Efeito da superalimentação neonatal sobre a função adrenal e o desenvolvimento da microesteatose hepática em ratos adultos

O estado nutricional e hormonal em fases iniciais de desenvolvimento (gestação e lactação) está relacionado a alterações epigenéticas, que podem levar ao desenvolvimento de doenças. A obesidade infantil está relacionada com a ocorrência da obesidade na idade adulta, resistência à insulina e maior risco cardiometabólico. Em estudos experimentais, a superalimentação neonatal causa obesidade e aumenta o risco de doenças cardiovasculares. Estes animais apresentam obesidade visceral, hiperfagia, hiperleptinemia e hipertensão na idade adulta. Previamente, demonstramos que a hiperleptinemia neonatal causa hiperfunção da medula adrenal e microesteatose na idade adulta. No presente estudo avaliamos a função adrenal de ratos adultos obesos no modelo de superalimentação neonatal por redução do tamanho da ninhada e a sensibilidade as catecolaminas no tecido adiposo visceral (TAV) e no fígado. Ao nascimento todas as ninhadas tiveram seu número de filhotes ajustados para 10. Para induzir a superalimentação neonatal, o tamanho da ninhada foi reduzido de dez para três filhotes machos no terceiro dia de lactação até o desmame (SA), enquanto que o grupo controle permaneceu com 10 filhotes durante toda a lactação. Após o desmame, os ratos tiveram livre acesso à dieta padrão e água até 180 dias (1 animal de cada ninhada, n = 7). O TAV e as glândulas adrenais foram pesadas. As contrações hormonais séricas, o conteúdo hepático de glicogênio e triglicerídeos foram avaliados por kits comerciais. O conteúdo e a secreção de catecolaminas adrenais foram avaliados utilizando o método do trihidroxindol. O conteúdo dos hormônios eixo hipotálamo-hipófise-córtex adrenal, das enzimas da via de síntese das catecolaminas na glândula adrenal, ADRB2 no fígado e ADRB3 no TAV foram determinados por Western blotting ou imunohistoquímica. As diferenças foram consideradas significativas quando p <0,05. Aos 180 dias de vida, o grupo SA apresentou maior massa corporal (+15%), maior consumo alimentar (+15%) e maior adiposidade visceral (+79%). Os hormônios do eixo hipotálamo-hipófise-córtex-adrenal não foram alterados. O grupo SA apresentou maior expressão de tirosina hidroxilase e de DOPA descarboxilase (+31% e 90%, respectivamente); conteúdo de catecolaminas adrenais (absoluta: 35% e relativa: 40%), e secreção de catecolaminas, tanto basal quanto estimulada por cafeína (+35% e 43%, respectivamente). O conteúdo ADRB3 no TAV não foi alterado nos grupo SA, entretanto o ADRB2 no fígado apresentou-se menor (-45%). O grupo SA apresentou maior conteúdo de glicogênio e triglicerídeos no fígado (+79% e +49%, respectivamente), além de microesteatose. A superalimentação neonatal resulta em hiperativação adrenomedular e aparentemente está associada a preservação da sensibilidade às catecolaminas no VAT. Adicionalmente sugerimos que o maior conteúdo de glicogênio e triglicerídeos hepático seja devido a menor sensibilidade as catecolaminas. Tal perfil pode contribuir para a disfunção metabólica hepática e hipertensão arterial que são características deste modelo de obesidade programada.

Avaliação dos testículos de ratos submetidos à torção testicular antes, durante e após a puberdade e o efeito do tratamento com resveratrol

A torção testicular (TT) é uma afecção de relativa frequência, alvo de muitos estudos clínicos e experimentais ao longo dos anos. Pode acometer qualquer idade, no entanto é mais incidente em pacientes com menos de 21 anos de idade. Sua distribuição ocorre em dois picos: um no período neonatal e outro ao redor dos 13 anos de idade. A taxa dessa morbidade em jovens com menos de 25 anos é na ordem de 1/4000. A TT resulta em rotação do cordão espermático, que gera um comprometimento do suprimento sanguíneo testicular, considerada uma urgência urológica. Depois da TT, a artéria testicular e o plexo pampiniforme sofrem oclusão, interrompem o suprimento arterial e a drenagem venosa do testículo, diminuindo o aporte de nutrientes e oxigênio aos tecidos e células, levando à isquemia testicular. Esta condição afeta a produção de espermatozóides do testículo torcido podendo comprometer a fertilidade do indivíduo. Este presente estudo avaliou a função reprodutiva, alguns parâmetros espermáticos e morfologia dos testículos de ratos adultos submetidos à torção testicular antes, durante e após a puberdade, e também o efeito do tratamento com resveratrol. Os testículos direitos dos ratos foram torcidos a 720 por quatro horas em todos os grupos, exceto no grupo controle. A TT foi realizada durante os períodos pré-púbere (4 semanas de idade), púbere (6 semanas de idade) e adulto jovem (9 semanas de idade). Para cada grupo, houve um outro grupo que os animais foram submetidos ao mesmo procedimento e foram tratados com resveratrol, 30 mg/kg resveratrol foi injetado por via intraperitonel, 30 minutos antes da destorção, seguido por gavage por 7 dias. Cada rato na idade adulta acasalou com três fêmeas adultas com 12 semanas de idade para avaliar parâmetros de fertilidade. Todos os animais foram mortos com 14 semanas de idade e os testículos foram removidos para análise de concentração, motilidade e viabilidade dos espermatozóides de amostras colhidas da cauda dos epidídimos. Os parâmetros morfológicos foram avaliados por métodos estereológicos macro e microscópicos. A função reprodutiva dos animais nas diferentes idades não foi afetada pela TT, no entanto, após o tratamento os ratos operados com 4 e 6 semanas de idades tiveram maior potência e os ratos operados com 9 semanas de idade apresentaram maior taxa de fecundidade na idade adulta.. Os parâmetros morfológicos foram afetados em todos os testículos torcidos em todas as idades. Alguns desses parâmetros melhoram após o tratamento com resveratrol, e o efeito adjuvante foi maior nos ratos submetidos à TT com 4 semanas de idade. Entretanto, o resveratrol recuperou o epitélio seminífero no grupo que sofreu TT com 9 semanas de idade, os quais não apresentaram nenhum epitélio após a TT. Os parâmetros espermáticos dos testículos torcidos decresceram em todas as idades, e o resveratrol não foi efetivo, embora tenha recuperado a produção de espermatozóides no grupo que foi submetido à TT com 9 semanas de idade, em que todos os animais foram aspermatogênicos após a TTNão houve nenhum dano nos testículos contralaterais. O resveratrol promoveu efeito protetor para TT, principalmente quando os animais foram submetidos à TT em idade prépúbere.

Efeito do pré-condicionamento isquêmico remoto em modelo de lesão hepática por isquemia-reperfusão em ratos

A lesão por isquemia-reperfusão (I/R) é o mecanismo fisiopatológico central no desenvolvimento da insuficiência hepática pós-operatória. Diversas estratégias para minimizar suas consequências estão sendo desenvolvidas, mas ainda sem resultados satisfatórios. Recentemente o pré-condicionamento isquêmico remoto (PCIR), método em que ciclos breves de I/R aplicados em um órgão ou membro é capaz de atenuar os resultados da I/R em um órgão distante, vem sendo utilizado, em modelos experimentais, com resultados promissores. No entanto seu mecanismo de ação ainda não foi esclarecido. Um dos mecanismos propostos é a modulação na expressão das citocinas sintetizadas durante a resposta inflamatória que acompanha o processo de I/R. Foram utilizados 36 ratos (Rattus norvegicus), machos, com peso entre 250 e 280 g, divididos em três grupos: Grupo Sham, cirurgia simulada; Grupo IR, isquemia de 70% do fígado por 45 minutos e reperfusão; e Grupo PCIR, pré-condicionamento isquêmico remoto do fígado através de seis ciclos de isquemia-reperfusão da pata do animal, com quatro minutos de isquemia e quatro minutos de reperfusão em cada ciclo, seguido de isquemia hepática semelhante ao do Grupo IR. Terminado os procedimentos cirúrgicos, metade dos animais foi morta decorridos 60 minutos de reperfusão, e a outra metade após 180 minutos. Foi coletado tecido hepático do lobo submetido à isquemia, para estudo histopatológico, utilizando o índice de injúria hepática modificado; e sangue, para dosagem plasmática de TNF-α, IL-6, IL-10 e ALT. A análise histopatológica mostrou que a necrose celular foi significativamente reduzida no Grupo PCIR quando comparado com Grupo IR (p <0,0001). As transaminases mostraram o mesmo padrão com redução significativa dos seus valores no Grupo PCIR quando comparados com o Grupo I-R (p <0,0001). A dosagem das interleucinas mostrou redução significativa na expressão da IL-6 no Grupo PCIR quando comparado com o Grupo IR (p<0,001). Houve aumento da expressão de IL-10 nos grupo PCIR, porém não atingiu significância estatística. Não foi identificada diferença na dosagem de TNF-α nos grupos estudados. O PCI-R foi eficaz na redução na necrose celular resultante da lesão por I-R nos grupos estudados. A redução na síntese de IL-6 segue o padrão observado em outros estudos.

Curso temporal dos efeitos da exposição à nicotina durante a lactação no sistema colinérgico cerebral de ratos

A Organização Mundial da Saúde estima que existam aproximadamente 250 milhões de mulheres tabagistas no mundo. Em países em desenvolvimento, a prevalência do tabagismo pode variar de 11 a 35% em mulheres grávidas, constituindo um problema de saúde pública. Nicotina, um agonista colinérgico considerado o mais importante componente ativo da fumaça do cigarro, é capaz de causar déficits em um cérebro em desenvolvimento, no entanto, muitos estudos investigam estes efeitos durante a gestação de roedores, que corresponde aos dois primeiros trimestres de gestação em humanos. O presente estudo, foi focado nos efeitos da nicotina sobre o sistema colinérgico cerebral durante o equivalente ao terceiro trimestre de gestação em humanos. Ratas lactantes foram expostas a nicotina (NIC, 6 mg/Kg/dia) ou a salina (SAL) via mini-bombas osmóticas (s.c.) a partir do 2 dia ate o 16 dia pós-natal (PN). Filhotes NIC e SAL foram sacrificados durante a exposição, em PN15, e após a retirada em três momentos diferentes, PN21, PN30 e em PN90. Quatro biomarcadores foram considerados. Para avaliação dos efeitos sobre os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs), nós utilizamos [3H]citisina, que é um ligante seletivo para α4β2. Nos também medimos o marcador [3H]hemicholinium-3 (CH-3) de alta afinidade para o transportador pré-sináptico de colina, e a atividade das enzimas colina acetiltransferase (ChAT) e acetilcolinesterase (AChE) no córtex cerebral (CX), mesencéfalo (MB) e hipocampo (HP) na prole. O grupo NIC apresentou supra-regulação de nAChRs em todas as regiões durante a exposição, este efeito foi revertido pouco tempo após a retirada. Interessantemente, uma significante infra-regulação de nAChRs foi observada após um longo tempo da retirada somente em CX. A exposição à nicotina reduziu a marcação para HC-3 durante a exposição em todas as regiões e foi revertida em PN21. Já em PN30, o grupo NIC apresentou uma diminuição do HC-3. Em contraste, em PN90, foi observado um aumento de HC-3. Não foram observados efeitos para atividade da ChAT e da AChE em CX. No que diz respeito ao MB, o grupo NIC apresentou um aumento de atividade para ambas as enzimas, ChAT e AChE, em PN30. Para a mesma idade, nos observamos um decréscimo desta atividade somente em HP. E, após um longo tempo de retirada, somente HP apresentou um aumento na atividade da ChAT. Estes dados sugerem que a exposição à nicotina em ratos durante o equivalente ao terceiro trimestre de gestação em humanos promove alterações no sistema colinérgico dos filhotes. Somado a isto, nossos resultados indicam que os efeitos prejudiciais são observáveis mesmo muito tempo após a exposição ter sido interrompida.

Avaliação estereológica glomerular em rins de ratos após isquemia-reperfusão por clampeamento arteriovenoso e arterial

A técnica de isquemia-reperfusão tem sido utilizada em cirurgias conservadoras do rim como a nefrectomia parcial e em transplantes renais. Para se realizar a isquemia pode-se fazer o bloqueio do fluxo sanguíneo da artéria renal ou o bloqueio simultâneo da artéria e da veia renal. O evento isquêmico acarreta em dano celular ao rim principalmente pelo estresse oxidativo local e a liberação de radicais livres assim como o aumento da resposta inflamatória. Diversos autores verificaram lesão renal após a isquemia-reperfusão, porém, apenas testes funcionais foram realizados até o momento. Os autores que tentaram avaliar a lesão morfológica do rim apenas fizeram a quantificação de escores subjetivos. O nosso objetivo é avaliar por quantificação estereológica o dano causado pela isquemia-reperfusão comparando o clampeamento somente arterial com o clampeamento arteriovenoso. Utilizamos 24 ratos wistar, machos, de quatro meses de idade. Os animais foram divididos em três grupos: o grupo Sham (n=8), o grupo de clampeamento somente da artéria renal (n=8) e o grupo de clampeamento simultâneo da artéria e da veia renal (n=8). Os animais foram submetidos a laparotomia mediana. Os animais do grupo Sham permaneceram os 60 minutos anestesiados mas sem obstrução do fluxo sanguíneo de seus vasos renais. Os animais do grupo de clampeamento arterial foram submetidos à clampeamento de sua arterial renal esquerda por 60 minutos e os animais do grupo de clampeamento arterial e venoso tiveram seus vasos renais esquerdos clampeados simultaneamente e em bloco pelo mesmo tempo. Após os 60 minutos os animais foram suturados e mantidos por 30 dias em caixas próprias sendo mortos por sobredose anestésica após decorrido esse tempo. Os rins foram coletados e mantidos em solução de formalina tamponada e posteriormente processados para análise histológica e estereológica. Foram analisados a densidade volumétrica (Vv) dos glomérulos, o número de glomérulos/mm3(Nv) e o volume glomerular médio (VGM). A Vv e Nv se encontrou reduzida nos rins esquerdos submetidos à isquemia mas foi somente significativa nos animais do grupo de clampeamento arterial e venoso. Mesmo usando o rato como modelo animal experimental, a partir de nossos resultados recomendamos o uso do clampeamento somente arterial nos casos em que mínina lesão ao rim é imperiosa.

Caracterización del daño morfológico en el área ca1 del hipocampo y deterioro funcional secundario a isquemia cerebral global en ratas envejecidas.

Tesis (Doctor en Medicina) UANL, 2014.

Efeito in vitro dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre as atividades enzimáticas dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial e da creatina quinase em córtex cerebral, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos jovens

A deficiência de desidrogenase das acil-CoA de cadeia curta (SCAD) é um erro inato do metabolismo devido a um defeito no último ciclo de β-oxidação, sendo específica para ácidos graxos de cadeia curta (4 a 6 carbonos), resultando no acúmulo de ácidos orgânicos de cadeia curta, principalmente dos ácidos etilmalônico e metilsucínico, formados pela metabolização por rotas secundárias do butiril-CoA acumulado. A deficiência de SCAD manifesta-se principalmente no período neonatal ou durante a infância e até mesmo na idade adulta. Os achados clínico-laboratoriais são heterogêneos, incluindo acidose metabólica, acidose lática, vômitos, atraso no desenvolvimento, convulsões, fraqueza muscular e miopatia crônica. No entanto, o sintoma mais comum apresentado pelos pacientes portadores dessa deficiência é a disfunção neurológica, a qual pode estar relacionada ao acúmulo de ácidos orgânicos de cadeia curta e sua toxicidade ao sistema nervoso central. No presente trabalho nosso objetivo foi investigar o efeito in vitro dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre algumas atividades enzimáticas fundamentais para o metabolismo energético. Visando contribuir para uma melhor compreensão da fisiopatogenia dessa doença testamos o efeito desses metabólitos sobre a atividade dos complexos da cadeia respiratória e da creatina quinase em córtex cerebral, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos jovens. Verificamos que os ácidos etilmalônico e metilsucínico, na concentração de 1 mM, inibiram significativamente a atividade do complexo I+III da cadeia respiratória em córtex cerebral de ratos, porém não alteraram a atividade dos demais complexos da cadeia respiratória (II, SDH, II+III, III e IV) nesses tecido bem como não alteraram a atividade de todos os complexos da cadeia repiratória em músculo esquelético e músculo cardíaco dos ratos nas concentrações de 1 e 5 mM. Observamos também que o ácido etilmalônico (1 e 2,5 mM) reduziu de forma significativa a atividade total de creatina quinase em córtex cerebral de ratos, mas não alterou essa atividade nos músculos esquelético e cardíaco. Por outro lado o ácido metilsucínico não modificou a atividade total da creatina quinase em nenhum dos três tecidos estudados, córtex cerebral, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos. Testamos então o efeito do ácido etilmalônico sobre a atividade da creatina quinase nas frações mitocondrial e citosólica de córtex cerebral, músculo cardíaco e músculo esquelético de ratos. O ácido (1 e 2,5 mM) inibiu significativamente a atividade da creatina quinase apenas na fração mitocondrial de córtex cerebral. Demostramos também que o antioxidante glutationa (1 mM) preveniu o efeito inibitório do ácido etilmalônico sobre a atividade total da creatina quinase em córtex cerebral. A glutationa (0,5 mM) e o ácido ascórbico (0,5 mM) também preveniram o efeito inibitório do ácido etilmalônico sobre a atividade da creatina quinase na fração mitocondrial de córtex cerebral. Por outro lado a adição de L-NAME ou trolox não alterou o efeito inibitório do ácido etilmalônico sobre a atividade da creatina quinase. Esses resultados indicam que o ácido etilmalônico possui um efeito inibitório específico sobre a isoforma mitocondrial da creatina quinase do cérebro, ou seja, sobre a CKmi a, não afetando a isoenzima citosólica cerebral ou as isoenzimas citosólicas e mitocondrial presentes no músculo esquelético e no músculo cardíaco. Além disso, o efeito da glutationa, que atua como um agente redutor de grupos tióis, indica que a ação inibitória do ácido etilmalônico sobre a creatina quinase pode estar relaciona à oxidação de grupos sulfidrila essenciais à atividade da enzima. Já a prevenção do efeito inibitório do ácido etilmalônico causada pelo ácido ascórbico sugere que o ácido pode estar envolvido com a formação dos radicais superóxido e hidroxila, uma vez que este agente antioxidante atua sobre esses radicais livres. Essas observações em seu conjunto indicam que os ácidos etilmalônico e metilsucínico comprometem o metabolismo energético cerebral através da inibição de atividades enzimáticas essenciais para a produção e transporte de energia pela célula. É, portanto, possível que esse possa ser um dos mecanismos envolvidos com o dano cerebral que ocorre nos pacientes afetados por deficiência de SCAD.

Efeito da fenilalanina sobre a atividade da creatina quinase em córtex cerebral, cerebelo e cérebro médio de ratos

A fenilcetonúria (PKU) é um erro inato do metabolismo de aminoácidos causada pela deficiência da enzima fenilalanina hidroxilase hepática (PAH) que converte fenilalanina (Phe) em tirosina. Caracteriza-se clinicamente por retardo mental severo e, em alguns pacientes, por convulsões e eczema cutâneo. Bioquimicamente os pacientes afetados por esta doença apresentam acúmulo de Phe e seus metabólitos no sangue e nos tecidos. Phe é considerada o principal agente neurotóxico nesta doença, cujos mecanismos de neurotoxicidade são pouco conhecidos. O metabolismo energético cerebral é caracterizado por níveis altos e variáveis de síntese e de utilização de ATP. O cérebro contém altos níveis de creatinaquinase (CK), uma enzima que transferere reversivelmente um grupo fosforil entre ATP e creatina e entre ADP e fosfocreatina (PCr). Considerando que a CK parece estar envolvida em certas condições patológicas relacionadas com deficiência de energia cerebral e sabendo que a PKU está associada à redução de produção e de utilização de energia pelo cérebro, no presente trabalho verificamos a atividade da CK em homogeneizado total de córtex cerebral, cerebelo e cérebro médio de ratos Wistar submetidos aos modelos experimentais agudo e crônico de hiperfenilalaninemia (HPA) quimicamente induzida. Também investigamos o efeito in vitro da Phe e da α-metil-DL-fenilalanina (MePhe), um inibidor da PAH, nas mesmas estruturas de ratos Wistar de 22 dias de idade não tratados. Nossos resultados mostraram uma redução significativa na atividade da CK nas estruturas cerebrais estudadas de ratos sujeitos a HPA. Também verificamos que Phe e MePhe inibiram in vitro a atividade da CK nas mesmas estruturas. O estudo da interação cinética entre Phe e MePhe, sugere a existência de um único sítio de ligação na CK para os dois compostos. Considerando a importância da CK para a manutenção do metabolismo energético cerebral, nossos resultados sugerem que a alteração da homeostasia energética pode contribuir para a neurotoxicidade da Phe na PKU.

Efeito dos ácidos D-2-hidroxiglutárico e L-2-hidroxiglutárico sobre vários parâmetros do metabolismo energético em cérebro, músculo esquelético e músculo cardíaco de ratos

As acidúrias L-2-hidroxiglutárica (LHGA) e D-2-hidroxiglutárica (DHGA) são distúrbios neurometabólicos hereditários caracterizados por extenso e severo dano cerebral, ocasionando predominantemente convulsões, coma e atrofia cerebral. Na LHGA, as lesões cerebrais ocorrem principalmente no cerebelo enquanto a maior parte do cérebro é afetada na DHGA. Além disso, hipotonia, fraqueza e hipotrofia muscular, bem como cardiomiopatia têm sido observadas nos pacientes afetados por essas acidemias orgânicas, com maior freqüência na DHGA. Bioquimicamente, ocorre acúmulo tecidual dos ácidos L- 2-hidroxiglutárico (LGA) e D-2-hidróxiglutárico (DGA), respectivamente, na LHGA e na DHGA. Além disso, elevadas concentrações urinárias de lactato, 2-cetoglutarato e outros metabólitos do ciclo de Krebs têm sido descritas em pacientes acometidos por essas patologias, sugerindo uma disfunção mitocondrial. mitocondrial. Tendo em vista que a etiopatogenia da disfunção tecidual nesses pacientes é desconhecida, o presente trabalho investigou o efeito in vitro dos ácidos LGA e DGA sobre diversos parâmetros do metabolismo energético celular. Inicialmente, avaliamos o efeito dos ácidos DGA e LGA sobre a utilização de glicose e produção de CO2 em homogeneizados e fatias de córtex cerebral. Verificamos que o DGA reduziu significativamente tanto o consumo de glicose quanto a produção de CO2 pelo córtex cerebral, enquanto o LGA não demonstrou efeito sobre esses parâmetros. Além disso, o DGA inibiu significativamente a atividade da citocromo c oxidase em homogeneizado de córtex cerebral de ratos (35-95%), de forma dose-dependente, sem alterar a atividade dos demais complexos da cadeia respiratória. A inibição verificada foi do tipo acompetitiva. Por outro lado, o LGA não alterou a atividade de nenhum dos complexos enzimático estudados. Posteriormente, avaliamos o efeito in vitro dos ácidos DGA e LGA sobre a atividade da creatina quinase (CK) em homogeneizado total e nas frações citosólica e mitocondrial de tecido cerebral, muscular esquelético e cardíaco de ratos. Os resultados mostraram que o DGA inibiu significativamente a atividade das isoformas mitocondrial e citosólica da CK em preparações de córtex cerebral, músculo esquelético de cardíaco. Por outro lado, tanto DGA quanto LGA inibiram seletivamente a isoforma mitocondrial em preparações de cerebelo. Estudos cinéticos mostraram um perfil não competitivo de inibição com relação à fosfocreatina para ambos os ácidos nos tecidos estudados. Além IV disso, observamos também que o efeito inibitório de ambos os ácidos foi totalmente revertido por glutationa reduzida, sugerindo uma modificação causada pelos metabólitos sobre os grupos sulfidrila, essenciais para a atividade da enzima. Nossos resultados sugerem que a inibição significativa causada pelo DGA sobre as atividades da citocromo c oxidase e da creatina quinase no córtex cerebral, assim como nos músculos cardíaco e esquelético poderiam explicar, ao menos em parte, a fisiopatogenia da disfunção neurológica e anormalidades estruturais no sistema nervoso central, bem como a mitocondriopatia esquelética e a cardiomiopatia presente nos pacientes afetados por DHGA. Por outro lado, é possível que a inibição seletiva da creatina quinase mitocondrial provocada pelo LGA em cerebelo possa estar associada à degeneração cerebelar característica dos pacientes com LHGA.

Avaliação do envolvimento da via do óxido nítrico na isquemia e reperfusão normotérmica renal : estudo experimental em ratos

Resumo não disponível.

Estresse neonatal, expressão do medo e sistema dopaminérgico em ratos

A estimulação neonatal tem sido utilizada como modelo experimental para examinar os mecanismos pelos quais variações precoces do ambiente do animal afetam o desenvolvimento de sistemas neurais, dando origem a alterações comportamentais e neuroendócrinas duradouras. Buscou-se estudar os efeitos do estresse neonatal sobre duas abordagens: comportamental e imunoistoquímica. Na primeira, foram avaliados em ratos adultos (90-110 dias) dois paradigmas de medo: inato (campo aberto, N=48) e aprendido, (condicionamento clássico N=48); enquanto na segunda abordagem realizou-se a técnica imunoistoquímica (N=15) na substância nigra compacta (SNCo) e área tegmental ventral (VTA) para detecção da enzima precursora da dopamina, a tirosina hidroxilase (TH). Foram utilizados ratos da variedade Wistar, que do 1º ao 10º dia de vida foram submetidos a 3 tipos de intervenção: manipulação (retirados do ninho por 3min sendo tocados gentilmente por 1 min); separação (retirados do ninho por 3h, e mantidos a temperatura de 33ºC); e grupo controle (sem intervenções do experimentador ou do tratador). O condicionamento clássico (treino) foi constituído por 10 pareamentos de 1 estímulo incondicionado (EI, choque elétrico –0,8mA) com 2 estímulos condicionados ou neutros (EC, som e luz) em 2 sessões de 5 pareamentos cada. A duração de cada emissão do EC foi de 5s sendo no último segundo associada ao EI. O teste foi realizado 24h após o treino, e consistiu de emissões de EC com mesma duração e intervalo por um período total de 30 min. No experimento 2, foi utilizado um campo aberto de 1m2 no qual os ratos permaneceram por 5 min. Em ambos experimentos os comportamentos eram registrados em vídeo e analisados através do programa Noldus. Os resultados (X±EPM) foram analisados por uma ANOVA, post-hoc Newman Keuls ou Kruskal Wallis post-hoc Dunn (p<0,05). Nos experimentos comportamentais foram observados os seguintes resultados: no medo aprendido houve diminuição da duração (s) do comportamento de imobilização (491±54); da duração de rearing (58±13) e da latência para extinção do condicionamento do grupo manipulado (591±434) comparado ao controle (718±73; 22±6; 1020±843 respectivamente) e no campo aberto houve aumento da duração e freqüência da locomoção e rearing (97.6±8; 4.3±1 e 64.3±5; 31±2), diminuição da duração de autolimpeza (4.2±1) e aumento da freqüência de entradas no centro do campo aberto (4.3±0,8) no grupo manipulado comparado ao controle (69±7; 30±3 e 48±6; 21.5±2; 19±5; 2.2±0.6, respectivamente). Na análise Imunoistoquímica não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos quanto imunomarcação de TH nas áreas estudadas. Foi confirmada a diminuição da inibição comportamental no campo aberto como conseqüência da manipulação. A manipulação neonatal também reduziu as respostas do medo condicionado, ratos manipulados no período neonatal expressam, quando adultos, menor expressão de medo aprendido e tem a extinção da aprendizagem aversiva mais acelerada. Curiosamente não foram observados efeitos da separação materna sobre as repostas de medo inato ou aprendido. Embora a dopamina do sistema mesocorticolímbico module as respostas comportamentais alteradas, nenhum dos modelos de intervenção estudados afetaram a intensidade de marcação deste neurotransmissor.

Utilização de nutrientes energéticos por córtex cerebral de ratos : efeitos de diferentes concentrações de potássio

Glicose é o principal substrato energético no SNC de mamíferos adultos, contudo o cérebro também é capaz de utilizar outros substratos, incluindo manose, frutose, galactose, glicerol, corpos cetônicos e lactato. Glicose é quase totalmente oxidada a CO2 e H2O, mas ela também é precursora de neurotransmissores, tais como glutamato, GABA e glicina. O metabolismo energético do SNC varia ontogeneticamente, visto o fato de que nas primeiras 2 horas após o nascimento, lactato é o seu principal substrato, glicose e corpos cetônicos servem como substratos nos 21 dias subseqüentes e, após este período, somente glicose predomina. A utilização de nutrientes é regulada de várias maneiras, tais como o transporte através das células endoteliais capilares, transporte através da membrana plasmática, variações na atividade enzimática e variações nas concentrações de nutrientes plasmáticos. Está bem estabelecido que a atividade funcional do SNC aumenta o metabolismo energético. Tal evento pode ser dependente da atividade da bomba Na+,K+-ATPase, a qual é requerida para restabelecer a homeostase iônica. O aumento da concentração de potássio extracelular de um nível basal 8-12 mM provoca excitação neuronal fisiológica. A concentração de potássio pode atingir 50-80 mM durante convulsões, isquemia ou hipoglicemia. O potássio liberado pela atividade elétrica é captado nos astrócitos através de processos dependentes e não dependentes de ATP. Neste estudo, observamos o efeito de diferentes concentrações de potássio extracelular (2.7, 20 e 50 mM), sobre a oxidação de glicose, frutose, manose e lactato a CO2 e a conversão a lipídios em córtex cerebral de ratos jovens (10dias) e adultos (60 dias). Considerando que a captação de deoxiglicose está relacionada com a atividade glicolítica, testamos a influência do potássio extracelular sobre este parâmetro. Os efeitos da ouabaína sobre a oxidação de glicose e captação de deoxiglicose foram testados para determinar se a influência de potássio extracelular era dependente da atividade da bomba Na+,K+-ATPase. Os efeitos da monensina (ionóforo de Na+) e bumetanide (inibidor do transportador de Na+/K+/2Cl-) foram também testados. O aumento da concentração de potássio extracelular aumentou a oxidação de glicose, frutose, e manose a CO2 em córtex cerebral de ratos adultos, contudo, este fenômeno não foi observado em ratos jovens. A oxidação de lactato aumentou com o aumento da concentração de potássio extracelular em ambos ratos jovens e adultos. Não houve diferença na oxidação de glicose e sobre a captação de deoxiglicose na presença de ouabaína. Monensina aumentou a captação de deoxiglicose em 2 minutos de incubação. Contudo, esta captação diminuiu em períodos de incubação de 1 hora e 10 minutos. Além disso, não houve efeito do bumetanide sobre o aumento causado pela alta concentração de potássio extracelular na oxidação de glicose.

Expressão da imunorreatividade à tirosina hidroxilase no hipotálamo de ratos machos adultos submetidos à manipulação neonatal

A estimulação neonatal tem sido utilizada como modelo experimental para examinar os mecanismos pelos quais variações precoces do ambiente do animal afetam o desenvolvimento de sistemas neurais, dando origem a alterações comportamentais e endócrinas estáveis. A estimulação neonatal consiste na manipulação dos animais por alguns minutos diariamente durante os primeiros dias de vida. Esse procedimento provoca, na vida adulta, uma série de alterações comportamentais e endócrinas que se caracterizam pela diminuição do medo a ambientes novos e uma resposta menos acentuada da secreção de glicocorticóides pela supra-renal quando os animais são expostos a estímulos estressantes. A dopamina é um neurotransmissor que atua no sistema nervoso central, onde está envolvida na integração de vários aspectos da função neuroendócrina, como, por exemplo, um regulador na secreção de prolactina e do hormônio liberador de corticotrofina. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel da manipulação neonatal sobre o sistema dopaminérgico através da quantificação de neurônios contendo tirosina hidroxilase, a enzima inicial e limitante da síntese de catacolaminas, em núcleos hipotalâmicos. Ratos machos Wistar foram divididos em dois grupos. Um grupo foi submetido à manipulação por um minuto, uma vez por dia, durante os dez primeiros dias de vida (grupo manipulado) e outro grupo não sofreu manipulação (grupo não-manipulado, controle). Aos 75-80 dias, os animais foram anestesiados, perfundidos e os cérebros processados para a detecção imunohistoquímica da tirosina hidroxilase. Foi utilizado um anticorpo monoclonal contra tirosina hidroxilase e o método indireto avidina-biotina-peroxidase. A quantificação da expressão da tirosina hidroxilase consistiu na contagem dos neurônios imunorreativos à tirosina hidroxilase nos núcleos arqueado, paraventricular e periventricular do hipotálamo em cada indivíduo. A média ± EPM do número de neurônios positivos para tirosina hidroxilase de todos os indivíduos foi comparada entre os grupos manipulado e não-manipulado através do teste t de Student. Não houve diferença significativa no número de neurônios imunorreativos à tirosina hidroxilase nos núcleos arqueado, paraventricular e periventricular do hipotálamo de ratos machos adultos entre os animais do grupo manipulado e controle não-manipulado. O estudo mostrou que a manipulação neonatal não se constituiu num estímulo suficiente para promover alterações no número de neurônios imunorreativos à tirosina hidroxilase nos núcleos arqueado, paraventricular e periventricular do hipotálamo de ratos machos adultos.

Efeito in vitro de quinureninas sobre parâmetros bioquímicos do metabolismo enrgético em cérebro de ratos jovens

A via das quinureninas é a principal rota de degradação do aminoácido triptofano. Os metabólitos dessa via, comumente chamados de quinureninas, estão envolvidos em vários processos fisiológicos e patológicos e, recentemente, algumas quinureninas foram relacionadas à fisiopatologia de várias doenças neurodegenerativas. Tendo em vista o pouco conhecimento a respeito do efeito das quinureninas sobre o metabolismo energético cerebral, e considerando que as concentrações de algumas quinureninas estão alteradas em várias doenças neurodegenerativas e que disfunção mitocondrial é uma importante característica dessas doenças, este trabalho teve por objetivo investigar os efeitos in vitro de alguns metabólitos da via das quinureninas, particularmente L-quinurenina, ácido quinurênico, 3-hidroxiquinurenina, ácido 3-hidroxi-antranílico, ácido antranílico e ácido quinolínico sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Verificamos que todas as quinureninas testadas, à exceção da L-quinurenina, aumentaram a captação de glicose e inibiram a produção de CO2 a partir de glicose, acetato e citrato em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida. Além disso, o ácido quinurênico inibiu a atividade da enzima sucinato desidrogenase, a 3-hidroxiquinurenina inibiu a atividade dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória, enquanto que o ácido 3-hidroxi-antranílico inibiu as atividades dos complexos I e II da cadeia respiratória e da enzima sucinato desidrogenase. Já o ácido antranílico inibiu as atividades do complexo I-III da cadeia respiratória e da enzima sucinato desidrogenase. Por outro lado, o ácido quinolínico inibiu apenas a atividade do complexo II, sem alterar as atividades dos outros complexos da cadeia transportadora de elétrons. Finalmente, observamos que nenhuma das substâncias testadas interferiu na atividade da enzima Na+,K+-ATPase. Esses resultados sugerem um bloqueio no ciclo do ácido cítrico, o qual poderia ser provocado pela inibição da cadeia respiratória ocasionada pelos metabólitos testados. Portanto nossos resultados sugerem que o metabolismo energético cerebral é inibido in vitro por algumas quinureninas. Caso esses achados se confirmem in vivo, é possível que um prejuízo no metabolismo energético possa colaborar, ao menos em parte, para o comprometimento cerebral dos pacientes afetados por doenças em que há alteração nas concentrações desses compostos.