Re-thinking cell cycle regulators: the cross-talk with metabolism.

Analysis of genetically engineered mice deficient in cell cycle regulators, including E2F1, cdk4, and pRB, showed that the major phenotypes are metabolic perturbations. These key cell cycle regulators contribute to lipid synthesis, glucose production, insulin secretion, and glycolytic metabolism. It has been shown that deregulation of these pathways can lead to metabolic perturbations and related metabolic diseases, such as obesity and type II diabetes. The cyclin-cdk-Rb-E2F1 pathway regulates adipogenesis in addition to its well-described roles in cell cycle regulation and cancer. It was also shown that E2F1 directly participates in the regulation of pancreatic growth and function. Similarly, cyclin D3, cdk4, and cdk9 are also adipogenic factors with strong effects on whole organism metabolism. These examples support the emerging notion that cell cycle regulatory proteins also modulate metabolic processes. These cell cycle regulators are activated by insulin and glucose, even in non-proliferating cells. Most importantly, these cell cycle regulators trigger the adaptive metabolic switch that normal and cancer cells require in order to proliferate. These changes include increased lipid synthesis, decreased oxidative metabolism, and increased glycolytic metabolism. In summary, these factors are essential regulators of anabolic biosynthetic processes, blocking at the same time oxidative and catabolic pathways, which is reminiscent of cancer cell metabolism.

Angiofil-mediated visualization of the vascular system by microcomputed tomography: a feasibility study.

Visualization of the vascular systems of organs or of small animals is important for an assessment of basic physiological conditions, especially in studies that involve genetically manipulated mice. For a detailed morphological analysis of the vascular tree, it is necessary to demonstrate the system in its entirety. In this study, we present a new lipophilic contrast agent, Angiofil, for performing postmortem microangiography by using microcomputed tomography. The new contrast agent was tested in 10 wild-type mice. Imaging of the vascular system revealed vessels down to the caliber of capillaries, and the digital three-dimensional data obtained from the scans allowed for virtual cutting, amplification, and scaling without destroying the sample. By use of computer software, parameters such as vessel length and caliber could be quantified and remapped by color coding onto the surface of the vascular system. The liquid Angiofil is easy to handle and highly radio-opaque. Because of its lipophilic abilities, it is retained intravascularly, hence it facilitates virtual vessel segmentation, and yields an enduring signal which is advantageous during repetitive investigations, or if samples need to be transported from the site of preparation to the place of actual analysis, respectively. These characteristics make Angiofil a promising novel contrast agent; when combined with microcomputed tomography, it has the potential to turn into a powerful method for rapid vascular phenotyping.

Endogenous protease nexin-1 protects against cerebral ischemia.

The serine protease thrombin plays a role in signalling ischemic neuronal death in the brain. Paradoxically, endogenous neuroprotective mechanisms can be triggered by preconditioning with thrombin (thrombin preconditioning, TPC), leading to tolerance to cerebral ischemia. Here we studied the role of thrombin's endogenous potent inhibitor, protease nexin-1 (PN-1), in ischemia and in tolerance to cerebral ischemia induced by TPC. Cerebral ischemia was modelled in vitro in organotypic hippocampal slice cultures from rats or genetically engineered mice lacking PN-1 or with the reporter gene lacZ knocked into the PN-1 locus PN-1HAPN-1-lacZ/HAPN-1-lacZ (PN-1 KI) exposed to oxygen and glucose deprivation (OGD). We observed increased thrombin enzyme activity in culture homogenates 24 h after OGD. Lack of PN-1 increased neuronal death in the CA1, suggesting that endogenous PN-1 inhibits thrombin-induced neuronal damage after ischemia. OGD enhanced β-galactosidase activity, reflecting PN-1 expression, at one and 24 h, most strikingly in the stratum radiatum, a glial cell layer adjacent to the CA1 layer of ischemia sensitive neurons. TPC, 24 h before OGD, additionally increased PN-1 expression 1 h after OGD, compared to OGD alone. TPC failed to induce tolerance in cultures from PN-1(-/-) mice confirming PN-1 as an important TPC target. PN-1 upregulation after TPC was blocked by the c-Jun N-terminal kinase (JNK) inhibitor, L-JNKI1, known to block TPC. This work suggests that PN-1 is an endogenous neuroprotectant in cerebral ischemia and a potential target for neuroprotection.

The α1-adrenergic receptors: diversity of signaling networks and regulation.

The α(1)-adrenergic receptor (AR) subtypes (α(1a), α(1b), and α(1d)) mediate several physiological effects of epinephrine and norepinephrine. Despite several studies in recombinant systems and insight from genetically modified mice, our understanding of the physiological relevance and specificity of the α(1)-AR subtypes is still limited. Constitutive activity and receptor oligomerization have emerged as potential features regulating receptor function. Another recent paradigm is that β arrestins and G protein-coupled receptors themselves can act as scaffolds binding a variety of proteins and this can result in growing complexity of the receptor-mediated cellular effects. The aim of this review is to summarize our current knowledge on some recently identified functional paradigms and signaling networks that might help to elucidate the functional diversity of the α(1)-AR subtypes in various organs.

Crucial role of CB(2) cannabinoid receptor in the regulation of central immune responses during neuropathic pain

Neuropathic pain is a clinical manifestation of nerve injury difficult to treat even with potent analgesic compounds. Here, we used different lines of genetically modified mice to clarify the role played by CB2 cannabinoid receptors in the regulation of the central immune responses leading to the development of neuropathic pain. CB2 knock-out mice and wild-type littermates were exposed to sciatic nerve injury, and both genotypes developed a similar hyperalgesia and allodynia in the ipsilateral paw. Most strikingly, knock-outs also developed a contralateral mirror image pain, associated with an enhanced microglial and astrocytic expression in the contralateral spinal horn. In agreement, hyperalgesia, allodynia, and microglial and astrocytic activation induced by sciatic nerve injury were attenuated in transgenic mice overexpressing CB2 receptors. These results demonstrate the crucial role of CB2 cannabinoid receptor in modulating glial activation in response to nerve injury. The enhanced manifestations of neuropathic pain were replicated in irradiated wild-type mice reconstituted with bone marrow cells from CB2 knock-outs, thus demonstrating the implication of the CB2 receptor expressed in hematopoietic cells in the development of neuropathic pain at the spinal cord.

Sodium and potassium balance depends on αENaC expression in connecting tubule.

Mutations in α, β, or γ subunits of the epithelial sodium channel (ENaC) can downregulate ENaC activity and cause a severe salt-losing syndrome with hyperkalemia and metabolic acidosis, designated pseudohypoaldosteronism type 1 in humans. In contrast, mice with selective inactivation of αENaC in the collecting duct (CD) maintain sodium and potassium balance, suggesting that the late distal convoluted tubule (DCT2) and/or the connecting tubule (CNT) participates in sodium homeostasis. To investigate the relative importance of ENaC-mediated sodium absorption in the CNT, we used Cre-lox technology to generate mice lacking αENaC in the aquaporin 2-expressing CNT and CD. Western blot analysis of microdissected cortical CD (CCD) and CNT revealed absence of αENaC in the CCD and weak αENaC expression in the CNT. These mice exhibited a significantly higher urinary sodium excretion, a lower urine osmolality, and an increased urine volume compared with control mice. Furthermore, serum sodium was lower and potassium levels were higher in the genetically modified mice. With dietary sodium restriction, these mice experienced significant weight loss, increased urinary sodium excretion, and hyperkalemia. Plasma aldosterone levels were significantly elevated under both standard and sodium-restricted diets. In summary, αENaC expression within the CNT/CD is crucial for sodium and potassium homeostasis and causes signs and symptoms of pseudohypoaldosteronism type 1 if missing.

Métabolisme d'antidépresseurs dans différentes espèces : aspects méthodologiques et pharmacogénétiques, perspectives cliniques

Résumé pour large public Unité de Biochimie et Psychopharmacologie Clinique, Centre de neurosciences Psychiatrique, Département de Psychiatrie Adulte, Faculté de Biologie et de Médecine, Université de Lausanne Lors de la prise d'un médicament, celui-ci va passer par différentes étapes que sont l'absorption, la distribution, le métabolisme et enfin l'élimination. Ces quatre étapes sont regroupées sous le nom de pharmacocinétique. A noter que ces quatre paramètres sont dynamiques et en constante évolution. Durant cette thèse, nous avons investigué différents aspects de la pharmacocinétique, tout d'abord par une revue de la littérature sur la glycoprotéine-P (Pgp). Récemment découverte, cette protéine de membrane est située aux endroits stratégiques de l'organisme comme la barrière hématoencéphalée, le placenta ou les intestins où elle influencera l'entrée de différentes substances, en particulier les médicaments. La Pgp serait impliquée dans les phénomènes de résistances aux agents thérapeutiques en oncologie. La Pgp influence donc l'absorption des médicaments, et son impact en clinique, en termes d'efficacité de traitement et de toxicité prend chaque jour plus d'importance. Ensuite nous avons mis au point une méthode d'analyse quantitative d'un antidépresseur d'une nouvelle génération : la mirtazapine (Remeron®). La nouveauté réside dans la façon dont la mirtazapine interagit avec les neurotransmetteurs impliqués dans la dépression que sont la sérotonine et la noradrénaline. Cette méthode utilise la chromatographie liquide pour séparer la mirtazapine de ses principaux métabolites dans le sang. La spectrométrie de masse est utilisée pour les détecter et les quantifier. Les métabolites sont des substances issues de réactions chimiques entre la substance mère, la mirtazapine, et généralement des enzymes hépatiques, dans le but de rendre cette substance plus soluble en vue de son élimination. Cette méthode permet de quantifier la mirtazapine et ses métabolites dans le sang de patients traités et de déterminer la variation des taux plasmatiques chez ces patients. Puis nous avons étudié le métabolisme d'un autre antidépresseur, le citalopram, qui a un métabolisme complexe. Le citalopram est un racémate, c'est-à-dire qu'il existe sous forme de deux entités chimiques (R-(-) et S-(+) citalopram) qui ont le même nombre d'éléments mais arrangés différemment dans l'espace. La voie métabolique cérébrale du citalopram est sous le contrôle d'une enzyme, la monoamine oxydase (MAO), conduisant à une forme acide du citalopram (l'acide propionique du citalopram). La MAO existe sous deux formes : MAO-A et MAO-B. Nous avons utilisé des souris déficientes d'un gène, celui de la MAO-A, pour mieux en comprendre le métabolisme en les comparants à des souris sauvages (sans déficience de ce gène). Nous avons utilisé le citalopram et deux de ses métabolites (le déméthylcitaloprarn et le didéméthyícitalopram) comme substrats pour tester la formation in vitro de l'acide propionique du citalopram. Nos résultats montrent que la MAO-A favorise la formation de l'entité R-(-) et présente une plus grande affinité pour le citalopram, tandis que la MAO-B métabolise préférentiellement l'entité S-(+) et a une plus grande affinité pour les deux métabolites déméthylés. De plus, la déficience en MAO-A est partiellement compensée parla MAO-B chez les souris déficientes du gène de la MAO-A. Enfin, nous avons étudié une deuxième voie métabolique du citalopram qui s'est avérée toxique chez le chien Beagle. Celle-ci est catalysée par une autre famille d'enzymes, les cytochromes P-450, et mène aux métabolites déméthylés et didéméthylés du citalopram. Nous avons utilisé des tissus hépatiques de chiens Beagle. Plusieurs cytochromes P-450 sont impliqués dans le métabolisme du citalopram menant à sa forme déméthylée, ceci tant chez l'homme que chez le chien. Par contre, dans le métabolisme de la forme déméthylée menant à 1a forme didéméthylée, un seul cytochrome P-450 serait impliqué chez l'Homme, tandis qu'ils seraient plusieurs chez le chien. L'activité enzymatique produisant la forme didéméthylée est beaucoup plus importante chez le chien comparé à l'homme. Cette observation soutien l'hypothèse que des taux élevés de la forme didéméthylée participent à la toxicité spécifique du citalopram chez le chien. Nous pouvons conclure que plusieurs famille d'enzymes sont impliquées tant au niveau cérébral qu'hépatique dans la métabolisation de médicaments psychotropes. Sachant que les enzymes peuvent être stimulées ou inhibées, il importe de pouvoir suivre au plus prés les taux plasmatiques des différents psychotropes et de leurs métabolites. Résumé Unité de Biochimie et Psychopharmacologie Clinique, Centre de neurosciences Psychiatrique, Département de Psychiatrie Adulte, Faculté de Biologie et de Médecine, Université de Lausanne La plupart des médicaments subissent une transformation enzymatique dans l'organisme. Les substances issues de cette métabolisation ne sont pas toujours dotées d'une activité pharmacologique. Il s'est avéré par conséquent indispensable de suivre les taux plasmatiques d'une substance et de ses métabolites et d'établir ou non l'existence d'une relation avec l'effet clinique observé. Ce concept nommé « therapeutic drag monitoring » (TDM) est particulièrement utile en psychiatrie ou un manque de compliance des patients est fréquemment observé. Les médicaments psychotropes ont un métabolisme principalement hépatique (cytochromes P-450) et parfois cérébral (monoamines oxydases), comme pour le citalopram par exemple. Une méthode stéréosélective de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse a été développée pour analyser les énantiomères R-(-) et S-(+) d'un antidépresseur agissant sur les récepteurs noradrénergiques et sérotoninergiques, la mirtazapine et de ses métabolites déméthylmirtazapine et 8-hydroxymirtazapine. Les données préliminaires obtenues dans les plasmas dosés suggèrent que les concentrations de R-(-)-mirtazapine sont plus élevées que celles de S-(+)-mirtazapine, à l'exception des patients qui auraient comme co-médication des inhibiteurs du CYP2D6, telle que la fluoxétine ou la thioridazine. Il y a une enantiosélectivité du métabolisme de la mirtazapine. En particulier pour la 8-hydroxymirtazapine qui est glucuroconjuguée et pour laquelle le ratio S/R varie considérablement. Cette méthode analytique présente l'avantage d'être utilisable pour le dosage stéréosélectif de la mirtazapine et de ses métabolites dans le plasma de patients ayant d'autres substances en co-médication. La glycoprotéine P fonctionne comme une pompe transmembranaire transportant les xénobiotiques depuis le milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire. Son induction et son inhibition, bien que moins étudiées que pour les cytochromes P-450, ont des implications cliniques importantes en termes d'efficacité de traitement et de toxicité. Cette glycoprotéine P a fait l'objet d'une recherche bibliographique. Nous avons étudié le métabolisme du citalopram, un antidépresseur de la classe des inhibiteurs spécifiques de la recapture de la sérotonine chez la souris et chez le chien. Cette substance subit un métabolisme complexe. La voie de métabolisation conduisant à la formation de l'acide propionique du citalopram, catalysée par les monoamines oxydases, a été étudiée in vitro dans les mitochondries cérébrales chez la souris déficiente du gène de la MAO-A (Tg8). La monoamine oxydase A catalyse la formation de l'énantiomère R-(-) et présente une plus grande affinité pour les amines tertiaires, tandis que la monoamine oxydase B favorise la formation de la forme S-(+) et a une affinité plus marquée pour les amines secondaires et primaires. L'étude du citalopram chez la souris Tg8 adulte a montré que la monoamine oxydase B compense la déficience de la monoamine oxydase A chez ces souris génétiquement modifiées. Une autre voie de métabolisation du citalopram conduisant à la formation de didéméthylcitalopram, catalysée par les cytochromes P-450, a été étudiée in vitro dans des microsomes hépatiques de chiens Beagle. Nos études ont montré que les cinétiques de N-déméthylation du citalopram sont biphasiques chez le chien. Les orthologues canins impliqués dans la première N-déméthylation semblent être identiques aux cytochromes P-450 humains. Par contre, dans la deuxième Ndéméthylation, un seul cytochrome P-450 semble être impliqué chez l'homme (CYP2D6), tandis qu'on retrouve jusqu'à cinq orthologues chez le chien. Le CYP2D15, orthologue canin du CYP2D6, est majoritairement impliqué. De plus, l'activité enzymatique, reflétée par les clairances intrinsèques, dans la première N-déméthylation est jusqu'à 45 fois plus élevée chez le chien comparé à l'homme. Ces différentes observations soutiennent l'hypothèse que des taux élevés de didéméthylcitalopram sont responsables de la toxicité du citalopram chez le chien. Nous pouvons conclure que plusieurs famille d'enzymes sont impliquées tant au niveau cérébral qu'hépatique dans la métabolisation de médicaments psychotropes. Sachant -que les enzymes peuvent être induits ou inhibés, il importe de pouvoir suivre au plus près les taux plasmatiques des différents psychotropes et de leurs métabolites. Summary Most of the drugs are metabolized in the organism. Substances issued from this metabolic activity do not always show a pharmacological activity. Therefore, it is necessary to monitor plasmatic levels of drugs and their metabolites, and establish the relationship with the clinical effect. This concept named therapeutic drug monitoring is very useful in psychiatry where lack of compliance is commonly observed. Antidepressants are mainly metabolized in the liver (cytochrome P-450) and sometimes in the brain (monoamine oxidase) like the citalopram, for exemple. A LC-MS method was developed, which allows the simultaneous analysis of R-(-) and S-(+) enantiomers of mirtazapine, an antidepressant acting specifically on noradrenergic and serotonergic receptors, and its metabolites demethylmirtazapine and 8-hydroxymirtazapine in plasma of mirtazapine treated patients. Preliminary data obtained suggested that R-(-) mirtazapine concentrations were higher than those of S-(+) mirtazapine, except in patients comedicated with CYP2D6 inhibitors such as fluoxetine or thioridazine. There is an enantioselectivity in the metabolism of mirtazapine. In particular for the 8-hydroxymirtazapine, which is glucuroconjugated and S/R ratio varies considerably. Therefore this method seems to be suitable for the stereoselective assay of mirtazapine and its metabolites in plasma of patients comedicated with mirtazapine and other drugs for routine and research purposes. P-glycoprotein is working as an efflux transporter of xenobiotics from intracellular to extracellular environment. Its induction or inhibition, although less studied than cytochrome P-450, has huge clinical implications in terms of treatment efficacy and toxicity. An extensive literature search on P-glycoprotein was performed as part of this thesis. The study of citalopram metabolism, an antidepressant belonging to the class of selective serotonin reuptake inhibitors. This substance undergoes a complex metabolism. First metabolization route leading to citalopram propionic acid, catalyzed by monoamine oxidase was studied in vitro in mice brain mitochondria. Monoamine oxidase A catalyzed the formation of R-(-) enantiomer and showed greater affinity for tertiary amines, whereas monoamine oxidase B triggered the formation of S-(+) enantiomer and demonstrated higher affinity for primary and secondary amines. citalopram evaluation in adult Tg8 mice showed that monoamine oxidase B compensated monoamine oxidase A deficiency in those genetically transformed mice. The second metabolization route of citalopram leading to didemethylcitalopram and catalyzed by cytochrome P-450 was studied in vitro in Beagle dog's livers. Our results showed that citalopram N-demethylation kinetics are biphasic in dogs. Canine orthologs involved in the first N-demethylation seemed to be identical to human cytochromes P-450. However, in the second N-demethylation only one cytochrome P-450 seemed to be involved in human (CYP2D6), whereas up to five canine orthologs were found in dogs. CYP2D15 canine ortholog of CYP2D6 was mainly involved. In addition, enzymatic activity reflected by intrinsic clearance in the first N-demethylation was up to 45 fold higher in dogs compared to humans. Those observations support the assumption that elevated rates of didemethylcitalopram are responsible for citalopram toxicity in dogs. We can conclude that several enzymes groups are involved in the brain, as well as in the liver, in antidepressant metabolization. Knowing that enzymes may be induced or inhibited, it makes sense to closely monitor plasmatic levels of antidepressants and their metabolites.

The alpha1-adrenergic receptors in cardiac hypertrophy: Signaling mechanisms and functional implications.

Cardiac hypertrophy is a complex remodeling process of the heart induced by physiological or pathological stimuli resulting in increased cardiomyocyte size and myocardial mass. Whereas cardiac hypertrophy can be an adaptive mechanism to stressful conditions of the heart, prolonged hypertrophy can lead to heart failure which represents the primary cause of human morbidity and mortality. Among G protein-coupled receptors, the α1-adrenergic receptors (α1-ARs) play an important role in the development of cardiac hypertrophy as demonstrated by numerous studies in the past decades, both in primary cardiomyocyte cultures and genetically modified mice. The results of these studies have provided evidence of a large variety of α1-AR-induced signaling events contributing to the defining molecular and cellular features of cardiac hypertrophy. Recently, novel signaling mechanisms have been identified and new hypotheses have emerged concerning the functional role of the α1-adrenergic receptors in the heart. This review will summarize the main signaling pathways activated by the α1-AR in the heart and their functional implications in cardiac hypertrophy.

Role of immunoglobulin E and mast cells in murine models of asthma

Immunoglobulin E (IgE) and mast cells are believed to play important roles in allergic inflammation. However, their contributions to the pathogenesis of human asthma have not been clearly established. Significant progress has been made recently in our understanding of airway inflammation and airway hyperresponsiveness through studies of murine models of asthma and genetically engineered mice. Some of the studies have provided significant insights into the role of IgE and mast cells in the allergic airway response. In these models mice are immunized systemically with soluble protein antigens and then receive an antigen challenge through the airways. Bronchoalveolar lavage fluid from mice with allergic airway inflammation contains significant amounts of IgE. The IgE can capture the antigen presented to the airways and the immune complexes so formed can augment allergic airway response in a high-affinity IgE receptor (FcepsilonRI)-dependent manner. Previously, there were conflicting reports regarding the role of mast cells in murine models of asthma, based on studies of mast cell-deficient mice. More recent studies have suggested that the extent to which mast cells contribute to murine models of asthma depends on the experimental conditions employed to generate the airway response. This conclusion was further supported by studies using FcepsilonRI-deficient mice. Therefore, IgE-dependent activation of mast cells plays an important role in the development of allergic airway inflammation and airway hyperresponsiveness in mice under specific conditions. The murine models used should be of value for testing inhibitors of IgE or mast cells for the development of therapeutic agents for human asthma.

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 in human disease

Les maladies cardiovasculaires (MCV) demeurent au tournant de ce siècle la principale cause de mortalité dans le monde. Parmi les facteurs de risque, l’hypercholestérolémie et l’obésité abdominale sont directement liées au développement précoce de l’athérosclérose. L’hypercholestérolémie familiale, communément associée à une déficience des récepteurs des lipoprotéines de basse densité (LDLR), est connue comme cause de maladie précoce d’athérosclérose et de calcification aortique chez l’humain. La subtilisine convertase proprotéine/kexine du type 9 (PCSK9), membre de la famille des proprotéines convertases, est trouvée indirectement associée aux MCV par son implication dans la dégradation du LDLR. Chez l'humain, des mutations du gène PCSK9 conduisent soit à une hypercholestérolémie familiale, soit à une hypocholestérolémie, selon que la mutation entraîne un gain ou une perte de fonction, respectivement. Il demeure incertain si les individus porteurs de mutations causant un gain de fonction de la PCSK9 développeront une calcification aortique ou si des mutations entraînant une perte de fonction provoqueront une obésité abdominale. Dans cette étude, nous avons examiné : 1) l’effet d’une surexpression de PCSK9 dans le foie de souris sur la calcification aortique ; 2) les conséquences d’une déficience en PCSK9 (Pcsk9 KO), mimant une inhibition pharmacologique, sur le tissu graisseux. Nous avons utilisé un modèle de souris transgénique (Tg) surexprimant le cDNA de PCSK9 de souris dans les hépatocytes de souris et démontrons par tomographie calculée qu’une calcification survient de façon moins étendue chez les souris PCSK9 Tg que chez les souris déficientes en LDLR. Alors que le PCSK9 Tg et la déficience en LDLR causaient tous deux une hypercholestérolémie familiale, les niveaux seuls de cholestérol circulant ne parvenaient pas à prédire le degré de calcification aortique. Dans une seconde étude, nous utilisions des souris génétiquement manipulées dépourvues de PSCK9 et démontrons que l’accumulation de graisses viscérales (adipogenèse) apparaît régulée par la PCSK9 circulante. Ainsi, en l’absence de PCSK9, l’adipogenèse viscérale augmente vraisemblablement par régulation post-traductionnelle des récepteurs à lipoprotéines de très basse densité (VLDLR) dans le tissu adipeux. Ces deux modèles mettent en évidence un équilibre dynamique de la PCSK9 dans des voies métaboliques différentes, réalisant un élément clé dans la santé cardiovasculaire. Par conséquent, les essais d’investigations et d’altérations biologiques de la PCSK9 devraient être pris en compte dans un modèle animal valide utilisant une méthode sensible et en portant une attention prudente aux effets secondaires de toute intervention.

Données nouvelles sur l’innervation à dopamine du striatum et son co-phénotype glutamatergique

Une sous-population des neurones à dopamine (DA) du mésencéphale ventral du rat et de la souris étant connue pour exprimer l'ARN messager du transporteur vésiculaire 2 du glutamate (VGLUT2), nous avons eu recours à l'immunocytochimie en microscopie électronique, après simple ou double marquage de l'enzyme de synthèse tyrosine hydroxylase (TH) et de VGLUT2, pour déterminer la présence de l'une et/ou l'autre protéine dans les terminaisons (varicosités) axonales de ces neurones et caractériser leur morphologie ultrastructurale dans diverses conditions expérimentales. Dans un premier temps, des rats jeunes (P15) ou adultes (P90), ainsi que des rats des deux âges soumis à l'administration intraventriculaire cérébrale de la cytotoxine 6-hydroxydopamine (6-OHDA) dans les jours suivant la naissance, ont été examinés, afin d'étayer l'hypothèse d'un rôle de VGLUT2 au sein des neurones DA, au cours du développement normal ou pathologique de ces neurones. Chez le jeune rat, ces études ont montré: i) la présence de VGLUT2 dans une fraction importante des varicosités axonales TH immunoréactives du coeur du noyau accumbens ainsi que du néostriatum; ii) une augmentation de la proportion de ces terminaisons doublement marquées dans le noyau accumbens par suite de la lésion 6-OHDA néonatale; iii) le double marquage fréquent des varicosités axonales appartenant à l'innervation DA aberrante (néoinnervation), qui se développe dans la substance noire, par suite de la lésion 6-OHDA néonatale. Des différences significatives ont aussi été notées quant à la dimension des terminaisons axonales marquées pour la TH seulement, VGLUT2 seulement ou TH et VGLUT2. Enfin, à cet âge (P15), toutes les terminaisons doublement marquées sont apparues dotées d'une spécialisation membranaire synaptique, contrairement aux terminaisons marquées pour la TH ou pour VGLUT2 seulement. Dans un deuxième temps, nous avons voulu déterminer le devenir du double phénotype chez le rat adulte (P90) soumis ou non à la lésion 6-OHDA néonatale. Contrairement aux observations recueillies chez le jeune rat, nous avons alors constaté: i) l'absence complète de terminaisons doublement marquées dans le coeur du noyau accumbens et le néostriatum d'animaux intacts, de même que dans les restes de la substance noire des animaux 6-OHDA lésés; ii) une très forte baisse de leurnombre dans le coeur du noyau accumbens des animaux 6-OHDA lésés. Ces observations, suggérant une régression du double phénotype TH/VGLUT2 avec l'âge, sont venues renforcer l'hypothèse d'un rôle particulier d'une co-libération de glutamate par les neurones mésencéphaliques DA au cours du développement. Dans ces conditions, il est apparu des plus intéressants d'examiner l'innervation DA méso-striatale chez deux lignées de souris dont le gène Vglut2 avait été sélectivement invalidé dans les neurones DA du cerveau, ainsi que leurs témoins et des souris sauvages. D'autant que malgré l'utilisation croissante de la souris en neurobiologie, cette innervation DA n'avait jamais fait l'objet d’une caractérisation systématique en microscopie électronique. En raison de possibles différences entre le coeur et la coque du noyau accumbens, l'étude a donc porté sur les deux parties de ce noyau ainsi que le néostriatum et des souris jeunes (P15) et adultes (P70-90) de chaque lignée, préparées pour l'immunocytochimie de la TH, mais aussi pour le double marquage TH et VGLUT2, selon le protocole précédemment utilisé chez le rat. Les résultats ont surpris. Aux deux âges et quel que soit le génotype, les terminaisons axonales TH immunoréactives des trois régions sont apparues comparables quant à leur taille, leur contenu vésiculaire, le pourcentage contenant une mitochondrie et une très faible incidence synaptique (5% des varicosités, en moyenne). Ainsi, chez la souris, la régression du double phénotype pourrait être encore plus précoce que chez le rat, à moins que les deux protéines ne soient très tôt ségréguées dans des varicosités axonales distinctes des mêmes neurones DA. Ces données renforcent aussi l’hypothèse d’une transmission diffuse (volumique) et d’un niveau ambiant de DA comme élément déterminant du fonctionnement du système mésostriatal DA chez la souris comme chez le rat.

Rôle et implication du système cannabinoïde dans la modulation périphérique de la douleur inflammatoire et neuropathique

Les dérivés de l’opium (opioïdes) et du cannabis (cannabinoïdes) présentent de nombreuses propriétés intéressantes. Suite à l’identification de leurs récepteurs respectifs, diverses stratégies pharmacologiques ont tenté d’exploiter leurs propriétés analgésiques. Le clonage des récepteurs cannabinoïdes CB1 et CB2 a favorisé la découverte de composés endogènes pour ces récepteurs, les endocannabinoïdes, dont les deux plus étudiés sont l’anandamide et le 2-arachidonyl glycérol (2-AG). Cette découverte a également mené à l’identification d’enzymes qui catalysent l’inactivation de ces cannabinoïdes endogènes : une amidohydrolase des acides gras ou FAAH ainsi qu’une monoacylglycérol lipase ou MAGL. Le système cannabinoïde endogène est régulé à la hausse dans une variété de processus pathologiques, tels que les douleurs inflammatoire et neuropathique. Cette augmentation est habituellement interprétée comme une réaction physiologique visant à rétablir l’homéostasie et elle a notamment été observée en périphérie. Les endocannabinoïdes semblent donc agir de façon spécifique à des moments clés dans certains tissus ciblés afin de minimiser les conséquences reliées au déclenchement de ces douleurs. Cette observation est très intéressante d’un point de vue thérapeutique puisqu’elle suggère la possibilité de cibler les enzymes de dégradation des endocannabinoïdes dans le but d’augmenter leurs concentrations locales et d’ainsi prolonger leur action neuromodulatrice. En périphérie, l’activation des récepteurs cannabinoïdes induit des effets antinociceptifs bénéfiques tout en minimisant les effets indésirables souvent associés à leur activation centrale. Nous avons orienté nos travaux vers la modulation périphérique de ce système endogène à l’aide d’inhibiteurs des enzymes de dégradation des endocannabinoïdes afin d’évaluer leur potentiel thérapeutique et d’élucider les mécanismes d’action qui sous-tendent leurs effets dans des modèles animaux de douleurs inflammatoire et neuropathique. Nous avons démontré que cette approche permet de soulager les symptômes associés à ces deux types de douleurs, et ce via les récepteurs CB1 et CB2. Les systèmes cannabinoïde et opioïde présentent des similitudes, dont des localisations similaires le long des voies de la douleur, des mécanismes d’action relayés par des récepteurs couplés aux protéines G et des propriétés pharmacologiques communes telles que l’analgésie. Le système opioïde est impliqué dans les effets antinociceptifs induits par les cannabinoïdes. À l’inverse, le rôle joué par le système cannabinoïde dans ceux induits par la morphine demeure incertain. Nous avons démontré que les effets antinociceptifs périphériques et spinaux produits par la morphine sont diminués chez les souris génétiquement modifiées chez lesquelles l’expression des récepteurs CB1 ou CB2 a été éliminée, laissant supposer un rôle pour ces récepteurs dans les effets de la morphine. Nous avons de plus démontré que la diminution de l'analgésie produite par la morphine dans ces souris n'est pas causée par un dysfonctionnement des récepteurs opioïdes mu (MOP) ni par une régulation à la baisse de ces récepteurs. Nos résultats confirment l'existence d'interactions fonctionnelles entre les systèmes cannabinoïde et opioïde au niveau périphérique et spinal. Ces observations sont prometteuses d’un point de vue thérapeutique puisqu’une modulation périphérique ciblée des niveaux d’endocannabinoïdes et d’opioïdes endogènes permettrait de produire des effets analgésiques bénéfiques potentiellement synergiques tout en minimisant les effets indésirables associés à l’activation centrale de ces systèmes.

Differences in the number of hemocytes in the snail host Biomphalaria tenagophila, resistant and susceptible to Schistosoma mansoni infection

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Ethanol intake-induced apoptosis in glial cells and axonal disorders in the cerebellar white matter of UChA rats (voluntary ethanol consumers)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Die Rolle des Fibronektins im Knochen und in der diabetischen Nephropathie

Diese Arbeit befasst sich mit der Rolle des Fibronektins im Knochen sowie in der diabetischen Nephropathie. Fibronektin im Knochen: Es war bekannt, dass Osteoblasten für ihre Differenzierung in vitro Fibronektin benötigen, dass Fibronektin für die Ausbildung einer Kollagenmatrix erforderlich ist und für die Matrixintegrität eine kontinuierliche Fibronektin-Versorgung gewährleistet sein muss. Um die Rolle des Fibronektins im Knochen, dessen Matrix zu 90% aus Kollagen besteht, näher zu untersuchen, wurde das Fibronektin der Osteoblasten spezifisch über das Cre/loxP-System in Mäusen ausgeschaltet. Dies führte zu einer erhöhten Anzahl an Osteoblasten, deren Fähigkeit die Matrix zu mineralisieren jedoch beeinträchtigt war. Dennoch zeigte sich kein Einfluss auf die Eigenschaften der Knochenmatrix. Insbesondere war der Fibronektingehalt nicht vermindert, entgegen der allgemeinen Annahme, dass die Osteoblasten die Produzenten des Fibronektins der Knochenmatrix seien. Im Gegensatz dazu stellte sich durch Untersuchungen an anderen genetisch veränderten Mäusen heraus, dass eine Ausschaltung des Plasmafibronektins im Blut zu einer deutlichen Verringerung des Fibronektingehalts des Knochens sowie zu einer Verminderung des Mineralgehalts bezogen auf die Proteinmenge führte. Auch die Komposition des Minerals war verändert. Da es jedoch keinen nennenswerten Effekt auf die Knochenzellen gab, lässt sich schlussfolgern, dass die Osteoblasten-spezifische Fibronektin-Isoform für eine regelgerechte Funktion der Osteoblasten notwendig ist, während das von der Leber produzierte Plasmafibronektin die Zusammensetzung der Knochenmatrix beeinflusst. Fibronektin in der diabetischen Niere: Mit der diabetischen Nephropathie geht eine Ausdehnung des Mesangiums in den Glomeruli einher, die mit dem Ausmaß des Nierenschadens korreliert ist. Fibronektin ist ein Bestandteil dieses expandierten Mesangiums. Vorarbeiten hatten gezeigt, dass injiziertes Fibronektin durch die Blutzirkulation in die Niere gelangt und in der Mesangialmatrix der Glomeruli eingelagert wird. Daher wurden in konditionellen Knockout-Mäusen das Plasmafibronektin bzw. das Fibronektin der Mesangialzellen und das Plasmafibronektin zugleich ausgeschaltet. In diesen Mäusen wurde ein Diabetes mellitus induziert und die Tiere für 22 Wochen mit Diabetes gehalten. Die Ausschaltung des Fibronektins hatte eine geringere Ausbreitung der Mesangialmatrix sowie eine geringere Mortalität der Tiere zur Folge. Interessanterweise schien das Plasmafibronektin alleine bereits grob ein Drittel der Ausdehnung des Mesangiums zu verursachen. Die kombinierte Ausschaltung von zirkulierendem und lokalem Fibronektin vermochte die Expansion der Mesangialmatrix sogar beinahe zu halbieren. Zusammengefasst zeigten sich neue Rollen eines traditionellen Proteins der Extrazellulärmatrix in physiologischen und pathologischen Zuständen. Einige dieser Aspekte demonstrieren die große Bedeutung der Fibronektin-Produktion durch die Leber.