Estudo das alterações biológicas causadas pela aderência de cepas de Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) com macrófagos humanos ativados da linhagem U-937

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno relacionado ao desenvolvimento de quadros de diarréia aguda ou persistente. A resposta inflamatória induzida por EAEC está relacionada à liberação de interleucina 8, que atua estimulando a transmigração de neutrófilos através do epitélio. Os macrófagos, de forma similar aos neutrófilos, são células fagocíticas que produzem espécies reativas de oxigênio (ERO), como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Neste trabalho, avaliamos as consequências da interação de diferentes cepas clínicas com macrófagos humanos ativados da linhagem U-937. Todas as cepas testadas apresentaram filamentos nos testes de aderência aos macrófagos, diferentemente do que ocorre na interação com outras linhagens celulares como HEp-2, T84 e Caco-2. O ferro é um microelemento essencial para bactérias, sendo utilizado como cofator de enzimas e que também pode participar da geração de ERO através da reação de Fenton. Considerando-se a possibilidade de que o H2O2 produzido pelos macrófagos possa gerar radical hidroxil através da reação de Fenton, testes de aderência foram realizados com as amostras cultivadas na presença do captador de ferro 2,2-dipiridil. Tal fato não suprimiu a formação de filamentos, entretanto diminuiu a aderência das cepas EAEC 042 e 17-2. Com o objetivo de produzir uma resposta adaptativa ao H2O2, as culturas bacterianas foram pré-tratadas com uma dose sub-letal de H2O2 por 60 minutos antes de aderirem aos macrófagos. Nossos resultados mostraram que o pré-tratamento também não inibiu o aparecimento de filamentos em relação às culturas não tratadas. Além disto, foi observado que o pré-tratamento com o H2O2 reduziu a aderência das amostras de EAEC ao tapete celular. A filamentação é uma das respostas SOS, induzida pela presença de danos e/ou bloqueio na síntese da molécula de DNA. Com o objetivo de verificar se o H2O2 produzido pelos macrófagos estaria causando danos induzindo o sistema SOS e a filamentação bacteriana, foram realizados testes de viabilidade com mutantes derivados de E. coli K12 deficientes em enzimas do reparo por excisão de bases (BW535) e na resposta SOS (DM49). Nossos resultados mostram que os mutantes apresentaram os níveis de sobrevivência semelhantes ao observado para cepa selvagem isogênica (AB1157). Todos estes resultados em conjunto indicam que o H2O2 não é o indutor da filamentação nos testes de aderência. Macrófagos ativados apresentam ação microbicida através da ação da enzima indolamina dioxigenase (IDO), associada à redução do aminoácido L-triptofano. Desta forma, realizamos testes qualitativos de aderência de EAEC aos macrófagos suplementando o meio de interação com este aminoácido. Nossos resultados mostram que a adição de triptofano ao meio de interação reduz o número de filamentos por campo. Desta forma, aventamos a hipótese de que a depleção do triptofano seja responsável pela indução de resposta SOS, tendo como conseqüência a filamentação das bactérias.

Staphylococcus haemolyticus e Staphylococcus epidermidis isolados de fômites de origem hospitalar: perfis de resistência aos agentes antimicrobianos e produção de biofilme

Os Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) são encontrados na pele e mucosas de seres humanos e outros animais, já que algumas espécies são parte constituinte da microbiota normal destes mesmos sítios, e podem constituir um reservatório para SCN. A espécie Staphylococcus epidermidis, é reconhecida como grande oportunista e agente de graves infecções nosocomiais e comunitárias, além de associado com infecções em pacientes submetidos a implantes com dispositivos médicos, e a espécie Staphyloccus haemolyticus é a segunda espécie mais isolada de hemoculturas humanas, sendo uma das espécies que apresenta elevada resistência aos antimicrobianos. O presente estudo teve como objetivo principal investigar a presença de SCN em fômites (estetoscópios, termômetros e esfigmomanômetros) no ambiente hospitalar, identificar as espécies S. haemolyticus e S. epidermidis e correlacionar seus perfis de resistência aos antimicrobianos com a capacidade de produção de biofilme. A técnica de multiplex-mPCR foi empregada na determinação das espécies e a fenotipagem foi realizada pelos testes fenotípicos convencionais. Os perfis de resistência aos antimicrobianos foram verificados através do teste de disco-difusão, determinação da CIM (oxacilina e vancomicina), determinação da CBM e presença do gene mecA. A capacidade de produção de biofilme foi investigada pelos testes do Ágar Vermelho do Congo e ensaios de aderência em superfícies abióticas (poliestireno e vidro) na presença e ausência de oxacilina e vancomicina, além da PCR para o gene icaAD. Os resultados demonstraram que pelos testes bioquímicos convencionais, a espécie mais encontrada foi S. epidermidis (43,5%). Após a confirmação pela técnica de PCR, 29 amostras (82%) foram identificadas como S. epidermidis, e 6 amostras (18%) foram identificadas como S. haemolyticus. Todas as amostras foram multirresistentes, oxacilina resistentes e vancomicina sensíveis, sendo que apenas 5 amostras S. epidermidis (17,2%) foram tolerantes a oxacilina. A presença do gene mecA foi detectada em 71,4% das amostras. Apesar da maioria das amostras ter apresentado capacidade de produzir slime e/ou biofilme não foi observada total correlação com a presença do gene icaAD enfatizando a natureza multifatorial da produção de biofilme. As amostras aderiram melhor ao esfigmomanômetro, e também, neste fômites, foi encontrado a maior porcentagem de amostras positivas para a produção de slime. Para aderência ao vidro e aderência ao poliestireno não foi encontrada correlação com os fômites. Foram isoladas amostras S. epidermidis de todos os sítios hospitalares estudados e S. haemolyticus só não foi encontrado em Enfermaria de Clínica Médica. Em relação aos fômites, S. epidermidis foi encontrado em todos os fômites estudados, e S. haemolyticus, apenas foi encontrado em esfigmomanômetro e em outros fômites. Os fômites estão servindo como fontes de transmissão e disseminação de micro-organismos, sendo necessário maiores estudos a respeito.

Avaliação da resposta imunológica após vacinação ou infecção por Neisseria meningitidis

A doença meningocócica (DM) é, ainda hoje, um sério problema de saúde pública, estando associada a elevadas taxas de morbidade e letalidade no mundo. A DM evoca proteção imunológica persistente contra a doença em pessoas com sistema imunológico normal. Em contraste, a proteção induzida por vacinas meningocócicas sempre requer a administração de doses reforço (booster) da vacina. No Brasil, Neisseria meningitidis dos sorogrupos C (MenC) e B (MenB) são as principais causas de DM durante os últimos anos. Atualmente, não existe uma vacina universal contra o meningococo B (MenB). A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) tem sido apontada como um fator de risco para a mortalidade da DM. Um dos pilares do tratamento do HIV é a utilização de vacinas para doenças imuno-preveníveis. A vacina conjugada anti-MenC é frequentemente recomendada para crianças e adolescentes infectados pelo HIV no Brasil e em muitos outros países. Poucos estudos têm abordado os mecanismos pelos quais as vacinas meningocócicas geram e sustentam a memória imunológica. Os objetivos deste estudo foram: 1) avaliar a resposta de anticorpos bactericidas e de linfócito T (LT) CD4 de memória contra o meningococo após a infecção; 2) avaliar a resposta de anticorpos bactericidas e de LT CD4 de memória e linfócito B de memória (LBm) contra o meningococo após o booster da vacina cubana VA-MENGOC-BC em voluntários imunizados há aproximadamente 17 anos; 3) investigar a resposta de anticorpos funcionais (bactericidas e opsonizantes) após imunização com a vacina conjugada anti-MenC (CRM197) em indivíduos infectados pelo vírus HIV. Após a infecção, 83% dos pacientes diagnosticados como tendo DM pelo teste de látex e/ou cultura tiveram títulos de anticorpos bactericidas protetores, mas não houve uma associação entre os títulos de anticorpos bactericidas e a concentração de imunoglobulina total específica. Houve aumento na frequência de linfócitos T de memória central (TCM) (mediana de 15%) ativados, principalmente após estímulo com a cepa MenC. Nos voluntários pré-vacinados, 3 de 5 indivíduos soroconverteram 7 ou 14 dias após a administração da dose booster. Houve um aumento importante da população TCM 14 dias após o booster, mas sem ativação celular diferenciada dos grupos controles. Observamos resposta positiva de LBm na maioria dos voluntários, mas sem correlação com os anticorpos bactericidas. Em relação aos pacientes HIV positivos, os resultados mostraram a necessidade de uma segunda dose da vacina, já que apenas 15% soroconverteram a uma única dose e a segunda dose resultou em soroconversão de cerca de 55% dos indivíduos. Observamos correlação positiva (r= 0,43) e significativa (P= 0,0007) entre os anticorpos opsonizantes e bactericidas após a vacinação. Não observamos diferenças significativas quando relacionamos os títulos de anticorpos bactericidas com o número absoluto de LT CD4 P= 0,051) e LT CD4 nadir (P= 0,09) entre os pacientes que soroconverteram (n= 43) ou não soroconverteram (n= 106) após a primeira dose. Desta forma, os resultados desta tese indicaram que: 1) os pacientes convalescentes da DM adquirem anticorpos bactericidas após infecção por N. meningitidis; 2) nos voluntários vacinados, a dose booster da vacina anti-MenB não foi plenamente eficaz em ativar a memória imunológica através da produção de anticorpos bactericidas ou ativação de LTm; 3) os pacientes HIV positivos necessitam de uma dose booster da vacina conjugada anti-MenC.

Avaliação microbiológica, detecção e susceptibilidade a antimicrobianos de potenciais enteropatógenos das famílias Enterobacteriaceae e Vibrionaceae em mexilhões Perna perna da praia de Itaipu, Niterói-RJ

Por serem organismos filtradores, os mexilhões devem ser extraídos para consumo somente de águas com padrões microbiológicos regulamentados pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente, uma vez que intoxicações alimentares de origem bacteriana são as consequências mais comuns relacionadas ao consumo destes moluscos. Após a retirada dos costões, estes organismos passam por processos de fervura, lavagem, acondicionamento em sacos plásticos e transporte até a chegada ao mercado onde são comercializados; etapas estas, realizadas sem cuidados assépticos. Objetivando avaliar a qualidade microbiológica de mexilhões Perna perna coletados na praia de Itaipu, Niterói, RJ; após a sua fervura; e comercializados no Mercado São Pedro, foram realizadas contagens de coliformes totais e termotolerantes e pesquisa de Escherichia coli, Salmonella spp. e Vibrio spp. por metodologia convencional e molecular em amostras obtidas destes locais. Pelo teste de disco-difusão foi observado o perfil de resistência das cepas isoladas. Do total de amostras analisadas (27) apenas 3 dos mexilhões que sofreram processo de aferventação, 1 do comercializado e 3 do in natura, se encontravam dentro dos padrões aceitáveis pela legislação. Não houve diferença significativa entre as contagens de coliformes termotolerantes dos diferentes mexilhões analisados, mas sim entre os períodos seco e chuvoso. Somente uma das nove coletas de água mostrou-se própria para o cultivo de mexilhões (até 14 CF/mL). Foram isoladas e caracterizadas fisiológicamente, 77 estirpes da espécie E. coli, sendo confirmadas molecularmente por PCR os sorotipos EPEC, STEC e EAEC; 4 cepas Salmonella spp. sendo apenas uma confirmada por PCR; e das 57 cepas caracterizadas como Vibrio spp., 51 foram confirmadas por PCR, sendo 46 Vibrio spp., 2 V. cholerae, 1 V. vulnificus, 1 V. parahaemolyticus e 1 V. mimicus. Entre as estirpes de E. coli, 13% apresentaram multirresistência e 15,6% apresentaram resistência múltipla. A estirpe de Salmonella spp. se mostrou sensível a todos os antimicrobiados testados. Das estirpes de Vibrio spp. testadas, 68,6% apresentaram multirresistência e 72,5% apresentaram resistência múltipla. A partir da pesquisa de genes direto do caldo de enriquecimento foi possível detectar todos os genes pesquisados, com exceção para os sorotipos de Salmonella e V. cholerae. Baseado nos resultados do presente trabalho pode-se inferir que os mexilhões, amplamente comercializados no município de Itaipú, podem se constituir em risco para a saúde pública dos consumidores no Rio de Janeiro, necessitando dos órgãos competentes uma eficiente fiscalização nos pontos de venda e cultivo destes moluscos.

Relação entre a resistência a oxacilina e a produção de biofilme de amostras de origem comunitária e hospitalar pertencentes a diferentes espécies de Staphylococcus coagulase negativo

Nas últimas décadas, os Staphylococcus coagulase-negativo, têm sido considerados como patógenos verdadeiros, sendo um dos principais grupos bacterianos responsáveis pelas infecções relacionadas a assistência a saúde (IRAS). O presente estudo teve como objetivo geral: avaliação da relação entre a resistência a oxacilina e a produção de biofilme de amostras Staphylococcus coagulase-negativo de origem comunitária e hospitalar. Neste sentido, foram desenvolvidos os seguintes objetivos específico: identificar ao nível de espécie os Staphylococcus coagulase-negativo; analisar por técnica fenotípica (Ágar vermelho do Congo) a produção de slime; avaliar quantitativamente, a produção de biofilme; correlacionar a produção de polissacarídeos extracelulares (slime) com a produção de biofilme; avaliar a relação da resistência a oxacilina como indicador da presença do gene mecA; avaliar a relação entre a concentração inibitória mínima e a concentração bactericida mínima para oxacilina; pesquisar a presença dos genes mecA, icaAD e atlE, pela técnica de PCR. Foi estudado um total de 150 amostras, sendo 50 isoladas de fômites, 50 isoladas de sangue e 50 isoladas de comunidade. Independente da origem, foram identificadas 14 espécies de Staphylococcus coagulase-negativo, sendo mais frequentes S. epidermidis 42,6%, S. haemolyticus 13,3% e S. cohnii cohnii 10,7%. A análise geral da expressão fenotípica de slime mostrou que 64% das amostras avaliadas eram produtoras de slime. Das 150 amostras testadas neste estudo, 95,3% foram produtoras de biofilme. Ao considerarmos a análise da quantificação do biofilme em relação às origens das amostras estudadas não encontramos diferenças significativas e a maioria das amostras foi considerada moderadamente produtora de biofilme. O gene mecA foi detectado em 6 amostras comunitárias, 34 amostras de fômites e 34 amostras de sangue. Não houve diferença significativa entre as amostras de fômites e sangue. Porém, houve diferença significativa entre as amostras de origem comunitária e as de origem hospitalar - fômites e sangue (p < 0,0001). Ao compararmos as três origens de isolamento quanto a presença do gene atlE observamos que houve diferença significativa (p = 0,0012) entre elas. Sendo, as amostras isoladas de sangue, as que apresentaram maior número de amostras que possuíam o gene atlE (n = 18). Das 150 amostras testadas observamos a presença do gene icaAD em 46% amostras comunitárias, 56% amostras de fômites e 60% amostras de sangue, não encontramos diferença significativa (p = 0,5750). Observamos uma correlação entre a resistência a oxacilina e a produção de slime, pois as amostras de origem hospitalar (fômites e sangue) apresentaram altos níveis de resistência a oxacilina e em sua grande maioria foram produtoras de slime. A espécie S. epidermidis foi a mais isolada e deve-se ressaltar que, quando comparada com as outras espécies, apresentou altos níveis de resistência a oxacilina, sendo a maioria produtora de slime e biofilme.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA): tipificação do cassete cromossômico SCCmec e resistência a antimicrobianos em pacientes com fibrose cística assistidos em dois centros no Rio de Janeiro

A infecção pulmonar de etiologia bacteriana é um dos principais problemas que levam a morbi-mortalidade na fibrose cística (FC). Staphylococcus aureus se destaca como um dos micro-organismos mais frequentes e com um agravante para a terapêutica quando se apresentam resistentes à oxacilina (MRSA). Amostras MRSA podem ser classificadas tanto genotipicamente quanto fenotipicamente em MRSA adquiridas na comunidade (CA-MRSA) ou adquiridas no hospital (HA-MRSA). Fenotipicamente, essa classificação é muito controversa, podendo se basear em critérios epidemiológicos ou ainda pelo perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. Por outro lado, a classificação genotípica consiste na determinação dos cassetes cromossômicos (SCCmec), local de inserção do gene mecA (que confere resistência a meticilina). Atualmente são reconhecidos 11 tipos de SCCmec, sendo os de tipo I ao III e VIII relacionados ao genótipo HA-MRSA e IV ao XI ao genótipo CA-MRSA. Classicamente CA-MRSA é capaz de produzir a toxina Panton-Valentine leukocidin (PVL), codificada pelos genes luk-S e luk-F que está associada à pneumonia necrotizante e infecções de tecidos moles em pacientes com FC com quadros de exacerbação pulmonar. No Brasil, raros são os trabalhos envolvendo caracterização de SCCmec em amostras de pacientes com FC. Diante disso, este estudo teve como objetivo principal a caracterização dos tipos de SCCmec e ainda a determinação do perfil de susceptibilidade a antimicrobianos em uma população de MRSA recuperada de pacientes com FC assistidos em dois centros de tratamento no Rio de Janeiro, Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) e Instituto Fernandes Figueira (IFF). Foram estudadas 108 amostras de MRSA isoladas do período de 2008 a 2010, sendo 94 oriundas de 28 pacientes adultos atendidos no IFF e 14 de 2 pacientes adultos atendidos no HUPE. Foram encontradas altas taxas de resistência para os antimicrobianos oxacilina, cefoxitina e eritromicina. Todas as amostras foram sensíveis à vancomicina e a linezolida quando determinada as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM). Através da técnica de PCR foi possível a tipificação dos SCCmec em 82,4% das amostras, sendo 64% destas compatíveis ao genótipo CA-MRSA. Não houve diferença estatística nas taxas de susceptibilidade aos antimicrobianos entre as amostras CA-MRSA e HA-MRSA. Foram encontrados os SCCmec dos tipos I, III, IV e V, sendo os tipos I e IV os mais frequentes. O gene que codifica a toxina PVL foi encontrado em 34,2% das amostras e foi observado em amostras CA-MRSA e HA-MRSA. Nosso estudo se destaca por apresentar um alto percentual de amostras CA-MRSA e ainda por ser o primeiro do país a detectar a presença do gene que codifica a toxina PVL em pacientes com FC. Além disso, de forma inédita na literatura, encontramos o gene luk-S, em amostras classificadas como HA-MRSA em pacientes com FC. Os poucos estudos nacionais, bem como as diferenças encontradas entre trabalhos, refletem a necessidade de conhecimento mais aprimorado do MRSA envolvido nas infecções pulmonares dos pacientes com FC.

Características microbiológicas e clínicas das infecções por Acinetobacter spp. e Pseudomonas aeruginosa em Unidade de Terapia Intensiva Cardíaca de um Hospital Universitário do Rio de Janeiro

As infecções em cirurgia cardíaca ainda apresentam um cenário importante nas infecções associadas à assistência a saúde (IAAS), favorecendo ao paciente à aquisição de infecções por micro-organimos multirreristentes. Este trabalho teve como objetivo avaliar o perfil de resistência a antimicrobianos, verificar a presença de genes que codificam as enzimas dos tipos oxacilinases e metalo-beta-lactamases e descrever as características demográficas e clínicas dos pacientes colonziados/infectados por Acinetobacter spp. e P.aeruginosa internados no Centro de Terapia Intensiva Cardíaca do HUPE no período de 2005 a 2010. A maioria das 46 amostras de Acinetobacter spp e das 35 de P.aeruginosa foram de origem respiratória seguido de sangue. A maioria das amostras de A. baumannii apresentou altos percentuais de resistência a: ceftazidina, cefepime, piperacilina-sulbactam, ciprofloxacin, ceftriaxona e CIM ≥32 μg/mL para os carbapenêmicos. Uma amostra foi resistente a Polimixina B. O gene blaOXA-23 foi detectado em 65% das amostras e uma amostra apresentou o gene blaOXA-24. Não foram detectados os genes blaOXA-58-like e blaOXA-143. Para P. aeruginosa os percentuais de resistência para todos os antimicrobianos foram inferiores a 32%. Quatro amostras apresentaram resistência intermediária a polimixina B e nenhum gene de resistência foi detectado. Os prontuários dos pacientes foram analisados a fim de associar as características clínicas com os processos infecciosos identificados e seu desfecho clínico. Na análise por tipo de micro-organismo associado ao processo infeccioso à idade acima de 70 anos, DM e uso da ventilação mecânica por tempo prolongado foi maior no grupo dos pacientes que apresentaram infecção por P.aeruginosa. O IAM, a ICC em internações anteriores e suas complicações (choque cardiogênico e arritmia) tiveram impacto na mortalidade na série de pacientes (p<0,05). A insuficiência renal entre todas as comorbidades foi à única que teve associação com a mortalidade (OR= 8,3). Não houve associação entre a mortalidade e o micro-organismo que causou a infecção (Acinetobacter spp. p=0,3 e P.aeruginosa p=0,2) ou a resistência a carbapenêmicos (p=0,5). Foram observados dois casos de mediastinte por Acinetobacter spp. e dois por P. aeruginosa sendo um achado inédito no Brasil até o momento.

Propriedades adesivas a substratos abióticos e bióticos, invasão e indução de apoptose celular de Corynebacterium pseudodiphtheriticum

A ocorrência de fenótipos multirresistentes de Corynebacterium pseudodiphtheriticum e sua associação a infecções graves, com elevada mortalidade em pacientes imunocomprometidos, aliados ao escasso conhecimento da virulência e patogenia destas infecções, motivou esta pesquisa, que teve como objetivo investigar mecanismos de virulência e resistência microbiana deste agente entre pacientes de um hospital universitário brasileiro. Um total de 113 amostras de C. pseudodiphtheriticum identificadas por métodos bioquímicos convencionais e sistema API-Coryne isoladas de pacientes de diferentes grupos etários. Os micro-organismos eram, em sua maioria, relacionados a infecções no trato respiratório (27,45%), urinário (29,20%) e sitios intravenosos (18,60%) e cerca de 32,70% das amostras foram provenientes de pacientes com pelo menos uma das condições predisponentes: insuficiência renal; transplante renal, tuberculose em paciente HIV+, câncer, cirrose hepática, hemodiálise e uso de cateter. As amostras testadas revelaram-se multirresistentes sendo a maioria resistente à oxacilina, eritromicina e clindamicina. A adesão das cepas ao poliestireno e ao poliuretano indicou o envolvimento de hidrofobicidade da superfície celular na fase inicial da formação de biofilmes. O crescimento subsequente conduziu à formação de microcolônias, agregados bacterianos densos incorporados na matriz exopolimérica rodeada por espaços vazios, típica de biofilmes maduros. Adicionalmente, a interação do micro-organismo com fibrinogênio e fibronectina humana indica o envolvimento destes componentes séricos na formação de biofilme, sugerindo a participação de diferentes adesinas neste processo e a capacidade deste agente formar biofilme in vivo. A afinidade por esses componentes e a formação de biofilme podem contribuir para o estabelecimento e disseminação da infecção no hospedeiro. Adicionalmente, as cepas de C. pseudodiphtheriticum isoladas de pacientes com infecções localizadas (ATCC10700/Pharyngitis) e sistêmicas (HHC1507/Bacteremia) exibiram um padrão de aderência agregativa-like a células HEp-2, caracterizado por aglomerados de bactérias com aparência de um "empilhado de tijolos". Através do teste FAS e ensaios de interação na presença de inibidores de citoesqueleto, demonstramos o envolvimento da polimerização de actina na internalização das cepas testadas. A internalização bacteriana e rearranjo do citoesqueleto pareceu ser parcialmente desencadeado pela ativação da tirosina-quinase. Finalmente, C. pseudodiphtheriticum foi capaz de sobreviver no ambiente intracelular e embora não tenha demonstrado capacidade de replicar intracelularmente, células HEp-2 foram incapazes de eliminar o patógeno completamente no ambiente extracelular no período de 24 horas. Todas as cepas estudadas foram capazes de induzir apoptose em células epiteliais 24 horas pós-infecção evidenciada pelo aumento significativo no número de células mortas e pela ocorrência de alterações nucleares reveladas através dos métodos de coloração pelo azul Trypan, pelo DAPI e microscopia electrônica de transmissão. Alterações morfológicas incluindo a vacuolização, a fragmentação nuclear e a formação de corpos apoptóticos foram observadas neste período. A citometria de fluxo demonstrou ainda uma diminuição significativa no tamanho das células infectadas e a utilização de dupla marcação (iodeto de propídio / anexina V) permitiu a detecção da ocorrência de necrose e apoptose tardia. Em conclusão, o conhecimento de tais características contribuiu para a compreensão de mecanismos envolvidos no aumento da frequência de infecções graves com elevada mortalidade em pacientes no ambiente hospitalar, por C. pseudodiphtheriticum, um patógeno rotineiramente subestimado em países em desenvolvimento.

Ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante por ExoU de Pseudomonas aeruginosa

ExoU, uma citotoxina produzida pelo patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa e translocada para o citosol de células hospedeiras via sistema de secreção do tipo III, é associada à gravidade de infecções agudas. No presente trabalho, o efeito de ExoU na ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante foi avaliado em culturas de células epiteliais respiratórias humanas infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa (produtora de ExoU), com a mutante deletada no gene exoU, PA103∆exoU, ou com a mutante complementada com exoU sem atividade tipo fosfolipase A2, PA103∆UT/S142A. Análises das dosagens de hidroperóxidos lipídicos e isoprostanos, considerados marcadores de estresse oxidativo, revelaram que ExoU promoveu um aumento em suas concentrações. Foi observado, também, que ExoU estimulou a produção de espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e peroxinitrito nas células infectadas, assim como a expressão de iNOS e eNOS, mas não de nNOS. Além disso, ExoU foi responsável pelo aumento da atividade de SOD1 e pela redução dos níveis de GSH, mas não afetou a atividade da catalase ou de NQO1. No modelo in vivo, a dosagem de malondialdeído, um subproduto da lipoperoxidação de membranas, evidenciou uma maior produção deste composto no pulmão de camundongos infectados pela cepa produtora de ExoU, em comparação ao pulmão de camundongos infectados pela cepa mutante. Em conjunto, estes resultados mostram que ExoU ativa a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, levando à peroxidação lipídica e modulando o sistema de defesa antioxidante

Caracterização e diversidade molecular do transposon Tn1546, carreador do gene vanA, responsável pela expressão de resistência à vancomicina, em amostras clínicas de diferentes espécies de Enterococcus

Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE) são reconhecidos como importantes patógenos causadores de infecções nosocomiais, configurando um grave problema de saúde pública, principalmente pela escassez de opção terapêutica eficaz. O fenótipo de resistência VanA é o mais frequente, sendo definido pela resistência a altos níveis de vancomicina e teicoplanina. VanA é caracterizado por um conjunto gênico (vanRSHAXYZ) localizado no elemento genético móvel denominado transposon Tn1546. A diversidade de Tn1546 resulta de alterações estruturais promovidas por deleções ou integração de sequências de inserção (IS) que, exercem papel chave na evolução do elemento VanA, modificando os aspectos relacionados à sua transferência e expressão do fenótipo. O objetivo deste estudo foi caracterizar e avaliar o polimorfismo de elementos Tn1546 presentes em amostras de diferentes espécies de Enterococcus isoladas em instituições hospitalares do Estado do Rio de Janeiro no período de 2000 a 2012. Foram incluídas neste estudo 70 amostras VRE que foram caracterizadas quanto ao gênero, espécies e genótipo de resistência aos glicopeptídeos por métodos convencionais e PCR multiplex. A susceptibilidade a 17 antimicrobianos foi avaliada pelo método de difusão em ágar, e concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina e teicoplanina foi determinada por microdiluição em caldo. O tranposon foi obtido após lise das células bacterianas e amplificação por PCR longo, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para a região repetida e invertida que flanqueia este elemento genético. A diversidade dos elementos Tn1546 foi avaliada por um conjunto de métodos moleculares que incluiu a análise do polimorfismo do tamanho de fragmentos de restrição (restriction fragment lenght polymorphism, RFLP), utilizando-se a endonuclease ClaI, amplificação de segmentos internos por PCR de sobreposição de oligonucleotídeos (overlapping PCR) e detecção de sequências de inserção (ISs). A caracterização em espécies considerada para as demais análises foi obtida pela metodologia de PCR de acordo com a seguinte distribuição: E. avium (N=6), E. faecalis (N=12), E. faecium (N=46), E. gallinarum (N=4) e E. raffinosus (N=2). Todas as amostras apresentaram o genótipo vanA. Nos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foi observado que todas as amostras foram multirresistentes, sendo resistente de 6 a 13 dentre os 17 antimicrobianos testados. A presença de elementos semelhantes ao arquétipo de Tn1546 foi observada em 61,5% das amostras; entretanto, 27 amostras apresentaram perfis variantes de Tn1546. Foram identificados nove perfis de RFLP, dentre 66 avaliadas, sendo o perfil I, prevalente e semelhante ao arquétipo de Tn1546. Não foi possível analisar quatro amostras por RFLP. Os produtos de amplificação de Tn1546 alterados, obtidos pela overlapping PCR e pelo rastreamento de IS, levaram à classificação de 15 tipos polimórficos, nomeados de A a O. A maioria dos Tn1546 polimórficos teve suas regiões de ORF1 e/ou ORF2 deletadas; e IS1542 juntamente com IS1216V foram as inserções mais frequentes, que em muitas situações compartilhavam a mesma região de inserção. IS19 foi detectada apenas na região vanS-vanH. Os dados apresentados neste estudo indicam que o polimorfismo de Tn1546 pode ser explorado no rastreamento de rotas de transmissão, acompanhamento da dispersão de elementos VanA e investigação da evolução de amostras VRE.

Estudo de atributos de virulência e resistência a antimicrobianos em amostras de P. aeruginosa

P. aeruginosa é um importante agente de infecções relacionadas à assistência em saúde. Habitualmente, o estabelecimento de infecções agudas é precedido pela colonização das mucosas dos pacientes. Não se sabe, porém, se os processos infecciosos são causados pelas próprias cepas bacterianas colonizadoras ou por outras com que os pacientes entrem em contato, dotadas ou não de maior potencial de virulência ou de resistência a antimicrobianos que as tornem mais eficientes como agentes infecciosos. Assim, este estudo teve como objetivos i) investigar a existência de potenciais diferenças entre amostras de P. aeruginosa que causaram apenas colonização e aquelas responsáveis por infecção, isoladas de um mesmo paciente, quanto a seus fenótipos de virulência e de não susceptibilidade a antimicrobiamos; ii) pesquisar a existência de associação entre características dos paciente, incluindo o tipo de evolução clínica, com as demais variáveis estudadas. No estudo foram incluídos 21 pacientes que desenvolveram infecção por P. aeruginosa durante sua internação no Centro de Terapia Intensiva do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, entre abril de 2007 e abril de 2008. De cada paciente foram selecionadas duas amostras bacterianas: a primeira isolada durante o episódio de infecção e a amostra colonizadora obtida imediatamente antes da ocorrência da infecção. As amostras selecionadas foram estudadas quanto a i) expressão de três mecanismos de virulência (citotoxicidade, aderência a células epiteliais respiratórias humanas e capacidade de formação de biofilme); ii) presença de genes codificadores das proteínas efetoras do sistema de secreção do tipo 3 (SST3 - exoS, exoT, exoU e exoY); iii) perfil de susceptibilidade a antimicrobianos, iv) perfil de fragmentação do DNA cromossômico por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). As amostras bacterianas obtidas de infecções agudas foram significativamente mais citotóxicas que aquelas obtidas de colonização. Embora sem diferença estatística, a citotoxicidade das amostras que causaram infecção em pacientes que evoluíram para óbito foi superior à citotoxicidade das amostras de pacientes que sobreviveram. O gene que codifica a toxina ExoU foi detectado em 16 amostras (38%), sendo nove de colonização e sete de infecção. Não houve diferença significativa entre as amostras de colonização e infecção quanto à aderência, produção de biofilme, expressão dos genes do SST3 e não-susceptibilidade às diferentes classes de antimicrobianos. Também não foi encontrada associação entre a não-susceptibilidade à quinolona, ou a outras classes de antimicrobianos, e a presença do gene exoU. As 42 amostras de P. aeruginosa estudadas foram incluídas em 20 genótipos. Em 10 deles foi detectado o gene exoU. Amostras de um mesmo genótipo foram uniformes quanto à expressão dos genes do SST3 e a não-susceptibilidade aos antimicrobianos, mas não quanto às outras variáveis estudadas. Em apenas sete pacientes (33,3%), as amostras de colonização e de infecção pertenciam ao mesmo genótipo. Assim, nesse estudo, o estabelecimento do processo infeccioso resultou não da perda do equilíbrio estabelecido entre os mecanismos de agressão das amostras colonizadoras e os de defesa do hospedeiro e sim da introdução de nova cepa bacteriana no organismo hospedeiro, cepa esta dotada de maior potencial citotóxico.

Caracterização de beta-lactamases de espectro ampliado (ESBLs), genes de resistência aos antimicrobianos e conteúdo plasmidial em cepas de Escherichia coli e Salmonella spp. não tifóides isoladas do ambiente hospitalar e da comunidade

Enterobactérias produtoras de ESBLs são descritas tanto no ambiente hospitalar quanto na comunidade em todo o mundo. No Brasil, esses microrganismos também têm emergido como uma causa importante de infecções, sendo as enzimas CTX-M as prevalentes. O objetivo deste estudo foi analisar diferentes aspectos genotípicos relacionados à expressão da resistência aos antimicrobianos em cepas Escherichia coli e de Salmonella spp, tais como: a diversidade de ESBLs, os genes de resistência aos antimicrobianos e o conteúdo plasmidial. Os aspectos epidemiológicos das cepas produtoras de ESBLs também foram investigados. Foram estudadas 88 cepas de enterobactérias, sendo 43 E. coli e 45 cepas de Salmonella spp., de origem hospitalar e da comunidade (principalmente alimentos), isoladas na cidade do Rio de Janeiro. A expressão de ESBL foi observada em sete cepas de E. coli (7/43, 16,3%) e em uma cepa de Salmonella Typhimurium (1/45, 2,3%) e as enzimas foram identificadas como variantes de CTX-M e SHV-5, respectivamente. Entre as cepas de E. coli, a enzima CTX-M-2 foi a mais frequente (n = 4), sendo detectada em cepas isoladas de swab retal de pacientes hospitalizados, enquanto as enzimas CTX-M-59 (uma variante de CTX-M) (n = 1) e CTX-M-9 (n = 2) foram identificadas em cepas isoladas a partir de espécimes clínicos. Salmonella Typhimurium produtora de SHV-5 foi isolada do ambiente hospitalar (fórmula infantil). As cepas de E. coli produtoras das enzimas CTX-M pertenceram a grupos filogenéticos (A, B1, D) e STs (ST34, ST69, ST101) diferentes, sendo os genes blaCTX-M identificados em plasmídeos com tipo de replicon IncA/C de cerca de 150 kb (blaCTX-M-2, blaCTX-M-9, blaCTX-M-59) ou 80 kb (blaCTX-M-2). A cepa de S. Typhimurium produtora de SHV-5 pertenceu a um único clone (A-ST19) e o gene blaSHV-5 foi identificado em plasmídeo com o replicon IncL/M com aproximadamente 55Kb. Foi identificado pela primeira vez no Brasil o ST313 em um clone de S. Typhimurium (D-ST313), comumente associado com doenças invasivas severas, particulamente no continente africano. Genes que codificam para a resistência aos antimicrobianos não-beta-lactâmicos e integrons classe 1 foram identificados entre as cepas de E. coli e de Salmonella spp. multirresistentes produtoras ou não de ESBLs. Em conclusão: i) nossos resultados referentes à E. coli confirmaram a disseminação de enzimas CTX-M (principalmente variantes do grupo CTX-M-2) desde, pelo menos, o ano de 2000, em hospitais no Rio de Janeiro; demonstraram a implicação dos plasmídeos IncA/C na disseminação de genes blaCTX-M; indicaram a possível evolução intra-plasmídeo de blaCTX-M-59 a partir de blaCTX-M-2; a observação da diversidade e multiplicidade de plasmídeos poderiam fornecer plataformas genéticas para a dispersão de diferentes genes e/ou elementos de resistência aos antimicrobianos; ii) em relação à Salmonella spp. este estudo descreveu, pela primeira vez, o isolamento, a partir de fórmula infantil, de uma cepa de S. Typhimurium produtora de ESBL; foi demonstrada a associação do gene blaSHV-5 com plasmídeo do tipo IncL/M, que é considerado epidêmico; foi identificado o clone D-ST313 de S. Typhimurium, que está associado a doenças invasivas severas no continente africano, que reuniu cepas isoladas exclusivamente do ambiente hospitalar.

Características morfológicas de vermes adultos machos e fêmeas de Schistosoma mansoni recuperados de camundongos desnutridos e deficientes em óxido nítrico

Esquistossomose e desnutrição são graves problemas de saúde pública nos países em desenvolvimento. A esquistossomose provoca uma série de morbidades, que é influenciada, em grande maioria, pela natureza do estímulo à resposta imunológica e ao estado nutricional do hospedeiro. Durante a infecção esquistossomótica, a resposta imune produz citocinas que são liberadas e estimulam a produção de óxido nítrico. Numerosos estudos demonstraram que o estado nutricional e a resposta imune afetam as características fenotípicas dos vermes adultos. No entanto, se o óxido nítrico desempenha um papel neste fenômeno é desconhecido. Neste estudo, os camundongos do tipo selvagem (grupo controle) e camundongos knockout com deficiência na produção de óxido nítrico foram alimentados com uma dieta comercial (UNILAB) ou uma dieta básica regional, dieta com baixa concentração de proteína (7,87%). Por meio de um sistema digital de análise de imagem (Image Pro Plus, USA) e microscopia confocal, estudou-se a morfologia da ventosa oral, tegumento e o sistema reprodutor de vermes machos e fêmeas. Vermes machos e fêmeas recuperados de camundongos desnutridos com deficiência de oxido nítrico mostraram descamação do tegumento. A superfície dorsal de vermes desnutridos machos apresentaram tubérculos irregulares, distribuídos de forma desigual, e escassos. O sistema reprodutivo de vermes fêmeas desnutridas não demonstrou alterações morfológicas. No entanto, os machos deste grupo exibiram menor número de células no processo de diferenciação dentro dos lobos testiculares. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a deficiência de produção de óxido nítrico não induz alterações morfológicas em nível do tegumento e do sistema reprodutor de vermes machos. Em contraste, a desnutrição é responsável por tais alterações morfológicas, principalmente no sistema reprodutivo e na ventosa oral.

Caracterização fenotípica e molecular de amostras de Enterococcus isoladas em um hospital universitário da cidade do Rio de Janeiro

Os enterococos estão amplamente distribuídos no ambiente. Nos seres humanos, compõem a microbiota do trato gastrintestinal, da cavidade oral e do trato geniturinário. Nas últimas décadas, esses microrganismos se tornaram importantes agentes etiológicos de infecções hospitalares. Uma característica marcante desses microrganismos é a resistência intrínseca a vários antimicrobianos utilizados habitualmente no tratamento de infecções, além de alguns fatores que tem sido relacionado à virulência de enterococos. Este estudo investigou a presença de enterococos em amostras de infecção e colonização de pacientes hospitalizados, profissionais de saúde, dietas hospitalares e manipuladores de alimentos. Foram analisadas 276 amostras de colonização, de quadros de infecção, dietas orais e manipuladores de alimento. Não foram recuperadas amostras dos profissionais de saúde. Todas as amostras foram submetidas a testes convencionais de caracterização do gênero e espécies. Testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foram empregados pelo método de disco difusão, além da CIM para vancomicina e teicoplanina. A produção de biofilme e a expressão da gelatinase também foram avaliadas. Os genes de resistência a gentamicina, estreptomicina e vancomicina e os genes de virulência cylA, esp e fsr foram pesquisados pela técnica de PCR. O polimorfismo genético foi determinado por PFGE. A espécie E. faecalis foi a prevalente nas amostras isoladas de colonização e infecção (42,2% e 81,9%, respectivamente). E. casseliflavus (58,9%) foi a mais freqüente dentre as amostras das dietas hospitalares e E. faecium (46,7%) de manipuladores. Dentre as amostras de colonização as maiores taxas de resistência foram observadas para eritromicina (76,3%) e ciprofloxacina (53,9%). Dentre as amostras de infecção, >70% foram resistentes a eritromicina, ciprofloxacina e tetraciclina. Resistência a níveis elevados de gentamcina (HLR-GE) e estreptomicina (HLR-ST) foi detectada em 24,6% e 20,4% das amostras, respectivamente, e todas foram portadoras dos respectivos genes. A maioria das amostras de colonização (52,6%) e infecção (55,7%) foram multirresistentes. A taxa para resistência a níveis elevados de vancomicina foi de 5,2% e todas eram portadoras do gene vanA. Em relação a formação de biofilme, 70,2% foram produtoras, com uma maior freqüência dentre as de infecção. A expressão de gelatinase foi detectada em 28,9% e 44,3% das amostras de colonização e infecção, respectivamente. Nenhuma das amostras isoladas das dietas hospitalares e de manipuladores expressou gelatinase. Nas amostras pertencentes as espécies E. faecalis e E. faecium (n=109) 16,5%, 51,4% e 48,6% apresentaram produtos de amplificação referentes aos genes cylA, esp e fsr, respectivamente. A análise do polimorfismo genético revelou uma extensa diversidade dentre as amostras pertencentes as espécies E. faecalis e E. faecium, não acarretando um perfil eletroforético prevalente. Entretanto, foi observado um perfil único dentre as amostras de E. gallinarum resistentes a vancomicina (vanA). Este estudo mostrou que amostras de enterococos isoladas de diferentes fontes, não só de quadros infecciosos, podem representar um risco para a população, apontando para uma maior reflexão quanto ao papel desses microrganismos nas infecções humanas, particularmente no ambiente hospitalar.

Enterococcus faecalis: fatores de virulência relacionados aos processos de natureza endodôntica

O objetivo principal deste estudo foi investigar a interação de 24 cepas de E. faecalis isoladas de infecções endodônticas primárias às proteínas de matriz dentinária, como também a moléculas de matriz presentes em lesões de endocardites. A análise desta interação foi feita através de técnica enzimática, com confirmação pela técnica de fluorescência. Além disto, foi realizada a confirmação do isolamento da espécie E. faecalis, através da técnica de PCR para o gene 16SrRNA e a análise da presença de genes de virulência da referida espécie microbiana para aderência às supostas proteínas de matriz incluindo às de ligação ao colágeno (ace, gelE, esp, agg e efaA). O maior padrão de interação das cepas ocorreu com a fibronectina (83,4%), seguido pelo fibrinogênio (62,5%) e colágeno humano tipo I (52%). Curiosamente, a aderência observada para o colágeno do tipo I, foi de pequena magnitude, quando comparado com a amostra padrão da ATCC 29212. As cepas ATCC 29212, A1, A43 e A68 interagiram com todas as proteínas de matriz utilizadas neste estudo. Um percentual expressivo das cepas testadas apresentou amplificação para efaA (86,9%) e para ace (73,9%). Paralelamente, todas as cepas apresentaram amplificação para gelE e foram negativas para os genes agg e esp. Adicionalmente, não houve correlação entre a detecção dos genes de virulência e a interação às proteínas de matriz, evidenciando que, mesmo com a detecção dos genes nas amostras, se faz necessário avaliar a expressão gênica por qPCR.