衍生物CDNB 溶液处理Wolffia，Spirodela 和Lemna， 三种水生生物，结果表明Wolffia 比Spirodela， Lemna 对重金属和芳香烃衍生物有更强的抗逆能力，如在同等条件下对于Cr3+Wolffia 的半致死剂量800GB(≈ 80mg/L)，而Spirodela 和Lemna 则分别为10mg/L;20mg/L;表明W. globosa 是一个优良的生态环境修复植物。与此同时，研究了W. globosa 中具有解毒功能的GSTs 粗酶液活力在不同浓度的重金属离子（Cu2+和Cd2+）以及芳香烃衍生物（CDNB 和NBD-Cl）随处理时间的变化情况。 6. 从水生生物黄鳝Monpterus albus Zuiew 中分离纯化GSTs 的研究GSTs 活性的变化是环境监测的一个Biomarker，为此研究从M. albus 中分离 纯化GSTs 的技术与方法。经GSH 亲和层析纯化的酶活力为粗酶液的207 倍，进而鉴定了maGST 的部分特性。SDS-PAGE 电泳和MALDI-TOF/MS 表明MaGST 为同源二聚体，分子量约为52kDa，单亚基分子量约为26 kDa。maGST 酶动力学表明对CDNB 为13.07 ± 0.37 微摩尔每分钟每毫克蛋白;对NBD-Cl 为5.54 ± 微摩尔每分钟每毫克蛋白;对ECA、4-NPA 几乎没有活性。在GSH 底物饱和，CDNB 的Km 值和Vmax 分别为0.32 mM 和16.19 微摩尔每分钟每毫克蛋白;CDNB 底物饱和，GSH 的Km 值和Vmax 分别为0.44 mM 和28.83 微摩尔每分钟每毫克蛋白。maGST 的酶活性pH 值较宽，温度范围广：在pH7.0-7.5 具有最大速度，在pH6.5 和pH8.5 时分别具有65%和72%的酶活力;在45℃时具有最大活性，30℃和55℃时为最大活力的80%，60℃几乎完全丧失酶活力。

冬小麦春化过程中低温诱导的开花特异mRNA及蛋白质的合成

本实验以冬小麦“农大139”（T. aestivum L. cv. Nongda 139）为材料对春化作用诱导开花的分子机制作了一些探讨，主要结果如下： 1. 应用SDS-PAGE及高分辨双向电泳技术，比较了冬小麦给予春化、脱春化及超期春化处理后的电泳图谱，并结合对春小麦对照样品的分析，结果发现有一些蛋白质和春化作用紧密相关，它们随春化而出现、随脱春化而消失，并在不经低温处理即可以开花的春小麦对照中存在。也就是说，这些开花特异的蛋白质（FSPs）的存在或在诱导下的合成和小麦抽穗开花能力的获得存在一种正相关，因此推测它们在冬小麦由营养生长状态向生殖生长状态转变的过程中起了关键性的作用。 2. 从不同处理的及对照样品中提取mRNA进行体外翻译的结果表明：春化作用过程中低温诱导了mRNA组分的变化，其中一些新产生的mRNA种类与春化诱导的开花能力的获得呈高度相关，即它们是开花特异的（Flower Specific），它们中有的只在春化的特定时期存在并起作用。 3．比较体内分析及体外翻译的结果发现，一些开花特异蛋白质（FSPs）可以同时在体内提取物及体外翻译产物中检测到，因此，春化作用中开花特异蛋白质诱导合成的调节很可能发生在转录水平上。 4．基于以上结果的分析可以推测春化诱导开花是低温导致了开花特异基因表达的结果，超期春化的效应不能被脱春化所逆转则系编码这些开花特异蛋白质的基因在长期低温条件下转变成了组成性表达所致。 有关低温诱导产生的开花特异蛋白质的性质与功能及编码这些蛋白质的基因尚需进一步研究。

小麦×玉米的小麦DH后代的分子生物学分析

植物远缘杂交是作物育种实践及其相关的基础遗传中应用最广泛的技术之一，几乎涉及到所有与栽培作物有关的科属内相对近缘的植物种类。除核型稳定的种间杂交可得到杂种外，还可以利用核型不稳定的种间杂交过程中父本染色体全部被消除的现象，通过胚培养和加倍处理获得大量的双单倍体（DH）杂交后代。然而，这种从小麦与玉米杂交获得的小麦DH后代与其理论上应完全同质的遗传表现却不相符，总有2-5%的DH植株发生了形态学变异，虽然没有明显的来自玉米的性状特征，而且一些研究者也认为它们是配子无性系变异，但是，不论是理论上还是一些间接的细胞学和生化证据都表明，有玉米的染色体DNA通过受精过程转移到小麦DH后代的基因组中，然而到目前为止，仍缺乏DNA水平上的直接证据。 本文在对来自小麦 * 玉米的谱通小麦DH系进行生化分析取得初步证据的基础上，构建玉米的随机基因组文库，从中筛选玉米的重复DNA序列作探针分别对普通小麦和波斯小麦的DH群体进行了系统的RFLP分析，并用有关的玉米重复列克隆对一些禾本科种和不同的玉米生物型基因组进行了比较研究，主要结果如下： 1、八种同工酶电泳分析表明，MDH、ADH、GDH、SKDH4种脱氢酶和GOT在后代中没有检测到任何变异，但21株普通小麦的DH后代群体中有7株在PER同工酶的慢区出现了增加一条酶带的变异，这条带在亲本小麦和玉米中均没有，它们与通常报道的无性系变异十分类似。其中有一株（第4号株）在迁移率为0.22的位置上出现了一条小麦所不具有的酶活性较强的EST带，在玉米同迁移率的位置上也有一条带，但活性十分微弱。此外，大部分小麦DH后代的AMY同工酶恬性有十分明显的增强。 2、可溶性蛋白质的SDS-PAGE分析，在小麦的DH后代中，有几株的变异很明显，其中第4、7、19号株（图2）在分子量为43000道尔顿的位置上出现了和玉米同迁移率而小麦不具有的蛋白质带，这强烈地暗示了玉米DNA的确通过受精作用导入小麦。 3、构建了玉米的随机基因组文库，依据菌落原位杂交结果，从中挑出了500个重组克隆。用其中的100个强信号的重复DNA克隆为探针对亲本小麦和玉米进行了RFLP筛选，其中80多个为玉米基因组特异的，9个与小麦有部分同源性，随后用它们探针分别对两个小麦DH群体进行RFLP分析。 4、用上文筛选的玉米特异的重复DNA克隆作探针进行RFLP分析，只有玉米的MR64克隆同时导入到两个小麦群体的各一株后代中，即普通小麦DH系的18号株和波斯小麦DH系的15号株检测到强杂交信号;另外一个克隆MR72只在4株波斯小麦DH后代中有杂交信号，这个结果首次从DNA水平上证明，的确有某些玉米特异的DNA序列通过受精作用以很低的频率转移到小麦DH后代的基因组中。 5、与小麦有部分同源性的玉米克隆MR13和MR50在一些普通小麦DH后代中检测到了缺失变异。特别是用MR13在普通小麦DH系的18号株（即导入了玉米特异的MR64的DNA的那一株小麦DH后代）的基因组中检测到了大幅度的限制性片段长度的变化，即原来的4.3kb的强信号带消失了，取而代之的是增加40kb、15kb、2.5kb和2.0kb四条杂交带，这要么与小麦基因组DNA较大的重俳事件有关，要么是由外源的玉米DNA插入造成的，但从增加的片段长度如此之大以及杂交信号变弱来看，它很可能就是玉米DNA插入到这个较强信号的小麦单拷贝序列中的结果。用小麦的DNA克隆pTa71也检测到了明显的变异。 6、测序分析发现，克隆MP64的插入片段长度为695bp，A+T含量为58%，经在GENEBANK中检索证实它是一个新克隆的DNA序列。序列中分别含有两对正向和反向重 序列及三个回文序列，对多种酶切的玉米基因组的RFLP分析表明它是一个带1-3个主串联重复单位的散布重复序列，在序列中的CCGG的第二个C高度甲基化，拷贝数约为5600左右。染色体原位杂交表明，MR64在玉米的每条染色体上均有分布，但拷贝数不同，这暗示它可能与玉米基因组的演化历程有密切的关系。 7、比较分析发现，MR64是玉米基因组特异的;而MR72在高粱、珍株粟、糜子和狼尾草等四个和玉米较近缘的种的基因组中有部分同源序列，这个比较结果更加肯定了小麦DH系所新增的DNA序列的确是异源的玉米DNA通过受精过程导入的。 8、初步分析发现，玉米的卫星DNA克隆MR4和其它卫星DNA一样也有严谨的重复等级结构，而且在主要禾本科种基因组中有较低的同源性。经在GENEBANK检索，串联重复DNA克隆MR68是一个新克隆的DNA序列，它在不同的玉米生物型基因组中表现出明显的分化特征，可用它作进一步的基因组的比较分析。 9、本文对染色体消除过程度中异源小片段DNA导入的可能机制和散布重复序列在远缘杂交的异源DNA鉴定中的应用进行了讨论，并分析了染色体消除型远缘杂交所获得的DH后代的变异来源。

陆地棉组织培养及转化研究

1．以MS无机盐+B 5有机成分为基本培养基，附加2，4-D，KT，ZT等激素，以农艺性状良好，抗枯萎病的棉花品种“冀492”为材料，建立了愈伤组织诱导，体细胞胚胎发生和植株再生体系． 2．实验结果表明，2，4-D是诱导愈伤组织产生的促进因子，效果明显好于其它生长素类物质，但是随着培养基中2，4-D浓度的升高，愈伤组织状态也会变差，褐化严重，而且，附加O.lppm 2，4-D，O.lppm K T的培养基是较为合适的培养基．IAA，NAA对愈伤组织的诱导不十分理想，此外，愈伤组织的产生还同外植体，基因型和一些物理条件有关， 胚性愈伤组织的产生，需不断调节培养基中激素浓度，逐步降低2，4 -D浓度，并添加低浓度ZT，胚状体要在去除2，4-D的培养基上才能产生．虽然，2，4-D对于胚性愈伤组织的诱导是必须的，但是却抑制胚状体的发育． 3．培养基中硝态氮和氨态氮比例，激素浓度和种类，活性炭的添加，对于胚状体的萌发和成熟有重要影响，硝酸钾加倍，硝酸铵减半，并附加低浓度ABA和活性炭是胚状体诱导和成苗（去除ABA）的适宜培养基，而附加0.2ppm N A A，0.2ppm ZT和活性炭的M S2培养基是胚状体成熟的适宜培养基．通过对胚性愈伤组织的干燥处理，培养基中低浓度ABA和活性炭的添加，比较有效地抑制了畸形胚的产生，大大地提高了正常胚的比例． 4．对陆地棉“冀4 9 2”的下胚轴和子叶利用含Bt抗虫基因的根农杆菌(AgrobacterIIm tumefrens)进行了遗传转化研究，在筛选培养基上获得了大量生长旺盛的阳性愈伤组织，葡糖酸苷检测结果表明，大部分愈伤组织均有G us基因的表达． 5．通过花粉管通道法，进行了将含有Bt抗虫基因DNA的大肠杆菌质粒导入陆地棉“冀492”的实验，并收获了近1 0，000粒种子，为从大量种子中筛选出抗性种质材料，建立了卡那霉素田间初步筛选法． 6．利用活体压片和石蜡切片技术对体细胞胚胎发生过程和胚状体起源进行了观察，发现胚状体发生主要是通过类合子途径进行的，胚状体可能起源于单细胞． 7．通过对相同培养基上的非胚性愈伤组织，胚性愈伤组织和不同时期胚状体的可溶性蛋白SDS - PAGE电泳分析，发现16KD和50K D蛋白特异性地存在于胚性愈伤和各期胚状体中，该蛋白可作为胚性愈伤组织的筛选标记．对不同发育时期的愈伤组织进行了同工酶和可溶性蛋白的IE F/SD S-PA G E双向电泳分析，结果表明，不同发育时期的愈伤组织同工酶酶谱和可溶性蛋白电泳图谱之间具有较大的差别，分化前期的胚性愈伤组织酶的活性强，种类多，并且有新的蛋白斑点的出现，这些都可能与体细胞胚胎发生相关．

柠条种子蛋白，同工酶遗传分析与群体遗传结构

本文研究了毛乌素沙地6个不同生态环境的柠条群体和1个锡盟草原站的小叶锦鸡儿群体的同工酶和种子蛋白的遗传变异。利用Brown等(/975)同工酶遗传分析方法对同工酶和种子蛋白的多态性进行了遗传分析。运用Shannon信息指数和Nei指数分析测定了锦鸡儿群体的遗传结构。结果表明： (l) Brown同工酶遗传分析的方法适合于柠条同工酶的遗传分析。 （2用LAP酶对柠条群体进行了精细的遗传结构研究。结果表明毛乌素沙地柠条群体的异交性。GST=D．134，即大部分的变异存在于群体内部，小部分的变异存在于群体之间。柠条群体的繁育系统与水分胁迫有关。随着生境变旱，繁育系统有向近交变化的趋势。 (3) Brown同工酶遗传分析方法也可以运用于种子蛋白遗传分析，柠条种子蛋白各亚基的遗传是孟德尔方式。 (4)由种子蛋白变异所统计测定的柠条群体的遗传分化系数GST=0.l81(Nei指数)或0.179(Shannon指数，Kongkiatngam改进)。群体变异水平按表型多样性依次为人工毛条群体>锡盟群体>滩地群体>硬梁群体>软梁群体>丘下群体>丘上群体。按遗传多样性依次为人工毛条群体>软梁群体>锡盟群体>滩地群体和硬梁群体>丘上群体>丘下群体。群体间基因流水平Nm>/，遗传距离D<0．1。 还试验对玉兰、合欢、紫藤、绿豆几种植物种子蛋白变异的遗传分析。最后对同工酶，种子蛋白遗传分析和群体遗传结构进行了讨论并提出今后工作的一些建议。