Caracterização e diversidade genética de isolados de Phytophthora spp. do cacaueiro com base em marcadores RAPD

Objetivou-se neste trabalho estudar a diversidade genética entre isolados das três principais espécies do gênero Phytophthora causadoras da podridão-parda do cacaueiro (Theobroma cacao) no Brasil, utilizando marcadores moleculares RAPD. Foram utilizados 22 isolados de Phytophthora spp., sendo oito de P. capsici, cinco de P. palmivora e nove de P. citrophthora. DNA genômico de cada isolado foi extraído e amplificado utilizando-se sete "primers" decâmeros, os quais geraram 191 marcadores RAPD. Distâncias genéticas e análises de agrupamento realizadas com base nestes marcadores permitiram uma diferenciação clara dos isolados de cada espécie e mostraram diferentes níveis de diversidade intra-específica. Ficou evidente o potencial dos marcadores RAPD como uma ferramenta auxiliar na classificação dos isolados e, também, em estudos de diversidade genética intra-específica.

Marcadores morfofisiológicos e isoenzimáticos na análise da diversidade genética de isolados de Acremonium strictum

Os fungos Acremonium strictum e Fusarium verticillioides normalmente apresentam algumas similaridades morfológicas. Este fator dificulta sua diferenciação em sementes, particularmente quando ocorrem simultaneamente. A análise de isoenzimas tem possibilitado o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis e específicos no diagnóstico de fitopatógenos em complemento à análise morfológica. Este trabalho objetivou caracterizar e dimensionar a diversidade genética de dez isolados de A. strictum obtidos de sementes de milho (Zea mays), provenientes de diferentes regiões produtoras brasileiras por meio da análise de nove marcadores morfofisiológicos e de cinco sistemas isoenzimáticos (aldolase, esterase, fosfatase ácida, fosfatase alcalina e malato desidrogenase). Objetivou-se ainda diferenciar os isolados de A. strictum de F. verticillioides por meio das técnicas citadas. A eletroforese de isoenzimas forneceu um total de 28 bandas polimórficas. Aspectos como pigmentação da colônia, velocidade e taxa de crescimento, produção de massa e densidade miceliais, e a análise isoenzimática tornaram possível e seguro o agrupamento de isolados de A. strictum e sua diferenciação de F. verticillioides. Os isolados de A. strictum apresentaram variabilidade intraespecífica entre 0% e 89,5%. Para a maioria dos casos não foi possível correlacionar a similaridade fenotípica com a origem geográfica dos isolados de A. strictum.

Marcadores RAPD na análise da diversidade genética de isolados de Acremonium strictum

Os fungos Acremonium strictum e Fusarium verticillioides normalmente apresentam algumas similaridades morfológicas, o que dificulta sua diferenciação em sementes de milho (Zea mays), particularmente quando ocorrem simultaneamente. Técnicas moleculares de análise do DNA têm possibilitado o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis eespecíficos no diagnóstico de fitopatógenos, em complemento à análise morfológica. Este trabalho objetivou caracterizar e dimensionar a diversidade genética de dez isolados de A. strictum obtidos de sementes de milho, provenientes de diferentes regiões produtoras brasileiras, por meio da análise do DNA genômico (RAPD). Objetivou-se ainda, diferenciar os isolados de A. strictum de F. verticillioides por meio da técnica citada. Pela análise do DNA, 25 primers Operon geraram polimorfismos, os quais tornaram possível e seguro o agrupamento de isolados de A. strictum e sua diferenciação de F. verticillioides. Os isolados de A. strictum apresentaram variabilidade intraespecífica entre 3,4% e 44,4%. Para a maioria dos casos não foi possível correlacionar a similaridade genotípica e a origem geográfica dos isolados de A. strictum.

Isoenzimas na diferenciação de sementes de três espécies do gênero Euterpe

A análise e o estudo das características morfológicas de sementes e plântulas de palmito-vermelho (Euterpe espiritosantensis Fernandes), juçara (E. edulis Mart.) e açaí (E. oleracea Mart.) não permitem que o analista de sementes, ou o melhorista, faça a identificação e a diferenciação inequívoca das espécies. Neste trabalho, buscou-se avaliar o potencial discriminante da técnica de eletroforese para sementes dessas espécies, utilizando-se nove sistemas enzimáticos. Foram realizadas análises de eletroforese de isoenzimas, testando-se 30 embriões (0 a 1 mm de protrusão) de cada espécie, por corrida e por sistema enzimático. Para a identificação das bandas e determinação do perfil eletroforético foram realizadas, no mínimo, 30 corridas por sistema enzimático avaliado, em gel de poliacrilamida (7,5%). Constatou-se que, dentre as isoenzimas testadas, a polifenol-oxidase e a fosfatase-ácida mostraram-se instáveis, raramente possibilitando a visualização das bandas. As isoenzimasalfa e beta-esterase nem sempre possibilitaram o aparecimento de bandas visíveis, principalmente para E. espiritosantensis, mas foram capazes de distinguir E. edulis de E. oleracea. A glucose-6-fosfato desidrogenase e a glutamato-desidrogenase revelaram perfis eletroforéticos nítidos em todas as corridas, mas a posição das bandas não permitiu a diferenciação das três espécies estudadas. As isoenzimas mais eficientes na avaliação da pureza genética e na diferenciação das sementes foram fosfoglucomutase, fosfoglucose isomerase e peroxidase, por apresentarem perfis eletroforéticos distintos.

Diversidade genética e tamanho efetivo de duas populações de Myracrodruon urundeuva Fr. All., sob conservação ex situ

O objetivo deste trabalho foi investigar a diversidade, a estrutura genética e o tamanho efetivo, retido em um banco de germoplasma, de duas populações de Myracrodruon urundeuva Fr. All. (aroeira), procedentes de Aramina-SP e Selvíria-MS. As populações foram avaliadas a partir da amostragem de 25 progênies de polinização aberta de cada população. De cada progênie, 17 a 20 indivíduos foram amostrados e genotipados para oito locos microssatélites. Os maiores valores para o número total de alelos (At), número médio de alelos por loco (A), número efetivo de alelos (Ae), heterozigosidade observada (H0) e esperada (He) foram detectados na população Selvíria (At = 105, A = 13,13, Ae = 3,98, H0 = 0,669 e He = 0,749), enquanto Aramina teve At = 94, A = 13,75, Ae = 3,10, H 0 = 0,535 e He = 0,678. A diferenciação nas frequências alélicas das duas populações, com relação ao pólen cruzado (0,159) e do óvulo (0,235), indica que cerca de 84% e 77%, respectivamente, da diversidade genética está dentro das populações. O coeficiente médio de coancestria foi maior (Selvíria Θ = 0,165, Aramina Θ = 0,169) e o tamanho efetivo médio das progênies (Selvíria Ne(v) = 3,04, Aramina Ne(v) = 2,69) foi menor do que o esperado em progênies de populações panmíticas (Θ = 0,125, Ne(v) = 4). O tamanho efetivo total retido no banco ex situ foi estimado em 67,5 na população Selvíria e 71,1 na população Aramina, valores menores do que o requerido (Ne = 150) para a conservação de populações em curto prazo. Entretanto, as duas populações apresentaram alta diversidade genética, o que as qualifica para serem utilizadas em programas de conservação e melhoramento genético da espécie, desde que seja aumentado o tamanho efetivo populacional conservado ex situ.

DIVERSIDADE CULTURAL, MORFOLÓGICA E GENÉTICA DE DIAZOTRÓFICOS ISOLADOS DE NÓDULOS DE BRACATINGA1

RESUMO O nitrogênio é um dos macronutrientes essenciais aos seres vivos, o que o torna um dos fatores limitantes para o crescimento vegetal. Apenas uma parcela dos procariotos, os diazotróficos, possui a capacidade de reduzir o nitrogênio atmosférico para outras formas disponíveis às plantas. A bracatinga é uma espécie arbórea de importância econômica capaz de estabelecer simbiose mutualística com organismos diazotróficos, sendo os seus principais usos: produção de energia, madeira, forragem, indústria química de produtos naturais, apicultura, paisagismo e sombreamento e recuperação de áreas degradadas e zonas ripárias. Este estudo objetivou estabelecer relação entre a diversidade cultural e morfológica e a variabilidade genética dos isolados nodulantes em bracatinga de diferentes condições edafoclimáticas. Coletaram-se nódulos radiculares retirados ao acaso em sete áreas compreendidas entre o Vale do Itajaí, Planalto Sul e Meio-Oeste do Estado de Santa Catarina. Foi observada ampla diversidade cultural entre os diazotróficos presentes, havendo predomínio de isolados de rápido crescimento, de colônia com coloração branca leitosa, formato circular, borda lisa e superfície mucoide. Entre os parâmetros avaliados, a transparência da colônia, a produção de muco e a alteração do pH foram considerados relevantes para a diferenciação dos isolados. A caracterização taxonômica dos isolados foi realizada por comparação dos fragmentos sequenciados, sendo as espécies isoladas deste conjunto amostral pertencentes aos gêneros Burkholderia, Pantoea, Pseudomonas e Rhizobium.

Identificação e diferenciação de herpesvírus bovino tipos 1 e 5 isolados de amostras clínicas no Centro-Sul do Brasil, Argentina e Uruguai (1987-2006)

Os herpesvírus bovino tipos 1 e 5 (BoHV-1; BoHV-5) são genética e antigenicamente muito semelhantes e por isso são indistinguíveis pela maioria dos testes diagnósticos. Como o BoHV-1 tem sido classicamente associado com doença respiratória e genital, os herpesvírus isolados dessas enfermidades têm sido provisoriamente - e às vezes definitivamente - identificados como BoHV-1. Da mesma forma, os casos de infecção neurológica por herpesvírus em bovinos têm sido atribuídos em sua totalidade ao BoHV-5. Este trabalho relata a identificação de 40 amostras de herpesvírus isoladas de diferentes casos clínicos na região Centro-Sul do Brasil, Argentina e Uruguai entre 1987 e 2006, pelo uso de um PCR capaz de diferenciar esses vírus. As amostras identificadas como BoHV-1 (n=16) foram isoladas de doença respiratória (n=3), balanopostite e/ou vulvovaginite (n=3), do sêmen de touros saudáveis (n=5) e de casos doença neurológica (n=5). As amostras virais identificadas como BoHV-5 (n=24) foram em sua maioria isoladas de doença neurológica (n=21), mas também do sêmen de touros saudáveis (n=2) e do baço de um bezerro com doença sistêmica (n=1). Esses resultados demonstram que tanto o BoHV-1 como o BoHV-5 não estão estritamente associados às suas respectivas síndromes clínicas e que podem estar freqüentemente envolvidos em casos clínicos classicamente atribuídos ao outro vírus. Esses achados também reforçam a necessidade de se identificar corretamente os isolados de herpesvírus para um melhor conhecimento da sua patogenia e epidemiologia.

Conservação genética de populações de Cryptocarya moschata Nees (Lauraceae) na Mata Atlântica do estado de São Paulo

Através da análise de 18 locos isoenzimáticos polimórficos, foram estimadas as freqüências alélicas referentes a 214 indivíduos adultos de quatro populações naturais de Cryptocarya moschata de duas regiões do estado de São Paulo. Com base nas heterozigosidades observadas e esperadas, foram obtidas estimativas das estatísticas F de Wright. Para fins de comparação, utilizou-se também o método da análise da variância para estimação dos parâmetros correspondentes F = FIT, qP= FST e f = FIS. Os dois métodos forneceram resultados bastante concordantes: IT = 0,142; ST = 0,140; IS = 0,002 e = 0,116; P = 0,123 e = ­0,008, indicando que os indivíduos dentro das populações devem ser panmíticos e que a diversidade entre populações é bastante alta, sendo similar à que se espera para famílias com estruturação de meios-irmãos. Calculando P com as populações tomadas duas a duas, notou-se tendência de P crescer com a distância geográfica o que sugere tendência de isolamento pela distância. O fluxo gênico foi estimado em 0,9 indivíduos por geração, o que corrobora a pronunciada diferenciação populacional encontrada. Devido ao valor negligível encontrado de IS, o tamanho efetivo de variância de cada população é equivalente ao número de indivíduos amostrados. As estratégias de manejo e conservação necessárias para a preservação da alta variabilidade genética intrapopulacional de C. moschata implicam na manutenção de populações com número grande de indivíduos. Além disso, para a preservação da espécie como um todo, a manutenção de muitas populações provavelmente é necessária.

Estrutura genética em populações naturais de Tibouchina papyrus (pau-papel) em áreas de campo rupestre no cerrado

O presente trabalho teve como objetivo utilizar marcadores RAPD para conhecer a variabilidade genética de populações de Tibouchina papyrus (Pohl) Toledo, provenientes da região de Serra Dourada e Serra dos Pirineus, no Estado de Goiás. Os seis iniciadores RAPD produziram um total de 147 locos, variando entre 23 e 26 por iniciador. A avaliação hierárquica da estruturação da variabilidade genética, realizada pela a AMOVA, considerando a existência de duas regiões (Serra dos Pirineus e Serra Dourada) apresentou uma estimativa de F ST = 0,3439. O valor do componente entre regiões (F CT) foi igual a 18,96% e a variação entre populações dentro de regiões igual a 15,43%. As estimativas de fluxo gênico sugerem a existência de uma baixa proporção de migrantes entre populações. As análises multivariadas (UPGMA e NMDS) indicam que existe uma relação entre distância genética e espaço geográfico, hipótese esta que foi confirmada por uma análise de padrão espacial utilizando o teste de Mantel (r = 0,71; P = 0,015 com 1000 permutações aleatórias). Os resultados indicam assim que esta estrutura tenha se originado seguindo um modelo de diferenciação estocástica (neutro), ou seja, por um balanço entre fluxo gênico a curtas distâncias e deriva genética nas populações. Os valores de diversidade genética obtidos apóiam a hipótese de que a espécie T. papyrus é uma espécie xenógama facultativa e o fato de não serem encontrados altos níveis de homozigose, indica que devem existir mecanismos relacionados à biologia reprodutiva da espécie, que previnem, de alguma maneira, a ocorrência de elevadas taxas de endogamia, que poderia ter um efeito deletério em médio e longo prazo.

Variabilidade genética em populações ameríndias e asiáticas : região 16p13.3 e inserções Alu

Um estudo envolvendo populações asiáticas e ameríndias foi realizado para avaliar os relacionamentos históricos e genéticos entre eles através de polimorfismos moleculares autossômicos. Um deles é uma seqüência polimórfica localizada na região 16p13.3. Um total de 1558 pares de base foram investigados em 98 indivíduos da Mongólia, Beringia e das Américas. Estes resultados foram comparados com aqueles obtidos em uma prévia investigação por outros autores. Cinqüenta e cinco sítios polimórficos foram classificados em trinta e cinco haplótipos. Uma árvore de haplótipos (median joining network) baseada neles, revelou dois grupos distintos, um mais compacto com haplótipos derivados das cinco categorias etno-geográficas estabelecidas; enquanto o outro, com haplótipos mais divergentes, era composto principalmente por africanos e ameríndios. Quase todos os parâmetro de neutralidade apresentaram valores negativos. Simulações realizadas para interpretar estes resultados foram executadas com dois conjuntos de dados: um composto exclusivamente de ameríndios e outro com populações mundiais. O primeiro, sugerindo crescimento e declínio populacional, rejeitou os cenários com crescimento abaixo de cinco vezes e anteriores a ~18 mil anos atrás; enquanto que o segundo, sugerindo crescimento populacional, não rejeitou cenários nos quais a magnitude de crescimento foi maior que dez vezes e anteriores a ~21 mil anos atrás, provavelmente refletindo um crescimento antigo fora da África. Doze polimorfismos de inserções Alu foram também estudados em 170 indivíduos pertencentes a 7 grupos nativos sul-americanos, 60 a dois siberianos, e 91 a dois mongóis. Estes dados foram integrados com aqueles de 488 indivíduos associados a outros 13 grupos, para determinar as relações entre asiáticos, Beringianos e ameríndios. Nestes três grupos, foi observado um decréscimo da heterozigosidade e da quantidade de fluxo gênico, na mesma ordem indicada acima. A solidez destas subdivisões foi demonstrada nas distâncias genéticas, nas análises de componentes principais, de variância molecular, no teste de Mantel, e numa abordagem Bayesiana de atribuição genética. Entretanto, não pode ser observada uma clara estrutura entre os nativos Sul-americanos, indicando a importância dos fatores dispersivos (deriva genética, efeito fundador) na sua diferenciação. A congruência dos resultados obtidos com os dois marcadores são: (a) não foi confirmada uma história de declínio populacional forte associado com a chegada do homem pré-histórico nas Américas; (b) os ameríndios não apresentaram estruturação clara dentro do continente e não se diferenciaram dos asiáticos do nordeste da Ásia (beringianos); e (c) o povo Aché foi o grupo mais divergente.

Análise da estabilidade genética de células-tronco mesenquimais humanas

Human multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs), also known as mesenchymal stem cells, have become an important and attractive therapeutic tool since they are easily isolated and cultured, have in vitro expansion potential, substantial plasticity and secrete bioactive molecules that exert trophic effects. The human umbilical cord as a cell source for cell therapy will help to avoid several ethical, political, religious and technical issues. One of the main issues with SC lines from different sources, mainly those of embryonic origin, is the possibility of chromosomal alterations and genomic instability during in vitro expansion. Cells isolated from one umbilical cord exhibited a rare balanced paracentric inversion, likely a cytogenetic constitutional alteration, karyotype: 46,XY,inv(3)(p13p25~26). Important genes related to cancer predisposition and others involved in DNA repair are located in 3p25~26. Titanium is an excellent biomaterial for bone-implant integration; however, the use can result in the generation of particulate debris that can accumulate in the tissues adjacent to the prosthesis, in the local bone marrow, in the lymph nodes, liver and spleen. Subsequently may elicit important biological responses that aren´t well studied. In this work, we have studied the genetic stability of MSC isolated from the umbilical cord vein during in vitro expansion, after the cryopreservation, and under different concentrations and time of exposition to titanium microparticles. Cells were isolated, in vitro expanded, demonstrated capacity for osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation and were evaluated using flow cytometry, so they met the minimum requirements for characterization as MSCs. The cells were expanded under different concentrations and time of exposition to titanium microparticles. The genetic stability of MSCs was assessed by cytogenetic analysis, fluorescence in situ hybridization (FISH) and analysis of micronucleus and other nuclear alterations (CBMN). The cells were able to internalize the titanium microparticles, but MSCs preserve their morphology, differentiation capacity and surface marker expression profiles. Furthermore, there was an increase in the genomic instability after long time of in vitro expansion, and this instability was greater when cells were exposed to high doses of titanium microparticles that induced oxidative stress. It is necessary always assess the risks/ benefits of using titanium in tissue therapy involving MSCs, considering the biosafety of the use of bone regeneration using titanium and MSCs. Even without using titanium, it is important that the therapeutic use of such cells is based on analyzes that ensure quality, security and cellular stability, with the standardization of quality control programs appropriate. In conclusion, it is suggested that cytogenetic analysis, FISH analysis and the micronucleus and other nuclear alterations are carried out in CTMH before implanting in a patient

Diversidade genética entre progênies e matrizes de rambutan

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Isoenzimas na diferenciação de sementes de três espécies do gênero Euterpe

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

caracterização in situ e estrutura genética de populações de Gossypium mustelinum

Gossypium mustelinum Miers ex Watt is the only cotton species native from Brazil. It is endemic of the semi-arid region from North-east of the country, where it occur near from resilient water sources. The threats to the in situ conservation of the populations are caused by human interference in its habitat, mainly by excessive cattle graze and deforestation. Establish efficient strategies of in situ conservation depend on the accomplishment of a diagnosis of how the specie is found in its natural environment, and the knowledge about the genetic structure of the populations. The objectives of this work were i) to determine the in situ conditions of two populations present in rivers from basin of Rio Paraguaçu at the Bahia State, ii) to evaluate the structure and genetic variability presented in both populations, iii) to establish in situ and ex situ conservation strategies. It were realized collection in november 2007, when was realized in situ characterization of G. mustelinum. SSR markers were used for analyze 218 genotypes deriving from two populations of the G. mustelinum, localized at Tocó river and the Capivara river. The allelic frequencies, the heterozigosity and the F statics were estimated. All the plants were classified as wild and natives, and there was no evidence of the use the plants or its parts. The populations showed different conservation conditions in situ. Few plantlets were found in sites with excessive cattle feed, an indication that the damages in young plants should be high enough to compromise the renovation of the populations. On the other hand, populations were well preserved when the anthropic damages was low or inexistent. The 14 SSR primer pairs amplified 17 loci with a medium number of 5 alleles per locus (a total of 85 alleles). The high level of endogamy estimated (FIS=0,808) and the low observed heterozygosity (H0=0,093) were indicatives that the populations reproduce mainly by selfing, geitonogamy and crosses between related individuals. The genetic diversity was high (HE=0,482) and the differentiation between the populations was very high (FST=0,328). At least two sites from both populations of G. mustelinum must be preserved to achieve suitable in situ conservation. Actions that preserve the gallery forest and keep the cattle away should implemented, and could be as simple as erecting a fence. It is not possible anticipated if the in situ preservation will be possible. Therefore collections and ex situ preservation of representative specimens are essential to conserve the genetic diversity of native G. mustelinum

Estrutura genética de populações de Amphobotrys ricini, agente causal do mofo cinzento da mamoneira

The gray mold, causal organism Amphobotrys ricini, is one of the major diseases of castor bean. Difficulties in managing plant disease arises form the limited understanding of the genetic structure of A. ricini, their complexity and variability make it difficult to control. Genetic structure can be used to infer the relative impact of different forces that influence the evolution of pathogen populations, that allow to predict the potencial for pathogen populations to envolve in agricultural ecosystems. Growers protect their crop by applying fungicides, but there aren t fungicides to provide significant control of gray mold of castor bean. The objectives of this work were use RAPD to determine the genetic structure of A. ricini subpopulations in Paraíba and assay the sensitivity of A. ricini isolates to azoxystrobin and carbendazim. To determine the genetic structure of A. ricini subpopulations in Paraíba, 23 isolates were colleted from two different geographic location (subpopulation). These isolates were analysed by RAPD using 22 random decamer primers, purchased from OPERON, produced a total of 80 markers polimorphics. The resulting matrixes were analysed using PopGene version 1.32. Sensitivity to azoxystrobin and carbendazim of 30 isolates, colleted form Paraíba and Alagoas, was estimated based on spore germination and colony growth inhibition. The stock solutions were added toV8 medium after sterilization to produce final concentrations of 0, 0.01, 0.1, 1, 10, and 100 µg/ml of carbendazim and 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1, and 10 µg/ml of azoxystrobin. All statistical analyses were performed using SAS to estimate the dose that inhibited fungal growth by 50% (ED50 values). The genetic diversity within subpopulations (Hs=0,271) accounted for 92% of the total genetic diversity (Ht=0,293), while genetic diversity between subpopulations (Gst = 0,075) represented only 7,5%. The estimated number of migrants per generation (NM ) was 6,15. Nei s average gene identity across 80 RAPD loci was 0,9468. Individual ED50 values, for the 30 isolates screened for their sensitivity to azoxystrobin, ranged From a maximum of 0,168 µg/ml to a minimum of 0,0036 µg/ml. The ED50 values for carbendazim varied within the range of 0,026 to 0,316 µg/ml