Influence of plant species on disease suppression by Pseudomonas fluorescens strain CHA0 with enhanced antibiotic production

Introduction of the recombinant cosmid pME3090 into Pseudomonas fluorescens strain CHAO, a good biocontrol agent of various diseases caused by soilborne pathogens, increased three- to five-fold the production of the antibiotic metabolites pyoluteorin (Pit) and 2,4-diacetylphlorogIucinol (Phi) in vitro. Strain CHAO/pME3090 also overproduced Pit and Phi in the rhizosphere of wheat infected or not infected with Pythium ultimum. The biocontrol activity of the wild-type and recombinant Straitis was compared using various plant pathogen-host combinations in a gnotobiotic system. Antibiotic overproduction affected neither the protection of wheat against P. ultimum and Gaeumannomyces graminis var. tritici nor the growth of wheat plants. In contrast, strain CHA0/pME3090 showed an increased capacity to protect cucumber against Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum and Phomopsis sclerotioides, compared with the wild-type strain CHAO, The antibiotic overproducing strain protected tobacco roots significantly better against Thielaviopsis basicola than the wild-type strain but drastically reduced the growth of tobacco plants and was also toxic to the growth of sweet com. On King's B agar and on malt agar, the recombinant strain CHA0/pME3090 inhibited all pathogens more than did the parental strain CHAO. Synthetic Pit and Phi were toxic to all fungi tested. Tobacco and sweet com were more sensitive to synthetic Pit and Phi than were cucumber and wheat. There was no correlation between the sensitivity of the pathogens to the synthetic antibiotics and the degree of disease suppression by strain CHAO pME3090. However, there was a correlation between the sensitivity of the plants and the toxicity of the recombinant strain. We conclude that the plant species rather than the pathogen determines whether cosmid pME3090 in P. fluorescens strain CHAO leads to improved disease suppression.

Plants respond to pathogen infection by enhancing the antifungal gene expression of root-associated bacteria.

Plant health and fitness widely depend on interactions with soil microorganisms. Some bacteria such as pseudomonads can inhibit pathogens by producing antibiotics, and controlling these bacteria could help improve plant fitness. In the present study, we tested whether plants induce changes in the antifungal activity of root-associated bacteria as a response to root pathogens. We grew barley plants in a split-root system with one side of the root system challenged by the pathogen Pythium ultimum and the other side inoculated with the biocontrol strain Pseudomonas fluorescens CHA0. We used reporter genes to follow the expression of ribosomal RNA indicative of the metabolic state and of the gene phlA, required for production of 2,4-diacetylphloroglucinol, a key component of antifungal activity. Infection increased the expression of the antifungal gene phlA. No contact with the pathogen was required, indicating that barley influenced gene expression by the bacteria in a systemic way. This effect relied on increased exudation of diffusible molecules increasing phlA expression, suggesting that communication with rhizosphere bacteria is part of the pathogen response of plants. Tripartite interactions among plants, pathogens, and bacteria appear as a novel determinant of plant response to root pathogens.

Deleterious impact of a virulent bacteriophage on survival and biocontrol activity of Pseudomonas fluorescens strain CHAO in natural soil.

Many biotic and abiotic factors affect the persistence and activity of beneficial pseudomonads introduced into soil to suppress plant diseases. One such factor may be the presence of virulent bacteriophages that decimate the population of the introduced bacteria, thereby reducing their beneficial effect. We have isolated a lytic bacteriophage (phi)GP100) that specifically infects the biocontrol bacterium Pseudomonas fluorescens CHA0 and some closely related Pseudomonas strains. phiGP100 was found to be a double-stranded-DNA phage with an icosahedral head, a stubby tail, and a genome size of approximately 50 kb. Replication of phiGP100 was negatively affected at temperatures higher than 25 degrees C. phiGP100 had a negative impact on the population size and the biocontrol activity of P. fluorescens strain CHA0-Rif (a rifampicin-resistant variant of CHA0) in natural soil microcosms. In the presence of phiGP100, the population size of strain CHA0-Rif in soil and on cucumber roots was reduced more than 100-fold. As a consequence, the bacterium's capacity to protect cucumber against a root disease caused by the pathogenic oomycete Pythium ultimum was entirely abolished. In contrast, the phage affected neither root colonization and nor the disease suppressive effect of a phiDGP100-resistant variant of strain CHA0-Rif. To our knowledge, this study is the first to illustrate the potential of phages to impair biocontrol performance of beneficial bacteria released into the natural soil environment.

Controle químico de fungos associados a sementes de sorgo e proteção contra fungos do solo

Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de alguns fungicidas no controle de fungos associados a sementes de sorgo cultivar CMS 182R e na proteção delas contra fungos do solo. A microbiota das sementes de sorgo, composta por Fusarium moniliforme, Penicillium spp., Alternaria tenuis, Cladosporium spp. e Phoma sorghina, foi patogênica a essas sementes, e os fungos Pythium aphanidermatum e Sclerotium rolfsii, infectantes do solo de monocultivo de sorgo, também se mostraram patogênicos. Os fungicidas captan, thiram, captan + thiabendazole, thiram + thiabendazole, iprodione + thiram e tolylfluanid foram os mais eficientes no controle não só de toda a microbiota das sementes, como também na proteção das sementes contra Pythium aphanidermatum e Sclerotium rolfsii.

RpoN (sigma54) controls production of antifungal compounds and biocontrol activity in Pseudomonas fluorescens CHA0.

Pseudomonas fluorescens CHA0 is an effective biocontrol agent of root diseases caused by fungal pathogens. The strain produces the antibiotics 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) and pyoluteorin (PLT) that make essential contributions to pathogen suppression. This study focused on the role of the sigma factor RpoN (sigma54) in regulation of antibiotic production and biocontrol activity in P. fluorescens. An rpoN in-frame-deletion mutant of CHAO had a delayed growth, was impaired in the utilization of several carbon and nitrogen sources, and was more sensitive to salt stress. The rpoN mutant was defective for flagella and displayed drastically reduced swimming and swarming motilities. Interestingly, the rpoN mutant showed a severalfold enhanced production of DAPG and expression of the biosynthetic gene phlA compared with the wild type and the mutant complemented with monocopy rpoN+. By contrast, loss of RpoN function resulted in markedly lowered PLT production and plt gene expression, suggesting that RpoN controls the balance of the two antibiotics in strain CHA0. In natural soil microcosms, the rpoN mutant was less effective in protecting cucumber from a root rot caused by Pythium ultimum. Remarkably, the mutant was not significantly impaired in its root colonization capacity, even at early stages of root infection by Pythium spp. Taken together, our results establish RpoN for the first time as a major regulator of biocontrol activity in Pseudomonas fluorescens.

Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria.

Mycelia have been recently shown to actively transport polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in water-unsaturated soil over the range of centimeters, thereby efficiently mobilizing hydrophobic PAH beyond their purely diffusive transport in air and water. However, the question if mycelia-based PAH transport has an effect on PAH biodegradation was so far unsolved. To address this, we developed a laboratory model microcosm mimicking air-water interfaces in soil. Chemical analyses demonstrated transport of the PAH fluorene (FLU) by the mycelial oomycete Pythium ultimum that was grown along the air-water interfaces. Furthermore, degradation of mycelia-transported FLU by the bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe was indicated. Since this organism expresses eGFP in response to a FLU flux to the cell, it was also as a bacterial reporter of FLU bioavailability in the vicinity of mycelia. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analyses revealed a significant increase of eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU. Hence, we could show that physically separated FLU becomes bioavailable to bacteria after transport by mycelia. Experiments with silicon coated glass fibers capturing mycelia-transported FLU guided us to propose a three-step mechanism of passive uptake, active transport and diffusion-driven release. These experiments were also used to evaluate the contributions of these individual steps to the overall mycelial FLU transport rate.

Promoção de crescimento e controle de tombamento de plântulas de pepino por rizobactérias

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de rizobactérias, no crescimento de plântulas de pepino e no controle de tombamento, causado por Pythium aphanidermatum. Foram realizados em laboratório ensaios de: degradação de 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC); colonização das raízes de plântulas de pepino; e pareamento de culturas. A identificação dos melhores isolados foi feita pela determinação das seqüências do gene 16S rDNA. Trinta e sete isolados, dos 165 testados, aumentaram a massa de matéria seca das plantas de pepino em até 63%. Desses, somente um isolado (N13 - Pseudomonas fluorescens) reduziu o tombamento de plântulas em 25%; 21 isolados inibiram o crescimento micelial de P. aphanidermatum, colonizaram o sistema radicular das plantas de pepino e cresceram em presença de ACC como única fonte de nitrogênio. Dos dez isolados que apresentaram resultados satisfatórios, cinco foram identificados como pertencentes aos gêneros Bacillus, quatro Pseudomonas e um Stenotrophomonas. Dos 165 isolados de rizobactérias testados, sete possuem potencial para promover o crescimento de plantas de pepino e um para controlar o tombamento causado por P. aphanidermatum.

Two novel MvaT-like global regulators control exoproduct formation and biocontrol activity in root-associated Pseudomonas fluorescens CHA0.

Pseudomonas fluorescens CHA0 protects various crop plants against root diseases caused by pathogenic fungi. Among a range of exoproducts excreted by strain CHA0, the antifungal compounds 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) and pyoluteorin (PLT) are particularly relevant to the strain's biocontrol potential. Here, we report on the characterization of MvaT and MvaV as novel regulators of biocontrol activity in strain CHA0. We establish the two proteins as further members of an emerging family of MvaT-like regulators in pseudomonads that are structurally and functionally related to the DNA-binding protein H-NS. In mvaT and mvaV in frame-deletion mutants of strain CHA0, PLT production was enhanced about four- and 1.5-fold, respectively, whereas DAPG production remained at wild-type levels. Remarkably, PLT production was increased up to 20-fold in an mvaT mvaV double mutant. DAPG biosynthesis was almost completely repressed in this mutant. The effects on antibiotic production could be confirmed by following expression of gfp-based reporter fusions to the corresponding biosynthetic genes. MvaT and MvaV also influenced levels of other exoproducts, motility, and physicochemical cell-surface properties to various extents. Compared with the wild type, mvaT and mvaV mutants had an about 20% reduced capacity (in terms of plant fresh weight) to protect cucumber from a root rot caused by Pythium ultimum. Biocontrol activity was nearly completely abolished in the double mutant Our findings indicate that MvaT and MvaV act together as further global regulatory elements in the complex network controlling expression of biocontrol traits in plant-beneficial pseudomonads.

Controle biológico da podridão radicular e promoção de crescimento em pepino hidropônico com microrganismos de manguezais

O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de microrganismos de manguezais para controlar a podridão radicular causada por Pythium aphanidermatum e para promover o crescimento em pepino hidropônico (Cucumis sativus). Avaliaram-se 19 microrganismos quanto ao controle da doença em mini-hidroponia. Os microrganismos mais promissores para esse fim - Gordonia rubripertincta SO-3B-2 e a mistura dos isolados G. rubripertincta SO-3B-2, MB-P3A-49, MB-P3-C68 e SO-3L-3, de Pseudomonas stutzeri, e Bacillus cereus AVIC-3-6 - foram, posteriormente, testados quanto à promoção de crescimento do pepineiro, em casa de vegetação. Microrganismos de manguezais podem ter importância funcional no controle biológico da podridão radicular causada por P. aphanidermatum e na promoção do crescimento do pepineiro cultivado em hidroponia. Os microrganismos G. rubripertincta SO-3B-2 e P. stutzeri MB-P3A-49 são promissores na promoção do crescimento das plantas não infestadas com o patógeno.

Lon protease negatively affects GacA protein stability and expression of the Gac/Rsm signal transduction pathway in Pseudomonas protegens.

In Pseudomonas protegens CHA0 and other fluorescent pseudomonads, the Gac/Rsm signal transduction pathway controls secondary metabolism and suppression of fungal root pathogens via the expression of regulatory small RNAs (sRNAs). Because of its high cost, this pathway needs to be protected from overexpression and to be turned off in response to environmental stress such as the lack of nutrients. However, little is known about its underlying molecular mechanisms. In this study, we demonstrated that Lon protease, a member of the ATP-dependent protease family, negatively regulated the Gac/Rsm cascade. In a lon mutant, the steady-state levels and the stability of the GacA protein were significantly elevated at the end of exponential growth. As a consequence, the expression of the sRNAs RsmY and RsmZ and that of dependent physiological functions such as antibiotic production were significantly enhanced. Biocontrol of Pythium ultimum on cucumber roots required fewer lon mutant cells than wild-type cells. In starved cells, the loss of Lon function prolonged the half-life of the GacA protein. Thus, Lon protease is an important negative regulator of the Gac/Rsm signal transduction pathway in P. protegens.

Principais doenças de Anonáceas no Brasil: descrição e controle

Várias doenças podem afetar folhas, caules, flores e frutos de gravioleira, pinheira e atemoia em diferentes estádios de seus desenvolvimentos. Geralmente, as doenças mais importantes são causadas por fungos durante o florescimento e a frutificação. Também podem ocorrer murchas ou podridões de raízes, causadas por nematoides e patógenos do solo. A antracnose (Colletotrichum gloeosporioides), murcha ou podridões de raízes (Rhizoctonia solani, Cylindrocladium clavatum, Phytophthora sp., Pythium sp., Phytophthora nicotianae var. parasitica, cancros (Albonectria rigidiuscula) e podridão de frutos (Botryodiplodia theobromae, sin. Lasiodiplodia theobromae) são as mais importantes. Por outro lado, a podridão-parda-do-fruto (Rhizopus stolonifer) provoca perdas expressivas na produção de graviola. A seguir, são descritas as principais doenças que afetam estas espécies de anonáceas, seus agentes causais e as medidas de controle.

Tratamento térmico solar da água para controle de fitopatógenos

Alguns microrganismos fitopatogênicos podem ser transportados pela água, que se constitui em importante e eficiente forma de disseminação. O controle de fitopatógenos pelo tratamento térmico da água infestada, utilizando a energia solar, constituiu o objetivo do trabalho. Quantificou-se a eficiência de um sistema automatizado de aquecimento solar desenvolvido para esta finalidade, baseado em processo misto de aquecimento da água em circuito fechado, com coletores planos e transmissão de calor por convecção natural e forçada. A automatização e a equalização da temperatura foram obtidas por termostatos localizados em diferentes pontos. Verificou-se boa eficiência do equipamento, trabalhando na temperatura de 60 ºC, tanto em rendimento de água processada como na eliminação do inóculo de fitopatógenos de importância econômica, como Botrytis cinerea, Colletotrichum spp., Fusarium spp., Pythium spp., Verticillium dahliae e Rhizoctonia solani. À exceção de F. oxysporum f. sp. phaseoli, os patógenos testados não sobreviveram ao tratamento térmico a temperaturas acima de 55 0C. A técnica mostrou-se promissora como uma opção na desinfestação da água para uso em irrigação de viveiros, casas de vegetação e diversas finalidades em pequenas ou médias propriedades agrícolas.

Controle químico de Fusarium moniliforme em sementes de milho: metodologia de avaliação e efeitos sobre a qualidade fisiológica

Objetivou-se verificar o efeito da luz sobre o crescimento micelial de Fusarium moniliforme em meio de cultura contendo fungicidas, o melhor regime luminoso e a variável a ser utilizada para detectar o patógeno em sementes tratadas de milho (Zea mays), e o efeito do tratamento sobre a qualidade sanitária e fisiológica das sementes. Os fungicidas avaliados foram fludioxonil + metalaxil-m (três concentrações), difenoconazole, acibenzolar-S-metílico e captan + tiabendazole. Para avaliação do crescimento micelial, os fungicidas foram adicionados em meio de cultura, nas concentrações de 100, 10 e 1 æg/ml. Incubaram-se as placas sob temperatura de 20±2 ºC e três condições de luz: escuro contínuo, luz branca e luz próxima da ultra violeta (12h de luz/12 de escuro). Para verificar o efeito da luz na avaliação das sementes tratadas, utilizou-se o método do papel de filtro com congelamento; a sanidade foi avaliada pelas variáveis incidência e severidade. Duas amostras de sementes tratadas foram submetidas aos testes de sanidade, germinação, emergência em casa de vegetação e frio, para verificar o efeito do tratamento sobre a qualidade sanitária e fisiológica. O teste in vitro indicou que a luz branca diminuiu o efeito dos ingredientes ativos fludioxonil + metalaxil-m (7,5 g + 11,51 g/l e 25 g + 10 g/l) e captan + tiabendazole; no teste de sanidade não se observou esse efeito. A severidade foi mais sensível para discriminar a eficiência dos fungicidas. Os resultados obtidos, avaliando-se as amostras de sementes tratadas, demonstraram que: F. moniliforme não afeta a qualidade fisiológica dessas sementes; o fungicida que ofereceu controle do patógeno na semente, acima de 90%, foi captan + tiabendazole, seguido de fludioxonil + metalaxil-m (97,2 g + 147,86 g/l); Pythium sp. foi controlado por captan + tiabendazole e por fludioxonil + metalaxil-m nas três concentrações.

Etiologia da podridão do coleto de Brachiaria brizantha em pastagens da amazônia

Desde 1995, pastos formados com Brachiaria brizantha cv. Marandu vêm sendo devastados por uma doença cujo sintoma típico é a morte de touceiras. Das amostras de plantas coletadas nos municípios de Paragominas (PA), Carutapera (MA) e Araguaína (TO), exibindo sintomas iniciais da doença, bem como, de sementes obteve-se quatro isolados de Pythium spp. e um de Rhizoctonia solani associados aos tecidos doentes. Os resultados dos testes de patogenicidade comprovaram que o principal agente da podridão do coleto do capim-braquiarão é Pythium periilum. A infestação do solo com mistura de inóculo dos três isolados de P. periilum e de R. solani resultou em elevada quantidade de doença (p<0,01). Na presença de alta população de R. solani, no solo, a associação desses patógenos deverá aumentar as áreas degradadas de pasto de capim-braquiarão, principalmente aquelas manejadas de modo inadequado, desde que R. solani é um reconhecido patógeno de B. brizantha. Trata-se do primeiro registro de P. periilum como agente primário de doença, em coleto de B. brizantha.

Indução de resistência sistêmica por rizobactérias em cultivos hidropônicos

Rizobactérias do grupo fluorescente de Pseudomonas spp. foram selecionadas quanto a sua capacidade na promoção de crescimento em plântulas de alface (Lactuca sativa L.) e atividade antagônica contra Pythium aphanidermatum a partir de teste in vitro. Em seguida, em sistema hidropônico, foi avaliada a aplicação prévia dos isolados visando reduzir os danos provocados por P. aphanidermatum em pepino (Cucumis sativus) por resistência sistêmica induzida (RSI), pela adoção da técnica "raízes subdivididas". As variáveis massa da matéria seca (parte aérea e raízes) e comprimento radicular foram utilizadas na avaliação. A produção de compostos antagônicos e/ou promotores de crescimento pelos isolados de Pseudomonas spp. fluorescente foi verificada de modo a associar sua atividade com os resultados obtidos nos testes in vitro e em hidroponia. No experimento in vitro os isolados Ps 140B e Ps 140C proporcionaram maior crescimento das plantas (raiz e hipocótilo) de alface nos tratamentos com e sem patógeno. Alguns dos isolados avaliados no experimento hidropônico demonstraram uma possível expressão da RSI. Não houve correspondência entre os compostos produzidos e a promoção de crescimento vegetal ou controle da doença.