Diferenciação das espécies Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii utilizando a metodologia de PCR multiplex e determinação do perfil epidemiológico de pacientes com meningite criptocócica

Cryptococcus neoformans é uma levedura oportunista que pode se alojar no sistema nervoso central causando meningite, meningoencefalite e encefalite principalmente em indivíduos com algum comprometimento do sistema imune. É responsável por 4,5% das infecções oportunistas que acometem pacientes portadores do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-positivos). Cryptococcus gattii é um patógeno primário responsável por uma alta incidência de criptococomas no pulmão e no cérebro e que apresenta uma alta morbidez neurológica e uma resposta retardada à terapia antifúngica. O diagnóstico da criptococose é, atualmente, baseado na detecção da levedura em amostras clínicas, no cultivo com posterior identificação bioquímica e na pesquisa de antígenos circulantes. A diferenciação entre as espécies C. neoformans e C. gattii, na maioria dos laboratórios, é realizada utilizando o meio de cultura ágar canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) e demora em torno de sete dias. Neste trabalho foi padronizada uma metodologia de PCR multiplex que pode vir a substituir as provas bioquímicas utilizadas atualmente para a identificação das espécies de Cryptococcus, reduzindo em 6 dias o tempo necessário para a identificação das espécies. A metodologia também se mostrou mais específica na identificação das espécies, concordando com os resultados das sorotipagens em todos os 132 isolados de Cryptococcus testados, enquanto o resultado obtido com o cultivo em ágar CGB foi discordante em 6 dos 132 isolados, sendo 5 falso-positivos e 1 falso negativo. Foi também realizado o primeiro estudo epidemiológico do perfil de pacientes com meningite criptocócica no estado do Rio Grande de Sul notificados no Laboratório Central de Saúde Pública IPB-LACEN/RS no período de 2000 a 2005. A maioria dos pacientes é do sexo masculino (77,12%), branco (83,5%), na faixa etária entre 30 a 39 anos (46,24%) e infectados pelo HIV (95%).

Identification of Salmonella spp. isolates from chicken abattoirs by multiplex-PCR

The present study was carried out to report the occurrence Salmonella spp., Salmonella Enteritidis, and Salmonella Typhimurium in chicken abattoirs. Samples of feces; feathers; scald, evisceration, and chiller water; and rinse water of non-eviscerated, eviscerated, and chilled carcass were collected from six chicken abattoirs. Salmonella isolates were identified by a multiplex-PCR using three sets of primers targeting the inuA, pefA, and sefA gene sequences from Salmonella spp., S. Typhimurium and S. Enteritidis, respectively. Salmonella spp. was detected in 10% (29/288) of the samples, whereas serovars Enteritidis and Typhimurium were identified in 62% (7/288), respectively. The results indicate the need to improve hygiene and sanitary standards in poultry slaughter lines, besides the education of food handlers and information to consumers. (c) 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Sexagem de embriões bovinos fecundados in vitro pela técnica de PCR multiplex

Neste trabalho, a técnica de PCR (polymerase chain reaction) foi utilizada para a sexagem de 92 embriões bovinos fertilizados in vitro. Os embriões originaram-se de fertilização in vitro de oócitos aspirados de ovários de fêmeas bovinas, provenientes de abatedouros comerciais. Os oócitos foram maturados, fertilizados e cultivados até o estádio de blastocisto. Os embriões foram lavados em solução de PBS, transferidos para tubos de polipropileno contendo água ultrapura, e imediatamente congelados a -196ºC. Os embriões foram descongelados sobre isopor contendo gelo picado e tratados com proteinase K. Para a reação de PCR, utilizaram-se alíquotas de 34 µl de cada tudo, onde foram acrescidos dois pares de primers, seqüência BC1.2 e seqüência satélite 1.715, desoxinucleotídeos, MgCl2, tampão PCR 10X, TaqDNA polimerase e água, em um volume final de 50 µl. As amostras foram amplificadas e a eletroforese realizada em gel de poliacrilamida a 8%. Os géis foram corados com solução de brometo de etídio e analisados em transiluminador de luz ultravioleta. Um índice de 93,47% de amplificação foi atingido, com 41 embriões (47,67%) machos e 45 (52,32%) embriões fêmeas. O uso de gel de poliacrilamida a 8% foi eficaz na separação de fragmentos de DNA muito próximos.

Correlation between API 50 CH and multiplex polymerase chain reaction for the identification of vaginal lactobacilli in isolates

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Myonecrosis by Clostridium septicum in a dog, diagnosed by a new multiplex-PCR

Clostridial myositis is an acute, generally fatal toxemia that is considered to be rare in pet animals. The present report describes an unusual canine clostridial myositis that was diagnosed by a new multiplex-PCR (mPCR) designed for simultaneous identification of Clostridium sordellii, Clostridium septicum, Clostridium perfringens type A, Clostridium chauvoei, and Clostridium novyi type A. A ten-month-old male Rottweiler dog, that had displayed lameness and swelling of the left limb for 12 h, was admitted to a veterinary hospital. The animal was weak, dyspneic and hyperthermic, and a clinical examination indicated the presence of gas and edema in the limb. Despite emergency treatment, the animal died in only a few minutes. Samples of muscular tissue from the necrotic area were aseptically collected and plated onto defibrinated sheep blood agar (5%) in anaerobic conditions. Colonies suggestive of Clostridium spp. were submitted to testing by multiplex-PCR. Impression smears of the tissues, visualized with Gram and also with panoptic stains, revealed long rod-shaped organisms, and specimens also tested positive using the fluorescent antibody technique (FAT). The FAT and mPCR tests enabled a diagnosis of C. septicum myonecrosis in the dog. (C) 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.

PCR Multiplex fluorescente para detecção de bactérias em sêmen bovino

Este estudo teve como objetivo avaliar o limiar de detecção da técnica de PCR multiplex fluorescente aliada a eletroforese capilar na detecção de agentes infecciosos em amostras de sêmen experimentalmente contaminadas com concentrações decrescentes das bactérias Brucella abortus, Leptospira interrogans sorovar pomona, Campylobacter fetus e Haemophilus somnus. Amostras de sêmen bovino foram experimentalmente contaminadas com concentrações decrescentes de bactérias obtidas através de diluições seriadas na base 10 de modo a obter-se amostras contendo desde 1 vez até 10-7 bactérias/mL a partir da concentração inicial de Leptospira pomona, Brucella abortus, Campylobacter fetus e Haemophilus somnus. As diluições foram efetuadas individualmente para cada bactéria, bem como nas diferentes concentrações necessárias para a padronização do teste de multiplex PCR. As extrações de DNA de todas as soluções contendo espermatozóides e bactérias analisadas no presente estudo foram realizadas segundo protocolo descrito por Heinemann et al. (2000). Os produtos de PCR multiplex foram avaliados por eletroforese em gel de poliacrilamida 8% e separação eletroforética por sistema capilar em equipamento automático de análise de fragmentos de DNA MegaBace. Observou-se a amplificação de fragmentos de 193pb, 330pb, 400pb e 415pb a partir do DNA de B. abortus, L. pomona, H. somnus, C. fetus, respectivamente. Na análise por eletroforese capilar de produtos da PCR multiplex do DNA para detecção simultânea dos quatro patógenos observou-se a sinal de positividade até a diluição de 10-3 bactérias/mL vezes da concentração inicial da solução estoque de cada bactéria. A técnica de PCR multiplex aliada à eletroforese capilar foi usada pela primeira vez para o diagnóstico direto de quatro bactérias patogênicas no sêmen, demonstrando ser um método rápido na detecção de bactérias causadoras de doenças reprodutivas.

Genetic identification of lamniform and carcharhiniform sharks using multiplex-PCR

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Identification of hybrids between Neotropical fish Leporinus macrocephalus and Leporinus elongatus by PCR-RFLP and multiplex-PCR: Tools for genetic monitoring in aquaculture

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Identification of the shark species Rhizoprionodon lalandii and R-porosus (Elasmobranchii, Carcharhinidae) by multiplex PCR and PCR-RFLP techniques

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Forensic identification of the guitarfish species Rhinobatos horkelli, R-percellens and Zapteryx brevirostris using multiplex-PCR

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Multiplex polymerase chain reaction to identify and determine the toxigenicity of Corynebacterium spp with zoonotic potential and an overview of human and animal infections

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Parentage testing in alpacas (Vicugna pacos) using semi-automated fluorescent multiplex PCRs with 10 microsatellite markers

The aim of this study was to assess and apply a microsatellite multiplex system for parentage determination in alpacas. An approach for parentage testing based on 10 microsatellites was evaluated in a population of 329 unrelated alpacas from different geographical zones in Peru. All microsatellite markers, which amplified in two multiplex reactions, were highly polymorphic with a mean of 14.5 alleles per locus (six to 28 alleles per locus) and an average expected heterozygosity (H-E) of 0.8185 (range of 0.698-0.946). The total parentage exclusion probability was 0.999456 for excluding a candidate parent from parentage of an arbitrary offspring, given only the genotype of the offspring, and 0.999991 for excluding a candidate parent from parentage of an arbitrary offspring, given the genotype of the offspring and the other parent. In a case test of parentage assignment, the microsatellite panel assigned 38 (from 45 cases) offspring parentage to 10 sires with LOD scores ranging from 2.19 x 10(+13) to 1.34 x 10(+15) and Delta values ranging from 2.80 x 10(+12) to 1.34 x 10(+15) with an estimated pedigree error rate of 15.5%. The performance of this multiplex panel of markers suggests that it will be useful in parentage testing of alpacas.

A single multiplex PCR and SNaPshot minisequencing reaction of 42 SNPs to classify admixture populations into mitochondrial DNA haplogroups

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Comparison of a multiplex-PCR assay with mycolic acids analysis and conventional methods for the identification of Mycobacteria

A fast, sensitive and cost-effective multiplex-PCR assay for Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) and Mycobacterium avium (M. avium) identification for routine diagnosis was evaluated. A total of 158 isolates of mycobacteria from 448 clinical specimens from patients with symptoms of mycobacterial disease were analyzed. By conventional biochemical methods 151 isolates were identified as M. tuberculosis, five as M. avium and two as Mycobacterium chelonae (M. chelonae). Mycolic acid patterns confirmed these results. Multiplex-PCR detected only IS6110 in isolates identified as MTC, and IS1245 was found only in the M. avium isolates. The method applied to isolates from two patients, identified by conventional methods and mycolic acid analysis, one as M. avium and other as M. chelonae, resulted positive for IS6110, suggesting co-infection with M. tuberculosis. These patients were successfully submitted to tuberculosis treatment. The multiplex-PCR method may offer expeditious identification of MTC and M. avium, which may minimize risks for active transmission of these organisms and provide useful treatment information.

Multiplex PCR use for Staphylococcus aureus identification and oxacillin and mupirocin resistance evaluation

Oxacillin-resistant Staphylococcus aureus represents a serious problem in hospitals worldwide, increasing infected patients' mortality and morbidity and raising treatment costs and internment time. In this study, the results of using the Multiplex PCR technique to amplify fragments of the genes femA (specific-species), mecA (oxacillin resistance) and ileS-2 (mupirocin resistance) were compared with those of tests conventionally used to identify S. aureus isolates and ascertain their resistance to drugs. Fifty S. aureus strains were isolated from patients receiving treatment at UNOESTE University Hospital in Presidente Prudente, SP, Brazil. The 686 bp fragment corresponding to the gene femA was amplified and detected in all the isolates. On the other hand, the 310 bp fragment corresponding to the mecA gene was amplified in 29 (58%) of the isolates. All of the isolates showed sensitivity to mupirocin in the agar diffusion test, which was corroborated by the lack of any amplicon of the 456 bp fragment corresponding to the ileS-2 gene, in the PCR bands. The conventional tests to identify S. aureus and detect resistance to oxacillin and mupirocin showed 100% agreement with the PCR Multiplex results. The use of techniques for rapid and accurate identification of bacteria and assessment of their resistance may be valuable in the control of infection by resistant strains, allowing the rapid isolation and treatment of an infected patient. However, the results demonstrate that traditional phenotypic tests are also reliable, though they take more time.