Antigen detection assay with parasite specific monoclonal antibodies for diagnosis of lymphatic filariasis

Background: Lymphatic filariasis is a painful and profoundly disfiguring disease. Infection is usually acquired in childhood but its visible manifestations occur later in life, causing temporary or permanent disability. The importance of developing effective assays to diagnose, monitor and evaluate human lymphatic filariasis has been emphasized by the WHO. Methods: High-affinity monoclonal antibodies (mAbs) specific for recombinant filarial antigen WbSXP-1 were developed. An ELISA based capture assay using monoclonal and polyclonal antibodies for WbSXP-1 was used for detection of circulating filarial antigen. Results: High-affinity monoclonal antibodies (mAbs) were developed that specifically binds both W. bancrofti and B. malayi mf antigens. Two mAbs (1F6H3 and 2E12E3) of subclass IgG2a and IgM showed high affinity, avidity and reactivity to recombinant and mf native antigen. Both the mAbs were used in combination as capture antibodies and polyclonal as detection antibody to develop the assay. The assay showed very high sensitivity towards W. bancrofti mf positive samples compared to endemic normal samples (P<0.0001). Conclusion: A capture assay using high-affinity monoclonal antibodies for WbSXP-1 was developed for the detection of filarial circulating antigen in clinical samples from bancroftian infection. Besides, this would also help in epidemiological studies in endemic areas of filarial infections. (C) 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.

Clinical Proteomics of the Neglected Human Malarial Parasite Plasmodium vivax

Recent reports highlight the severity and the morbidity of disease caused by the long neglected malaria parasite Plasmodium vivax. Due to inherent difficulties in the laboratory-propagation of P. vivax, the biology of this parasite has not been adequately explored. While the proteome of P. falciparum, the causative agent of cerebral malaria, has been extensively explored from several sources, there is limited information on the proteome of P. vivax. We have, for the first time, examined the proteome of P. vivax isolated directly from patients without adaptation to laboratory conditions. We have identified 153 proteins from clinical P. vivax, majority of which do not show homology to any previously known gene products. We also report 29 new proteins that were found to be expressed in P. vivax for the first time. In addition, several proteins previously implicated as anti-malarial targets, were also found in our analysis. Most importantly, we found several unique proteins expressed by P. vivax. This study is an important step in providing insight into physiology of the parasite under clinical settings.

Autophosphorylation of Ser(428) of EhC2PK Plays a Critical Role in Regulating Erythrophagocytosis in the Parasite Entamoeba histolytica

The protozoan parasite Entamoeba histolytica can invade both intestinal and extra intestinal tissues resulting in amoebiasis. During the process of invasion E. histolytica ingests red blood and host cells using phagocytic processes. Though phagocytosis is considered to be a key virulence determinant, the mechanism is not very well understood in E. histolytica. We have recently demonstrated that a novel C2 domain-containing protein kinase, EhC2PK is involved in the initiation of erythrophagocytosis. Because cells overexpressing the kinase-dead mutant of EhC2PK displayed a reduction in erythrophagocytosis, it appears that kinase activity is necessary for initiation. Biochemical analysis showed that EhC2PK is an unusual Mn2+-dependent serine kinase. It has a trans-autophosphorylated site at Ser(428) as revealed by mass spectrometric and biochemical analysis. The autophosphorylation defective mutants (S428A, KD Delta C) showed a reduction in auto and substrate phosphorylation. Time kinetics of in vitro kinase activity suggested two phases, an initial short slow phase followed by a rapid phase for wild type protein, whereas mutations in the autophosphorylation sites that cause defect (S428A) or conferred phosphomimetic property (S428E) displayed no distinct phases, suggesting that autophosphorylation may be controlling kinase activity through an autocatalytic mechanism. A reduction and delay in erythrophagocytosis was observed in E. histolytica cells overexpressing S428A and KD Delta C proteins. These results indicate that enrichment of EhC2PK at the site of phagocytosis enhances the rate of trans-autophosphorylation, thereby increasing kinase activity and regulating the initiation of erythrophagocytosis in E. histolytica.

Malaria Parasite-Synthesized Heme Is Essential in the Mosquito and Liver Stages and Complements Host Heme in the Blood Stages of Infection

Heme metabolism is central to malaria parasite biology. The parasite acquires heme from host hemoglobin in the intraerythrocytic stages and stores it as hemozoin to prevent free heme toxicity. The parasite can also synthesize heme de novo, and all the enzymes in the pathway are characterized. To study the role of the dual heme sources in malaria parasite growth and development, we knocked out the first enzyme, d-aminolevulinate synthase (ALAS), and the last enzyme, ferrochelatase (FC), in the heme-biosynthetic pathway of Plasmodium berghei (Pb). The wild-type and knockout (KO) parasites had similar intraerythrocytic growth patterns in mice. We carried out in vitro radiolabeling of heme in Pb-infected mouse reticulocytes and Plasmodium falciparum-infected human RBCs using 4-(14) C] aminolevulinic acid (ALA). We found that the parasites incorporated both host hemoglobin-heme and parasite-synthesized heme into hemozoin and mitochondrial cytochromes. The similar fates of the two heme sources suggest that they may serve as backup mechanisms to provide heme in the intraerythrocytic stages. Nevertheless, the de novo pathway is absolutely essential for parasite development in the mosquito and liver stages. PbKO parasites formed drastically reduced oocysts and did not form sporozoites in the salivary glands. Oocyst production in PbALASKO parasites recovered when mosquitoes received an ALA supplement. PbALASKO sporozoites could infect mice only when the mice received an ALA supplement. Our results indicate the potential for new therapeutic interventions targeting the heme-biosynthetic pathway in the parasite during the mosquito and liver stages.

Endoplasmic Reticulum Stress Triggers Gametocytogenesis in the Malaria Parasite

The malaria parasite experiences a significant amount of redox stress during its growth in human erythrocytes and heavily relies on secretory functions for pathogenesis. Most certainly, the parasite is equipped with machinery to tackle perturbations in the secretory pathway, like the unfolded protein response pathway in higher eukaryotes. Our bioinformatics analysis revealed the complete absence of genes involved in the canonical unfolded protein response pathway in Plasmodium falciparum. Accordingly, the parasite was unable to up-regulate endoplasmic reticulum (ER) chaperones or ER-associated degradation in response to DTT-mediated ER stress. Global profiling of gene expression upon DTT treatment revealed a network of AP2 transcription factors and their targets being activated. The overall outcome was up-regulation of genes involved in protein export and the sexual stage of the parasite life cycle culminating in gametocytogenesis. Our results suggest that the malaria parasite uses ER stress as a cue to switch to the transmissible sexual stages.

Purification of a recombinant histidine-tagged lactate dehydrogenase from the malaria parasite, Plasmodium vivax, and characterization of its properties

Lactate dehydrogenase (LDH) of the malaria parasite, Plasmodium vivax (Pv), serves as a drug target and immunodiagnostic marker. The LDH cDNA generated from total RNA of a clinical isolate of the parasite was cloned into pRSETA plasmid. Recombinant his-tagged PvLDH was over-expressed in E. coli Rosetta2DE3pLysS and purified using Ni2+-NTA resin giving a yield of 25-30 mg/litre bacterial culture. The recombinant protein was enzymatically active and its catalytic efficiency for pyruvate was 5.4 x 10(8) min(-1) M-1, 14.5 fold higher than a low yield preparation reported earlier to obtain PvLDH crystal structure. The enzyme activity was inhibited by gossypol and sodium oxamate. The recombinant PvLDH was reactive in lateral flow immunochromatographic assays detecting pan- and vivax-specific LDH. The soluble recombinant PvLDH purified using heterologous expression system can facilitate the generation of vivax LDH-specific monoclonals and the screening of chemical compound libraries for PvLDH inhibitors.

Histone H3K9 acetylation level modulates gene expression and may affect parasite growth in human malaria parasite Plasmodium falciparum

Three-dimensional positioning of the nuclear genome plays an important role in the epigenetic regulation of genes. Although nucleographic domain compartmentalization in the regulation of epigenetic state and gene expression is well established in higher organisms, it remains poorly understood in the pathogenic parasite Plasmodium falciparum. In the present study, we report that two histone tail modifications, H3K9Ac and H3K14Ac, are differentially distributed in the parasite nucleus. We find colocalization of active gene promoters such as Tu1 (tubulin-1 expressed in the asexual stages) with H3K9Ac marks at the nuclear periphery. By contrast, asexual stage inactive gene promoters such as Pfg27 (gametocyte marker) and Pfs28 (ookinete marker) occupy H3K9Ac devoid zones at the nuclear periphery. The histone H3K9 is predominantly acetylated by the PCAF/GCN5 class of lysine acetyltransferases, which is well characterized in the parasite. Interestingly, embelin, a specific inhibitor of PCAF/GCN5 family histone acetyltransferase, selectively decreases total H3K9Ac acetylation levels (but not H3K14Ac levels) around the var gene promoters, leading to the downregulation of var gene expression, suggesting interplay among histone acetylation status, as well as subnuclear compartmentalization of different genes and their activation in the parasites. Finally, we found that embelin inhibited parasitic growth at the low micromolar range, raising the possibility of using histone acetyltransferases as a target for antimalarial therapy.

Plasmodium berghei glycine cleavage system T-protein is non-essential for parasite survival in vertebrate and invertebrate hosts

T-protein, an aminomethyltransferase, represents one of the four components of glycine cleavage system (GCS) and catalyzes the transfer of methylene group from H-protein intermediate to tetrahydrofolate (THF) forming N-5, N-10-methylene THF (CH2-THF) with the release of ammonia. The malaria parasite genome encodes T-, H- and L-proteins, but not P-protein which is a glycine decarboxylase generating the aminomethylene group. A putative GCS has been considered to be functional in the parasite mitochondrion despite the absence of a detectable P-protein homologue. In the present study, the mitochondrial localization of T-protein in the malaria parasite was confirmed by immunofluorescence and its essentiality in the entire parasite life cycle was studied by targeting the T-protein locus in Plasmodium berghei (Pb). PbT knock out parasites did not show any growth defect in asexual, sexual and liver stages indicating that the T-protein is dispensable for parasite survival in vertebrate and invertebrate hosts. The absence of P-protein homologue and the non-essentiality of T protein suggest the possible redundancy of GCS activity in the malaria parasite. Nevertheless, the H- and L-proteins of GCS could be essential for malaria parasite because of their involvement in alpha-lcetoacid dehydrogenase reactions. (C) 2014 Elsevier B.V. All rights reserved.

Simultaneously targeting inflammatory response and parasite sequestration in brain to treat Experimental Cerebral Malaria

Malaria afflicts around 200 million people annually, with a mortality number close to 600,000. The mortality rate in Human Cerebral Malaria (HCM) is unacceptably high (15-20%), despite the availability of artemisinin-based therapy. An effective adjunct therapy is urgently needed. Experimental Cerebral Malaria (ECM) in mice manifests many of the neurological features of HCM. Migration of T cells and parasite-infected RBCs (pRBCs) into the brain are both necessary to precipitate the disease. We have been able to simultaneously target both these parameters of ECM. Curcumin alone was able to reverse all the parameters investigated in this study that govern inflammatory responses, CD8(+) T cell and pRBC sequestration into the brain and blood brain barrier (BBB) breakdown. But the animals eventually died of anemia due to parasite build-up in blood. However, arteether-curcumin (AC) combination therapy even after the onset of symptoms provided complete cure. AC treatment is a promising therapeutic option for HCM.

How to be a fig wasp parasite on the fig-fig wasp mutualism

The nursery pollination mutualism between figs and pollinating fig wasps is based on adaptations that allow wasps to enter the enclosed inflorescences of figs, to facilitate seed set, and to have offspring that develop within the nursery and that leave to enter other inflorescences for pollination. This closed mutualistic system is not immune to parasitic fig wasps. Although the life histories and basic biology of the mutualists have been investigated, the biology of the fig wasp parasites has been severely neglected. This review brings together current knowledge of the many different ways in which parasites can enter the system, and also points to the serious lacunae in our understanding of the intricate interactions between gallers, kleptoparasites, seed eaters and parasitoids within this mutualism.

Identificación de habitats potenciales, efectivos y conectividad para la fauna silvestre, Nandaime, Nicaragua

El presente estudio surge a partir de monitoreos previos en la zona en los cuales se determinaron muy pocas especies principalmente de Mamíferos, así que se propuso conocer si los hábitats en el parche tiene la capacidad para albergar suficientes especies y si el parche se encontraba aislado de otros para que se diera un flujo de animales desde otras partes del paisaje hasta el sitio de interés. Se identificaron los hábitats efectivos y potenciales y la existencia de conexión de ésta área con otra área natural (estudio de paisaje) que sirva de corredor a la fauna silvestre en la comunidad La Chipopa, Nandaime. Los tipos de hábitats se seleccionaron según criterios florísticos: formas de vida predominantes, composición y densidad de especies. Para el estudio de conectividad y fragmentación se realizó un análisis con imágenes de satélite para determinar las clases de cobertura de la zona y se utilizaron como firmas espectrales las clases de cobertura vegetal 2011 del Ministerio de Agropecuario y Forestal (MAGFOR), la herramienta V_LATE 1.1 y la herramienta Corridor Designer . Se determinaron siete tipos de hábitat. El hábitat de mayor tamaño fue el Área de árboles con poca lianas (AAPL) (3.25 ha) la cual representa el 76 % del área total. En registro bibliográfico se determinaron 270 especies en el paisaje, de éstas el 22 % no encontrarían hábitat dentro del área. El hábitat efectivo el cual alberga más especies (12 ) fue AAPL. Dentro de los hábitats potenciales se encuentran: AAP L (25 ) y Área de árboles con mucha infección por lianas (AAML) (12 ), sin embargo, se determinaron que 67 especies (32 %) prefieren cualquier hábitat como potencial dentro del mosaico. El análisis de estructura del paisaje indica que el área se divide en 17 clases de cobertura, de éstas, las áreas de tacotal cubren el 48% del total mientras que las áreas de cultivos y pastos cubren en 34%. Dentro de la matriz del paisaje el uso que se encuentra más fragmentado es el área de bosque cerrado ya que la distancia mínima que una especie debería de recorrer para encontrar esa clase es de 4,184 m, las clases de cobertura menos fragmentadas fueron las áreas agrícolas y pastos. Existe una relación entre los índices de diversidad de formas , dimensión fractal y proximidad en relación a los usos cultivos, pasto y bosque latifoliado cerrado. Dentro del paisaje se crean dos tipos de corredores uno se localiza al noroeste y otro al sureste, a pesar de formarse corredores el paisaje se encuentra muy fragmentado para permitir la conectividad de Nandarola con otros parches cercanos.

Análisis de la contribución de los sistemas silvopastoriles a la conservación de la flora y fauna en tres comunidades de la reserva de biósfera Bosawás

El estudio se realizó en tres comunidades del Territorio Miskitu Indian Tasbaika Kum, Reserva de Biósfera BOSAWAS (Shiminka, Boca de Plis y Esperanza), para describir la interacción entre especies de flora y avifauna y su influencia en la conservación de estas especies en las áreas de pastoreo, a partir de tres criterios: 1) cuantificar flora y avifauna, 2) prácticas de manejo tradicional, 3) estimar beneficios económico generado por sistemas de pastoreo. Se establecieron tres puntos de conteo dentro de transeptos para avifauna, se estableció parcelas para muestreo de la vegetación en cada comunidad, se seleccionó una comunidad beneficiada por subproyectos del Proyecto Corazón (MARENA) y dos áreas clasificadas como bosque secundario. Para evaluar el beneficio económi co se aplicó entrevistas abiertas y estructuradas dirigida a propietarios de ganado, para documentar los principales beneficios tangibles e intangibles que la población obtiene de estos agrosistemas. El análisis de resultados se determinó en base a índices de diversidad, dominancia, equidad y similitud; tomando en cuenta la riqueza, abundancia y densidad de especies. Se encontró que para flora Shiminka obtuvo los mayores valores de dominancia lo que indica que se encuentran especies de mayor importancia, Esperanza tiene mayor equidad y diversidad, en Shiminka y Esperanza se necesitan mayores estudios, el análisis de Clúster arrojó que aunque existe alguna concordancia entre Boca de Plis y Shiminka, las tres difieren entre sí y el mismo resultado se encontró para la avifauna; y para fauna mayor equidad en Shiminka y Esperanza, mientras la más diversa resultó Esperanza. La similitud establece que Boca de Plis y Esperanza necesitan mayor intensidad de muestreo.

Insectos descortezadores y fauna insectil asociada a los pinos en dos municipios del departamento de Nueva Segovia

Los pinos son afectados por plagas y e nfermedades debido a diferentes factores como: incendios forestales, periodos de sequías prolongados, el manejo inadecuado del bosque y la falta de aplicación de prácticas silviculturales. Uno de los insectos que más se reporta atacando los pinos es el gor gojo descortezador del pino Dendroctonus frontalis. Ataques por este insecto fueron reportados en el departamento de Nueva Segovia en el periodo comprendido entre 1999 al 2001. D. frontalis afectó aproximadamente 32,359.41 ha. de bosques equivalentes al 50 % del área boscosa de Nueva Segovia y unos 3 millones m 3 de madera en rollo. Los daños estimados por este ataque se aproximan a los 39 millones de dólares por pérdida de madera en pie y 56 millones de dólares por costo de oportunidad y un cuantioso daño a mbiental. Ante tal situación y debido a la importancia que tiene el recurso forestal en Nicaragua, se realizó una investigación con el objetivo de describir la fluctuación poblacional de todos los insectos asociados a los pinos y sus enemigos naturales. El estudio se realizó en el Departamento de Nueva Segovia, específicamente en los Municipios de Dipilto y El Jicaro en el periodo comprendido entre Febrero 2004 a Enero 2005. El monitoreo se realizó cada 15 días y se utilizaron trampas del tipo “Lindgren non sticky funnel trap®” de doce embudos con vaso colector, llevando adherido un paquete de feromona sintetica (frontalin ®) y un depósito de aguarrás (pine turpentine). Los resultados obtenidos fueron los siguientes. Se describió la fluctuación poblacional d e insectos de la familia Scolytidae. Las poblaciones de insectos de esta familia fueron estadísticamente similares en ambos municipios. También, se describió la fluctuación poblacional de insectos del Orden Coleóptera y se les identificó hasta el nivel de familia. El número de insectos de la familia Curculionidae, Cerambycidae, Scarabaeidae, Coccinellidae fueron mayores estadísticamente en Dipilto que en El Jicaro. Por el contrario, los insectos de la familia Buprestidae y Elateridae fueron mayores en El Ji caro en comparación con el municipio de Dipilto. El número de insectos de las familias Chrysomelidae, Carabidae, Nitidullidae, Lampiridae, Tenebrionidae fueron estadísticamente similares en ambos municipios. En este mismo estudio, se describió la fluctuaci ón poblacional de insectos depredadores encontrados en el bosque de pino. Los insectos de la familia Staphylinidae fueron estadísticamente mayores en Dipilto que en El Jicaro, por el contrario las poblaciones de insectos Trogostidae, Histeridae y Cucujidae fueron estadísticamente similares en Dipilto y El Jicaro. Es importante señalar que en comparación con los otros depredadores, la familia Trogostidae se encontró en mayor númer o a lo largo de todo el estudio

Evaluación de tres compuestos simuladores de alfa pineno y sinérgicos de frontalin para la captura de gorgojos descortezadores de pino y fauna asociada en trampas de embudo multiple en el municipio de San Fernando, Nueva Segovia

Con el objetivo de evaluar la efectividad de tres compuestos considerados simuladores de alfa pineno se realizó el presente estudio en tres sitios del municipio de San Fernando, siendo ellos San Nicolás, Las Tapias y San José. Los compuestos evaluados fueron pinene lure, esencia de trementina (aguarrás) y el diluyente FT 90, el trabajo se realizo durante el periodo Octubre 2007 a Marzo 2008. Los principales insectos capturados durante el estudio correspondieron a: Dendroctonus frontalis, Dendroctonus approximatus, Ips sp, Xyleborus sp, Temnochila sp, Enoclerus sp, Cossonus sp, Silvanus sp, Sascelis sp, Tomolips sp, Pangaeus sp y varios miembros de la familia Staphylinidae. Para el caso de los gorgojos descortezadores D. frontalis, D. approximatus e Ips sp no ocurrieron capturas en el sitio San Nicolás, lo que evidencia la importancia de la práctica del manejo forestal en la disminución de la incidencia estos insectos, comparado con los sitios Las Tapias y San José en donde se dieron capturas y no había una práctica efectiva de manejo forestal. El compuesto esencia de trementina (aguarrás), combinado con la feromona frontalin fue estadísticamente el mas efectivo en la captura de Dendroctonus frontalis, Dendroctonus approximatus y Temnochila sp. La sustancia química conocida como diluyente FP 90 no debe ser considerado como un simulador de alfa pineno y no debe ser usado como equivalente o sustituto de aguarrás dado que es una sustancia que proviene del petróleo y no contiene en su esencia química alfa pineno. En el mes de noviembre fue notorio observar un patrón de incremento poblacional por parte la mayoría de los insectos estudiados, con particular referencia al caso de Dendroctonus frontalis. Los resultados de estudio refuerzan el hecho observado en otros estudios relativo a que en los meses de noviembre y diciembre parece existir una mayor actividad de vuelo de Dendroctonus frontalis, lo cual se refleja en mayores capturas durante dichos meses.

Diversidad de fauna silvestre en bosque seco tropical, Nandarola, Nandaime

Frente a los efectos de la degradación de hábitat por fragmentación que enfrentan los bosques de nuestro país, es importante conocer las especies de fauna silvestre que mantienen relación ecológica con estos fragmentos aislados y que promueven el desarrollo de la vegetación a consecuencia de sus actividades y hábitos. El objetivo de este estudio es determinar y comparar la diversidad de fauna silvestre (vertebrados terrestres) en dos fragmentos de bosque seco secundarios de diferentes edades y tamaños (15 años, 3.5 ha; 11 años, 2.8 ha) en bosque seco tropical, Nandarola, Nandaime, e identificar los gremios alimenticios de las especies. Se establecieron seis transeptos de 20 x 100 m en el fragmento de 15 años denominado “La Chipopa” y tres transeptos de iguales dimensiones en el fragmento de 11 años denominado “La Zorra”, en estos se cuantificó la diversidad de anfibios, reptiles y mamíferos. En el extremo de cada transepto se estableció un punto de muestreo de 25 m de radio para evaluar diversidad de aves, se realizaron 17 observaciones distribuidas en ocho meses. Como resultados se determinaron 2 especies de anfibios, 10 de reptiles, 26 de aves y 7 de mamíferos. La riqueza de especie para los cuatro grupos fue mayor en La Zorra (69 especies) comparada con La Chipopa (49 especies). Los índices demostraron una mayor diversidad de reptiles, aves y mamíferos en La Zorra al compararse con La Chipopa según los índices ecológicos de Shannon-Wiener y Simpson. Se identificaron nueve gremios alimenticios en los dos sitios de estudio. El gremio más grande fue el Insectívoro involucrando a 26 especies, para los gremios importantes en la dispersión de frutos y semillas, y en la polinización: los Frugívoros, Granívoros Nectarívoros fueron determinadas 12, 10 y 2 especies respectivamente. Pese a las diferencias en edades y tamaños el fragmento de La Zorra presenta la mayor diversidad de vida silvestre comparado con La Chipopa, pero esas diferencias no son significativas. En sí la presencia de dispersores de semillas y frutos es muy baja en ambos sitios, en cuanto a los vertebrados polinizadores solo se determinó una especie. El 44% de las especies son exclusivas de bosques intervenidos y lugares abiertos.