Características bioativas, funcionais e efeito protetor do resíduo desidratado de camu-camu (Myrciaria dubia H.B.K. (McVaugh)) sobre doenças degenerativas utilizando modelos in vivo C. elegans

Camu-camu (Myrciaria dubia H.B.K. (McVaugh)) is a native Amazon fruit, recognized worldwide as one of the main natural sources of ascorbic acid. Due to its great acidity, this fruit is generally consumed after processing into juice or as ingredient in food preparations. As a co-product of the camu-camu processing, a significant amount of agroindustrial residue is generated. Despite the studies showing the bioactive value and biological potential of the fruit, few studies have approached the possible processing techniques, transformation and preservation of camu-camu fruits and its agroindustrial pomace. Therefore, the present work has the objective of evaluating two different drying processes applied to camu-camu pomace (peel and seeds with residual pulp), freeze drying and hot air drying, in order to obtain a functional fruit product. This thesis was divided into three stages: the first one shows the studies related to the freeze drying and hot air drying, where we demonstrated the impact of the selected drying techniques on the bioactive components of camu-camu, taking the fresh pomace as the control group. Among the investigated conditions, the groups obtained at 50ºC and 4 m/s (SC50) and 80ºC and 6 m/s (SC80) were selected as for further studies, based on their ascorbic acid final content and Folin-Ciocalteau reducing capacity. In addition to SC50 and SC80, the fresh pomace (RF) and freeze dried (RL) samples were also evaluated in these further stages of the research. Overall, the results show higher bioactive concentration in the RF samples, followed by RL, SC50 and SC80. On the second step of the research, the antioxidant, antimicrobial and antienzymatic activities were evaluated and the same tendency was observed. It was also reported, for the first time in the literature, the presence of syringic acid in dried camu-camu pomace. In the third and final stage of the research, it was investigated the effect of dried camu-camu on aging and neuroprotective disorders, using the in vivo model C.elegans. It was observed that camu-camu extracts were able to modulate important signaling genes relevant to thermal and oxidative stresses (p < 0.05). The polar acid, polar basic and polar neutral fractions obtained from the low molecular extracts of SC50 were able to extend the lifespan of wild type N2 C. elegans in 20% and 13% (p < 0.001). Results also showed that the paralysis induced by the β1-42 amyloid was significantly (p < 0.0001) retarded in CL4176 worms. Similarly, the camu-camu extracts attenuated the dopaminergic induction associated to Parkinson’s disease. Finally, a global analysis of the data presented here reveal that the camu-camu pomace, a co-product obtained from the industrial processing of a native Brazilian fruit, is a relevant natural source of health relevant compounds. This thesis, shows for the first time, the multifunctionality of camu-camu pomace, a natural resource still underexploited for scientific, commercial and technological purposes.

Excreção urinária de glicosaminoglicanos em crianças com bexiga neurogênica secundária a mielomeningocele

A excreção urinária de glicosaminoglicanos (GAG) está alterada em várias patologias do trato urinário; o padrão de excreção pode estar associado com o estado da doença. A excreção urinária de GAG em crianças com bexiga neurogênica (BN) secundária a mielomeningocele (MMC) pode também estar alterada, mas até a presente data não há detalhamento epidemiológico dos pacientes e não se correlacionou o padrão de excreção com grau de disfunção vesical. Analisamos a excreção urinária de um grupo bem definido de crianças com MMC e correlacionamos os resultados com escore cistométrico. As amostras de urina de 17 pacientes com MMC, 10 meninos e 7 meninas (média de idade DP de 4,6 2,9 anos) foram obtidas durante o exame cistométrico. As amostras do grupo controle foram obtidas de 18 crianças normais, 13 meninos e 5 meninas (6,9 2,2 anos). Todas as crianças não estavam com infecção urinária, tinham função renal normal e não estavam sob tratamento farmacológico. A quantificação do GAG urinário total foi expressa em μg de ácido hexurônico / mg de creatinina e a proporção dos diferentes tipos de GAGs sulfatados foi obtida por eletroforese em gel de agarose. A avaliação cistométrica foi realizada utilizando aparelho de urodinâmica Dynapack modelo MPX816 (Dynamed, São Paulo, Brasil), a partir da qual o escore cistométrico foi calculado de acordo com procedimento recente publicado. [14]. Não observamos diferença significativa na excreção urinária de GAG total entre meninos e meninas tanto no grupo com MMC ( 0,913 0,528 vs 0,867 0,434, p>0,05) como no grupo controle (0,546 0,240 vs 0,699 0,296, p>0,05). Os resultados mostraram também que a excreção de GAG urinário não se correlacionou com a idade tanto no grupo com MMC ( r = -0,28, p> 0,05) como no grupo controle (r = -0,40, p> 0,05). Entretanto, a comparação dos dois grupos mostrou que o grupo com MMC excretava 52% a mais de GAG total que o grupo controle (0,894 0,477 vs 0,588 0,257, p <0,04). Nesses pacientes a excreção de GAG total não se correlacionou com a complacência vesical isoladamente (r = -0,18, p> 0,05) mas foi significativa e negativamente correlacionada ao escore cistométrico (r= -0,56, p<0,05). Em média, os pacientes com piores escores (<9) excretaram 81% a mais de GAG que os pacientes com melhor escore (>9) (1,157 0,467 vs 0,639 0,133, p<0,04). O sulfato de condroitin foi o GAG sulfatado predominante nos grupos neurogênico e controles (92,5 7,6% vs 96,4 4,8%, respectivamente, p> 0,05), enquanto o sulfato do heparan estava presente em quantidades marcadamente menores; o dermatam sulfato não foi detectado. A excreção urinária de GAG em pacientes com MMC é significativamente maior que a excreção das crianças normais e os altos valores encontrados estão correlacionados a um maior compromentimento da função vesical. Evidências em modelos animais com MMC induzida sugerem que alterações no detrusor estão associadas a um elevado turnover da matriz extra celular (MEC) vesical, o que pode explicar a elevada excreção de GAG nos pacientes com MMC. Além disso, esses resultados indicam que a excreção urinária de GAG pode ser usada como fator adjuvante para a caracterização da disfunção vesical em pacientes com MMC.

Estudo da bioenergética mitocondrial de cardiomiócitos de camundongos obesos

A obesidade é uma doença crônica, resultante do excesso de gordura no organismo. O aumento da obesidade no mundo, tem se revelado como um dos fenômenos clínicos e epidemiológicos da atualidade. Estudos populacionais e em modelos animais demonstram que a origem da epidemia da obesidade está relacionada a fatores genéticos, modificações de hábitos nutricionais, redução da atividade física, e alterações nutricionais durante a lactação, desempenhando um papel relevante no desenvolvimento da obesidade, DM2 e cardiomiopatias. As mitocôndrias são os coordenadores centrais do metabolismo energético, assim, alterações funcionais e estruturais dessa organela têm sido associadas à desordens metabólicas. Elas exercem um papel na sobrevivência e função dos cardiomiócitos devido à alta demanda energética do miocárdio. Desta forma, disfunções mitocondriais estão relacionadas com disfunções no miocárdio e conseqüente progressão de cardiomiopatias. Neste estudo, avaliamos a bioenergética e a ultraestrutura de cardiomiócitos de camundongos obesos e controle hiperalimentados durante a lactação. O consumo de oxigênio das fibras cardíacas foi avaliado por respirometria de alta-resolução, utilizando um oxígrafo-2K-Oroboros. A ultraestrutura dos cardiomiócitos foi analisada por microscopia eletrônica de transmissão e o conteúdo das proteínas Carnitina palmitoil transferase 1 (CPT1), Proteína desacopladora 2 (UCP2) , Transportador de glicose 1 e 4 (GLUT1) e (GLUT4), Proteína Kinase ativada por AMP (AMPK) e Proteína kinase ativada por AMP fosforilada p(AMPK) por Western blotting (WB). Além disso, o peso dos animais, a gordura retroperitoneal, epididimal e a glicemia em jejum foram determinadas. Nossos resultados confirmaram que os animais do grupo hiperalimentados (GH), aos 90 dias de vida, apresentaram aumento da massa corporal, de gordura epididimária e retroperitoneal comparado ao grupo controle (GC). As taxas respiratórias foram semelhantes nos dois grupos quando foram utilizados os substratos dos complexos I e II. Entretanto, quando o ácido graxo palmitoil-L-carnitina foi utilizado, a taxa respiratória máxima do GH foi significativamente menor. A análise ultraestrutural dos cardiomiócitos do GH demonstrou intenso dano na matriz mitocondrial e maior presença de gotículas de lipídios, caracterizando deposição ectópica. Os resultados do WB mostraram aumento significativo do conteúdo de CPT1 e UCP2 no GH comparado ao GC. Não foram encontradas diferenças significativas no conteúdo de GLUT1 entre os grupos, entretanto, observamos maior conteúdo do GLUT4 no GH. Além disso, encontramos maior conteúdo de AMPK no GH, ao passo que o conteúdo de pAMPK foi semelhante entre os grupos. Entretanto, a razão pAMPK/AMPK é significativamente menor no GH. Esses resultados sugerem que a hiperalimentação durante a lactação leva a obesidade na vida adulta com alterações na bioenergética e ultraestrutura dos cardiomiócitos.

O transplante de células mononucleares de medula óssea contribui para o remodelamento da matriz extracelular durante a regeneração do fígado em ratos com fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar

A fibrose hepática é o resultado de uma lesão crônica, com a ativação de células inflamatórias e fibrogênicas no fígado, as quais levam a um acúmulo excessivo de proteínas de matriz extracelular (MEC). Essas alterações resultam na morte de células do fígado, com desorganização e perda da função do parênquima hepático. A cirrose é o estágio avançado da fibrose, e culmina na falência hepática, uma condição potencialmente fatal cujo único tratamento efetivo é o transplante de fígado, o qual é limitado pela disponibilidade de órgãos. Na busca por terapias alternativas visando a regeneração hepática, o transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO) mostrou resultados benéficos e promissores em modelos animais e alguns protocolos clínicos. Entre essas células, estão as células-tronco hematopoiéticas e mesenquimais, que apresentam potencial regenerativo e modulador da resposta inflamatória. Este estudo pretendeu avançar na compreensão dos mecanismos pelos quais as CMMO podem ajudar na regeneração hepática. Ratos com fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) foram transplantados com CMMO e comparados com ratos com fibrose sem transplante e ratos normais. Parâmetros hepáticos como componentes da MEC (colágeno total, colágenos tipos I e IV, laminina, metaloproteinases de matriz MMPs), componentes celulares (células fibrogênicas, células de Kupffer e colangiócitos) e enzimas hepáticas foram analisados por microscopia de luz, microscopia confocal, western blotting e espectrofotometria. Os resultados mostraram que o transplante de CMMO contribui para a regeneração hepática de maneira global, (a) diminuindo o acúmulo de colágeno e laminina; (b) aumentando a produção de MMPs que favorecem o remodelamento da MEC, principalmente por células de Kupffer; (c) normalizando a quantidade de colangiócitos e diminuindo a quantidade de células fibrogênicas; e (d) normalizando os níveis sanguíneos das enzimas hepáticas. Portanto, nós sugerimos que as CMMO podem ajudar na regeneração hepática através de mecanismos parácrinos e se diferenciando em células de Kupffer, contribuindo para a secreção de fatores antiinflamatórios e anti-fibrogênicos no fígado com fibrose.

Avaliação da morfologia testicular e dos parâmetros espermáticos em ratos espontaneamente hipertensos e tratados com enalapril

A hipertensão arterial sistêmica (HAS) é um problema de saúde pública, geralmente associada a outras doenças, como obesidade, diabetes, doença renal, aterosclerose, acidente vascular cerebral (AVC) e identificado como um dos fatores de risco mais prevalentes para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Orgãos-alvo, como coração, rins, cérebro e olhos, são comumente afetados em pacientes hipertensos. No entanto, o dano testicular causado pela hipertensão não foi claramente definido. A hipertensão é um fator de risco bem estabelecido para a disfunção erétil, mas sua relação com o dano testicular e a fertilidade masculina não é claramente compreendida. Este estudo avalia a morfologia testicular e alguns parâmetros espermáticos de ratos espontaneamente hipertensos (SHR), virgem de tratamento e tratados com enalapril. Ratos SHR foram distribuídos em dois grupos, um grupo hipertenso (H), e um grupo tratado com enalapril (HE). Ratos Wistar-Kyoto (WKY) foram utilizados como controles. A pressão arterial sistólica foi medida semanalmente, até o final do experimento. A concentração de espermatozóides, motilidade e viabilidade foram determinadas em amostras coletadas da cauda do epidídimo. Métodos estereológicos foram usados para analisar objetivamente a morfologia testicular macroscopicamente e microscopicamente. Todos os dados foram analisados por ANOVA com pós-teste de Tukey, considerando p <0,05. Ao final do experimento a pressão arterial sistólica no grupo HE (153,9 mmHg 21,03 ) foi semelhante a dos animais pertencentes ao grupo WKY (153,4 24,41) e menor que a dos animais H (205,1 24,9). A concentração espermática do grupo H (1,31 x 107 sptz/ml 0,27) foi inferior à do grupo WKY (2,11 x 107 sptz/ml 0,34), entretanto o controle da pressão arterial com o enalapril melhorou este parâmetro e a concentração espermática do grupo HE (2,46 x 107 sptz/ml 0,54) foi semelhante a do WKY. A densidade volumétrica vascular também foi alterada no grupo de hipertensos, enquanto que os animais do grupo HE foram semelhantes aos controles. O epitélio seminífero dos animais HE apresentou a maior densidade volumétrica, indicando um possível efeito protetor indireto do enalapril na espermatogênese. Neste modelo animal, a HAS promoveu alterações morfológicas no testículo, com conseqüências sobre a produção de espermatozóides. O controle da pressão arterial com o enalapril protegeu o testículo destas alterações, restabelecendo a produção normal dos espermatozóides.

Uso de plasma rico em plaquetas em queimaduras Modelo experimental em ratos

As queimaduras são eventos comuns e recorrentes no dia a dia dos atendimentos médicos. Há uma constante busca para entender a sua fisiopatologia, no intuito de minimizar seus resultados devastadores. Plasma rico em plaquetas (PRP) é um concentrado de plaquetas com capacidade de liberação local de múltiplos fatores de crescimento (FC) que aceleram a cicatrização. Este estudo consiste em dois experimentos: o primeiro visa validar um modelo experimental para a criação de queimaduras de tamanho e profundidade padronizados e, o segundo, avalia o uso de PRP em queimaduras. Para o desenvolvimento de queimaduras na validação do modelo experimental, foi idealizado um equipamento que permitisse o controle preciso da temperatura, além da utilização em conjunto de uma técnica inovadora de fixação que garante pressão constante no momento das queimaduras. Para o primeiro experimento, foram utilizados 12 ratos, por grupo, submetidos a queimaduras de 60 oC, 70 oC ou 80 oC por dez segundos, com um equipamento que desenvolvemos. Metade dos animais de cada grupo foi morta no terceiro dia e suas feridas foram analisadas por histologia, e, na outra metade, a ferida foi mensurada e acompanhada até o seu fechamento. No uso de PRP em queimaduras, foram avaliadas queimaduras de segundo grau (SG), segundo grau com diabetes mellitus induzido (SGD) e queimaduras de terceiro grau (TG). Noventa animais foram distribuídos em três grupos (SG, SGD e TG), onde, em cada um, dez animais foram tratados, dez serviram de controle e dez foram utilizados para o preparo do PRP. As áreas das feridas foram acompanhadas até o vigésimo primeiro dia, quando os animais foram mortos e biópsias de pele foram realizadas. Os resultados da validação do modelo mostram que as queimaduras produzidas com 60 oC foram de SG superficial (28% da derme envolvida); com 70 oC foram de SG profundo (72% da derme envolvida); e com 80 oC foram de TG (100% da derme envolvida). Em relação ao uso de PRP em queimaduras, observou-se que nos grupos tratados SG e SGD houve aceleração do fechamento da ferida e redução no número de células CD31, CD163, CD68, MPO e TGF-β positivas, e aumento do número de células MMP2 positivas. A neoepiderme foi mais fina nos controles dos grupos SG e SGD, e o tecido de granulação foi reduzido nos controles SGD e TG. O modelo utilizado é seguro e confiável para produzir queimaduras regulares e uniformes, de diâmetros variados, pela capacidade do controle fino da temperatura e pelo posicionamento do animal, e reprodutíveis. PRP parece acelerar a cicatrização de queimaduras de SG e SGD, mas não de TG.

Analgesia em modelo animal superior para ortopedia

O teste de novos biomateriais para aplicações clínicas em ortopedia, ou noutras áreas da medicina, em modelos animais vivos e sencientes, em prol do benefício humano, deve ser objecto de planeamento cuidado e ponderado, dado o conflito ético que se coloca. Compete-nos, enquanto investigadores, garantir que as condições de vida, saúde e bem-estar são asseguradas. O uso de ovinos como modelo superior pré-clínico, para investigação em Ortopedia, tem-se evidenciado devido às suas características translacionais para a espécie humana. Neste estudo retrospectivo deu-se ênfase ao plano anestésico/ analgésico instituído em três tipos de técnicas cirúrgicas ortopédicas, realizadas em ovinos. Os animais intervencionados foram adquiridos com 2 meses de antecedência em relação às cirurgias e mantidos em rebanho, com condições adequadas de abrigo, alimentação e maneio. As técnicas cirúrgicas inovadoras foram treinadas previamente em peças anatómicas adquiridas no matadouro. Todas as cirurgias e anestesias foram realizadas por médicos veterinários devidamente qualificados. Durante os períodos pós-operatórios os animais foram mantidos no Hospital Veterinário, sob vigilância e tratamento, após o que regressaram ao pasto. Considera-se que os protocolos anestésico e analgésico instituídos foram suficientes para eliminar a dor ortopédica/ neuropática causada pelas técnicas cirúrgicas referidas.

Modelo animal ex vivo para vertebroplastia percutânea

O teste de novos biomateriais para vertebroplastia percutânea (VP), depende da escolha de um modelo animal adequado. O objectivo deste estudo foi o desenvolvimento ex vivo de um modelo animal reprodutível e fiável para VP, para posterior aplicação in vivo, tendo em consideração a necessidade de evitar o derrame de cimento para o canal vertebral e estruturas vasculares adjacentes. Foi seleccionado um modelo animal superior (ovino), pelas suas reconhecidas propriedades translacionais para a espécie humana. Foram realizadas VP’s em vértebras lombares sob controlo táctil e fluoroscópico, através de uma abordagem parapedicular bilateral. O volume médio de defeito obtido foi 1234±240 mm3, o que assegura defeitos viáveis para o teste de novos biomateriais injectáveis. Seis vértebras foram injectadas com um cimento comercial (Cerament®, Bone Support, Suécia) tendo-se observado preenchimento adequado dos defeitos em todas as vértebras. Todas as vértebras foram avaliadas por microtomografia axial computorizada (microTAC) antes e após a criação dos defeitos e após injecção dos cimentos. Realizaram-se testes mecânicos de compressão, tendo as vértebras sido sujeitas a cargas superiores às fisiológicas e inspeccionadas macroscopicamente. Em conclusão considera-se este modelo adequado para estudos in vivo pré-clínicos, mimetizando aplicações clínicas.

Analgesia em modelo animal superior para ortopedia

O teste de novos biomateriais para aplicações clínicas em ortopedia, ou noutras áreas da medicina, em modelos animais vivos e sencientes, em prol do benefício humano, deve ser objecto de planeamento cuidado e ponderado, dado o conflito ético que se coloca. Compete-nos, enquanto investigadores, garantir que as condições de vida, saúde e bem-estar são asseguradas. O uso de ovinos como modelo superior pré-clínico, para investigação em Ortopedia, tem-se evidenciado devido às suas características translacionais para a espécie humana. Neste estudo retrospectivo deu-se ênfase ao plano anestésico/ analgésico instituído em três tipos de técnicas cirúrgicas ortopédicas, realizadas em ovinos. Os animais intervencionados foram adquiridos com 2 meses de antecedência em relação às cirurgias e mantidos em rebanho, com condições adequadas de abrigo, alimentação e maneio. As técnicas cirúrgicas inovadoras foram treinadas previamente em peças anatómicas adquiridas no matadouro. Todas as cirurgias e anestesias foram realizadas por médicos veterinários devidamente qualificados. Durante os períodos pós-operatórios os animais foram mantidos no Hospital Veterinário, sob vigilância e tratamento, após o que regressaram ao pasto. Considera-se que os protocolos anestésico e analgésico instituídos foram suficientes para eliminar a dor ortopédica/ neuropática causada pelas técnicas cirúrgicas referidas.

Modelo animal ex vivo para vertebroplastia percutânea

O teste de novos biomateriais para vertebroplastia percutânea (VP), depende da escolha de um modelo animal adequado. O objectivo deste estudo foi o desenvolvimento ex vivo de um modelo animal reprodutível e fiável para VP, para posterior aplicação in vivo, tendo em consideração a necessidade de evitar o derrame de cimento para o canal vertebral e estruturas vasculares adjacentes. Foi seleccionado um modelo animal superior (ovino), pelas suas reconhecidas propriedades translacionais para a espécie humana. Foram realizadas VP’s em vértebras lombares sob controlo táctil e fluoroscópico, através de uma abordagem parapedicular bilateral. O volume médio de defeito obtido foi 1234±240 mm3, o que assegura defeitos viáveis para o teste de novos biomateriais injectáveis. Seis vértebras foram injectadas com um cimento comercial (Cerament®, Bone Support, Suécia) tendo-se observado preenchimento adequado dos defeitos em todas as vértebras. Todas as vértebras foram avaliadas por microtomografia axial computorizada (microTAC) antes e após a criação dos defeitos e após injecção dos cimentos. Realizaram-se testes mecânicos de compressão, tendo as vértebras sido sujeitas a cargas superiores às fisiológicas e inspeccionadas macroscopicamente. Em conclusão considera-se este modelo adequado para estudos in vivo pré-clínicos, mimetizando aplicações clínicas.

Analgesia em modelo animal superior para ortopedia

O teste de novos biomateriais para aplicações clínicas em ortopedia, ou noutras áreas da medicina, em modelos animais vivos e sencientes, em prol do benefício humano, deve ser objecto de planeamento cuidado e ponderado, dado o conflito ético que se coloca. Compete-nos a nós, enquanto investigadores, garantir que as condições de vida, saúde e bem-estar são asseguradas. O uso de ovinos como modelo superior pré-clínico, para investigação em Ortopedia, tem-se evidenciado devido às suas características translacionais para a espécie humana. Neste estudo retrospectivo deu-se ênfase ao plano anestésico/ analgésico instituído em três tipos de técnicas cirúrgicas ortopédicas, realizadas em ovinos. Os animais intervencionados foram adquiridos com 2 meses de antecedência em relação às cirurgias e mantidos em rebanho, com condições condignas de abrigo e alimentação. As técnicas cirúrgicas inovadoras foram treinadas previamente em peças anatómicas adquiridas no matadouro. Todas as cirurgias e anestesias foram realizadas por médicos veterinários devidamente qualificados. Durante os períodos pós-operatórios os animais foram mantidos no Hospital Veterinário, sob vigilância e tratamento, após o que regressaram ao pasto. Considera-se que os protocolos anestésico e analgésico instituídos foram suficientes para eliminar a dor ortopédica/ neuropática causada pelas técnicas cirúrgicas referidas.

Mitochondrial plasticity in pathophysiological conditions

Both skeletal and cardiac muscles daily burn tremendous amounts of ATP to meet the energy requirements for contraction. So, it is not surprising that the maintenance of mitochondrial morphology, number, distribution and functionality in striated muscle are important for muscle homeostasis. In these tissues mitochondria present the added dimension of two populations, the intermyofibrillar (IMF) and the subsarcolemmal (SS) mitochondria, being IMF the most abundant one. In the present thesis, the molecular mechanisms harboured in mitochondria of striated muscles were studied using animal models, to better comprehend the role of mitochondrial plasticity in several pathophysiological conditions such as aging, diabetes mellitus and bladder cancer. The comparative analysis of IMF and SS populations isolated from heart evidenced a higher respiratory chain activity of mitochondria interspersed in the contractile apparatus. The higher susceptible of SS respiratory chain complexes subunits to carbonylation, but not to nitration, seems to justify the lower respiratory chain activity observed in this mitochondrial population. Our results showed that in heart from aged mice there is an accumulation of dysfunctional mitochondria. The age-related decrease of oxidative phosphorylation activity seems to be justified, at least partially, by the increased proneness of mitochondrial proteins as OXPHOS subunits and MnSOD to oxidative modifications. Moreover, a sedentary lifestyle seems to worsen the functional consequences of aging in heart by increasing mitochondrial proteins susceptibility to nitration. In skeletal muscle from rats with type 1 diabetes mellitus induced by streptozotocin administration, we verified the accumulation of dysfunctional mitochondria due, at least in part, to the impairment of PQC system. Indeed, the decreased activity of AAA proteases was accompanied by the accumulation of oxidatively modified mitochondrial proteins with impact in respiratory chain activity. The diminishing of mitochondria activity also underlies cancer-induced muscle wasting. Indeed, using a rat model of chemically induced urothelial carcinoma we verified that the loss of gastrocnemius mass was related to mitochondrial dysfunction due to, at least partially, the down-regulation of PQC system involving the mitochondrial proteases paraplegin and Lon. PQC impairment resulted in the accumulation of oxidatively modified mitochondrial proteins. In overall, regardless the pathophysiological stimuli that promote mitochondrial alterations, there are similarities in the pattern of disease-related mitochondrial plasticity. The diminished capacity for ATP production in striated muscle seems to be due to increased oxidative damage of mitochondrial proteins, namely subunits of respiratory chain complexes, metabolic proteins and MnSOD. Our data highlighted, for the first time, the impact of mitochondrial PQC system impairment in the accumulation of oxidized proteins, exacerbating the dysfunction of this organelle in striated muscle in several pathophysiological conditions.

The activity of mouse Cerberus like 2 during cardiogenesis - genetic and morphogenetic studies

Cardiogenesis is a delicate and complex process that requires the coordination of an intricate network of pathways and the different cell types. Therefore, understanding heart development at the morphogenetic level is an essential requirement to uncover the causes of congenital heart disease and to provide insight for disease therapies. Mouse Cerberus like 2 (Cerl2) has been defined as a Nodal antagonist in the node with an important role in the Left-Right (L/R) axis establishment, at the early embryonic development. As expected, Cerl2 knockout mice (Cerl2-/-) showed multiple laterality defects with associated cardiac failure. In order to identify the endogenous role of Cerl2 during heart formation independent of its described functions in the node, we accurately analyzed animals where laterality defects were not present. We thereby unravel the consequences of Cerl2 lossof- function in the heart, namely increased left ventricular thickness due to hyperplasia of cardiomyocytes and de-regulated expression of cardiac genes. Furthermore, the Cerl2 mutant neonates present impaired cardiac function. Once that the cardiac expression of Cerl2 is mostly observed in the left ventricle until around midgestration, this result suggest a specific regulatory role of Cerl2 during the formation of the left ventricular myoarchitecture. Here, we present two possible molecular mechanisms underlying the cardiac Cerl2 function, the regulation of Cerl2 antagonist in activation of the TGFßs/Nodal/Activin/Smad2 signaling identified by increased Smad2 phosphorilation in Cerl2-/- hearts and the negative feedback between Cerl2 and Wnt/ß-catenin signaling in heart formation. In this work and since embryonic stem cells derived from 129 mice strain is extensively used to produce targeted mutants, we also present echocardiographic reference values to progressive use of juveniles and young adult 129/Sv strain in cardiac studies. In addition, we investigate the cardiac physiology of the surviving Cerl2 mutants in 129/Sv background over time through a follow-up study using echocardiographic analysis. Our results revealed that Cerl2-/- mice are able to improve and maintain the diastolic and most of systolic cardiac physiologic parameters as analyzed until young adult age. Since Cerl2 is no longer expressed in the postnatal heart, we suggest that an intrinsic and compensatory mechanism of adaptation may be active for recovering the decreased cardiac function found in Cerl2 mutant neonates. Altogether, these data highlight the role of Cerl2 during embryonic heart development in mice. Furthermore, we also suggest that Cerl2-/- may be an interesting model to uncover the molecular, cellular and physiological mechanisms behind the improvement of the cardiac function, contributing to the development of therapeutic approaches to treat heart failures.

Molecular characterization of Gla-rich protein (GRP) gene expression and function

Gla-rich protein (GRP) is a vitamin K-dependent protein related to bone and cartilage recently described. This protein is characterized by a large number of Gla (γ-carboxyglutamic acid) residues being the protein with the highest Gla content of any known protein. It was found in a widely variety of tissues but highest levels was found in skeletal and cartilaginous tissues. This small secreted protein was also expressed and accumulated in soft tissues and it was clearly associated with calcification pathologies in the same tissues. Although the biological importance of GRP remains to be elucidated, it was suggested a physiological role in cartilage development and calcification process during vertebrate skeleton formation. Using zebrafish, an accepted model to study skeletal development, we have described two grp paralog genes, grp1 and grp2, which exhibited distinct patterns of expression, suggesting different regulatory pathways for each gene. Gene synteny analysis showed that grp2 gene is more closely related to tetrapod grp, although grp1 gene was proposed to be the vertebrate ortholog by sequence comparison. In addition, we identified a functional promoter of grp2 gene and using a functional approach we confirmed the involvement of transcription factors from Sox family (Sox9b and Sox10) in the regulation of grp2 expression. In an effort to provide more information about the function of grp isoforms, we generated two zebrafish transgenic lines capable to overexpress conditionally grp genes and possible roles in the skeleton development were studied. To better understand GRP function a mammalian system was used and the analysis of knockout mice showed that GRP is involved in chondrocyte maturation and the absence of GRP is associated to proteoglycans loss in calcified articular cartilage. In addition, we detected differences in chondrogenesis markers in articular chondrocyte primary culture. Overall, our data suggest a main role for GRP on chondrocyte differentiation.

Drug repurposing in the treatment of Melanoma Brain Metastasis

Dissertação de Mestrado, Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015