Role of basic calcium phosphate crystals in osteoarthritis

L'arthrose est une maladie d��g��n��rative des articulations due �� une d��gradation progressive du cartilage. La calcification de l'articulation (essentiellement due �� des d��p��ts de cristaux de phosphate de calcium basique -cristaux BCP-) est une caract��ristique de cette maladie. Cependant, le r��le des cristaux BCP reste �� d��terminer. Nous avons tout d'abord d��termin�� en utilisant des cultures primaires de chondrocytes que les cristaux de BCP induisaient la production de la cytokine IL-6, via une signalisation intracellulaire implicant les kinase Syk, PI3 et Jak et Stat3. Les cristaux de BCP induisent ��galement la perte de prot��oglycanes et l'expression de IL-6 dans des explants de cartlage humain et ces deux effets peuvent ��tre bloqu��s par un inhibiteur de IL-6, le Tocilizumab. Par ailleurs, nous avons trouv�� que l'IL-6 ajout�� �� des chondrocytes, favorisait la formation de cristax de BCP et augmentait l'expression de g��nes impliqu��s dans le processus de min��ralisation : Ank (codant pour un transporteur de pyrophooshate), Annexin5 (codant pour un canal calcique) et Pit-1 (codant pour un transporteur de phoshate). In vivo, les cristaux de BCP inject��s dans l'articulation de souris induisent une ��rosion du cartilage. Dans un mod��le murin d'arthrose du genou induit par m��nisectomie, nous avons observ�� la formation progressive de cristaux de BCP. Fait int��ressant, la pr��sence de ces cristaux dans l'articulation pr��c��dait la destruction du cartilage. Un agent susceptible de bloquer les calcifications tel que le sodium thiosulfate (STS), administr�� �� des souris m��nisectomis��es, inhibait le d��p��t intra-articulaire de ces cristaux ainsi que l'��rosion du cartilage. Nous avons identifi�� ainsi un cercle vicieux dans l'arthrose, les cristaux induisant l'interleukine-6 et l'interleukine-6 induisant la formation de ces cristaux. Nous avons ��tudi�� si on pouvait bloquer cette boucle cristaux de BCP-IL6 soit par des agents d��calcifiants, soit par des inhibiteurs d'IL-6. In vitro, des anticorps anti IL- 6 ou des inhibiteurs de signalisation, inhibaient significativement IL-6 et la min��ralisation induite par IL-6. De m��me le STS inhibait la formation de ces cristaux et la production de l'IL-6. Tout r��cemment, nous avons trouv�� que des inhibiteurs de la xanthine oxidor��ductase ��taient aussi capables d'inhiber �� la fois la production d'IL-6 et la min��ralization des chondrocytes. Finalement, nous avons pu exclure un r��le du syst��me IL-1 dans le mod��le d'arthrose induite par m��nisectomie, les souris d��ficientes pour IL-1a/��, MyD88 et l'inflammasome NLRP3 n'��tant pas prot��g��es dans ce mod��le d'arthrose. L'ensemble de nos r��sultats montre que les cristaux BCP sont pathog��niques dans l'arthrose et qu'un inhibiteur de min��ralisation tel que le STS ou un inhibiteur de l'interleukine-6 constitueraient des nouvelles th��rapies pour l'arthrose. -- Osteoarthritis (OA), the most common degenerative disorder of the joints, results from an imbalance between the breakdown and repair of the cartilage and surrounding articular structures. Joint calcification (essentially due to basic calcium phosphate (BCP) crystal deposition) is a characteristic feature of OA. However, the role of BCP crystal deposition in the pathogenesis of OA remains unclear[1][1]. We first demonstrated that in primary murine chondrocytes exogenous BCP crystals led to IL-6 up-modulation and that BCP crystal signaling pathways involved Syk and PI3 kinases, and also gp130 associated molecules, Jak2 and Stat3. BCP crystals also induced proteoglycan loss and IL-6 expression in human cartilage expiants, (which were significantly reduced by an IL-6 inhibitor). In addition, we found that in chondrocytes exogenous IL-6 promoted calcium-containing crystal formation and up- regulation of genes codifying for proteins involved in the calcification process: the inorganic pyrophosphate transport channel Ank, the calcium channel Annexin�� and the sodium/phosphate cotransporter Piti. In vivo, BCP crystals injected into murine knee joints induced cartilage erosion. In the menisectomy model, increasing deposits, identified as BCP crystals, were progressively observed around the joint before cartilage erosion. These deposits strongly correlated with cartilage degradation and IL-6 expression. These results demonstrated that BCP crystals deposition and IL-6 production are mutually reinforcing in the osteoarthritic pathogenic process. We then investigated if we could block the BCP-IL6 loop by either targeting IL-6 production or BCP crystal deposits. Treatment of chondrocytes with anti-IL-6 antibodies or inhibitors of IL-6- signaling pathway significantly inhibited IL-6-induced crystal formation. Similarly, sodium thiosulfate (STS), a well-known systemic calcification inhibitor, decreased crystal deposition as well as HA-induced IL-6 secretion in chondrocytes and, in vivo, it decreased crystal deposits size and cartilage erosion in menisectomized knees. Interestingly, we also found that xanthine-oxidoreductase (XO) inhibitors inhibited both IL-6 production and calcium crystal depositis in chondrocytes. We began to unravel the mechanisms involved in this coordinate modulation of IL-6 and mineralization. STS inhibited Reactive Oxygen Species (ROS) generation and we are currently investigating whether XO represents a major source of ROS in chondrocyte mineralization. Finally, we ruled out that IL-1 activation/signaling plays a role in the murine model of OA induced by menisectomy, as IL-1a/��, the IL-1 R associated molecule MyD88 and NLRP3 inflammasome deficient mice were not protected in this model of OA. Moreover TLR-1, -2, -4,-6 deficient mice had a phenotype similar to that of wild-type mice. Altogether our results demonstrated a self-amplification loop between BCP crystals deposition and IL-6 production, which represents an aggravating process in OA pathogenesis. As currently prescribed OA drugs are addressing OA symptoms,our results highlight a potential novel treatment strategy whereby inhibitors of calcium- containing crystal formation and IL-6 could be combined to form the basis of a disease modifying treatment and alter the course of OA.

New insight in the relationship between regional patterns of knee cartilage thickness, osteoarthritis disease severity, and gait mechanics.

To test if the relationship between knee kinetics during walking and regional patterns of cartilage thickness is influenced by disease severity we tested the following hypotheses in a cross-sectional study of medial compartment osteoarthritis (OA) subjects: (1) the peak knee flexion (KFM) and adduction moments (KAM) during walking are associated with regional cartilage thickness and medial-to-lateral cartilage thickness ratios, and (2) the associations between knee moments and cartilage thickness data are dependent on disease severity. Seventy individuals with medial compartment knee OA were studied. Gait analysis was used to determine the knee moments and cartilage thickness was measured from magnetic resonance imaging. Multiple linear regression analyses tested for associations between cartilage thickness and knee kinetics. Medial cartilage thickness and medial-to-lateral cartilage thickness ratios were lower in subjects with greater KAM for specific regions of the femoral condyle and tibial plateau with no associations for KFM in patients of all disease severities. When separated by severity, the association between KAM and cartilage thickness was found only in patients with more severe OA, and KFM was significantly associated with cartilage thickness only for the less severe OA subjects for specific tibial plateau regions. The results support the idea that the KAM is larger in patients with more severe disease and the KFM has greater influence early in the disease process, which may lessen as pain increases with disease severity. Each component influences different regions of cartilage. Thus the relative contributions of both KAM and KFM should be considered when evaluating gait mechanics and the influence of any intervention for knee OA.

Interleukin-6 and chondrocyte mineralisation act in tandem to promote experimental osteoarthritis.

OBJECTIVES: Basic calcium phosphate (BCP) crystal and interleukin 6 (IL-6) have been implicated in osteoarthritis (OA). We hypothesise that these two factors may be linked in a reciprocal amplification loop which leads to OA. METHODS: Primary murine chondrocytes and human cartilage explants were incubated with hydroxyapatite (HA) crystals, a form of BCP, and the modulation of cytokines and matrix-degrading enzymes assayed. The ability of IL-6 to stimulate chondrocyte calcification was assessed in vitro. The mechanisms underlying the effects of HA on chondrocytes were investigated using chemical inhibitors, and the pathways mediating IL-6-induced calcification characterised by quantifying the expression of genes involved in chondrocyte mineralisation. The role of calcification in vivo was studied in the meniscectomy model of murine OA (MNX), and the link between IL-6 and cartilage degradation investigated by histology. RESULTS: In chondrocytes, BCP crystals stimulated IL-6 secretion, further amplified in an autocrine loop, through signalling pathways involving Syk and PI3 kinases, Jak2 and Stat3 molecules. Exogenous IL-6 promoted calcium-containing crystal formation and upregulation of genes involved in calcification: the pyrophosphate channel Ank, the calcium channel Annexin5 and the sodium/phosphate cotransporter Pit-1. Treatment of chondrocytes with IL-6 inhibitors significantly inhibited IL-6-induced crystal formation. In meniscectomised mice, increasing deposits of BCP crystals were observed around the joint and correlated with cartilage degradation and IL-6 expression. Finally, BCP crystals induced proteoglycan loss and IL-6 expression in human cartilage explants, which were reduced by an IL-6 inhibitor. CONCLUSIONS: BCP crystals and IL-6 form a positive feedback loop leading to OA. Targeting calcium-containing crystal formation and/or IL-6 are promising therapeutic strategies in OA.

Experimental osteoarthritis in rabbits: lesion progression

The aim of this study was to evaluate the progression of lesions in different stages of osteoarthritis (OA) experimental by radiography (RX), computed tomography (CT), macroscopic and histopathology, linking these different diagnostic methods, helped to provide information that helps the best time for the therapeutic approach. Four experimental periods were delineated at 3, 6, 9 and 12 weeks after induction of OA, known as PI, PII, PIII and PIV, respectively, each with six animals. We evaluated the five compartments of the femorotibial joint: medial femoral condyle (MFC), lateral femoral condyle (LFC), medial tibial plateau (MTP), lateral tibial plateau (LTP) and femoral trochlea (FT). Therefore we established an index by compartment (IC) and by adding such an index was estimated joint femorotibial (IFT). It was observed that the CFM was the compartment with the highest IC also differed significantly (p<0.05) from other compartments. Compartments showed no significant difference (p&gt;0.05) between the PI and PII, however contrary fact occurred between the PII and PIII (p<0.05), PIII and PIV (p<0.01) and between PI and PIV (p<0.001). Similarly the IFT, showed a significant difference in the animals of PIV compared to PI (p<0.001), PII (p<0.001) and PIII (p<0.01), and there was no statistical difference (p&gt; 0.05) between the PI and PII. In the variation of the average interval between periods, there was a higher value between the PIII PIV and for the other intervals of time periods (PI, PII, and PIII-PII). However, these intervals showed no statistically significant difference (p&gt;0.05). Through the RX, CT, macroscopic and histopathological findings, we found similar patterns among individuals within the same period demonstrating a gradual progression of the disease. These results show that between 3 and 6 weeks progression of the lesion is slower and probably also can be reversed in comparison to other ranges where proved further progression between 9 and 12 weeks after induction of trauma OA. These results may provide a better therapeutic approach aimed at reversing the lesions in early stages of OA. We conclude that the interconnection of the four diagnostic methods individually classified into scores, which were unified in both indices in the evaluation by the femorotibial joint compartment and may represent a diagnostic condition closer to the true condition of the injury and its progression.

Muscular function and functional mobility of faller and non-faller elderly women with osteoarthritis of the knee

Falls are a major concern in the elderly population with chronic joint disease. To compare muscular function and functional mobility among older women with knee osteoarthritis with and without a history of falls, 15 elderly women with a history of falls (74.20 �� 4.46 years) and 15 without a history of falls (71.73 �� 4.73 years) were studied. Muscular function, at the angular speed of 60, 120, and 180��/s, was evaluated using the Biodex Isokinetic Dynamometer. The sit-to-stand task was performed using the Balance Master System and the Timed Up and Go test was used to determine functional mobility. After collection of these data, the history of falls was investigated. A statistically significant difference was detected in the time taken to transfer the center of gravity during the sit-to-stand test (means �� SD; non-fallers: 0.35 �� 0.16 s; fallers: 0.55 �� 0.32 s; P = 0.049, Student t-test) and in the Timed Up and Go test (medians; non-fallers: 10.08 s; fallers: 11.59 s; P = 0.038, Mann-Whitney U-test). The results indicated that elderly osteoarthritic women with a history of falls presented altered functional mobility and needed more time to transfer the center of gravity in the sit-to-stand test. It is important to implement strategies to guarantee a better functional performance of elderly patients to reduce fall risks.

Whole-body vibration decreases the proliferativeb response of TCD4+ cells in elderly individuals with knee osteoarthritis

The aim of this study was to investigate the effect of adding whole-body vibration (WBV; frequency = 35 to 40 Hz; amplitude = 4 mm) to squat training on the T-cell proliferative response of elderly patients with osteoarthritis (OA) of the knee. This study was a randomized controlled trial in which the selected variables were assessed before and after 12 weeks of training. Twenty-six subjects (72 �� 5 years of age) were divided into three groups: 1) squat training with WBV (WBV, N = 8); 2) squat training without WBV (N = 10), and 3) a control group (N = 8). Women who were &#8805;60 years of age and had been diagnosed with OA in at least one knee were eligible. The intervention consisted of 12 uninterrupted weeks of squatting exercise training performed 3 times/week. Peripheral blood mononuclear cells were obtained from peripheral blood collected before and after training. The proliferation of TCD4+ and TCD8+ cells was evaluated by flow cytometry measuring the carboxyfluorescein succinimidyl ester fluorescence decay before and after the intervention (&#8710;). The proliferative response of TCD4+ cells (P = 0.02, effect size = 1.0) showed a significant decrease (23%) in the WBV group compared to the control group, while there was no difference between groups regarding the proliferative response of TCD8+ cells (P = 0.12, effect size = 2.23). The data suggest that the addition of WBV to squat exercise training might modulate T-cell-mediated immunity, minimizing or slowing disease progression in elderly patients with OA of the knee.

Measurement of serum estrogen and estrogen metabolites in pre- and postmenopausal women with osteoarthritis using high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry

Although 17&#946;-estradiol (E2) deficiency has been linked to the development of osteoarthritis (OA) in middle-aged women, there are few studies relating other estrogens and estrogen metabolites (EMs) to this condition. We developed a high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS) method to measure the levels of six EMs (i.e., estrone, E2, estriol, 2-hydroxyestrone, 2-hydroxyestradiol, and 16a-hydroxyestrone) in healthy pre- and postmenopausal women and women with OA. This method had a precision ranging from 1.1 to 3.1% and a detection limit ranging from 10 to 15 pg. Compared to healthy women, serum-free E2 was lower in the luteal and postmenopausal phases in women with OA, and total serum E2 was lower in postmenopausal women with OA. Moreover, compared to healthy women, total serum 2-hydroxyestradiol was higher in postmenopausal women with OA and total serum 2-hydroxyestrone was lower in both the luteal and follicular phases in women with OA. In conclusion, our HPLC-ESI-MS/MS method allowed the measurement of multiple biochemical targets in a single assay, and, given its increased cost-effectiveness, simplicity, and speed relative to previous methods, this method is suitable for clinical studies.

Protective effects of tumor necrosis factor-&#945; blockade by adalimumab on articular cartilage and subchondral bone in a rat model of osteoarthritis

We aimed to investigate the effects of an anti-tumor necrosis factor-&#945; antibody (ATNF) on cartilage and subchondral bone in a rat model of osteoarthritis. Twenty-four rats were randomly divided into three groups: sham-operated group (n=8); anterior cruciate ligament transection (ACLT)+normal saline (NS) group (n=8); and ACLT+ATNF group (n=8). The rats in the ACLT+ATNF group received subcutaneous injections of ATNF (20 &#956;g/kg) for 12 weeks, while those in the ACLT+NS group received NS at the same dose for 12 weeks. All rats were euthanized at 12 weeks after surgery and specimens from the affected knees were harvested. Hematoxylin and eosin staining, Masson's trichrome staining, and Mankin score assessment were carried out to evaluate the cartilage status and cartilage matrix degradation. Matrix metalloproteinase (MMP)-13 immunohistochemistry was performed to assess the cartilage molecular metabolism. Bone histomorphometry was used to observe the subchondral trabecular microstructure. Compared with the rats in the ACLT+NS group, histological and Mankin score analyses showed that ATNF treatment reduced the severity of the cartilage lesions and led to a lower Mankin score. Immunohistochemical and histomorphometric analyses revealed that ATNF treatment reduced the ACLT-induced destruction of the subchondral trabecular microstructure, and decreased MMP-13 expression. ATNF treatment may delay degradation of the extracellular matrix via a decrease in MMP-13 expression. ATNF treatment probably protects articular cartilage by improving the structure of the subchondral bone and reducing the degradation of the cartilage matrix.

Therapeutic potential of endothelin receptor type A and bradykinin receptor B1 dual antagonism in osteoarthritis treatment

Nous avons pr��alablement d��montr�� que l'endoth��line-1 (ET-1), un peptide vasoconstricteur de 21 acides amin��s, joue un r��le central dans le m��tabolisme des tissus articulaires et a des fonctions cataboliques sur le cartilage articulaire dans l'ost��oarthrose, en liant son r��cepteur de type A (ETA). Suite �� la rel��che du nonapeptide vasodilatateur bradykinine (BK), et l'augmentation d'expression du r��cepteur B1 des kinines (BKB1), ces m��diateurs engendrent un cycle d'inflammation, une destruction du cartilage, et une douleur articulaire. Lors de cette ��tude, l'efficacit�� th��rapeutique des antagonistes sp��cifiques du ETA et/ou BKB1 dans un mod��le animal d'ost��oarthrose a ��t�� test��e. Notre hypoth��se est que l'antagonisme va diminuer la progression de la pathologie et de la douleur articulaire. L'ost��oarthrose a ��t�� induite chez des rats par rupture chirurgicale du ligament crois�� ant��rieur. Les animaux ont ��t�� trait��s par injections intra articulaire hebdomadaires des antagonistes peptidiques sp��cifiques du ETA et/ou BKB1. La douleur articulaire a ��t�� ��valu��e par le test d'incapacitance statique durant les deux mois postop��ratoires ; la morphologie articulaire a ��t�� examin��e post mortem par radiologie et histologie. On constate que le traitement a diminu�� la douleur et a pr��serv�� la morphologie articulaire ; la double inhibition a ��t�� plus efficace que la simple inhibition. En conclusion, l'antagonisme double d'ETA et BKB1 am��liore la douleur chronique et pr��vient la d��gradation articulaire dans l'ost��oarthrose, ce qui sugg��re que ces r��cepteurs peuvent ��tre des cibles th��rapeutiques potentiels pour le traitement de cette pathologie.

The specific in vivo role of PPARgamma and its downstream signaling pathway in the pathophysiology of Osteoarthritis

L'arthrose est une maladie articulaire d��g��n��rative, avec une pathogen��se inconnue. Des ��tudes r��centes sugg��rent que l'activation du facteur de transcription du r��cepteur activateur de la prolif��ration des peroxysomes (PPAR) gamma est une cible th��rapeutique pour ce maladie. Les agonistes du PPAR�� inhibent l'inflammation et r��duisent la synth��se des produits de d��gradation du cartilage in vitro et in vivo. Cependant, des ��tudes utilisant des agonistes du PPAR�� n�����lucident pas les effets exacts m��di��s par ce g��ne complexe. En effet, certains de ces agonistes ont la capacit�� de r��gulariser d'autres voies de signalisation ind��pendantes de PPAR��, ainsi entra��nant des effets secondaires graves. Afin d'obtenir une efficacit�� th��rapeutique avec potentiellement moins de probl��mes de s��curit��, il est donc essentiel d'��lucider, in vivo, le r��le exact de PPAR�� dans la physiopathologie OA. Mon projet de th��se permettra de d��terminer, pour la premi��re fois, le r��le sp��cifique de PPAR�� in vivo dans la physiopathologie OA. Les souris utilis��es pour l�����tude avaient une d��l��tion conditionnelle du g��ne PPAR�� dans le cartilage. Ces derni��res ont ��t�� g��n��r��es en employant le syst��me LoxP/Cre. Pour tester cette hypoth��se, j'ai g��n��r�� deux types de souris avec une d��l��tion au PPAR��, (a) une suppression du g��ne PPAR�� sp��cifiquement dans le cartilage germinale pour l'��tude de l'arthrose li��e au d��veloppement et �� l'��ge et (b) la suppression inductible du g��ne PPAR�� sp��cifiquement dans le cartilage chez la souris adulte pour les ��tudes OA. L�����tude pr��c��dente dans notre laboratoire, utilisant ces souris ayant une d��l��tion au g��ne PPAR�� germinales, montre que ces souris pr��sentent des anomalies du d��veloppement du cartilage. J'ai ��galement explor�� si ces souris qui pr��sentent des d��fauts pr��coces du d��veloppement ont toutes les modifications ph��notypiques dans le cartilage au cours du vieillissement. Mes r��sultats ont montr�� que les souris adultes, ayant une d��l��tion au g��ne PPAR��, ont pr��senter un ph��notype de l'arthrose spontan��e associ��e �� une d��gradation du cartilage, l���hypocellularit��, la fibrose synoviale. Cette ��tude a montr�� que PPAR�� est un r��gulateur essentiel pour le cartilage, et c���est le manque (l���absence) de ce dernier qui conduit �� un ph��notype de l'arthrose spontan��e acc��l��r��e (American Journal of Pathologie). A partir de ce but de l'��tude, on n���a pas pu v��rifier si ces souris pr��sentaient l���OA spontan��e en raison des d��fauts de d��veloppement ou �� la suite de la d��l��tion du g��ne PPAR��. Pour contourner les d��fauts de d��veloppement, j'ai g��n��r�� des souris ayant une d��l��tion du g��ne PPAR�� sp��cifiquement dans le cartilage inductible avec le syst��me Col2rTACre. Ces souris ont ��t�� soumises �� mod��le de la chirurgie OA (DMM: d��stabilisation du m��nisque m��dial) et les r��sultats r��v��lent que les souris PPAR�� KO ont une d��gradation acc��l��r��e du cartilage, une hypocellularit��, une fibrose synoviale et une augmentation de l'expression des marqueurs cataboliques et des marqueurs inflammatoire. La perte de PPAR dans le cartilage articulaire est un ��v��nement critique qui initie la d��gradation de cartilage dans OA. Les ��tudes r��centes sugg��rent que le proc��s d���autophagie, une forme de survie cellulaire programm��e, est alt��r�� pendant l���OA et peut contribuer vers une protection diminu��e des cellules, r��sultant la d��gradation du cartilage. J���ai donc explor�� le r��le de PPAR�� dans la protection des cellules en d��terminant l���effet de manque de PPAR�� dans le cartilage par l���expression de mTOR (r��gulateur n��gatif principal d���autophagie) et les g��nes d���autophagie durant OA. Mes r��sultats ont montr�� que les souris KO PPAR�� pr��sentent ��galement une augmentation sur l'expression de mTOR et une diminution sur l���expression des marqueurs autophagiques en comparaison avec les chondrocytes articulaires isol��s des souris contr��les OA. J'ai sugg��r�� l'hypoth��se que PPAR�� contr��le la r��gulation de la signalisation de mTOR/autophagie, et finalement la mort des chondrocytes et l���expression des facteurs cataboliques et les facteurs inflammatoire. Pour tester cette hypoth��se, j���ai fait la transfection des chondrocytes arthrosiques PPAR��-KO avec le vecteur d���expression de PPAR�� pour d��terminer si la restauration de l'expression de PPAR�� peut sauver le ph��notype des cellules PPAR��-KO OA. J'ai observ�� que la restauration de l'expression de PPAR�� dans les cellules PPAR��-KO en pr��sence du vecteur d'expression PPAR��, a pu consid��rablement r��gulariser n��gativement l'expression de mTOR et mettre en r��gle positivement l'expression des g��nes autophagiques ainsi que le sauvetage significative de l'expression du collag��ne de type II et l���aggrecan et de baisser de mani��re significative l'expression de marqueurs cataboliques critiques et des marqueurs inflammatoires. Pour prouver que l���augmentation de la signalisation de mTOR et la diminution de l'autophagie est responsable du ph��notype OA acc��l��r��e observ��e dans les souris PPAR�� KO in vivo, j'ai g��n��r�� les souris doubles KO PPAR��- mTOR inductible sp��cifique du cartilage en utilisant le syst��me Col2 - rtTA -Cre et soumis ces souris �� DMM mod��le de l'arthrose. Mes r��sultants d��montrent que les souris avec PPAR��- mTOR doubles KO ont ��t�� significativement prot��g��s contre les OA DMM induites associ��es �� une protection significative contre la destruction du cartilage, la perte de prot��oglycanes et la perte de chondro-cellularit�� par rapport aux souris t��moins. Consid��rant que mTOR est un r��presseur majeur de l'autophagie, j'ai trouv�� que l'expression de deux marqueurs de l'autophagie critiques (ULK1 et LC3B) a ��t�� significativement plus ��lev��e dans les chondrocytes extraits les souris doubles KO PPAR��-mTOR par rapport aux souris t��moins. En plus, les ��tudes de sauvetage in vitro en utilisant le vecteur d'expression PPAR et les ��tudes in vivo utilisant les souris doubles KO PPAR��- mTOR montrent que PPAR�� est impliqu�� dans la r��gulation de la prot��ine signalant de mTOR/autophagie dans le cartilage articulaire. Ces r��sultats contournent PPAR�� et sa signalisation en aval de mTOR/autophagie en tant que cibles th��rapeutiques potentielles pour le traitement de l'arthrose.

The role of transcription factor Nrf2 in osteoarthritis

Introduction: L'arthrose est caract��ris��e par une destruction progressive du cartilage, une inflammation synoviale, et un remodelage de l���os sous-chondral avec une production excessive des m��diateurs inflammatoires et cataboliques. Nous avons d��montr�� que le niveau du 4-hydroxynon��nal (4-HNE), un produit de la peroxydation lipidique, est augment�� dans le cartilage humain arthrosique sans qu���on sache le m��canisme exacte impliqu�� dans l���augmentation de cette mol��cule. Des donn��es de la litt��rature indiquent que l���accumulation du HNE est contr��l��e par l���action de la glutathione S-transf��rase A4-4 (GSTA4-4), une enzyme impliqu��e dans la d��toxification du HNE. Au niveau transcriptionel, l���expression de cette enzyme est r��gul��e par la transactivation du facteur de transcription Nrf2. Objectif: L���objectif de cette ��tude vise �� d��montrer que l���augmentation du HNE dans le cartilage arthrosique est attribu��e, en partie, �� l���alt��ration de l���expression de la GSTA4-4 et de Nrf2. M��thode: Le niveau d���expression de la GSTA4-4 et de Nrf2 a ��t�� mesur��e par Western blot et par PCR en temps r��el dans le cartilage humain arthrosique et dans le cartilage provenant des souris atteintes d���arthrose. Pour d��montrer le r��le du Nrf2 dans l���arthrose, les chondrocytes humains arthrosiques ont ��t�� trait��s par l���interleukine 1beta (IL-1��) ou par le H2O2 en pr��sence ou en absence des activateurs du Nrf2 tels que le Protandim��, AI, et du 6-Ging��rol. Par ailleurs, les chondrocytes ont ��t�� transfect��s par un vecteur d���expression de Nrf2 puis trait��s par l���IL-��. En utilisant le mod��le d���arthrose chez la souris, les animaux ont ��t�� trait��s par voie orale de 10 mg/kg/jour de Protandim�� pendant 8 semaines. R��sultats: Nous avons observ�� une diminution significative de l���expression de la GSTA4-4 et de Nrf2 dans le cartilage humain et murin arthrosique. L'activation de Nrf2 bloque la stimulation de la m��talloprot��inase-13 (MMP-13), la prostaglandine E2 (PGE2) et de l'oxyde nitrique (NO) par l���IL-1��. En outre, nous avons montr�� que l'activation Nrf2 prot��ge les cellules contre la mort cellulaire induite par H2O2. Fait int��ressant, l'administration orale de Protandim�� r��duit la production du HNE par l'interm��diaire de l���activation de la GSTA4. Nous avons d��montr�� que le niveau d���expression de la GSTA4-4 et de Nrf2 diminue dans le cartilage provenant des patients et des souris atteints d���arthrose. De plus, la surexpression de ce facteur nucl��aire Nrf2 emp��che la production du HNE et la MMP-13 et l���inactivation de la GSTA4-4. Dans notre mod��le exp��rimental d���arthrose induite par d��stabilisation du m��nisque m��dial chez la souris, nous avons trouv�� que l'administration orale de Protandim�� �� 10 mg / kg / jour r��duit les l��sions du cartilage. Conclusion: Cette ��tude est de la premi��re pour d��montrer le r��le physiopathologique du Nrf2 in vitro et in vivo. Nos r��sultats d��montrent que l���activation du Nrf2 est essentielle afin de maintenir l���expression de la GSTA4-4 et de r��duire le niveau du HNE. Le fait que les activateurs du Nrf2 abolissent la production de la HNE et aussi un certain nombre de facteurs connus pour ��tre impliqu��s dans la pathogen��se de l���arthrose les rend des agents cliniquement utiles pour la pr��vention de la maladie.

Selective inhibition of inducible nitric oxide synthase prevents lipid peroxidation in cartilage from patients with osteoarthritis.

INTRODUCTION: Emerging evidence indicates that nitric oxide (NO), which is increased in osteoarthritic (OA) cartilage, plays a role in 4-hydroxynonenal (HNE) generation through peroxynitrite formation. HNE is considered as the most reactive product of lipid peroxidation (LPO). We have previously reported that HNE levels in synovial fluids are more elevated in knees of OA patients compared to healthy individuals. We also demonstrated that HNE induces a panoply of inflammatory and catabolic mediators known for their implication in OA cartilage degradation. The aim of the present study was to investigate the ability of inducible NO synthase (iNOS) inhibitor, L-NIL (L-N6-(L-Iminoethyl)Lysine), to prevent HNE generation through NO inhibition in human OA chondrocytes. METHOD: Cells and cartilage explants were treated with or without either an NO generator (SIN or interleukin 1beta (IL-1��)) or HNE in absence or presence of L-NIL. Protein expression of both iNOS and free-radical-generating NOX subunit p47 (phox) were investigated by western blot. iNOS mRNA detection was measured by real-time RT-PCR. HNE production was analysed by ELISA, Western blot and immunohistochemistry. S-nitrosylated proteins were evaluated by Western Blot. Prostaglandin E2 (PGE2) and metalloproteinase 13 (MMP-13) levels as well as glutathione S-transferase (GST) activity were each assessed with commercial kits. NO release was determined using improved Griess method. Reactive oxygen species (ROS) generation was revealed using fluorescent microscopy with the use of commercial kits. RESULTS: L-NIL prevented IL-1��-induced NO release, iNOS expression at protein and mRNA levels, S-nitrosylated proteins and HNE in a dose dependent manner after 24h of incubation. Interestingly, we revealed that L-NIL abolished IL-1��-induced NOX component p47phox as well as ROS release. The HNE-induced PGE2 release and both cyclooxygenase-2 (COX-2) and MMP-13 expression were significantly reduced by L-NIL addition. Furthermore, L-NIL blocked the IL-1�� induced inactivation of GST, an HNE-metabolizing enzyme. Also, L-NIL prevented HNE induced cell death at cytotoxic levels. CONCLUSION: Altogether, our findings support a beneficial effect of L-NIL in OA by preventing LPO process in NO-dependent and/or independent mechanisms.

Role of histone methylation in the regulation of COX-2, iNOS, and mPGES-1 gene expression in human chondrocytes: Implication for Osteoarthritis

L'arthrose (OA) est une maladie articulaire d��g��n��rative, class��e comme la forme la plus fr��quente au monde. Elle est caract��ris��e par la d��g��n��rescence du cartilage articulaire, l���inflammation de la membrane synoviale, et le remodelage de l���os sous-chondral. Ces changements structurels et fonctionnels sont dues �� de nombreux facteurs. Les cytokines, les prostaglandines (PG), et les esp��ces r��actives de l'oxyg��ne sont les principaux m��diateurs impliqu��s dans la pathophysiologie de l'OA. L'interleukine-1�� (IL-1��) est une cytokine pro-inflammatoire majeure qui joue un r��le crucial dans l'OA. L'IL-1�� induit l'expression de la cyclooxyg��nase-2 (COX-2), la microsomale prostaglandine E synthase-1 (mPGES-1), la synthase inductible de l'oxyde nitrique (iNOS), ainsi que leurs produits la prostaglandine E2 (PGE2) et l'oxyde nitrique (NO). Ce sont des m��diateurs essentiels de la r��ponse inflammatoire au cours de l'OA qui contribuent aux m��canismes des douleurs, de gonflement, et de destruction des tissus articulaires. Les modifications ��pig��n��tiques jouent un r��le tr��s important dans la r��gulation de l���expression de ces g��nes pro-inflammatoires. Parmi ces modifications, la m��thylation/ d��m��thylation des histones joue un r��le critique dans la r��gulation des g��nes. La m��thylation/ d��m��thylation des histones est m��di��e par deux types d'enzymes: les histones m��thyltransf��rases (HMT) et les histones d��m��thylases (HDM) qui favorisent l���activation et/ou la r��pression de la transcription. Il est donc n��cessaire de comprendre les m��canismes mol��culaires qui contr��lent l���expression des g��nes de la COX-2, la mPGES-1, et l���iNOS. L'objectif de cette ��tude est de d��terminer si la m��thylation/d��m��thylation des histones contribute �� la r��gulation de l���expression des g��nes COX-2, mPGES-1, et iNOS dans des chondrocytes OA humains induits par l'IL-1��. Nous avons montr�� que la m��thylation de la lysine K4 de l'histone H3 (H3K4) par SET-1A contribue �� l���activation des g��nes COX-2 et iNOS dans les chondrocytes humains OA induite par l'IL-1��. Nous avons ��galement montr�� que la lysine K9 de l���histone H3 (H3K9) est d��m��thyl��e par LSD1, et que cette d��m��thylation contribue �� l���expression de la mPGES-1 induite par IL-1�� dans les chondrocytes humains OA. Nous avons aussi trouv�� que les niveaux d'expression des enzymes SET-1A et LSD1 sont ��lev��s au niveau du cartilage OA. Nos r��sultats montrent, pour la premi��re fois, l'implication de la m��thylation/ d��m��thylation des histones dans la r��gulation de l���expression des g��nes COX-2, mPGES-1, et iNOS. Ces donn��es sugg��rent que ces m��canismes pourraient ��tre une cible potentielle pour une intervention pharmacologique dans le traitement de la physiopathologie de l'OA.

The Role of ULK1 in the Pathophysiology of Osteoarthritis

L'arthrose est la maladie musculo-squelettique la plus commune dans le monde. Elle est l'une des principales causes de douleur et d���incapacite�� chez les adultes, et elle repre��sente un fardeau conside��rable sur le syste��me de soins de sante��. L'arthrose est une maladie de l���articulation entie��re, impliquant non seulement le cartilage articulaire, mais aussi la synoviale, les ligaments et l���os sous-chondral. L���arthrose est caracte��rise��e par la de��ge��ne��rescence progressive du cartilage articulaire, la formation d���oste��ophytes, le remodelage de l'os sous-chondral, la de��te��rioration des tendons et des ligaments et l'inflammation de la membrane synoviale. Les traitements actuels aident seulement a�� soulager les sympto��mes pre��coces de la maladie, c���est pour cette raison que l'arthrose est caracte��rise��e par une progression presque ine��vitable vers la phase terminale de la maladie. La pathoge��nie exacte de l'arthrose est encore inconnue, mais on sait que l'e��ve��nement cle�� est la de��gradation du cartilage articulaire. Le cartilage articulaire est compose�� uniquement des chondrocytes; les cellules responsables de la synthe��se de la matrice extracellulaire et du maintien de l'home��ostasie du cartilage articulaire. Les chondrocytes maintiennent la matrice du cartilage en remplac��ant les macromole��cules de��grade��es et en re��pondant aux le��sions du cartilage et aux de��ge��ne��rescences focales en augmentant l'activite�� de synthe��se locale. Les chondrocytes ont un taux faible de renouvellement, c���est pour cette raison qu���ils utilisent des me��canismes endoge��nes tels que l'autophagie (un processus de survie cellulaire et d���adaptation) pour enlever les organelles et les macromole��cules endommage��s et pour maintenir l'home��ostasie du cartilage articulaire. i ���L'autophagie est une voie de de��gradation lysosomale qui est essentielle pour la survie, la diffe��renciation, le de��veloppement et l���home��ostasie. Elle re��gule la maturation et favorise la survie des chondrocytes matures sous le stress et des conditions hypoxiques. Des e��tudes effectue��es par nous et d'autres ont montre�� qu���un de��re��glement de l���autophagie est associe�� a�� une diminution de la chondroprotection, a�� l'augmentation de la mort cellulaire et a�� la de��ge��ne��rescence du cartilage articulaire. Carames et al ont montre�� que l'autophagie est constitutivement exprime��e dans le cartilage articulaire humain normal. Toutefois, l'expression des inducteurs principaux de l'autophagie est re��duite dans le vieux cartilage. Nos e��tudes pre��ce��dentes ont e��galement identifie�� des principaux ge��nes de l���autophagie qui sont exprime��s a�� des niveaux plus faibles dans le cartilage humain atteint de l'arthrose. Les me��mes re��sultats ont e��te�� montre��s dans le cartilage articulaire provenant des mode��les de l���arthrose expe��rimentaux chez la souris et le chien. Plus pre��cise��ment, nous avons remarque�� que l'expression d���Unc-51 like kinase-1 (ULK1) est faible dans cartilage humain atteint de l'arthrose et des mode��les expe��rimentaux de l���arthrose. ULK1 est la se��rine / thre��onine prote��ine kinase et elle est l���inducteur principal de l���autophagie. La perte de l���expression de ULK1 se traduit par un niveau d���autophagie faible. Etant donne�� qu���une signalisation ade��quate de l'autophagie est ne��cessaire pour maintenir la chondroprotection ainsi que l'home��ostasie du cartilage articulaire, nous avons propose�� l���hypothe��se suivante : une expression ade��quate de ULK1 est requise pour l���induction de l���autophagie dans le cartilage articulaire et une perte de cette expression se traduira par une diminution de la chondroprotection, et une augmentation de la mort des chondrocytes ce qui conduit a�� la de��ge��ne��rescence du cartilage articulaire. Le ro��le exact de ULK1 dans la pathoge��nie de l'arthrose est inconnue, j���ai alors cre��e�� pour la premie��re fois, des souris KO ULK1spe��cifiquement dans le cartilage en utilisant la technologie Cre-Lox et j���ai ensuite soumis ces souris a�� la de��stabilisation du me��nisque me��dial (DMM), un mode��le de l'arthrose de la souris pour e��lucider le ro��le spe��cifique in vivo de ULK1 dans pathogene��se de l'arthrose. Mes re��sultats montrent que ULK1 est essentielle pour le maintien de l'home��ostasie du cartilage articulaire. Plus pre��cise��ment, je montre que la perte de ULK1 dans le cartilage articulaire a cause�� un phe��notype de l���arthrose acce��le��re��, associe�� a�� la de��ge��ne��rescence acce��le��re��e du cartilage, l���augmentation de la mort cellulaire des chondrocytes, et l���augmentation de l'expression des facteurs cataboliques. En utilisant des chondrocytes provenant des patients atteints de l���arthrose et qui ont e��te�� transfecte��es avec le plasmide d'expression ULK1, je montre qu���ULK1 est capable de re��duire l���expression de la prote��ine mTOR (principal re��gulateur ne��gatif de l���autophagie) et de diminuer l���expression des facteurs cataboliques comme MMP-13 et ADAMTS-5 et COX-2. Mes re��sultats jusqu'a�� pre��sent indiquent que ULK1 est une cible the��rapeutique potentielle pour maintenir l'home��ostasie du cartilage articulaire.