Alteração da resposta imune mediada por células durante o tratamento com Benzonidazol

Coelhos inoculados com tripomastigotas da cepa Ernestina do Trypanosoma cruzi tiveram parasitemias, demonstradas pelo xenodiagnóstico, até cinco meses e meio após a infecção. O tratamento de alguns desses coelhos com benzonidazol, na dose de 8mg/kg durante sessenta dias, após dois meses de infecção, resultou na negativação dos xenos após 30 dias de uso da medicação. Os coelhos chagásicos crônicos, após seis meses de infecção, já tinham a parasitemia subpatente quando foram submetidos a tratamento idêntico àqueles da fase aguda. Em ambos os casos, os coelhos tratados com benzonidazol tiveram títulos de anticorpos humorais semelhantes àqueles verificados nos coelhos chagásicos não- tratados, inclusive durante a quimioterapia. A não alteração da imunidade humoral em coelhos tratados foi comprovada quando animais chagásicos e não chagásicos submetidos ao tratamento produziram títulos de anticorpos hemolíticos idênticos àqueles verificados nos animais não-tratados. Em acentuado contraste, a função imune timo-dependente foi severamente alterada pelo uso do benzonidazol. As reações de hipersensibilidade tardia contra um antígeno sub- celular do T. cruzi foram suprimidas durante a vigência do tratamento dos coelhos chagásicos. Paralelamente, estas reações eram intensas nos coelhos chagásicos não-tratados e negativas em coelhos controles normais. Todavia, as reações cutâneas tornaram-se novamente positivas 10 dias após o tratamento. Foi interessante notar que as reações de hipersensibilidade tardia in vivo, em coelhos imunizados com BCG e testados com PPD ou em coelhos sensibilizados com DNCB também foram suprimidas durante o tratamento com o benzonidazol. Contudo, as reações de imunidade celular contra estes antígenos também reverteram aos valores normais 7 a 10 dias após a suspensão do benzonidazol. Resultados semelhantes foram relatados em relação ao nifurtimox, outra droga utilizada no tratamento da doença de Chagas. 0 benzonidazol e o nifurtimox são compostos nitro-aromáticos cuja nitrorredução resulta na formação de metabólitos intermediários potencialmente citotóxicos para o protozoário e para as células do hospedeiro.

Teste reverso para anticorpos igm na toxoplasmose, com hemácias sensibilizadas por antígenos de Toxoplasma gondii

Descreve-se um teste para anticorpos IgM-antitoxoplasma baseado na técnica de captura de IgM do soro por anticorpos anti-IgM adsorvidos a placas plásticas. Para evidenciação dos anticorpos antitoxoplasma nessa fração, utiliza-se uma suspensão de hemácias humanas, formolizadas e sensibilizadas por antígenos de Toxoplasma gondii. Nos testes positivos estas aparecem como uma camada contínua, enquanto que nos testes negativos depositam-se ao fundo das cavidades das placas. A leitura dos testes é muito mais evidente do que na técnica anteriormente proposta por Desmonts e cols, 1981, que utiliza suspensões de toxoplasmas. A suspensão de hemácias sensibilizadas pode ser preparada por simples diluição do reagente para o teste de hemaglutinação para a toxoplasmose.

Anticorpos líticos detectados em líquido pericárdico de chagásicos crônicos

A pesquisa de anticorpos líticos (AL) através do teste de lise mediada por complemento (LMCo) foi positiva em 11 líquidos pericárdicos obtidos de pacientes chagásicos falecidos subitamente ou por causas não relacionadas à doença de Chagas e que estão incluídos em um estudo da forma indeterminada dessa doença. Em todos esses pacientes a sorologia convencional para doença de Chagas apresentou resultados positivos e o quadro anátomo-patológico mostrou lesões características ou compatíveis com a cardite chagásica crônica. Em 12 líquidos pericárdicos de indivíduos que faleceram por diferentes causas e nos quais a sorologia para doença de Chagas foi negativa, a LMCo também foi negativa. A presença de AL no líquido pericárdico constitui forte evidência da presença de infecção ativa por T. cruzi nos chagásicos necropsiados e abre perspectivas para o estudo e o melhor conhecimento da patologia da doença de Chagas.

Freqüência de indivíduos com anticorpos sericos anti-Cysticercus cellulosae em cinco Municípios do Estado de São Paulo

Considerando a importância da cisticercose humana em Saúde Pública, foi estudada a freqüência de positividade da detecção de anticorpos anti-Cysticercus cellulosae em 1.264 amostras de soro, assim distribuídas: Grupol-1.064 de indivíduos da população geral (821 adultos e 243 crianças) residentes em cinco municípios do Estado de São Paulo (São Paulo, Presidente Prudente, Santos, Campinas e Marília), Brasil; Grupo 11-200 de pacientes adultos internados em hospital psiquiátrico (Presidente Prudente). Para a pesquisa dos anticorpos séricos foi empregado o teste ELISA utilizando como suporte discos de tecido-resina. No Grupo I foram encontrados 18 (2,30%) soros reagentes entre as amostras de adultos, e 2 (0,82%) entre as das crianças; entre os doentes psiquiátricos, Grupo II, a freqüência de positividade foi de 5 %, significativamente maior (p < 0.05).

Leptospirose em doentes com anticorpos anti-HIV: relato de dois casos

Relata-se a concomitância de leptospirose e síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) em humanos. Nestes casos não foram observados aspectos clínicos diferentes que possam ser atribuídos à simultaneidade dessas patologias.

Infecção por Cryptosporidium parvum: resposta imunitária e tecnologia de anticorpos monoclonais para o diagnóstico

Cryptosporidium parvum é um protozoário intracelular, de distribuição ubiquitária, que causa enterite em humanos e animais. A diarreia é autolimitada em indivíduos imunocompetentes, podendo ser fatal em imunocomprometidos. Actualmente não existem terapêuticas específicas ou preventivas disponíveis, e o elevado custo dos actuais métodos de diagnóstico, sustentam a importância do desenvolvimento de novas abordagens. Vários estudos salientam a importância das células T CD4+ na resposta imunitária à infecção por C. parvum; outros direccionam a sua atenção para as células reguladoras (Treg); e outros tentam esclarecer qual o papel das citocinas específicas produzidas pelas células Th1 e Th2, na regulação da resposta imune, acompanhada pela produção de imunoglobulinas particulares. Na área do diagnóstico, vários e diferentes métodos têm sido utilizados, variando entre a rapidez de execução, especificidade e custo. Várias questões colocam-se, relacionadas com as características das células envolvidas na resposta à infecção e com a especificidade/sensibilidade de cada técnica. Com o objectivo de estudar a resposta imunitária de longo-termo à infecção por C. parvum, no modelo animal imunocompetente, murganhos Balb/c foram inoculados por via oral com oocistos de C. parvum, e efectivadas colheitas e análise de amostras fecais, intestino, sangue e baço, segundo um protocolo previamente definido. A caracterização das populações celulares do sangue e baço foi feita por citometria de fluxo e a identificação e quantificação de imunoglobulinas e citocinas no soro, por tecnologia xMAP® Luminex. A análise por citometria de fluxo não revelou diferenças estatisticamente significativas entre os murganhos infectados e os controlos, tendo sido apenas observado um aumento do número de neutrófilos e eosinófilos circulantes, e a sua posterior diminuição, no primeiro grupo de murganhos. Associada à elevada variabilidade observada após a reinfecção, tais variações são sugeridas como sendo o perfil exibido por estas populações de células no contexto de infecção por C. parvum no organismo imunocompetente, particularmente os eosinófilos, que apresentam um comportamento idêntico em infecção por outros parasitas. O aumento da secreção de TNF-α e IFN-γ (citocinas Th1) nos murganhos infectados, comparativamente com os grupos controlo, para além da secreção de citocinas Th2, como IL-4, IL-5 e IL-10, após a reinfecção, sugere um balanço entre as respostas Th1, para controlar o crescimento do parasita, e Th2, para limitar a patologia. A IgG1 foi o isotipo predominante ao longo de toda a infecção e reinfecção, tendo-se observado um pico de IgG2a após a reinfecção, seguido de diminuição. Esta variação poderá estar relacionada com a função da IgG1 e da IgG2a, ao nível da opsonização e neutralização dos agentes patogénicos, respectivamente. A obtenção de hibridomas secretores de anticorpos específicos para antigénios de C. parvum, por fusão celular, permitiu obter anticorpos e testar a sua aplicação à detecção de oocistos de C. parvum, em amostras fecais humanas e de animais (bovinos). Em resumo, os resultados obtidos permitem sugerir o perfil de imunoglobulinas e citocinas envolvido na resposta à infecção por C. parvum no modelo roedor imunocompetente, assim como desenvolver um futuro “kit” para detecção de C. parvum em amostras biológicas, por técnicas de imunofluorescência

Humoral response towards high density lipoprotein : a new mechanism for atherogenesis

RESUMO:Aterosclerose é uma das principais causas de morbilidade e mortalidade no mundo ocidental. É responsável, direta ou indiretamente, pela maior percentagem de gastos com a saúde na maioria dos países europeus. A “teoria lipídica” da aterosclerose, que se baseia na dislipidemia como causa primária para a doença vascular tem algumas implicações práticas importantes: permite a definição de linhas de orientação e protocolos simples e ainda estabelece alvos terapêuticos que podem ser atingidos na maior parte dos casos com a atual intervenção farmacológica. A associação da aterosclerose com o sistema imunológico (a “teoria imunológica”), forneceu por sua vez novas formas de explorar os mecanismos envolvidos e abriu novas perspetivas para um conhecimento mais completo da doença. No entanto, levanta dificuldades evidentes no que diz respeito às possibilidades terapêuticas. De todos os intervenientes no processo aterosclerótico (bioquímicos, imunológicos e anatómicos), as lipoproteínas de elevada densidade (HDL) são atualmente reconhecidas como um dos fatores mais importantes na aterogénese. Isto é baseado no reconhecimento das múltiplas propriedades anti-aterogénicas das HDL como por exemplo: a anti-oxidante, a anti-inflamatória e a antitrombótica, bem como o seu importante papel na melhoraria da função endotelial. Atualmente, é consensual que as funções anti-aterogénicas das HDL vão além do seu papel no transporte reverso do colesterol (RCT) e a importância das HDL no processo aterosclerótico baseia-se não apenas no seu papel protetor impedindo a formação da placa de ateroma, mas também na estabilização destas, prevenindo a sua ruptura e, consequentemente o evento trombótico. Como fundamentais no processo aterosclerótico estão reconhecidos dois principais conjuntos de eventos: um caracterizado por alterações no metabolismo das lipoproteínas que resultam em lipoproteínas pró-inflamatórias e pró-oxidantes que interagem com os componentes celulares da parede arterial e que conduzem à formação da placa de ateroma; o outro evento é a resposta imunológica desencadeada contra um novo conjunto de antigénios que por sua vez leva à produção de citoquinas pró-inflamatórias. Dada a complexidade da HDL e das suas múltiplas funções estas lipoproteínas tornaram-se um potencial alvo para a resposta auto-imune, e cujas consequências podem explicar algumas das associações identificados em estudos clínicos e epidemiológicos. Contudo esta interação entre o sistema imunológico e HDL nunca foi exaustivamente estudada. Portanto, pomos a hipótese de que em condições oxidativas e pró-inflamatórias, um aumento do antigénio (HDL) conduz a um consequente acréscimo na produção de anticorpos anti-HDL (aHDL) responsáveis pela alteração quantitativa e / ou qualitativa das HDL. O conceito de que estes anticorpos podem contribuir tanto para a evolução a longo prazo do processo aterosclerótico, como para o desencadeamento de eventos clínicos pode também explicar a heterogeneidade encontrada em cada doente e nos grandes estudos clínicos, no que diz respeito aos fatores de risco e outcomes clínicos. Para além disso, a confirmação desta hipótese pode permitir explicar porque é que as intervenções terapêuticas atualmente em desenvolvimento para aumentar os níveis de HDL, não conseguem mostrar a tão esperada redução do risco vascular. O objetivo geral desta tese foi identificar e caracterizar a resposta humoral contra os componentes da HDL, e avaliar possíveis mecanismos que possam contribuir para a modificação das propriedades anti-aterogénicas das HDL. Para alcançar este objetivo investigou-se: 1) A presença de anticorpos aHDL em doentes com lúpus eritematoso sistémico (SLE) e em doentes com manifestações clínicas de aterosclerose, como os doentes com doença arterial coronária (CAD), acidente vascular cerebral isquémico (IS) e diabetes tipo 2; 2) Os principais alvos antigénicos dentro do complexo das HDL e a associação entre os títulos de anticorpos aHDL e diferentes características clínicas destas doenças; 3) As modificações das funções normais associadas às HDL, em particular da função anti-oxidante e anti-inflamatória; 4) A atividade biológica dos anticorpos aHDL isolados do soro de doentes através de um conjunto de experiências in vitro de inibição da atividade da paraoxonase 1 (PON1) e da expressão de moléculas de adesão em culturas de células endoteliais. Para tal foi necessário estabelecer um método de isolamento dos anticorpos. Os anticorpos aHDL isolados do soro de doentes foram utilizados de forma a identificar as potenciais alterações dos sistemas celulares utilizados; 5) O efeito de fármacos usados no tratamento das dislipidemias, em particular o ácido nicotínico e as estatinas, na variação dos títulos de anticorpos aHDL através de ensaios clínicos randomizados, controlados com placebo e em dupla ocultação. Os métodos utilizados neste trabalho incluíram: técnicas imunológicas (como por exemplo, enzyme-linked immunoabsorbent assay - ELISA, ensaio imunoturbidimetrico e cromatografia de imuno-afinidade) técnicas bioquímicas (tais como a quantificação de atividade enzimática por espectrofotometria e por luminescência), experiências com cultura de células e citometria de fluxo. Os nossos resultados mostram que: 1) A presença de anticorpos aHDL, e mais especificamente anticorpos contra alguns do seus principais componentes como a apolipoproteína A-I (ApoA-I, principal apolipoproteína presente nas HDL) e a PON1 (o enzima que mais contribui para a propriedade anti-oxidante das HDL), quer em doentes com doenças auto-imunes, como o SLE, quer em doentes com manifestações clínicas de aterosclerose, como CAD, IS e diabetes tipo 2. Os doentes apresentaram títulos de anticorpos IgG aHDL, aApoA-I e aPON1 significativamente mais elevados do que controlos saudáveis com a mesma idade e sexo. 2) A correlação positiva estatisticamente significativa entre os títulos de aHDL e aApoA-I e aPON1 sugere que estes sejam dois dos principais alvos antigénicos dentro do complexo das HDL. Os anticorpos encontrados nestes doentes estão associados com a diminuição da atividade da PON1 e a uma redução da capacidade anti-oxidante total (TAC) do soro, um aumento dos biomarcadores de disfunção endotelial (como por exemplo dos metabolitos do óxido nítrico - NO2- e NO3-, as moléculas de adesão vascular e intracelular - VCAM-1 e ICAM-1 e os níveis de 3-nitrotirosina). Nos doentes com SLE os títulos destes estão associados a um aumento do dano cardiovascular e à atividade global da doença avaliados pelas escalas SLICC/ACR DI e BILAG score, respetivamente. Enquanto que nos doentes com diabetes tipo 2 estes anticorpos estão associados com um aumento dos níveis de glicemia em jejum (FGP) e hemoglobina glicada (HbA1c). 3) Após se ter estabelecido um método de isolamento dos anticorpos que permite isolar quantidades significativas de anticorpos do soro de doentes sem perder a sua especificidade, foi identificada a capacidade dos anticorpos isolados do soro de doentes inibirem de uma forma dependente da concentração a atividade da PON1 até um máximo de 70% no caso dos doentes com SLE e ente 7-52% no caso dos anticorpos isolados de doentes com CAD e IS. 4) O efeito anti-inflamatório das HDL na inibição da produção de VCAM-1 induzida por citoquinas (como o TNF-) foi revertido em mais de 80% pelos anticorpos aHDL isolados do soro de doentes. 5) A angiogenesis induzida por HDL através do aumento do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) foi anulada em 65% pelos anticorpos aHDL isolados do soro de doentes. 6) Os atuais agentes farmacológicos disponíveis para aumentar as concentrações de HDL-C estão associados a um aumento dos títulos de anticorpos.-------- ABSTRACTAtherosclerosis is the major cause of morbidity and mortality in the western world. It is also responsible, directly or indirectly, for the highest percentage of health costs in most European countries. Despite the use of new technologies for the diagnosis of vascular disease and regardless of the major advances in treatment, the atherosclerosis-related clinical burden is still raising. The “lipid theory” of atherogenesis, which identifies dyslipidemia as the primary cause of this vascular disease has some important practical implications: it allows the definition of simple guidelines and establishes therapeutic targets which can be generally met with current pharmacologic intervention. The association between atherosclerosis an the immune system (the immune concept) has in turn provided new ways of exploring the mechanisms involved in this condition and has opened new perspectives in the understanding of the disease. However, it raises obvious difficulties when it comes to treatment options. Of all the players (biochemical, immunological and anatomical) involved in this matter, high-density lipoproteins (HDL) are currently recognised as one of the most important factors in atherogenesis. This is based on the recognition of HDL's multiple anti-atherogenic properties: anti-oxidant, anti-inflammatory and antithrombotic, as well as its capacity to improve endothelial function. Nowadays, it is widely recognized that the anti-atherogenic functions of HDL go beyond reverse cholesterol transport (RCT), and the importance of HDL is based not just on its ability to reduce atheroma formation but also on its ability to stabilise plaques, therefore preventing their rupture and ultimately thrombosis. Two main set of events have been recognised as fundamental in atherogenesis: one, characterized by lipoprotein metabolism alterations, resulting in pro-inflammatory and pro-oxidative lipoproteins, which interact with the normal cellular elements of the arterial wall leading to atheroma formation; the other, the immune cellular response towards new sets of antigens which lead to the production of pro-inflammatory cytokines. Given to HDL complexity and multiple functions this lipoprotein has became a potential target for an auto-immune response, the consequences of which may explain some of the association identified in epidemiological and clinical studies, though the interaction between the immune system and HDL has never been thoroughly addressed. Therefore, we hypothesized that under oxidative and pro-inflammatory conditions, the increase in the antigen (HDL) would lead to a consequent increase in the production of anti-HDL (aHDL) antibodies be responsible for quantitative and/or qualitative changes of HDL. The concept that these antibodies may contribute either to the long-term evolution of atherosclerosis or to the triggering of clinical events may also explain the heterogeneity found in individual patients and in large cohorts regarding risk factors and clinical outcomes. Moreover this may be a major breakthrough in understanding why therapeutic interventions that increase HDL levels, failed to show the anticipated reduction in vascular risk. The overall aims of this thesis were to identified and characterize the humoral response towards HDL components and to evaluate the possible mechanisms that may contribute to the modifications of the anti-atherogenic properties of HDL. To achieve this objective we investigated: 1) the presence of aHDL antibodies in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and in patients with atherosclerosis-related clinical events, such as coronary artery disease (CAD), ischemic stroke (IS) and type 2 diabetes; 2) the association between the titres of aHDL antibodies and different clinical features of these diseases; 3) the modifications of the anti-atherogenic properties of HDL; 4) the biologic effect of aHDL antibodies isolated from serum of patients on the anti-oxidant and anti-inflammatory properties of HDL; 5) the effect of different pharmacologic treatments for dyslipidemia on the prevalence and activity of aHDL antibodies. The methodologies used in this work included immunologic-related techniques (e.g. enzyme-linked immunoabsorbent assay – ELISA, immunoturbidimetric immunoassay and immunoaffinity chromatography), biochemical techniques (enzymatic assays with quantification by spectrophotometry and luminescence methods), cell culture experiments and flow cytometry. Our results indicate that: 1) The titres of IgG aHDL, anti-apolipoprotein A-I (aApoA-I) and anti-paraoxonase 1 (aPON1) antibodies were higher in patients with SLE, CAD, IS and type 2 diabetes when compared with age and sex matched healthy controls. 2) The antibodies found in these patients were associated with decreased PON1 activity, (the enzyme responsible for most of the anti-oxidant effect of HDL), reduced total anti-oxidant capacity (TAC) of serum and increased biomarkers of endothelial dysfunction (nitric oxide metabolites, adhesion molecules, nitrotyrosine). In patients with SLE the antibody titres were associated with an increase in disease-related cardiovascular damage and activity whereas in patients with type 2 diabetes they were directly related with the fasting glucose plasma (FGP) levels and the glycosylated haemoglobin (HbA1c). 3) The antibodies isolated from serum of our patients, directly inhibited HDL-associated PON1 activity in a dose dependent way ranging from 7 to 52%. 4) The anti-inflammatory effect of HDL, measured by the percentage of inhibition of the cytokine-induced production of vascular adhesion molecules (VCAM-1), was reduced in more than 80% by aHDL antibodies isolated from our patients. 5) The HDL-induced angiogenesis by increasing vascular endothelial growth factor (VEGF) levels was abrogated in 65% by the antibodies isolated from serum of patients. 6) The current available pharmacologic agents for increasing HDL-C concentrations were associated with an increase in the titres of IgG aApoA-I antibodies. This increase was higher in the extended release niacin when compared to statins probably due to their dampening effect on oxidative stress. In conclusion, aHDL antibodies are present in different pathologic conditions. aHDL antibodies represent a family of self-reacting immunoglobulins, of which ApoA-I and PON1 might be the most relevant targets. These antibodies are biologically active, interfering with the HDL anti-oxidant and anti-inflammatory properties and, consequently, with the atherosclerotic process. The pathogenic potential of these antibodies may lead to the identification of a new biomarker for vascular disease, whilst presenting itself as a novel target for a different treatment approach which may redefine the treatment strategies and clinical trials design for HDL interventions in the future.

Análise dos anticorpos vibriocidas e aglutinantes na população urbana do Município do Manacapuru/AM (1992/1993)

Foi realizado um estudo sorológico em 1.196 indivíduos residentes na área urbana do município de Manacapuru/AM, visando analisar o perfil dos anticorpos vibriocidas e aglutinantes. Empregou-se o procedimento de amostragem aleatória sistemática na obtenção da amostra populacional. Um ano após, obteve-se uma 2a amostra de soro de 120 indivíduos (10% da amostra inicial), escolhidos aleatoriamente entre os participantes do inquérito, com o objetivo de avaliar o comportamento dos anticorpos nesse intervalo de tempo. Foram empregados os métodos de microtitulação de anticorpos vibriocidas e de soroaglutinação em tubos. A associação entre os anticorpos estudados foi determinada pelo coeficiente de correlação, calculado com base na distribuição de freqüência dos títulos detectados. A análise dos resultados revelou forte correlação positiva entre os anticorpos (r = 1,0) e queda nos títulos em grande proporção das amostras após um ano.

Anticorpos anti-hantavírus em escolares de Salvador, Bahia

As hantaviroses são doenças emergentes nas Américas e, em todo o mundo, os casos clínicos descritos foram infreqüentes entre crianças. O objetivo de investigar a freqüência de escolares portadores de anticorpos (IgG) anti-hantavírus justifica-se porque poucos estudos soroepidemiológicos pesquisaram a infecção por hantavírus no grupo pediátrico. Nos espécimes séricos de 379 escolares, de duas Escolas públicas da cidade do Salvador, Bahia, foram pesquisados os anticorpos anti-Hantaan (HTN) e anti-Sin Nombre (SN). A soropositividade de anticorpos anti-HTN foi de 13,2% (50/379) e todos os escolares foram soronegativos para o vírus SN. A soropositividade anti-HTN aumentou proporcionalmente com a idade. Não houve associação entre a soropositividade anti-HTN e as características relacionadas à exposição a roedores urbanos. A soroprevalência de anticorpos anti-HTN nos escolares estudados foi elevada e reforçou a hipótese de circulação de hantavírus em Salvador. A não observação de portadores de anticorpos anti-SN indica, provavelmente, a circulação de outros sorotipos nesta região, mais relacionados antigenicamente ao sorotipo Hantaan.

Pesquisa de anticorpos contra o vírus da hepatite C em pool de 5 soros: sua utilização em inquéritos soroepidemiológicos

Para avaliar redução de custo da pesquisa de anticorpos contra hepatite C, por ELISA, em pool de cinco soros, realizou-se o teste em grupos de baixo e alto risco. Dois terços dos conjuntos de alto risco tiveram que ser repetidos. A redução do gasto de reagente foi de 80% na população de baixo risco e de 13% na amostra de alto risco. Estes dados sugerem que a pesquisa do anti-VHC em pool reduz o custo do procedimento em populações de baixo risco.