Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Sviluppo di un sistema per allocazione e scheduling di applicazioni periodiche

In questa tesi, viene illustrato un metodo risolutivo al problema dell’allocazione e schedulazione, su risorse eterogenee con capacità unaria rinnovabile e cumulativa non rinnovabile, di applicazioni multitask periodiche, con periodi in relazione armonica, strutturate in attività indipendenti o sottoposte a vincoli di precedenza e con durate dipendenti dalla specifica risorsa di allocazione. L’obiettivo è quello di fornire un’implementazione del modello in grado di gestire l’allocazione e la schedulazione di istanze (i.e. insieme di applicazioni) variabili, caratterizzate da una serie di parametri. La struttura implementativa, realizzata secondo la Logic-based Benders decomposition, prevede la suddivisione del problema in due moduli. Il primo in grado di generare un’allocazione e realizzato con tecniche di programmazione lineare intera mista, il secondo con lo scopo di controllare l’ammissibilità di tale allocazione attraverso una schedulazione ottima e realizzato mediante tecniche di programmazione a vincoli. Il meccanismo di comunicazione tra i due moduli avviene mediante vincoli lineari, denominati tagli di Benders, che vengono aggiunti dopo ogni iterazione del sistema. L’efficacia del modello sarà valutata confrontando i risultati ottenuti attraverso una serie di test, con i valori forniti da un metodo di allocazione e schedulazione alternativo.

A new marker for rapid sex identification of red deer (cervus elaphus) | Un nuovo marcatore per l'identificazione rapida del sesso del cervo (cervus elaphus)

Un nuovo marcatore per l'identificazione rapida del sesso del cervo (Cervus elaphus). Il cervo (Cervus elaphus) è una specie cacciabile economicamente importante che risente di alcuni problemi di conservazione. La conoscenza di parametri di popolazione come il rapporto sessi è importante per la sua gestione e conservazione. In questo studio, utilizzando condizioni poco specifiche per l’amplificazione di un frammento del cromosoma Y già descritto in precedenza, descriviamo un metodo che permette una rapida e corretta identificazione del sesso in questa specie, producendo due amplicons diversi nei maschi e uno nelle femmine. I due frammenti, diversi per il peso molecolare, sono facilmente separabili mediante elettroforesi in gel di agarosio, permettendo l'identificazione del sesso con un unico test in campioni biologici come carcasse, embrioni recuperati da femmine abbattute e, forse, peli o escrementi (se la qualità del DNA è accettabile). Questo metodo può essere di aiuto in studi sul rapporto sessi degli embrioni, sulla mortalità associata al sesso o sul rapporto sessi in popolazioni selvatiche o semiselvatiche, con ricadute applicative per le analisi demografiche, la gestione venatoria e la conservazione

Interpretazione geotecnica di alcuni risultati ottenuti dalla costruzione del grande terrapieno sperimentale di Treporti(VE)

I terreni di Treporti, nella laguna di Venezia, sono caratterizzati da una fitta alternanza di strati con caratteristiche di compressibilità fortemente variabili, pertanto risulta alquanto complessa la determinazione e la scelta di parametri appropriati per la progettazione. La costruzione del terrapieno sperimentale, ed il contemporaneo impiego dell'assestimetro a basi multiple, ha permesso di misurare il comportamento deformativo del terreno in sito e le analisi retrospettive hanno simulato, in base a parametri di tentativo, il comportamento nel tempo dei terreni di fondazione. L'analisi a posteriori delle deformazioni è stata confrontata con le misure effettuate nel corso degli anni precedenti la fase di scarico, mentre oltre questa fase è stata eseguita una previsione confrontata con le tre misure eseguite dopo la fase di scarico, ottenendo in entrambi i casi un buon accordo tra simulazioni e misure. L’aderenza quasi perfetta ottenuta tra le curve ε-t calcolate e le corrispondenti curve ε-t sperimentali, fa ritenere che tutti i parametri geotecnici ottenuti dal modello, rispecchino con buona approssimazione quelli realmente mobilitati dai 40 m di sottosuolo interessati dal carico. Pertanto anche i risultati ottenuti in ordine all'influenza della consolidazione secondaria sugli abbassamenti totali, debbono ritenersi con buona approssimazione vicini al comportamento reale. Il modello è anche in grado di descrivere molto bene i cedimenti dei diversi strati di terreno e quello del piano di posa.

Individuazione dei valori ottimali di crescita di dinoflagellate bentoniche, valutazione della tossicità e di interazioni allopatiche.

Individuazione dei valori ottimali di crescita di dinoflagellate bentoniche, valutazione della tossicità e di interazioni allelopatiche. Il fitoplancton rappresenta la base della catena trofica in ambiente marino, nonché oltre la metà  della produzione primaria a livello mondiale. Le dinoflagellate, assieme alle diatomee, costituiscono la maggior parte del fitoplancton, comprendendo numerose e diversificate specie di microalghe dalla differente distribuzione, ecologia e fisiologia. Alcune specie appartenenti a tale gruppo sono in grado di dare luogo, in determinate condizioni, a estesi fenomeni di fioriture algali, che diventano particolarmente impattanti se le specie coinvolte sono responsabili della produzione di biotossine, le quali possono direttamente uccidere altri organismi o accumularsi nei loro tessuti. Gli effetti nocivi di questi fenomeni si ripercuotono pesantemente sull'ecosistema marino, con ingenti morie di organismi acquatici (da pesci a molluschi, dal bentos al necton) e profonde alterazioni nelle comunità specifiche. Un forte coinvolgimento si ha di conseguenza anche per le attività umane, in seguito a forti esternalità negative su pesca, turismo, attività ricreative, o spesso con rischi direttamente correlati alla salute umana, dovuti perlopiù ad ingestione di organismi contaminati o all'inalazione di tossine per via aerea. Negli ultimi anni le fioriture algali tossiche si sono fortemente intensificate in distribuzione, estensione e frequenza, attirando l'interesse globale della comunità scientifica. Diversi studi condotti in questo senso hanno portato all'identificazione di numerose specie di dinoflagellate tossiche e all'isolamento di una lunga serie di composti chimici con effetti dannosi da esse sintetizzate. Tuttavia si conosce ancora ben poco sull'ecologia di queste specie, in particolare su quali siano i fattori che possano indurre o regolare la proliferazione e lo sviluppo di un bloom algale. Questo studio si è focalizzato su due specie di dinoflagellate bentoniche tossiche, Ostreopsis ovata e Coolia monotis, entrambe appartenenti alla famiglia Ostreopsidaceae, note già da tempo nei paesi tropicali poiché associate alla sindrome da ciguatera. Negli ultimi anni, Ostreopsis ovata è stata oggetto di numerose ricerche in Europa, poiché ha dato luogo a fenomeni di bloom, collegati con danni respiratori nell'uomo, anche lungo i litorali italiani; soltanto recentemente grazie ad una tecnica analitica basata sulla combinazione di cromatografia liquida e spettrometria di massa (LC-MS), è stato possibile isolare la diverse tossine responsabili. Durante i vari monitoraggi e campionamenti delle acque, questa dinoflagellata è stata sempre riscontrata in presenza di Coolia monotis (e Prorocentrum lima), di cui invece si conosce ben poco, visto che la sua tossicità in Mediterraneo non è ancora stata dimostrata, né la sua tossina caratterizzata. Il primo step di questo studio è stato quello di valutare, attraverso il mantenimento di colture in vitro, l'importanza della temperatura nella crescita di O. ovata e C. monotis (singolarmente) provenienti dalla zona del monte Conero (Ancona, Marche). Esistono già studi di questo tipo su ceppi adriatici di O. ovata, tuttavia è stato effettuato un esperimento similare utilizzando un nuovo ceppo, isolato in anni recenti; per C. monotis invece non sono presenti molti studi in letteratura, in particolare nessuno riguardante ceppi italiani. La valutazione della crescita è stata effettuata attraverso conteggio delle cellule, misura dell'efficienza fotosintetica e consumo dei macronutrienti. Quindi, visto che le due specie vivono in associazione nell'ambiente marino, si è cercato di evidenziare l'instaurarsi di eventuali processi competitivi o di fenomeni di allelopatia. Dall'analisi dei risultati è emerso che, se coltivate individualmente, sia C. monotis che O. ovata mostrano un optimum di crescita alla temperatura di 20°C, con tasso di crescita, numero di cellule e rendimento fotosintetico raggiunti più elevati, seppure non di molto rispetto alle colture a 25°C. Le colture a 30°C al contrario hanno mostrato valori sensibilmente inferiori. Se fatte crescere assieme, invece, C. monotis mantiene lo stesso pattern riscontrato nella monoculture a 20 e 25°C, seppur raggiungendo numeri di cellule inferiori, mentre a 30°C ha una crescita bassissima. Al contrario, O. ovata alla temperatura più elevata raggiunge lo stesso numero di cellule della monocultura, alla temperatura intermedia registra il tasso di crescita, ma non il numero di cellule, più elevato, mentre alla temperatura più bassa (che era l'optimum per la monocultura) si ha il maggior stress per la specie, evidenziando forti fenomeni di competizione. Esperimenti su C. monotis fatta crescere in un filtrato di O. ovata non hanno invece chiarito l'esistenza o meno di eventuali effetti allelopatici di Ostreopsis su Coolia, dato che non sono apparse differenze evidenti tra il controllo e il filtrato, mentre hanno messo in luce l'importanza dei batteri associati alle microalghe come supporto alla loro crescita, poiché le colture cresciute in filtrato sterile hanno manifestato tutte quante un rendimento quantico fotosintetico inferiore.

Profilo farmacogenetico di determinanti molecolari dell'attività di cisplatino e gemcitabina in pazienti affetti da tumore polmonare non a piccole cellule

Il carcinoma polmonare rappresenta un problema socio-sanitario di grande rilievo, essendo la prima causa di morte per neoplasia. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (non small cell lung cancer - NSCLC) rappresenta la variante istologica più frequente (80% dei casi di tumore polmonare). Al momento della diagnosi circa il 60-70% dei pazienti presenta una malattia in stadio avanzato o metastatico non essendo suscettibile di trattamento chirurgico. Per questi pazienti il trattamento chemioterapico determina un prolungamento della sopravvivenza e un miglioramento della qualità  della vita rispetto alla sola terapia di supporto, identificandosi come standard terapeutico. L'individuazione del migliore trattamento chemioterapico per questo subset di pazienti rappresenta pertanto una delle principali sfide della ricerca oncologica. I regimi polichemioterapici si possono dividere schematicamente in tre generazioni in relazione all'introduzione nel corso degli anni di nuovi agenti chemioterapici. Con l'avvento dei regimi di terza generazione, il trattamento del NSCLC avanzato sembra aver raggiunto un plateau, mancando infatti chiare dimostrazioni di superiorità  di un regime di ultima generazione rispetto ad un altro. Tra questi l'associazione cisplatino e gemcitabina rappresenta uno dei regimi standard più utilizzati in considerazione del suo favorevole rapporto costo-beneficio. Al fine di migliorare i risultati del trattamento chemioterapico in termini di attività  ed efficacia, una possibilità  consiste nell'individuazione di parametri predittivi che ci consentano di identificare il miglior trattamento per il singolo paziente. Tra i vari parametri predittivi valutabili, un crescente interesse è stato rivolto a quelli di carattere genetico, anche grazie all'avvento di nuove tecniche di biologia molecolare e al sequenziamento del genoma umano che ha dato nuovo impulso a studi di farmacogenetica e farmacogenomica. Sulla base di queste considerazioni, in questa tesi è stato effettuato uno studio mirato a valutare l'espressione di determinanti molecolari coinvolti nel meccanismo di azione di gemcitabina e cisplatino in pazienti affetti dai due tipi istologici principali di NSCLC, adenocarcinomi e carcinomi squamocellulari. Lo studio dei livelli di espressione genica è stata effettuata in tessuti di 69 pazienti affetti da NSCLC arruolati presso l'Istituto Europeo di Oncologia di Milano. In particolare, mediante Real Time PCR è stata valutata l'espressione genica di ERCC1, hENT1, dCK, 5'-NT, CDA, RRM1 e RRM2 in 85 campioni isolati con microdissezione da biopsie provenienti dai tessuti polmonari normali o tumorali o dalle metastasi linfonodali. Le analisi di questi tessuti hanno mostrato differenze significative per i pattern di espressione genica di diversi determinanti molecolari potenzialmente utile nel predire l'efficacia di gemcitabina/cisplatino e per personalizzare i trattamenti in pazienti affetti da cancro. In conclusione, l'evoluzione delle tecniche di biologia molecolare promossa dagli studi di farmacogenetica racchiude in sè notevoli potenzialità  per quanto concerne l'ideazione di nuovi protocolli terapeutici. Identificando le caratteristiche genotipiche e i livelli di espressione geniche di determinanti molecolari implicati nella risposta ai farmaci potremmo infatti predisporre delle mappe di chemiosensibilità-chemioresistenza per ciascun paziente, nell'ottica di approntare di volta in volta le più appropriate terapie antitumorali in base alle caratteristiche genetiche del paziente e della sua patologia neoplastica.

Il Restauro di Palazzo Angelelli-Zambeccari ad Argelato

L'evoluzione delle tipologie architettoniche sviluppate all'interno del panorama bolognese ha portato allo sviluppo nel XVI secolo di Palazzi immersi nella campagna rispondenti ai canoni dei principi rinascimentali di armonia fra l'uomo e la Natura. E' in questo contesto che si sviluppa il Palazzo Angelelli-Zambeccari, il cui nucleo risale alla fine del XVI secolo e che si è costituito successivamente come importante tenuta agricola. La proprietà del Palazzo va attribuita in un primo momento alla Famiglia Senatoria Angelelli, che apporta le principali modifiche costruttive, quali le due ali simmetriche e una parte fondamentale del corpo centrale, successivamente alla Famiglia Zambeccari, che si occupa di sistemazioni interne e della struttura della tenuta. Attualmente la proprietà risulta essere del Comune, che cerca di svilupparla come centro propulsore del Paese. Il progetto di restauro vuole restituire all'edificio il suo carattere originale, inserendo all'interno di esso funzioni utili al Paese, come la biblioteca e i laboratori didattici, e attività legate al sostentamento stesso della proprietà, come un piccolo agriturismo e il centro di rappresentanza della Cantina Sociale del Paese. Proprio per la Cantina il progetto ha cercato di sviluppare un adeguato impianto di climatizzazione e di parametri legati alle condizioni ottimali per l'utilizzo, al fine di costruire uno spazio funzionale che possa essere testimonianza dell'attività agro-vinicola propria della tradizione della villa di campagna.

Sviluppo di algoritmi per l'automazione di misure industriali

Oggi, grazie al continuo progredire della tecnologia, in tutti i sistemi di produzione industriali si trova almeno un macchinario che permette di automatizzare determinate operazioni. Alcuni di questi macchinari hanno un sistema di visione industriale (machine vision), che permette loro di osservare ed analizzare ciò che li circonda, dotato di algoritmi in grado di operare alcune scelte in maniera automatica. D’altra parte, il continuo progresso tecnologico che caratterizza la realizzazione di sensori di visione, ottiche e, nell’insieme, di telecamere, consente una sempre più precisa e accurata acquisizione della scena inquadrata. Oggi, esigenze di mercato fanno si che sia diventato necessario che macchinari dotati dei moderni sistemi di visione permettano di fare misure morfometriche e dimensionali non a contatto. Ma le difficoltà annesse alla progettazione ed alla realizzazione su larga scala di sistemi di visione industriali che facciano misure dimensioni non a contatto, con sensori 2D, fanno sì che in tutto il mondo il numero di aziende che producono questo tipo di macchinari sia estremamente esiguo. A fronte di capacità di calcolo avanzate, questi macchinari necessitano dell’intervento di un operatore per selezionare quali parti dell’immagine acquisita siano d’interesse e, spesso, anche di indicare cosa misurare in esse. Questa tesi è stata sviluppata in sinergia con una di queste aziende, che produce alcuni macchinari per le misure automatiche di pezzi meccanici. Attualmente, nell’immagine del pezzo meccanico vengono manualmente indicate le forme su cui effettuare misure. Lo scopo di questo lavoro è quello di studiare e prototipare un algoritmo che fosse in grado di rilevare e interpretare forme geometriche note, analizzando l’immagine acquisita dalla scansione di un pezzo meccanico. Le difficoltà affrontate sono tipiche dei problemi del “mondo reale” e riguardano tutti i passaggi tipici dell’elaborazione di immagini, dalla “pulitura” dell’immagine acquisita, alla sua binarizzazione fino, ovviamente, alla parte di analisi del contorno ed identificazione di forme caratteristiche. Per raggiungere l’obiettivo, sono state utilizzate tecniche di elaborazione d’immagine che hanno permesso di interpretare nell'immagine scansionata dalla macchina tutte le forme note che ci siamo preposti di interpretare. L’algoritmo si è dimostrato molto robusto nell'interpretazione dei diametri e degli spallamenti trovando, infatti, in tutti i benchmark utilizzati tutte le forme di questo tipo, mentre è meno robusto nella determinazione di lati obliqui e archi di circonferenza a causa del loro campionamento non lineare.

Co-simulazione e co-progetto non lineare/elettromagnetico di sistemi wireless non convenzionali

L’attività di ricerca contenuta in questa tesi si è concentrata nello sviluppo e nell’implementazione di tecniche per la co-simulazione e il co-progetto non lineare/elettromagnetico di sistemi wireless non convenzionali. Questo lavoro presenta un metodo rigoroso per considerare le interazioni tra due sistemi posti sia in condizioni di campo vicino che in condizioni di campo lontano. In sostanza, gli effetti del sistema trasmittente sono rappresentati da un generatore equivalente di Norton posto in parallelo all’antenna del sistema ricevente, calcolato per mezzo del teorema di reciprocità e del teorema di equivalenza. La correttezza del metodo è stata verificata per mezzo di simulazioni e misure, concordi tra loro. La stessa teoria, ampliata con l’introduzione degli effetti di scattering, è stata usata per valutare una condizione analoga, dove l’elemento trasmittente coincide con quello ricevente (DIE) contenuto all’interno di una struttura metallica (package). I risultati sono stati confrontati con i medesimi ottenibili tramite tecniche FEM e FDTD/FIT, che richiedono tempi di simulazione maggiori di un ordine di grandezza. Grazie ai metodi di co-simulazione non lineari/EM sopra esposti, è stato progettato e verificato un sistema di localizzazione e identificazione di oggetti taggati posti in ambiente indoor. Questo è stato ottenuto dotando il sistema di lettura, denominato RID (Remotely Identify and Detect), di funzioni di scansione angolare e della tecnica di RADAR mono-pulse. Il sistema sperimentale, creato con dispositivi low cost, opera a 2.5 GHz ed ha le dimensioni paragonabili ad un normale PDA. E’ stato sperimentata la capacità del RID di localizzare, in scenari indoor, oggetti statici e in movimento.

Progetto ed implementazione di protocolli a basso consumo energetico per reti wireless

"I computer del nuovo millennio saranno sempre più invisibili, o meglio embedded, incorporati agli oggetti, ai mobili, anche al nostro corpo. L'intelligenza elettronica sviluppata su silicio diventerà sempre più diffusa e ubiqua. Sarà come un'orchestra di oggetti interattivi, non invasivi e dalla presenza discreta, ovunque". [Mark Weiser, 1991] La visione dell'ubiquitous computing, prevista da Weiser, è ormai molto vicina alla realtà e anticipa una rivoluzione tecnologica nella quale l'elaborazione di dati ha assunto un ruolo sempre più dominante nella nostra vita quotidiana. La rivoluzione porta non solo a vedere l'elaborazione di dati come un'operazione che si può compiere attraverso un computer desktop, legato quindi ad una postazione fissa, ma soprattutto a considerare l'uso della tecnologia come qualcosa di necessario in ogni occasione, in ogni luogo e la diffusione della miniaturizzazione dei dispositivi elettronici e delle tecnologie di comunicazione wireless ha contribuito notevolmente alla realizzazione di questo scenario. La possibilità di avere a disposizione nei luoghi più impensabili sistemi elettronici di piccole dimensioni e autoalimentati ha contribuito allo sviluppo di nuove applicazioni, tra le quali troviamo le WSN (Wireless Sensor Network), ovvero reti formate da dispositivi in grado di monitorare qualsiasi grandezza naturale misurabile e inviare i dati verso sistemi in grado di elaborare e immagazzinare le informazioni raccolte. La novità introdotta dalle reti WSN è rappresentata dalla possibilità di effettuare monitoraggi con continuità delle più diverse grandezze fisiche, il che ha consentito a questa nuova tecnologia l'accesso ad un mercato che prevede una vastità di scenari indefinita. Osservazioni estese sia nello spazio che nel tempo possono essere inoltre utili per poter ricavare informazioni sull'andamento di fenomeni naturali che, se monitorati saltuariamente, non fornirebbero alcuna informazione interessante. Tra i casi d'interesse più rilevanti si possono evidenziare: - segnalazione di emergenze (terremoti, inondazioni) - monitoraggio di parametri difficilmente accessibili all'uomo (frane, ghiacciai) - smart cities (analisi e controllo di illuminazione pubblica, traffico, inquinamento, contatori gas e luce) - monitoraggio di parametri utili al miglioramento di attività produttive (agricoltura intelligente, monitoraggio consumi) - sorveglianza (controllo accessi ad aree riservate, rilevamento della presenza dell'uomo) Il vantaggio rappresentato da un basso consumo energetico, e di conseguenza un tempo di vita della rete elevato, ha come controparte il non elevato range di copertura wireless, valutato nell'ordine delle decine di metri secondo lo standard IEEE 802.15.4. Il monitoraggio di un'area di grandi dimensioni richiede quindi la disposizione di nodi intermedi aventi le funzioni di un router, il cui compito sarà quello di inoltrare i dati ricevuti verso il coordinatore della rete. Il tempo di vita dei nodi intermedi è di notevole importanza perché, in caso di spegnimento, parte delle informazioni raccolte non raggiungerebbero il coordinatore e quindi non verrebbero immagazzinate e analizzate dall'uomo o dai sistemi di controllo. Lo scopo di questa trattazione è la creazione di un protocollo di comunicazione che preveda meccanismi di routing orientati alla ricerca del massimo tempo di vita della rete. Nel capitolo 1 vengono introdotte le WSN descrivendo caratteristiche generali, applicazioni, struttura della rete e architettura hardware richiesta. Nel capitolo 2 viene illustrato l'ambiente di sviluppo del progetto, analizzando le piattaforme hardware, firmware e software sulle quali ci appoggeremo per realizzare il progetto. Verranno descritti anche alcuni strumenti utili per effettuare la programmazione e il debug della rete. Nel capitolo 3 si descrivono i requisiti di progetto e si realizza una mappatura dell'architettura finale. Nel capitolo 4 si sviluppa il protocollo di routing, analizzando i consumi e motivando le scelte progettuali. Nel capitolo 5 vengono presentate le interfacce grafiche utilizzate utili per l'analisi dei dati. Nel capitolo 6 vengono esposti i risultati sperimentali dell'implementazione fissando come obiettivo il massimo lifetime della rete.

Sviluppo di nuove tecniche per la diagnosi e il monitoraggio di malattie dell'orecchio interno

Questa tesi nasce dall’idea di sfruttare i recenti sviluppi della tecnica nell’ambito delle elaborazioni tridimensionali su immagini interne al corpo umano per creare nuovi strumenti di diagnosi e controllo utili ai fini medici. In particolare, si cercherà un nuovo strumento di diagnosi per una malattia, ampiamente diffusa tra la popolazione, che colpisce l’orecchio interno: la cupololitiasi, anche nota come vertigine parossistica posizionale benigna. Il presente studio, che fa parte di un più ampio progetto di ricerca, è volto a definire un protocollo sia di misure antropometriche che di densità di tessuti e alla verifica di parametri, su un numero limitato di campioni, la cui presenza consente di rilevare la malattia. Si cercano misure che diano valori differenti tra orecchi interni sani e malati, cioè segnali inequivocabili della presenza della cupololitiasi. Si utilizzano immagini provenienti da TAC effettuate a pazienti sofferenti di cupololitiasi per scopi diagnostici; si elaborano in 3D e si misurano con il programma di Materializze: MIMICS.

Sistemi innovativi per il miglioramento della qualità e della sicurezza degli alimenti

Nell’attuale contesto, caratterizzato da un’elevata attenzione alla qualità e alla sicurezza degli alimenti e alle soluzioni tese a garantirli, l’implementazione di sistemi microelettronici per il controllo del prodotto attraverso supporti miniaturizzati e a basso costo può risultare un’opportunità strategica. Oggetto della ricerca di dottorato sono stati lo studio dell’utilizzo di sensori e strumentazione innovativi per la misurazione ed il controllo di parametri ambientali di conservazione di prodotti alimentari e per la loro identificazione mediante la tecnologia della radiofrequenza. Allo scopo è stato studiato il contesto in cui operano gli attori principali della filiera agroalimentare ed è stata sviluppata un’idea di etichetta progettata per essere in grado di emettere attivamente segnale di allarme in caso di necessità (etichetta RFID intelligente semi-passiva). Il prototipo di chip, realizzato in via sperimentale, è stato validato positivamente, sia come strumento di misura, sia in termini di prestazione nel caso studio del monitoraggio della conservazione di un prodotto alimentare in condizioni controllate di temperatura e radiazione luminosa. Le significative evidenze analitiche di reazioni di degradazione dello stato qualitativo del prodotto, quali analisi di pH e colore, raccolte durante il periodo di osservazione di 64 giorni, hanno trovato riscontro con le misure rilevate dal chip prototipo. I risultati invitano ad individuare un partner industriale, con il quale sperimentare l’applicazione della tecnologia proposta.

Tecniche di localizzazione indoor per il tracciamento di oggetti: studio per un caso reale

Nuovi sviluppi nella comunicazione wireless e nell'elettronica hanno permesso lo sviluppo di dispositivi poco costosi, poco energivori e multifunzione, piccoli in dimensione e in grado di comunicare a breve distanza. Collegati con tecnologie senza fili e disponibili in gran numero, questi sensori hanno offerto opportunità senza precedenti nel monitorare e controllare case, città, e l'ambiente. In aggiunta, i sensori wireless hanno anche una vasta gamma di applicazioni nella sicurezza, generando nuove capacità di riconoscimento e sorveglianza, unite ad altre finalità tattiche. La capacità di localizzazione di questi congegni poi è altamente studiata e ricercata, per applicazioni che vanno dal monitoraggio di incendi,della qualità dell'acqua e dell'agricoltura di precisione alla gestione di inventari, di sistemi anti intrusione, monitoraggio del traffico e di parametri medici. Da questo esteso panorama di utilizzi, è scaturita l'idea di un impiego di queste reti in un contesto particolare. L'esperienza maturata in ambito fieristico mi ha portato a considerare una problematica da sempre sentita, ma che non ha mai trovato soluzioni soddisfacenti o definitive, che è quella della protezione dei beni dai rapinatori. In questo ultimo periodo, dove si assiste ad un progressivo ma repentino calo degli affari dovuto ad una congiuntura economica mondiale sfavorevole, il problema è più avvertito da chi, in vari settori, vede un sempre più basso margine di compensazione ai furti.

Sviluppo di sistemi per l'analisi della combustione in tempo reale per motori endotermici alternativi

I moderni motori a combustione interna diventano sempre più complessi L'introduzione della normativa antinquinamento EURO VI richiederà una significativa riduzione degli inquinanti allo scarico. La maggiore criticità è rappresentata dalla riduzione degli NOx per i motori Diesel da aggiungersi a quelle già in vigore con le precedenti normative. Tipicamente la messa a punto di una nuova motorizzazione prevede una serie di test specifici al banco prova. Il numero sempre maggiore di parametri di controllo della combustione, sorti come conseguenza della maggior complessità meccanica del motore stesso, causa un aumento esponenziale delle prove da eseguire per caratterizzare l'intero sistema. L'obiettivo di questo progetto di dottorato è quello di realizzare un sistema di analisi della combustione in tempo reale in cui siano implementati diversi algoritmi non ancora presenti nelle centraline moderne. Tutto questo facendo particolare attenzione alla scelta dell'hardware su cui implementare gli algoritmi di analisi. Creando una piattaforma di Rapid Control Prototyping (RCP) che sfrutti la maggior parte dei sensori presenti in vettura di serie; che sia in grado di abbreviare i tempi e i costi della sperimentazione sui motopropulsori, riducendo la necessità di effettuare analisi a posteriori, su dati precedentemente acquisiti, a fronte di una maggior quantità di calcoli effettuati in tempo reale. La soluzione proposta garantisce l'aggiornabilità, la possibilità di mantenere al massimo livello tecnologico la piattaforma di calcolo, allontanandone l'obsolescenza e i costi di sostituzione. Questa proprietà si traduce nella necessità di mantenere la compatibilità tra hardware e software di generazioni differenti, rendendo possibile la sostituzione di quei componenti che limitano le prestazioni senza riprogettare il software.

La qualità del binario nelle linee AV/AC: studio dei dati rilevati dai treni diagnostici di RFI e analisi degli interventi manutentivi in previsione dell'aumento di velocità a 360 km/h.

Dal punto di vista geometrico, il tracciato delle linee AV/AC è determinato in funzione delle velocità di progetto, attualmente variabili tra 250 e 300 km/h, e in modo da limitare i parametri cinematici. In questa maniera è assicurata la corretta qualità di marcia dei treni ad alta velocità. La sovrastruttura ferroviaria è realizzata in modo da sopportare i carichi dinamici trasmessi dai convogli transitanti a elevate velocità, e da garantire la sicurezza della circolazione e il comfort di marcia. In particolare, la qualità del binario ferroviario è determinata attraverso una serie di parametri geometrici fondamentali, definiti da Rete Ferroviaria Italiana. A seconda dei valori assunti da tali parametri, il binario rientra in un livello di qualità geometrica: sono definiti tre livelli per i quali la circolazione ferroviaria avviene senza limitazioni e un livello che richiede l’imposizione di vincoli all’esercizio (rallentamenti o interruzioni). L’introduzione dei parametri geometrici e dei rispettivi valori di riferimento ha lo scopo di mantenere elevati livelli qualitativi e di sicurezza per l’infrastruttura ferroviaria, in materia di geometria dell’armamento. Infatti, il superamento di certe soglie da parte dei parametri, implica l’intervento manutentivo sul binario, al fine di ripristinare la corretta geometria e di garantire così la qualità della marcia dei treni. La politica è quella d’intervento prima del raggiungimento del quarto livello di qualità, per il quale sono necessarie restrizioni alla circolazione e interventi correttivi immediati.