Relatório de estágio de Mestrado em Ensino de Biologia e de Geologia no 3º ciclo de Ensino Básico e no Ensino Secundário

Relatório de estágio Pedagógico apresentado na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Ensino de Biologia e Geologia no 3º Ciclo de Ensino Básico e no Ensino Secundário

As teses do defensor Pacis, II, XIII

pp. 205-227

Aplicação de técnicas de biologia molecular no estudo da diversidade genética

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Grau de Mestre por Licenciados Pré-Bolonha, em Biotecnologia

Acidose Tubular Renal Distal e Surdez Neurossensorial com Mutação no Gene ATP6V1B1

A acidose tubular renal distal é uma doença rara, caracterizada pela incapacidade na acidificação da urina, condicionando acidose metabólica hiperclorémica, hipocaliémia, hipercalciúria e nefrocalcinose, o que poderá causar atraso de crescimento, alteração do metabolismo ósseo e insuficiência renal crónica. A acidose tubular renal distal associada a surdez neurossensorial é uma doença de herança autossómica recessiva, causada por mutações do gene que codifica a subunidade B1 da H+ -ATPase (ATP6V1B1). Os autores relatam os casos de duas irmãs que apresentaram má progressão ponderal, alterações iónicas, do equilíbrio ácido base e surdez neurossensorial. Foi detectada em ambas as crianças a mutação homozigótica no gene ATP6V1B1. Com estes dois casos pretende -se destacar a importância de um diagnóstico precoce nesta patologia rara.

Leishmaniose tegumentar americana na Ilha Grande. Rio de Janeiro: V. Observações sobre a biologia dos transmissores em condiçoes naturais

Durante um surto de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) na Praia Vermelha, Ilha Grande, município de Angra dos Reis, Rio de Janeiro, foram coletados 4.192 exemplares de flebotomíneos em ambiente domiciliar e silvestre, com isca animal e outros abrigos naturais, durante o período de janeiro de 1976 a abril de 1977. Entre o total de 11 espécies coletadas encontraram-se 2.493 exemplares de Lutzomyia intermedia, 1.594 de Lutzomyia migonei e 105 exemplares de outras espécies. A L. intermedia apresentou densidade mais elevada no domicílio humano, enquanto a L. migonei apresentou coletas mais rendosas com iscas animais e galinheiros. O sinantropismo e a elevada densidade no ambiente domiciliar incriminam as espécies L. intermedia e L. migonei como as prováveis vetoras da LTA na Ilha Grande.

Influência da temperatura e umidade na biologia de Rhodnius neglectus Lent, 1954 em laboratório (Hemiptera, Reduviidae,Triatominae)

O objetivo do presente trabalho foi observar o desenvolvimento de R. neglectus em diferentes condições de temperatura e umidade. Três grupos foram formados:33/40 (33+/- 1ºC e 40% +/-5% UR), 33/70 (33+/- 1ºC e 70% +/-5% UR), e 28/70 (28+/- 1ºC e 70% +/-5% UR). Todos os grupos foram observados diariamente para avaliação do período de incubação dos ovos, período de desenvolvimento dos estádios ninfais, percentual de mortalidade por estádio, número de repastos realizados, e período de desenvolvimento da eclosão a muda imaginal. O desenvolvimento embrionário apresentou diferenças significativas em todos os tratamentos, o grupo 33/40 apresentou o menor período de incubação. O menor número de repastos foi observado no grupo 33/40 exceto para o primeiro estádio (grupo 28/70). O período de desenvolvimento ninfal foi significativamente reduzido no grupo 33/40; entretanto, o percentual de mortalidade deste grupo foi alto, e os insetos não conseguiram realizar a muda imaginal.

Transcriptional regulation of the mannosyltransferase-encoding gene pigm in inherited glycosylphosphatidylinositol (GPI) deficiency

RESUMO:O glicosilfosfatidilinositol (GPI) é um complexo glicolipídico utlizado por dezenas de proteínas, o qual medeia a sua ancoragem à superfície da célula. Proteínas de superfície celular ancoradas a GPI apresentam várias funções essenciais para a manutenção celular. A deficiência na síntese de GPI é o que caracteriza principalmente a deficiência hereditária em GPI, um grupo de doenças autossómicas raras que resultam de mutações nos genes PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO e PIGT, os quais sao indispensáveis para a biossíntese do GPI. Uma mutação pontual no motivo rico em GC -270 no promotor de PIGM impede a ligação do factor de transcrição (FT) Sp1 à sua sequência de reconhecimento, impondo a compactação da cromatina, associada à hipoacetilação de histonas, e consequentemente, impedindo a transcrição de PIGM. Desta forma, a adição da primeira manose ao GPI é comprometida, a síntese de GPI diminui assim como as proteínas ligadas a GPI à superficie das células. Pacientes com Deficiência Hereditária em GPI-associada a PIGM apresentam trombose e epilesia, e ausência de hemólise intravascular e anemia, sendo que estas duas últimas características definem a Hemoglobinúria Paroxística Nocturna (HPN), uma doença rara causada por mutações no gene PIGA. Embora a mutação que causa IGD seja constitutiva e esteja presente em todos os tecidos, o grau de deficiência em GPI varia entre células do mesmo tecido e entre células de tecidos diferentes. Por exemplo nos granulócitos e linfócitos B a deficiência em GPI é muito acentuada mas nos linfócitos T, fibroblastos, plaquetas e eritrócitos é aproximadamente normal, daí a ausência de hemólise intravascular. Os eventos transcricionais que estão na base da expressão diferencial da âncora GPI nas células hematopoiéticas são desconhecidos e constituem o objectivo geral desta tese. Em primeiro lugar, os resultados demonstraram que os níveis de PIGM mRNA variam entre células primárias hematopoiéticas normais. Adicionalmente, a configuração dos nucleossomas no promotor de PIGM é mais compacta em células B do que em células eritróides e tal está correlacionado com os níveis de expressão de PIGM, isto é, inferior nas células B. A presença de vários motivos de ligação para o FT específico da linhagem megacariocítica-eritróide GATA-1 no promotor de PIGM sugeriu que GATA-1 desempenha um papel regulador na sua transcrição. Os resultados mostraram que muito possivelmente GATA-1 desempenha um papel repressor em vez de activador da expressão de PIGM. Resultados preliminares sugerem que KLF1, um factor de transcrição restritamente eritróide, regula a transcrição de PIGM independentemente do motivo -270GC. Em segundo lugar, a investigação do papel dos FTs Sp demonstrou que Sp1 medeia directamente a transcrição de PIGM em ambas as células B e eritróide. Curiosamente, ao contrário do que acontece nas células B, em que a transcrição de PIGM requer a ligação do FT geral Sp1 ao motivo -270GC, nas células eritróides Sp1 regula a transcrição de PIGM ao ligar-se a montante e não ao motivo -270GC. Para além disso, demonstrou-se que Sp2 não é um regulador directo da transcrição de PIGM quer nas células B quer nas células eritróides. Estes resultados explicam a ausência de hemólise intravascular nos doentes com IGD associada a PIGM, uma das principais características que define a HPN. Por último, resultados preliminares mostraram que a repressão da transcrição de PIGM devida à mutação patogénica -270C>G está associada com a diminuição da frequência de interacções genómicas em cis entre PIGM e os seus genes “vizinhos”, sugerindo adicionalmente que a regulação de PIGM e desses genes é partilhada. No seu conjunto, os resultados apresentados nesta tese contribuem para o conhecimento do controlo transcricional de um gene housekeeping, específico-detecido, por meio de FTs genéricos e específicos de linhagem.-------------ABSTRACTC: Glycosylphosphatidylinositol (GPI) is a complex glycolipid used by dozens of proteins for cell surface anchoring. GPI-anchored proteins have various functions that are essential for the cellular maintenance. Defective GPI biosynthesis is the hallmark of inherited GPI deficiency (IGD), a group of rare autosomal diseases caused by mutations in PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO and PIGT, all genes indispensable for GPI biosynthesis. A point mutation in the -270GC-rich box in the core promoter of PIGM disrupts binding of the transcription factor (TF) Sp1 to it, imposing nucleosome compaction associated with histone hypoacetylation, thus abrogating transcription of PIGM. As a consequence of PIGM transcriptional repression, addition of the first mannose residue onto the GPI core and thus GPI production are impaired; and expression of GPI-anchored proteins on the surface of cells is severely impaired. Patients with PIGM-associated IGD suffer from life-threatening thrombosis and epilepsy but not intravascular haemolysis and anaemia, two defining features of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH), a rare disease caused by somatic mutations in PIGA. Although the disease-causing mutation in IGD is constitutional and present in all tissues, the degree of GPI deficiency is variable and differs between cells of the same and of different tissues. Accordingly, GPI deficiency is severe in granulocytes and B cells but mild in T cells, fibroblasts, platelets and erythrocytes, hence the lack of intravascular haemolysis.The transcriptional events underlying differential expression of GPI in the haematopoietic cells of PIG-M-associated IGD are not known and constitute the general aim of this thesis. Firstly, I found that PIGM mRNA levels are variable amongst normal primary haematopoietic cells. In addition, the nucleosome configuration in the promoter of PIGM is more compacted in B cells than in erythroid cells and this correlated with the levels of PIGM mRNA expression, i.e., lower in B cells. The presence of several binding sites for GATA-1, a mega-erythroid lineage-specific transcription factor (TF), at the PIGM promoter suggested that GATA-1 has a role on PIGM transcription. My results showed that GATA-1 in erythroid cells is most likely a repressor rather than an activator of PIGM expression. Preliminary data suggested that KLF1, an erythroid-specific TF, regulates PIGM transcription but independently of the -270GC motif. Secondly, investigation of the role of the Sp TFs showed that Sp1 directly mediates PIGM transcriptional regulation in both B and erythroid cells. However, unlike in B cells in which active PIGM transcription requires binding of the generic TF Sp1 to the -270GC-rich box, in erythroid cells, Sp1 regulates PIGM transcription by binding upstream of but not to the -270GC-rich motif. Additionally, I showed that Sp2 is not a direct regulator of PIGM transcription in B and erythroid cells. These findings explain lack of intravascular haemolysis in PIGM-associated IGD, a defining feature of PNH. Lastly, preliminary work shows that transcriptional repression of PIG-M by the pathogenic -270C>G mutation is associated with reduced frequency of in cis genomic interactions between PIGM and its neighbouring genes, suggesting a shared regulatory link between these genes and PIGM. Altogether, the results presented in this thesis provide novel insights into tissuespecific transcriptional control of a housekeeping gene by lineage-specific and generic TFs.

Biologia comparativa e comportamento alimentar de Rhodnius neglectus e Rhodnius robustus (Triatominae) sob condições de laboratório

INTRODUÇÃO: A competência vetorial de triatomíneos é determinada a partir de estudos sobre biologia e comportamento alimentar em condições de campo e/ou laboratório. Fatores como número de picadas, quantidade de sangue ingerido e tempo de defecação têm implicações na transmissão de tripanosomatídeos. Parâmetros biológicos e comportamentais de Rhodnius neglectus e R. robustus foram comparados experimentalmente para estimar diferenças no potencial de transmissão de tripanosomatídeos. MÉTODOS: Os triatomíneos foram observados diariamente para determinar o período de desenvolvimento ninfal, mortalidade, detecção da fonte alimentar, número de picadas, tempo do repasto sanguíneo, quantidade de sangue ingerido, tempo entre o final do repasto e a primeira defecação e frequência de defecação. RESULTADOS: Apesar do período ninfal de R. neglectus (156,4 ± 25,05d) ter sido menor que o de R. robustus (204,7 ± 13,22d), a mortalidade foi similar entre as espécies (63,8 e 65%, respectivamente). R. robustus e R. neglectus detectaram rapidamente a fonte alimentar, especialmente no primeiro estádio (2,5 e 1,6min, respectivamente). Apesar do tempo de repasto sanguíneo ter sido similar entre as espécies, R. robustus ingeriu em média uma maior quantidade de sangue em todos os estádios, com maiores valores para as ninfas V. As ninfas de R. neglectus picaram mais vezes as fontes alimentares, defecaram mais rápido e mais frequentemente que as de R. robustus. CONCLUSÕES: Sob as condições de laboratório usadas, R. neglectus possui um maior potencial para transmissão de Trypanosoma cruzi e T. rangeli que R. robustus, atributo que deve ser avaliado em infecções experimentais.

Alguns aspectos da biologia reprodutiva do guaranazeiro (Paullinia cupana var. sorbilis (Mart.) Ducke - Sapindaceae

O objetivo deste trabalho é a identificação dos insetos visitantes do guaraná (Paullinia cupanavar. sorbilis)e a determinação dos prováveis polinizadores, em uma plantação próxima de Manaus, assim como determinar a taxa de visita em ambas as flores, masculinas e femininas. Também estuda a variação na freqüência da produção de flores masculinas e femininas, no período da floração. Foram coletadas trinta e duas famílias de insetos de cinco ordens. Hymenoptera foi a ordem mais freqüente com 71% de todos os indivíduos. Vinte e sete espécies de abelhas foram encontradas visitando as flores. A síndrome geral da polinização da espécies parece estar adaptada aos Hymenoptera. E sugerido que Melipona seminigra merilae, Xylocopa muscariae Apis melliferaestão entre os mais Importantes polinlzadores, sendo que outros Hymenoptera, Diptera, Lepidoptera e Coleoptera são, talvez, ocasionais . Parece não haver preferência dos diversos grupos de insetos por flores masculinas ou femininas. A floração ocorreu durante 37 a 38 dias com dois períodos bem definidos. Houve uma pausa de um a dois dias [sem floração) entre os dois períodos, coincidindo em todas as inflarescências estudadas. 0 primeiro período durou 20-22 dias, enquanto o segundo foi menor, durando somente 16-18 dias. Em nenhum caso, o pique da floração masculina coincidiu com a feminina.

Biologia alimentar de três espécies de Triportheus (PISCES: CHARACOIDEIL, CHARACIDAE) do Lago do Castanho, Amazonas

Neste trabalho, é discutida a composição do conteúdo estomacal de três espécies de sardinha: Triportheus angulatus, Triportheus elongatus e Triportheus culter, do lago do Castanho, um lago de várzea localizado na Amazônia Central, com o objetivo de determinar o comportamento alimentardessas espécies, comparativamente, em funções de variações hidrológicas e ecológicas regionais, e desenvolvimento dos indivíduos. Paralelamente, procura-se correlacionar determinadas estruturas morfoanatômicas de adaptação ligadas mais diretamente ao tipo de regime alimentar de cada espécie como dentes e rastros branquiais. Em conseqüência dos tipos de alimentos ingeridos e observações de campo é feita a caracterização do possível bíotopo ocupado pelas espécies.

Biologia de Anofelinos Amazônicos. VI. Variabilidade Enzimática em ANOPHELES DARLINGI Root. (DIPTERA, CULICIDAE)

São relatados resultados preliminares sobre o polimorfismo protético de populuções naturais de Anopheles darlingi, procedentes de duas localidades da região amazônica-Ariquemes (Rondônia) e Rodovia PA-422 (Pará). Pata as esterases, foi detectada variação para o locus Est-2na população de Ariquemes, enquanto foi monomórfico na população da PA-422, sendo verificados nesta última, apenas indivíduos com o genótipo Est2*F/Est2*F. A freqüência do alelo Est2*F foi estimada em 0,80 na população de Ariquemes, valor este muito maior do que o observado na população da BR-174 (Manaus/Boa Vista), em estudos anteriores, que foi de 0,48. Os resultados para o sistema da leucina aminopeptidase (LAP) sugerem que a enzima é controlada por três loci, aparentemente monomórficos em ambas as populações.

Contribuição ao conhecimento da biologia de Carcharhinus porosus Ranzani, 1839 (PISCES, CHONDRICHTHYES) das reentrâncias Maranhenses

184 machos da Carcharchinus porosas foram capturados com rede de emalhar nas Reentrâncias Maranhenses, entre Cururupu (1º 20' S e 45º W) e São Luis (2º 241 30'' S e 44º W) no período de outubro de 1983 à janeiro de 1984 e de junho à setembro de 1984. O desenvolvimento dos machos desta espécie foi estudado através da relação peso-comprimento e do crescimento: dos claspers, dos testículos, dos epidídimos e do fígado. Com exceção dos claspers e do fígado, o crescimento dos órgãos em questão é contínuo. No crescimento dos claspers evidenciou-se 3 fases que correspondem: a fase juvenil, a fase de adolescência e a fase adulta. Demonstrou-se, também, que existe uma descontinuidade no crescimento do fígado no momento da passagem da fase de adolescência à fase adulta, e que esta se verifica quando se relaciona o peso deste órgão com o peso corporal. Esfregaços do conteúdo da visívula seminal mostraram que o líquido branco presente neste órgão é livre de espermatozóides até 70 cm. Com base no crescimento dos claspers e na produção de espermatozóides normais, estabeleceu-se o tamanho de primeira maturidade em 71 cm (fim da fase de adolescência) e o tamanho de 100% de maturidade em 75 cm (início da fase adulta).

Biologia de anofelinos Amazônicos. XI. Estudos em populações de Anopheles e controle da malária em Ariquemes (Rondônia)

São apresentados dados sobre inquérito entomológico para espécies de Anopheles rea lizado no Município de Ariquemes e discutida a incidência da malária neste Município e no Estado de Rondônia. Os resultados do inquérito entomológico na zona urbana de Ariquemes evidenciaram a diversidade de espécies nos diferentes Setores, possibilitando verificar o grau de penetração dos anofelinos na cidade. São correlacionados casos autóctones de malária e a presença do principal vetor da malária humana na Amazônia, o Anopheles darlingi. A dinâmica da transmissão da malária na zona urbana é enfocada, discutindo-se os riscos verificados para cada Setor e são apresentadas estratégias de controle, ao nível do vetor, fundamentadas no manuseio do habitat. Να zona rural estão sendo estudados parâmetros populacionais relacionados (1) à atividade de picar, abrigo natural, sí-tios de reprodução e deslocamento para hematofagia; e (2) comportamento das populações para atividade hematófaga e preferências alimentares. Os resultados, embora preliminares, evidenciam variações na densidade populacional e na diversidade de espécies, as quais devem estar relacionadas à mudanças estacionais. Variações nas preferências alimentares das espécies também foram verificadas, sendo constatada elevada antropofilia de A. darlingi. Dois parâmetros relevantes na atividade hematófaga de A. darlingi foram detectados, observando se que os anofelinos estão penetrando nas habitações petas partes inferiores e que não estão pousando nas paredes com DDΤ. Na vegetação circundante às habitações, está havendo preferência para locais de pouso, que podem ser alternativamente alto e baixo.

Biologia floral de Solanum sessiliflorum Dun. Var. sessiliflorum, na região de Manaus, AM

Foi estudada a biologia floral de Solanum sessiliflorum var. sessiflorum em Manaus, Amazonas. Esta espécie é polinizada por abelhas que vibram durante a visita à flor sendo a abelha Eulaema nigrita considerada como a polinizadora mais eficiente, pelo seu comportamento, tamanho e freqüência. O sistema de reprodução desta espécie parece ser alogãmico, o modo de, apresentação das flores numa mesma planta e asòlncronlco e o único recurso oferecido é o polen. As abelhas visitantes de, Solanum sessiliflorum var. sessiliflorum são de um modo geral florestais, sendo necessária uma região de mata relativamente próxima para a manutenção da poinizção e perpetuação dessas espécies.

Biologia de Anofelinos Amazônicos. XIII. Estudo do ciclo biológico de Anopheles nuñez-tovari Gabaldon, 1940 (Diptera, Culicidae)

No estudo do ciclo biológico de Anopheles nuñez-tovari foram analisadas 108 posturas, totalizando 13.999 ovos. A média de ovos postos por postura foi de 128,83 + 4,85 e uma taxa de eclosão elevada de 84,06%. Foi constatado qe 89% dos ovos eclodem com 48 horas após a oviposição, mostrando, no total, um período médio de eclosão de 1,86 + 0,004 dias. A média de ovos eclodidos por postura foi de 109,39 + 5,26. Os dados de correlação entre ovos postos e ovos eclodidos evidenciaram que à medida que aumenta o número de ovos por postura há também um aumento correspondente na taxa de eclosão . Contudo, quando as posturas são reunidas em intervalos de classe de 40 ovos, constatou-se que não há correlação para algumas delas. Para as fases imaturas, verificou-se que existem diferenças no tempo de desenvolvimento, sendo o estádio 4o - pupa - o mais longo, apresentando uma média de 3,15 + 0,03 dias. A menor média foi observada para os estádios 2o - 3o com 1,46 + 0,02 dias. Valores intermediários foram constatados para os estádios 1o - 2o, 3o - 4oe estágio de pupa - adulto (2,34 + 0,02; 1,67 + 0,02 e 1,54 + 0,01 dias, respetivamente). Para o ciclo completo ovo-adulto observou-se um tempo médio de desenvolvimento de 12,02 + 0,04 dias. As maiores taxas de mortalidade foram verificadas para o 4o. estádio (19,6%0) e para o estádio até a emergência do imago, foi de 71,40%, sendo um valor elevado segundo os dados da literatura. A comparação dos períodos do desenvolvimento entre A. nuñez-tovari com A. darlingi e A. trannulatuspossibilitou considerar A. nuñez-tovari como mais próxima da primeira espécie.