Évolution moléculaire : un modèle Markov-modulé pour les processus de substitution

Les processus Markoviens continus en temps sont largement utilisés pour tenter d’expliquer l’évolution des séquences protéiques et nucléotidiques le long des phylogénies. Des modèles probabilistes reposant sur de telles hypothèses sont conçus pour satisfaire la non-homogénéité spatiale des contraintes fonctionnelles et environnementales agissant sur celles-ci. Récemment, des modèles Markov-modulés ont été introduits pour décrire les changements temporels dans les taux d’évolution site-spécifiques (hétérotachie). Des études ont d’autre part démontré que non seulement la force mais également la nature de la contrainte sélective agissant sur un site peut varier à travers le temps. Ici nous proposons de prendre en charge cette réalité évolutive avec un modèle Markov-modulé pour les protéines sous lequel les sites sont autorisés à modifier leurs préférences en acides aminés au cours du temps. L’estimation a posteriori des différents paramètres modulants du noyau stochastique avec les méthodes de Monte Carlo est un défi de taille que nous avons su relever partiellement grâce à la programmation parallèle. Des réglages computationnels sont par ailleurs envisagés pour accélérer la convergence vers l’optimum global de ce paysage multidimensionnel relativement complexe. Qualitativement, notre modèle semble être capable de saisir des signaux d’hétérogénéité temporelle à partir d’un jeu de données dont l’histoire évolutive est reconnue pour être riche en changements de régimes substitutionnels. Des tests de performance suggèrent de plus qu’il serait mieux ajusté aux données qu’un modèle équivalent homogène en temps. Néanmoins, les histoires substitutionnelles tirées de la distribution postérieure sont bruitées et restent difficilement interprétables du point de vue biologique.

Mode d’action moléculaire de la toxine anti-tumorale : PS1Aa2 du bacille de Thuringe

Les parasporines sont des toxines Cry du bacille de Thuringe actives contre des cellules tumorales. Ce travail montre que la parasporine PS1Aa2 (Cry31Aa2) forme des pores dans des membranes artificielles, comme de nombreuses toxines Cry. Ceux-ci ont plusieurs niveaux de conductance dont les plus fréquents étaient de 11, 16 et 21 pS dans une solution de 150 mM KCl. Nos résultats de microspectrofluorométrie avec la sonde Fura-2 montrent que la présence de la PS1Aa2 peut produire des augmentations du calcium intracellulaire, la plupart du temps sous la forme d’oscillations calciques et parfois des augmentations soutenues. Ces réponses ont été observées en présence et en absence de calcium extracellulaire, dans les lignées tumorales HeLa et HepG2 et dans la lignée non tumorale HEK 293. Bien que quelques études aient montré que le calcium semble intervenir dans leur mode d’action, de telles oscillations calciques n’ont jamais été décrites auparavant pour des toxines Cry. Les expériences ont dû être faites à des concentrations beaucoup plus élevées de toxine que prévues sur la base des résultats publiés de cytotoxicité. Malgré la présence des fragments identifiés auparavant comme actifs, sa faible efficacité semble liée à la présence d’ADN dans les préparations qui entraîne la précipitation de la protéine. Les travaux futurs sur cette toxine seraient donc grandement facilités par une amélioration de sa méthode de préparation.

Profilage Moléculaire de la Scoliose Idiopathique de l’Adolescent

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est la déformation la plus fréquente en orthopédie pédiatrique. C'est une maladie qui génère des déformations complexes du rachis, du thorax et du bassin affectant plus sévèrement et majoritairement les filles à la puberté. Malgré de nombreuses années de recherches approfondies dans le domaine de la SIA, la cause n'a toujours pas été résolue. OBJECTIFS : Il a été démontré qu’il existe une dysfonction de la signalisation de la mélatonine par les protéines G inhibitrices (Gi) dans les ostéoblastes isolés de patients atteints de SIA. Ceci a conduit à une stratification des patients en trois groupes fonctionnels. Le but de ce projet de maîtrise est d’établir les profils d’expression moléculaire correspondant à chacun des groupes fonctionnels. Les objectifs spécifiques sont d’identifier les gènes responsables de l’initiation de la SIA et du défaut différentiel observé dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines Gi. MÉTHODES : Des ARNs ont été préparés à partir d’ostéoblastes isolés de patients atteints de SIA sélectionnés pour chaque groupe fonctionnel et comparés aux ARNs obtenus d’ostéoblastes de sujets sains. En plus, des cellules sanguines (PBMCs) isolées d’une paire de jumelles monozygotes discordantes pour la scoliose ont été étudiées pour comparer leur profil d’expression génétique. Nous avons utilisé des biopuces à ADN contenant un ensemble de 54,000 sondes permettant l’analyse du niveau d’expression de plus de 47,000 transcrits représentant 30,000 gènes humains bien caractérisés (Affymetrix, GeneChip® Human gene 1.0 ST array). Les gènes retenus ont par la suite été validés par qPCR sur un plus grand nombre de patients afin de tester la spécificité des profils d’expression pour chaque groupe de patients à partir des cellules osseuses dérivées lors de la chirurgie. RÉSULTATS: Le profilage moléculaire proposé permettra d’établir les fondements moléculaires de la SIA selon le test fonctionnel développé par le Dr Moreau et son équipe et d’identifier de nouveaux gènes associés à la SIA. Ce projet a permis de mettre en évidence des gènes possiblement impliqués dans le défaut de signalisation associé aux protéines Gi communs aux trois groupes, ainsi que des gènes spécifiques à certains groupes, pouvant contribuer au développement de certaines co-morbidités et/ou au risque d’aggravation des déformations rachidiennes. L’étude préliminaire des jumelles monozygotes discordantes pour la scoliose a mis en évidence un nombre limité de gènes possiblement associés au défaut de signalisation observé chez la jumelle scoliotique, gènes dont l’expression pourrait être influencée par des modifications d’ordre épigénétique liées à l’environnement. CONCLUSION: Les données obtenues par des approches de transcriptomiques dans le cadre de ce projet soutiennent notre méthode de stratification fonctionnelle des patients SIA et ont conduit à l’identification de nouveaux gènes associés à la SIA. Ces résultats jettent un éclairage nouveau sur la SIA et contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes et facteurs impliqués dans l’étiologie de la SIA. À cet égard, nos résultats permettront éventuellement d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles et des traitements personnalisés compte tenu des profils moléculaires distincts observés pour chaque groupe de patients.

Mesure de la génération de thrombine et son application pour la surveillance pharmacothérapeutique de l'héparine de faible poids moléculaire chez le chien

Chez le chien, la daltéparine est un anticoagulant utilisé pour la prévention et le traitement de la thrombose. La surveillance thérapeutique de la daltéparine par l’activité anti-facteur Xa (FXa) n’est pas un test fonctionnel. Cette étude avait pour but d’étudier l’emploi de la génération de thrombine (GT) pour évaluer les effets in vitro de la daltéparine sur du plasma canin, ainsi que pour détecter les effets pharmacodynamiques de la daltéparine administrée chez des chiens sains. Premièrement, les paramètres normaux de la GT ont été établis à partir du plasma de 25 beagles et 11 chiens sains de clients. Ensuite, des pools de plasma canin fortifié avec de la daltéparine, à dose croissante, ont été analysés selon la GT, l’activité anti-FXa et selon le temps de thromboplastine partielle activée (aPTT). Finalement, 24 beagles sains répartis au hasard dans 4 groupes on reçu soit une dose sous-cutanée (SC) de 50U/kg, 100U/kg ou 150U/kg de daltéparine ou un placebo. Du plasma pauvre en plaquettes (PPP) a été récolté pendant 24 heures et analysé selon la GT, l’anti-FXa et l’aPPT. In vitro, la daltéparine a démontré un effet anticoagulant sur la GT qui était concentration-dépendant. Les tests de GT et anti-FXa étaient plus sensibles aux effets de la daltéparine que l’aPPT. L’étude pharmacodynamique a démontré que le temps, la dose ainsi qu’une interaction temps*dose avaient un effet significatif sur les paramètres de GT et anti-FXa. La GT peut mesurer les effets pharmacodynamiques de la daltéparine à des doses variées chez des chiens sains.

Investigation of the structure and dynamics of the centromeric epigenetic mark

Le centromère est le site chromosomal où le kinetochore se forme, afin d’assurer une ségrégation fidèles des chromosomes et ainsi maintenir la ploïdie appropriée lors de la mitose. L’identité du centromere est héritée par un mécanisme épigénétique impliquant une variante de l’histone H3 nommée centromere protein-A (CENP-A), qui remplace l’histone H3 au niveau de la chromatine du centromère. Des erreurs de propagation de la chromatine du centromère peuvent mener à des problèmes de ségrégation des chromosomes, pouvant entraîner l’aneuploïdie, un phénomène fréquemment observé dans le cancer. De plus, une expression non-régulée de CENP-A a aussi été rapportée dans différentes tumeurs humaines. Ainsi, plusieurs études ont cherchées à élucider la structure et le rôle de la chromatine contenant CENP-A dans des cellules en prolifération. Toutefois, la nature moléculaire de CENP-A en tant que marqueur épigénétique ainsi que ces dynamiques à l'extérieur du cycle cellulaire demeurent des sujets débat. Dans cette thèse, une nouvelle méthode de comptage de molécules uniques à l'aide de la microscopie à réflexion totale interne de la fluorescence (TIRF) sera décrite, puis exploitée afin d'élucider la composition moléculaire des nucléosomes contenant CENP-A, extraits de cellules en prolifération. Nous démontrons que les nucléosomes contenant CENP-A marquent les centromères humains de façon épigénétique à travers le cycle cellulaire. De plus, nos données démontrent que la forme prénucléosomale de CENP-A, en association avec la protéine chaperon HJURP existe sous forme de monomère et de dimère, ce qui reflète une étape intermédiaire de l'assemblage de nucléosomes contenant CENP-A. Ensuite, des analyses quantitatives de centromères lors de différenciation myogénique, et dans différents tissus adultes révèlent des changements globaux qui maintiennent la marque épigénétique dans une forme inactive suite à la différentiation terminale. Ces changements incluent une réduction du nombre de points focaux de CENP-A, un réarrangement des points dans le noyau, ainsi qu'une réduction importante de la quantité de CENP-A. De plus, nous démontrons que lorsqu'une dédifférenciation cellulaire est induite puis le cycle cellulaire ré-entamé, le phénotype "différencié" décrit ci-haut est récupéré, et les centromères reprennent leur phénotype "prolifératif". En somme, cet oeuvre décrit la composition structurale sous-jacente à l'identité épigénétique des centromères de cellules humaines lors du cycle cellulaire, et met en lumière le rôle de CENP-A à l'extérieur du cycle cellulaire.

Hypertension et régulation de l'expression moléculaire de l'angiotensinogène par la ribonucléoprotéine hétérogène nucléaire K

Le diabète est une maladie chronique dont la principale caractéristique est un niveau plasmatique élevé de glucose, qui est causé soit par un défaut dans la production d’insuline, l’action de l’insuline, ou les deux à la fois. Plusieurs études ont démontré que l’hyperglycémie chronique peut mener à la dysfonction et même la défaillance de plusieurs organes, dont le coeur, le système vasculaire, les yeux et les reins, se traduisant par des infarctus du myocarde, des accidents cérébro-vasculaires et des complications rétinales et rénales, respectivement. La néphropathie diabétique (DN) est la principale cause de déficience rénale et affecte près de 25-40% des patients diabétiques. La DN est invariablement associée à un risque élevé d’accident cérébrovasculaire et de dysfonction cardivasculaire. L’angiotensinogène (Agt) est l’unique précurseur de tous les types d’angiotensines. En plus du système rénine-angiotensine (RAS) sytémique, le rein possède son propre système intrarénal et exprime tous les composants du RAS. L’Agt est fortement exprimé dans les cellules du tubule proximal rénal (RPTC) et y est converti en angiotensine II (AngII), le peptide biologiquement actif du RAS. Les patients diabétiques présentent de hauts niveaux d’AngII et une augmentation de l’expression des gènes du RAS, suggérant que l’activation du RAS intrarénal joue un rôle important dans la progression de la DN. Les mécanismes qui contrôlent la régulation du niveau rénal d’Agt par l’hyperglycémie et l’insuline demeurent mal compris. Le but global de cette thèse est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent l’expression du gène Agt chez la souris Akita (un modèle murin de diabète de type 1). Dans cette optique, la première partie de la thèse se concentre sur deux facteurs de transcription de la famille des ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP). Chan et collaborateurs ont déjà identifié 2 protéines nucléaires hnRNP F et hnRNP K, de 48kD et 70kD respectivement. HnRNP F et hnRNP K forment un hétérodimère et se lient à l’élément de réponse à l’insuline (IRE) présent dans le promoteur du gène Agt du rat et inhibent la transcription du gène Agt in vitro. Afin de déterminer si hnRNP F / K sont responsables de l’inhibition de l’expression rénale de Agt par l’insuline in vivo, nous avons étudié des souris Akita males traités ou non avec des implants d’insuline pour une période de 4 semaines. Des souris non-Akita males ont été employées comme contrôles. Les souris Akita développent de l’hypertension et de l’hypertrophie rénale. Le traitement à l’insuline rétablit les niveaux de glucose plasmatiques et la pression systolique (SBP), et atténue l’hypertrophie rénale, l’albuminurie (ratio albumine/créatinine urinaire, ACR) et les niveaux urinaires d’Agt et AngII chez les souris Akita. De plus, le traitement à l’insuline inhibe l’expression rénale du gène Agt, tout en augmentant l’expression des gènes hnRNP F, hnRNP K et ACE2 (enzyme de conversion de l’angiotensine-2). Dans des RPTC in vitro, l’insuline inhibe Agt, mais stimule l’expression de hnRNP F et hnRNP K en présence de hautes concentrations de glucose, et ce via la voie de signalisation MAPK p44/42 (protéine kinase activée par un mitogène). La transfection avec des petits ARN interférents (siRNA) contre hnRNP F et hnRNP K prévient l’inhibition de l’expression d’Agt par l’insuline dans les RPTC. Cette étude démontre bien que l’insuline prévient l’hypertension et atténue les dommages rénaux observés chez les souris Akita diabétiques, en partie grâce à la suppression de la transcription rénale de Agt, via une augmentation de l’expression de hnRNP F et hnRNP K. La seconde partie de cette thèse change de focus et se tourne vers le facteur Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2). Nrf2 est un facteur de transcription qui contrôle les gènes de la réponse antioxydante cellulaire en réponse au stress oxydant ou aux électrophiles. Le but de cette étude est d’examiner l’impact de la surexpression de la catalase (Cat) dans les RPTC sur l’expression du gène Agt via Nrf2 et sur le développement de l’hypertension et des dommages rénaux résultants chez les souris diabétiques Akita transgéniques (Tg). Nos études ont démontré que la surexpression de Cat dans les souris Akita Cat-Tg normalise la SBP, atténue les dommages rénaux et inhibe l’expression des gènes Nrf2 et Agt dans les RPTC. In vitro, le glucose élevé (HG) et l’oltipraz (un activateur de Nrf2) stimulent l’expression de Nrf2 et Agt, et cet effet peut être bloqué par la trigonelline (inhibiteur de Nrf2), des siRNA contre Nrf2, des antioxydants ou des inhibiteurs pharmacologiques NF-κB et MAPK p38. La suppression de sites de réponse à Nrf2 présents dans le promoteur du gène Agt du rat abolit la stimulation par l’oltipraz. Finalement, des souris males adultes non-transgéniques traitées avec l’oltipraz montrent une augmentation de l’expression de Nrf2 et Agt dans leurs RPTC et cette augmentation peut être normalisée par la trigonelline. Ces données permettent d’identifier un nouveau mécanisme d’action de Nrf2, par la stimulation du gène Agt intrarénal et l’activation du RAS, qui induisent l’hypertension et les dommages rénaux par le glucose élevé et les espèces réactives de l’oxygène chez les souris diabétiques. Nos conclusions permettent de démontrer que l’insuline induit l’expression de hnRNP F et hnRNP K, qui jouent ensuite un rôle protecteur en prévenant l’hypertension. La surexpression de la catalase dans les RPTC vient quant à elle atténuer l’activation de Nrf2 et ainsi réduit la SBP chez les souris Akita.

Vers des assemblages de complexes métalliques oligonucléaires, servant d’antenne solaire au niveau moléculaire

Les fichiers additionnels sont les données cristallographiques en format CIF. Voir le site de la Cambridge Crystallographic Data Centre pour un visualiseur: http://www.ccdc.cam.ac.uk

Assemblage moléculaire régi par la formation de bifluorènes : vers la formation de réseaux organiques covalents retenus par des liaisons carbone-carbone

Les réseaux organiques covalents (COFs) sont des réseaux bidimensionnels et tridimensionnels assemblés seulement par des atomes légers, c’est-à-dire de la première et deuxième rangée du tableau périodique. Ceux-ci ont montré des propriétés de porosité pouvant être exploitées dans le stockage, dans la catalyse et dans la séparation moléculaire. La plupart de ces matériaux ont été obtenus par une réaction finale de condensation, ce qui nuit à leurs cristallisations, donc à l’homogénéité et à la caractérisation détaillée de ces matériaux. Les p-xylylènes de Thiele et Tschitschibabin sont des molécules qui ont suscité l’intérêt pour leurs structures et leurs propriétés magnétiques. Subséquemment, Wittig a démontré que le remplacement des fragments diphénylméthylène par des fragments fluorénylidène sur le p-xylylène de Thiele donne des molécules pouvant s’oligomériser pour former un tétramère. Dans notre étude, nous avons examiné l’assemblage de dérivés fluorénylidène dans le but d’obtenir un COF. Tout d’abord, un dérivé linéaire similaire à ce que Wittig a obtenu a été synthétisé afin de vérifier l’assemblage à partir d’un cœur spirobifluorényle. Ces molécules se sont assemblées en tétramère, comme prévu, et en hexamère. Ces deux résultats ont pu être rationalisés par une étude à l’état solide par diffraction des rayons-X. L’empilement tridimensionnel a également été étudié pour ces deux molécules. Subséquemment, des dérivés tétraédriques ont été synthétisés afin d’étudier leurs assemblages. Un premier dérivé est resté sous sa forme quinoïdale et ne s’est pas assemblé, alors qu’un second dérivé a mené à un dimère partiellement assemblé. La structure de ce dernier suggère la formation d’un polymère linéaire pour ce composé dans le cas où il aurait été possible de l’assembler complètement.

Détection moléculaire des métastases des ganglions lymphatique dans le cancer du col de l'utérus

Le Cancer du Col Utérin (CCU) chez la femme est provoqué par le virus oncogénique VPH. La métastase lymphatique ganglionnaire est un facteur pronostique majeur pour l’évolution de ce cancer et sa présence influence la décision thérapeutique. En général, l’envahissement ganglionnaire est diagnostiqué par histologie, mais cette méthode est laborieuse et parfois prise en défaut pour détecter les micrométastases et les cellules cancéreuses isolées et pour donner des résultats rapides en per opératoire. L’outil moléculaire que nous désirons développer pour combler cette lacune est basé sur une analyse d’ARN des gènes du VPH exprimés par les cellules du CCU. Ceci sera fait par transcription réverse de l’ARN cellulaire couplé à une réaction quantitative en chaine par polymérase en temps réel (RT-qPCR). Cette technique devrait nous permettre une détection et une évaluation rapide des micrométastases pour aider à déterminer immédiatement un pronostic fiable et la thérapie associée. C’est un test précis, sensible et rapide pour détecter un envahissement ganglionnaire dans le CCU visant à améliorer la gestion thérapeutique. Le projet est basé sur trois objectifs. En premier lieu, valider les marqueurs moléculaires E6 et E7 de VPH16 et 18 à partir des échantillons frais et des échantillons fixés dans des blocs de paraffine. En deuxième lieu, déterminer la fiabilité et la sensibilité des marqueurs pour la détection des macrométastases, des micrométastases et les cellules tumorales isolées en utilisant la technique de RT-qPCR. En troisième lieu et parallèlement au travail présenté dans ce mémoire, il est nécessaire de constituer une base de données des patientes qui ont le virus VPH16 et 18 intégré dans leur génome, qui ont été traitées et dont nous connaissons déjà le diagnostic final afin de valider la méthode (biobanque). Nous avons réussi à extraire de l’ARNm de haute qualité à partir d’échantillons complexes, à détecter les gènes E6 et E7 de VPH16 et 18 en RT-qPCR, et à déterminer précisément la limite de détection de E6 et E7 dans les échantillons frais qui est une proportion de 0,008% de cellules cancéreuses. Dans les échantillons fixés dans la paraffine, cette limite est de 0,02% et 0,05% pour E6-E7-VPH16 et E6-E7-VPH18 respectivement. Ceci comparativement à une limite de détection histologique de 1% qui est déterminée par immunohistochimie de CK19. Enfin, notre protocole est validé pour VPH18 dans les ganglions lymphatiques du CCU.

Detecting uterine cervical cancer cells using molecular biomarkers

Arrière-plan: les cellules tumorales circulantes (CTC) sont détectables dans de nombreux cancers et peuvent être utiles cliniquement pour le pronostic de la maladie, pour mesurer la récidive et pour prédire la sensibilité aux medicaments chimiothérapeutiques. Au cours des dernières années, l’études des CTC dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, du poumon, du côlon et de la prostate a grandement évolué. Alternativement, il y peu d'études à ce sujet concernant le cancer du col de l’utérus (CCU). Objectifs: Notre objectif est d’optimiser le processus d'enrichissement des CTC dans le CCU et la détection moléculaire des biomarqueurs E6 et E7. Matériel et Méthodes: Dans l’optique de mimer la présence de CTC dans le sang, nous avons dilué des cellules cancéreuses CaSki VPH16-positif provenant d’un CCU dans du sang humain prélevé sur des volontaires sains. Les CaSki ont été collectées suite à une centrifugation par densité avec le Ficoll, la lyse des globules rouges (RBC) et la lyse des RBC combinée avec un enrichissement positif et négatif à l’aide de marqueurs de surface cellulaire. Les CTC ont été détectées par la mesure d’expression des oncogènes E6 et E7 du virus du papillome humain (VPH), de la cytokératine 19 (CK19) et de la cycline p16INK4 en utilisant la technique quantitative en temps réel de Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). Pour valider notre méthode de détection des CTC in vivo, nous avons recruté dix patientes atteintes d’un CCU VPH16 positif et six contrôles sains. Résultats: Dans le modèle de dilutions de cellules CaSki, la lyse des RBC seule ou combinée avec l'enrichissement négatif ou positif suggèrent des limites de détection de 1 CTC par mL de sang pour tous les biomarqueurs moléculaires utilisés. La sensibilité de détection est accrue lors de l'utilisation de l’enrichissement positif et négatif en réduisant le bruit de fond causé par les monocytes sanguins. Contrairement aux oncogènes E6 et E7, les marqueurs CK19 et p16INK4A ont été détectés chez des individus sains, les niveaux d'expression de base appropriés doivent donc être déterminés avec précision par rapport aux patientes CCU. Le gradient de densité par Ficoll a une limite de détection de seulement environ 1000 cellules par mL de sang. Enfin, les CTC ont été détectées dans 2/10 patientes en utilisant le marqueur CK19. Cependant, ces patientes étaient négatives pour les oncogènes E6/E7. Le marqueur p16INK4A était exprimé au même niveau dans tous les échantillons (CCU et normaux). Conclusion: Notre étude suggère que les oncogènes E6 et E7 du VPH16 sont les marqueurs biologiques les plus sensibles et spécifiques en qRT-PCR pour détecter les CTC dans le modèle de dilution de cellules de CCU dans le sang. Chez les patientes atteintes d’un CCU de stade précoce, seulement CK19 a révélé la présence potentielle de CTC, ce qui suggère que ces cellules sont rares à ce stade de la maladie. Mots clés: cancer du col de l’utérus, cellules tumorales circulantes, RT-qPCR, E6 et E7, CK19, p16INK4A, enrichissement immunomagnétique, détection moléculaire.

Studies on IL-18 in HIV infection : effects of the cytokine on intestinal integrity, and platelets as a new source of the cytokine

L'interleukine IL-18 (IL-18), un membre de la famille de l’IL-1, est une cytokine pro-inflammatoire multifonctionnelle. Elle est produite par les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules épithéliales, les kératinocytes et le cortex surrénal dans le corps humain. Cette cytokine est d'abord produite comme une protéine précurseure inactive, qui est par la suite clivée en une forme mature par la caspase-1 activée. La caspase, en elle-même, existe comme précurseur inactif dans les cellules humaines et requiert l'assemblage d'inflammasomes pour son activation. L'IL-18 pour joue un rôle clé dans la médiation des conditions inflammatoires. Notre laboratoire et d'autres ont montré que l'infection par le VIH est accompagnée d'une augmentation des taux circulants d'IL-18 avec une diminution des niveaux de son antagoniste, l'interleukine-18 binding protein (IL-18BP). Dans cette thèse, nous démontrons pour que l'IL-18 est également produite et sécrétée par les plaquettes humaines lors de leur activation. Les plaquettes contiennent des composants de l'inflammasome. Ils assemblent et activent la caspase-1, qui ensuite traite le précurseur de l'IL-18 dans sa forme mature au cours du processus d'activation des plaquettes. La cytokine est synthétisée de novo lors de l'activation des plaquettes. Contrairement à l'IL-18, les plaquettes expriment constitutivement l’IL-18BP, et la libèrent de manière constitutive, ainsi que lors de l'activation. L'IL-18 et l'IL-18BP sont colocalisés avec CD63, un marqueur pour les granules α des plaquettes. L'IL-18 libéré des plaquettes constitue la source principale de cette cytokine dans la circulation humaine chez les individus sains. Nous avons identifié des concentrations faibles de cette cytokine dans les lysats de plaquettes chez les individus infectés par le VIH par rapport à ceux en santé. D'autre part, les concentrations ont été augmentées dans le sérum et le plasma pauvre en plaquettes chez les individus infectés. Des résultats similaires ont été obtenus avec l'IL-18BP dans les lysats de plaquettes d'individus sains et infectés par le VIH. Cependant, des quantités plus faibles de cet antagoniste ont été trouvées dans le sérum et le plasma pauvre en plaquettes d'individus infectés par le VIH par rapport à ceux en santé. Nos résultats ont des implications importantes pour les maladies inflammatoires chroniques dans laquelle une activité accrue de l'IL-18 joue un rôle pathogène. Le VIH est également accompagné par une inflammation intestinale et une diminution de l'intégrité intestinale, mesurée par la réparation de la muqueuse, la régénération et la perméabilité. Cependant, on en sait peu sur la relation entre le niveau élevé de l'IL-18 associé à l'infection au VIH et la perméabilité intestinale: ceci n'a jamais été étudié. Dans cette thèse, nous démontrons le rôle du virus et sa protéine Tat à augmenter la production d'IL-18 chez deux lignées de cellules épithéliales intestinales (HT29 et Caco2) ainsi qu'une diminution de l'IL-18BP. L'IL-18 induit une hyperperméabilité de la barrière épithéliale en perturbant à la fois les jonctions serrées et adhérentes, et ce, en modulant l'expression et la distribution de l'occludine, de claudine-2 et de la bêta-caténine. Une désorganisation de l'actine F a également été observée dans les cellules lors de l'incubation avec l'IL-18. Les mêmes observations ont été faites avec la protéine Tat du VIH-1. Après une incubation prolongée, l'IL-18 a causé la mort des cellules intestinales et induit l'apoptose par l'activation de la caspase-1 et la caspase-3. Fait intéressant, les taux plasmatiques de lipopolysaccharides chez trois catégories différentes de patients au VIH (ART-naïf, ART-traitée et contrôleurs élite) sont en corrélation avec les niveaux plasmatiques de l'IL-18. Enfin, nous avons étudié la voie de signalisation à travers laquelle l'IL-18 induit une perméabilité intestinale accrue. En bref, nos études identifient les plaquettes comme une source importante d'IL-18, et leur activation lors d'une infection à VIH contribue à des concentrations accrues de cette cytokine. Le virus entraine également l'augmentation de la production de cytokines par les cellules épithéliales intestinales. L'activité biologique accrue de ces cytokines contribue à la pathogenèse du sida en augmentant la perméabilité intestinale et en causant la mort des cellules intestinales. L'IL-18 pourrait servir de cible moléculaire pour retarder la progression du sida et réduire l'inflammation chronique dans un stade précoce d'une infection à VIH.

Le GABA comme marqueur de récupération suite à une commotion cérébrale dans le sport ?

L’association démontrée récemment entre les commotions cérébrales dans le sport et le développement possible de maladies neurodégénératives a suggéré la possibilité que des altérations persistantes soient présentes dans le cerveau de l’athlète commotionné. En fait, des altérations neurophysiologiques ont récemment été révélées au sein du cortex moteur primaire (M1) d’athlètes ayant un historique de commotions via la stimulation magnétique transcrânienne (SMT). Plus précisément, la période silencieuse corticale (PSC), une mesure d’inhibition liée aux récepteurs GABAB, était anormalement élevée, et cette hyper-inhibition était présente jusqu’à 30 ans post-commotion. La PSC, et possiblement le GABA, pourraient donc s’avérer des marqueurs objectifs des effets persistants de la commotion cérébrale. Toutefois, aucune étude à ce jour n’a directement évalué les niveaux de GABA chez l’athlète commotionné. Ainsi, les études cliniques et méthodologiques composant le présent ouvrage comportent deux objectifs principaux: (1) déterminer si l’inhibition excessive (GABA et PSC) est un marqueur des effets persistants de la commotion cérébrale; (2) déterminer s’il est possible de moduler l’inhibition intracorticale de façon non-invasive dans l’optique de développer de futurs avenues de traitements. L’article 1 révèle une préservation des systèmes sensorimoteurs, somatosensoriels et de l’inhibition liée au GABAA chez un groupe d’athlètes universitaires asymptomatiques ayant subi de multiples commotions cérébrales en comparaison avec des athlètes sans historique connu de commotion cérébrale. Cependant, une atteinte spécifique des mesures liées au système inhibiteur associé aux récepteurs GABAB est révélée chez les athlètes commotionnés en moyenne 24 mois post-commotion. Dans l’article 2, aucune atteinte des mesures SMT liées au système inhibiteur n’est révélée en moyenne 41 mois après la dernière commotion cérébrale chez un groupe d’athlètes asymptomatiques ayant subi 1 à 5 commotions cérébrales. Bien qu’aucune différence entre les groupes n’est obtenue quant aux concentrations de GABA et de glutamate dans M1 via la spectroscopie par résonance magnétique (SRM), des corrélations différentielles suggèrent la présence d’un déséquilibre métabolique entre le GABA et le glutamate chez les athlètes commotionnés. L’article 3 a démontré, chez des individus en bonne santé, un lien entre la PSC et la transmission glutamatergique, ainsi que le GABA et le glutamate. Ces résultats suggèrent que la PSC ne reflète pas directement les concentrations du GABA mesurées par la SRM, mais qu’un lien étroit entre la GABA et le glutamate est présent. L’article 4 a démontré la possibilité de moduler la PSC avec la stimulation électrique transcrânienne à courant direct (SÉTcd) anodale chez des individus en santé, suggérant l’existence d’un potentiel thérapeutique lié à l’utilisation de cette technique. L’article 5 a illustré un protocole d’évaluation des effets métaboliques de la SÉTcd bilatérale. Dans l’article 6, aucune modulation des systèmes GABAergiques révélées par la SMT et la SRM n’est obtenue suite à l’utilisation de ce protocole auprès d’individus en santé. Cet article révèle également que la SÉTcd anodale n’engendre pas de modulation significative du GABA et du glutamate. En somme, les études incluent dans le présent ouvrage ont permis d’approfondir les connaissances sur les effets neurophysiologiques et métaboliques des commotions cérébrales, mais également sur le mécanisme d’action des diverses méthodologies utilisées.

Identification and characterization of new biomarkers in aggressive subtypes of breast cancer

En 2015, la récidive tumorale et les métastases du cancer du sein demeurent une cause importante de décès à travers le monde. Toutefois, ces cancers sont souvent hétérogènes car en dépit d’un phénotype similaire, l’évolution clinique et la réponse au traitement peuvent varier considérablement. Il y a donc un intérêt évident à identifier et à caractériser de nouveaux biomarqueurs pour permettre classer les tumeurs mammaires dans des sous-groupes plus homogènes. Notre hypothèse est que chaque cancer mammaire possède des caractéristiques distinctes au plan des altérations du génome et des profils d’expression géniques et que ces changements se traduisent cliniquement par une prédisposition à former des métastases ou à répondre ou non à la chimiothérapie et aux thérapies ciblées. Dans le cadre de nos travaux, nous nous sommes intéressés aux sous-types agressifs de tumeurs mammaires et notamment les cancers de type triple négatif. Nous avons aussi tenté d’identifier des marqueurs capables de distinguer l’une de l’autre les tumeurs de type luminal A et luminal B. Pour ce faire, nous avons d’abord utilisé une stratégie in silico à partir de données publiques (micro-puces d’ADN et séquençage de l’ARN). Nous avons ensuite construit sept micro-matrices tissulaires (TMA) provenant de tissus mammaires normaux et tumoraux fixés à la formaline et enrobés en paraffine. Ces outils nous ont permis d’évaluer par immunohistochimie les niveaux d’expression différentielle des marqueurs suivants : ANXA1, MMP-9, DP103 et MCM2. Ceux-ci ont été comparés aux marqueurs usuels du cancer du sein (ER, PR, HER2, CK5/6 et FOXA1) et corrélés aux données cliniques (survie globale et métastase). Nos résultats indiquent que ces nouveaux marqueurs jouent un rôle important dans l’évolution clinique défavorable des tumeurs de haut grade. Dans un premier article nous avons montré que l’expression d’ANXA1 est dérégulée dans les cancers de type triple-négatif et aussi, dans une certaine mesure, dans les tumeurs HER2+. Nous croyons qu’ANXA1 permet de mieux comprendre le processus d’hétérogénéité tumorale et facilite l’identification des tumeurs de haut grade. Nous proposons également qu’ d’ANXA1 stimule la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et la formation des métastases. Dans un second temps, nous avons montré que les niveaux d’expression de MMP-9 reflètent la différenciation cellulaire et corrèlent avec les sous-types de cancers mammaires ayant un mauvais pronostic. Nous estimons que MMP-9 permet de mieux comprendre et d’identifier les tumeurs mammaires à haut risque. De fait, la surexpression de MMP-9 est associée à une augmentation des métastases, une récidive précoce et une diminution de la survie globale. Dans le cadre d’un troisième article, nous avons montré que la surexpression du marqueur de prolifération MCM2 s’observe dans les cancers triple-négatifs, HER2+ et Luminal B par comparaison aux cancers luminal A (p< 0.0001). Nos résultats suggèrent qu’en utilisant un seuil de 40% de noyaux marqués, nous pourrions distinguer l’une de l’autre les tumeurs de type luminal A et luminal B. Cela dit, avant de pouvoir envisager l’utilisation de ce marqueur en clinique, une étude de validation sur une nouvelle cohorte de patientes s’impose. En somme, les résultats de nos travaux suggèrent qu’ANXA1, MMP-9 et MCM2 sont des marqueurs intéressants pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la progression tumorale et le développement des métastases. À terme, ces nouveaux marqueurs pourraient être utilisés seuls ou en combinaison avec d’autres gènes candidats pour permettre le développement de trousses « multigènes » ou d’essais protéomiques multiplex pour prédire l’évolution clinique des cancers mammaires.

Ablation laser femtoseconde de verres métalliques de Cu_x Zr_(1−x) : une étude par dynamique moléculaire

L’ablation laser de verres métalliques de CuxZr1−x (x = 0.33, 0.50 et 0.67) et d’un alliage métallique cristallin de CuZr2 dans la structure C11b a été étudiée par dynamique moléculaire (DM) combinée à un modèle à deux températures (TTM). Le seuil d’ablation (Fth) a été déterminé pour chacun des 4 échantillons et s'est avéré plus bas pour les échantillons plus riches en Cu étant donné que la cohésion du Cu est plus faible que celle du Zr dans tous les échantillons. Pour x=0.33, Fth est plus bas pour le cristal que pour l’amorphe car le couplage électron-phonon est plus faible dans ce dernier, ce qui implique que l’énergie est transférée plus lentement du système électronique vers le système ionique pour le a-CuZr2 que le c-CuZr2. La vitesse de l’onde de pression créée par l’impact du laser croît avec la fluence dans l’échantillon cristallin, contrairement aux échantillons amorphes dans lesquels sa vitesse moyenne est relativement constante avec la fluence. Ceci est expliqué par le fait que le module de cisaillement croît avec la pression pour le cristal, ce qui n’est pas le cas pour les verres métalliques étudiés. Finalement, la zone affectée par la chaleur (HAZ) a été étudiée via la profondeur de fusion et les déformations plastiques. La plus faible température de fusion des échantillons amorphes implique que la profondeur de fusion est plus importante dans ceux-ci que dans l’échantillon cristallin. Dans les verres métalliques, les déformations plastiques ont été identifiées sous forme de zones de transformation par cisaillement (STZ) qui diffusent et fusionnent à plus haute fluence. Aucune déformation plastique importante n’a été identifiée dans le c-CuZr2 mis à part de légères déformations près du front de fusion causées par les contraintes résiduelles. Ce travail a ainsi permis d’améliorer notre compréhension de l’ablation laser sur les verres métalliques et de l’étendue des dommages qu’elle peut entraîner.

Une approche moléculaire pour mieux comprendre l'infertilité chez la vache laitière

Au cours des dernières années, une sélection génétique importante a été faite pour améliorer la production de lait des bovins, ceci au détriment des performances reproductives. Cette diminution de performance n’a cependant pas été rapportée chez la génisse présentant un même potentiel génétique. Cette immense production de lait et les changements métaboliques qui l’accompagnent ont donc un impact négatif sur l’efficacité reproductive des vaches laitières qui subissent un stress métabolique supérieur à celui des génisses. Le but de l’étude était d’acquérir une meilleure connaissance des différences moléculaires et métaboliques entre ces deux groupes d’animaux pour amener à une meilleure compréhension de la pathogenèse de l’infertilité chez la vache laitière. Pour ce faire, les vagues folliculaires de vaches en lactation (30-50 jours en lait; N = 12) et de génisses (N = 10) ont été synchronisées par ablation écho guidée des follicules et par traitement hormonal avec injection de prostaglandine et insertion d’un implant de progestérone. L’aspiration du liquide folliculaire et des cellules de la granulosa du follicule dominant a été faite au jour 6. Les paramètres métaboliques mesurés chez les animaux à partir de prises de sang, faites au jour 6, confirment un plus grand stress métabolique chez la vache, les niveaux de BHBA, acides biliaires et cholestérol étant plus élevés et le niveau de glucose plus bas chez celles-ci. Un total de six échantillons a été utilisé pour le séquençage d’ARN et des analyses bio-informatiques ont été effectuées. Plusieurs gènes et voies de signalisation ont présenté des différences entre les deux groupes d’animaux incluant le cycle cellulaire et la production d’hormones. Une confirmation des résultats par PCR en temps réel a été faite, mais la grande variation intragroupe a nui à l’obtention de résultats significatifs. Conjointement, une culture primaire de cellules de la granulosa a été réalisée pour évaluer l’effet des acides biliaires sur la stéroïdogenèse suite à la détection d’une plus grande quantité de ceux-ci chez la vache laitière. La présence d’acide biliaire dans la culture cellulaire cause une diminution de l’accumulation d’estradiol ainsi que de l’expression des gènes CYP19A1 et CYP11A1. Les résultats présentés dans ce mémoire indiquent une différence potentielle au niveau métabolique et moléculaire des follicules dominants entre la vache laitière et la génisse pouvant avoir une responsabilité dans la diminution de l’efficacité reproductive observée chez la vache laitière.