Efeitos in vitro e in vivo do extrato de glândulas salivares de fêmeas de carrapatos Rhipicephalus sanguineus com 2 dias de alimentação sobre modelos tumorais

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Investigação do perfil de metilação de genes candidatos a biomarcadores na endometriose

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Alterações epigenéticas do gene RASSF1 e investigação de modulação gene-específica por non-coding RNA em linhagens celulares derivadas de carcinomas mamários

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Impaired protamination and sperm DNA damage in a Nellore bull with high percentages of morphological sperm defects in comparison to normospermic bulls

The routine semen evaluation assessing sperm concentration, motility and morphology, does not identify subtle defects in sperm chromatin architecture. Bulls appear to have stable chromatin, with low levels of DNA fragmentation. However, the nature of fragmentation and its impact on fertility remain unclear and there are no detailed reports characterizing the DNA organization and damage in this species. The intensive genetic selection, the use of artificial insemination and in vitro embryo production associated to the cryopreservation process can contribute to the chromatin damage and highlights the importance of sperm DNA integrity for the success of these technologies. Frozen-thawed semen samples from three ejaculates from a Nellore bull showed high levels of morphological sperm abnormalities (55.8±5.1%), and were selected for complementary tests. Damage of acrosomal (76.9±8.9%) and plasma membranes (75.7±9.3%) as well as sperm DNA strand breaks (13.8±9.5%) and protamination deficiency (3.7±0.6%) were significantly higher compared to the values measured in the semen of five Nellore bulls with normospermia (24.3±3.3%; 24.5±6.1%; 0.6±0.5%; 0.4±0.6% for acrosome, plasma membrane, DNA breaks and protamine deficiency, respectively) (P<0.05). Motility and percentage of spermatozoa with low mitochondrial potential showed no differences between groups. This study shows how routine semen analyses (in this case morphology) may point to the length and complexity of sperm cell damage emphasizing the importance of sperm function testing.

Características físicas e morfológicas do sêmen de Bos taurus e Bos indicus antes e após a criopreservação

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FCAV

Avaliação dos constituintes proteicos do plasma seminal e da membrana plasmática se espermatozóides e sua correlação com a fertilidade de garanhões

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Avaliação da atividade da unidade epidermo-melânica e do dano dérmico no melasma

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Caracterização funcional e estrutural das proteínas RUV-1 e RUV-2 do fungo Neurospora crassa

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Estudo ultraestrutural da espermatogênese de Chinavia impicticornis, Edessa meditabunda, E. collaris e Thyanta perditor (Heteroptera: Pentatomidae)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Avaliação da ação da melatonina em células-tronco tumorais mamárias RE-positivas tratadas com disruptores estrogênicos: verificação da via do receptor de estrógeno mediada pelo gene OCT 4

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Produção de oócitos e embriões bubalinos: efeitos da época do ano e da adição de óleo essencial de Lippia origanoides na maturação in vitro

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Análise invasiva e não invasiva do fuso meiótico de oócitos humanos obtidos de ciclos estimulados: dados preliminares

OBJETIVOS: Avaliar a concordância entre as técnicas de microscopia de polarização e microscopia confocal na avaliação do fuso meiótico de oócitos humanos maturados in vivo. MÉTODOS: Estudo prospectivo que avaliou oócitos com o primeiro corpúsculo polar extruído obtidos de mulheres inférteis submetidas à estimulação ovariana para realização de injeção intracitoplasmática de espermatozoide. Os oócitos com o primeiro corpúsculo polar extruído foram avaliados por meio da microscopia de polarização e, imediatamente após, foram fixados e corados para avaliação dos microtúbulos e cromatina pela microscopia confocal de alto desempenho. Foram comparadas as técnicas de microscopia de polarização e confocal, de acordo com a visualização ou não do fuso meiótico pela microscopia de polarização e a presença ou não de anomalias meióticas à análise pela microscopia confocal. Foram calculados os intervalos de confiança, o índice de Kappa e a concordância entre as metodologias, considerando a análise da microscopia de imunofluorescência como padrão-ouro para avaliação de normalidade do fuso e distribuição cromossômica oocitária. RESULTADOS: Observou-se que 72,7% dos oócitos em metáfase II com fuso celular não visível à polarização apresentaram anormalidades meióticas à análise confocal e que 55,6% dos oócitos em metáfase II com fuso celular visível à polarização apresentaram-se como oócitos anormais à análise confocal. Somente 44,4% dos oócitos com fuso celular visível à polarização apresentaram-se como normais à análise confocal. A concordância entre os métodos foi de 51,1% (Kappa: 0,11; IC95% -0,0958 - 0,319). CONCLUSÕES: A baixa concordância entre a microscopia de polarização e a confocal na avaliação do fuso meiótico oocitário sugere que a visualização do fuso meiótico de oócitos humanos em metáfase II pela microscopia de polarização tem limitado o valor preditivo de normalidade meiótica oocitária.

Relação entre a quantidade de AgNORS, atividade proliferativa e o estágio de desenvolvimento placentário em equinos

As Regiões Organizadoras de Nucléolo (NORs - nucleolar organizer regions) são utilizadas para descrever regiões de cromatina coradas por Nitrato de Prata e estão relacionados com a atividade de síntese de RNAr e com a agilidade e rapidez na proliferação celular nos tecidos estudados. O objetivo deste trabalho foi relacionar a quantidade de AgNORs, a atividade proliferativa e o estágio da gestação em equinos, utilizando a coloração de Nitrato de Prata. Os anexos embrionários foram coletados, fixados em solução de formaldeído tamponado 10%, emblocadas em paraplast e submetidos à coloração de Nitrato de Prata. Os grupos foram determinados de acordo com a idade gestacional. A quantidade de NORs encontrada no cório no começo da gestação indica início da atividade celular e na medida em que a gestação avança, a quantidade de NORs aumenta, sugerindo maior atividade de síntese e aumento da sua importância na manutenção do feto. Ao contrário do que ocorre no cório, a quantificação das NORs foram maiores no final da gestação do que no inicio, sugerindo a estabilização destas membranas no final da gestação. A cinta coriônica e o saco vitelino foram encontrados no início da gestação e apresentaram grande quantidade de NORs, sugerindo função de síntese e proliferação no inicio da gestação, visto que suas funções é manutenção do embrião até a formação completa da placenta verdadeira (cório-alantoide). Concluímos que as membranas que se desenvolvem de maneira progressiva de acordo com o crescimento embrionário/fetal (cório, alantoide e âmnio) têm aumento no número de NORs e as membranas que involuem após a formação do embrião/feto (saco vitelino e cinta coriônica) têm um decréscimo neste número, sugerindo a diminuição da atividade proliferativa nestas membranas.

Localizzazione della topoisomerasi IB sui telomeri di S. cerevisiae e ruolo della sua attività catalitica sulle modificazioni istoniche

Il superavvolgimento del DNA nelle cellule, regolato dalle DNA Topoisomerasi, influenza molti processi biologici, quali la trascrizione, la replicazione, la ricombinazione ed il rimodellamento della cromatina. La DNA Topoisomerasi IB eucariotica, (Top1), è un enzima efficiente nella rimozione dei superavvolgimenti del DNA in vitro e la sua principale funzione cellulare è la rimozione dei superavvolgimenti positivi e negativi generati durante la trascrizione e la replicazione. Risultati recenti hanno fornito evidenze sperimentali del coinvolgimento di Top1 in meccanismi multipli di regolazione dell’espressione genica eucariotica, in particolare nella fase di inizio e maturazione dei trascritti. Tuttavia, le funzioni di Top1 non sono ancora state stabilite a livello globale. Pertanto, nella presente tesi di dottorato abbiamo risposto a questa domanda con l’analisi dei profili di trascrizione genica globale e con studi di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in cellule di S. cerevisiae. Circa il 9% dei geni sono influenzati da Top1, e l’analisi dei profili di espressione mostra che Top1 wt aumenta l’utilizzo del glucosio e dei pathway per la produzione di energia, con specifica diminuzione della trascrizione dei geni telomerici e subtelomerici. Abbiamo inoltre dimostrato che Top1 wt, ma non il suo mutante inattivo, aumenta la velocità di crescita cellulare nelle cellule di lievito studiate. Le analisi di ChIP mostrano che, in confronto all’assenza dell’enzima, Top1 wt diminuisce l’acetilazione dell’istone H4, compresa quella specifica della lisina 16, nel telomero destro del cromosoma XIV mentre la mutazione che inattiva l’enzima aumenta in maniera marcata l’acetilazione dell’istone H4 e la di-metilazione della lisina 4 dell’istone H3. Top1 wt incrementa anche il reclutamento di Sir3 nelle regioni di confine della cromatina silenziata dello stesso telomero. Studi di immunoprecipitazione indicano che l’enzima interagisce direttamente con la struttura della cromatina telomerica poichè entrambe le proteine, quella wt e quella inattiva, sono localizzate sulle ripetizioni telomeriche dei cromosomi di lievito. Questi risultati dimostrano che Top1, una proteina non essenziale in lievito, ottimizza i livelli globali dei trascritti per una crescita più efficiente di cellule in fase esponenziale. Indagando il meccanismo che è alla base della specifica repressione dei geni telomerici, abbiamo dimostrato che Top1 favorisce delle modifiche posttraduzionali degli istoni che indicano una struttura della cromatina repressa nelle regioni telomeriche.

Caratterizzazione mediante HPLC-MS di modifiche post-trasduzionali di proteine istoniche

Gli istoni sono proteine basiche che possono essere classificate in varie classi: H1, H2A, H2B, H3 e H4. Queste proteine formano l’ottamero proteico attorno al quale si avvolge il DNA per formare il nucleosoma che è l’unità fondamentale della cromatina. A livello delle code N-terminali, gli istoni possono essere soggetti a numerose modifiche posttraduzionali quali acetilazioni, metilazioni, fosforilazioni, ADP-ribosilazioni e ubiquitinazioni. Queste modifiche portano alla formazione di diversi siti di riconoscimento per diversi complessi enzimatici coinvolti in importanti processi come la riparazione e la replicazione del DNA e l’assemblaggio della cromatina. La più importante e la più studiata di queste modifiche è l’acetilazione che avviene a livello dei residui amminici della catena laterale dell’amminoacido lisina. I livelli corretti di acetilazione delle proteine istoniche sono mantenuti dall’attività combinata di due enzimi: istone acetil transferasi (HAT) e istone deacetilasi (HDAC). Gli enzimi appartenenti a questa famiglia possono essere suddivisi in varie classi a seconda delle loro diverse caratteristiche, quali la localizzazione cellulare, la dimensione, l’omologia strutturale e il meccanismo d’azione. Recentemente è stato osservato che livelli aberranti di HDAC sono coinvolti nella carcinogenesi; per questo motivo numerosi gruppi di ricerca sono interessati alla progettazione e alla sintesi di composti che siano in grado di inibire questa classe enzimatica. L’inibizione delle HDAC può infatti provocare arresto della crescita cellulare, apoptosi o morte cellulare. Per questo motivo la ricerca farmaceutica in campo antitumorale è mirata alla sintesi di inibitori selettivi verso le diverse classi di HDAC per sviluppare farmaci meno tossici e per cercare di comprendere con maggiore chiarezza il ruolo biologico di questi enzimi. Il potenziale antitumorale degli inibitori delle HDAC deriva infatti dalla loro capacità di interferire con diversi processi cellulari, generalmente non più controllati nelle cellule neoplastiche. Nella maggior parte dei casi l’attività antitumorale risiede nella capacità di attivare programmi di differenziamento, di inibire la progressione del ciclo cellulare e di indurre apoptosi. Inoltre sembra essere molto importante anche la capacità di attivare la risposta immunitaria e l’inibizione dell’angiogenesi. Gli inibitori delle HDAC possono essere a loro volta classificati in base alla struttura chimica, alla loro origine (naturale o sintetica), e alla loro capacità di inibire selettivamente le HDAC appartenenti a classi diverse. Non è ancora chiaro se la selettività di queste molecole verso una specifica classe di HDAC sia importante per ottenere un effetto antitumorale, ma sicuramente inibitori selettivi possono essere molto utili per investigare e chiarire il ruolo delle HDAC nei processi cellulari che portano all’insorgenza del tumore. Nel primo capitolo di questa tesi quindi è riportata un’introduzione sull’importanza delle proteine istoniche non solo da un punto di vista strutturale ma anche funzionale per il destino cellulare. Nel secondo capitolo è riportato lo stato dell’arte dell’analisi delle proteine istoniche che comprende sia i metodi tradizionali come il microsequenziamento e l’utilizzo di anticorpi, sia metodi più innovativi (RP-LC, HILIC, HPCE) ideati per poter essere accoppiati ad analisi mediante spettrometria di massa. Questa tecnica consente infatti di ottenere importanti e precise informazioni che possono aiutare sia a identificare gli istoni come proteine che a individuare i siti coinvolti nelle modifiche post-traduzionali. Nel capitolo 3 è riportata la prima parte del lavoro sperimentale di questa tesi volto alla caratterizzazione delle proteine istoniche mediante tecniche cromatografiche accoppiate alla spettrometria di massa. Nella prima fase del lavoro è stato messo a punto un nuovo metodo cromatografico HPLC che ha consentito di ottenere una buona separazione, alla linea di base, delle otto classi istoniche (H1-1, H1-2, H2A-1, H2A-2, H2B, H3-1, H3-2 e H4). La separazione HPLC delle proteine istoniche ha permesso di poter eseguire analisi accurate di spettrometria di massa mediante accoppiamento con un analizzatore a trappola ionica tramite la sorgente electrospray (ESI). E’ stato così possibile identificare e quantificare tutte le isoforme istoniche, che differiscono per il tipo e il numero di modifiche post-traduzionali alle quali sono soggette, previa estrazione da colture cellulari di HT29 (cancro del colon). Un’analisi così dettagliata delle isoforme non può essere ottenuta con i metodi immunologici e permette di eseguire un’indagine molto accurata delle modifiche delle proteine istoniche correlandole ai diversi stadi della progressione del ciclo e alla morte cellulare. Il metodo messo a punto è stato convalidato mediante analisi comparative che prevedono la stessa separazione cromatografica ma accoppiata a uno spettrometro di massa avente sorgente ESI e analizzatore Q-TOF, dotato di maggiore sensibilità e risoluzione. Successivamente, per identificare quali sono gli specifici amminoacidi coinvolti nelle diverse modifiche post-traduzionali, l’istone H4 è stato sottoposto a digestione enzimatica e successiva analisi mediante tecniche MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS. Queste analisi hanno permesso di identificare le specifiche lisine acetilate della coda N-terminale e la sequenza temporale di acetilazione delle lisine stesse. Nel quarto capitolo sono invece riportati gli studi di inibizione, mirati a caratterizzare le modifiche a carico delle proteine istoniche indotte da inibitori delle HDAC, dotati di diverso profilo di potenza e selettività. Dapprima Il metodo messo a punto per l’analisi delle proteine istoniche è stato applicato all’analisi di istoni estratti da cellule HT29 trattate con due noti inibitori delle HDAC, valproato e butirrato, somministrati alle cellule a dosi diverse, che corrispondono alle dosi con cui sono stati testati in vivo, per convalidare il metodo per studi di inibizione di composti incogniti. Successivamente, lo studio è proseguito con lo scopo di evidenziare effetti legati alla diversa potenza e selettività degli inibitori. Le cellule sono state trattate con due inibitori più potenti, SAHA e MS275, alla stessa concentrazione. In entrambi i casi il metodo messo a punto ha permesso di evidenziare l’aumento dei livelli di acetilazione indotto dal trattamento con gli inibitori; ha inoltre messo in luce differenti livelli di acetilazione. Ad esempio il SAHA, potente inibitore di tutte le classi di HDAC, ha prodotto un’estesa iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MS275 selettivo per la classe I di HDAC, ha prodotto modifiche molto più blande. E’ stato quindi deciso di applicare questo metodo per studiare la dose e la tempo-dipendenza dell’effetto di quattro diversi inibitori delle HDAC (SAHA, MS275, MC1855 e MC1568) sulle modifiche post-traduzionali di istoni estratti da cellule HT29. Questi inibitori differiscono oltre che per la struttura chimica anche per il profilo di selettività nei confronti delle HDAC appartenenti alle diverse classi. Sono stati condotti quindi studi di dose-dipendenza che hanno consentito di ottenere i valori di IC50 (concentrazione capace di ridurre della metà la quantità relativa dell’istone meno acetilato) caratteristici per ogni inibitore nei confronti di tutte le classi istoniche. E’ stata inoltre calcolata la percentuale massima di inibizione per ogni inibitore. Infine sono stati eseguiti studi di tempo-dipendenza. I risultati ottenuti da questi studi hanno permesso di correlare i livelli di acetilazione delle varie classi istoniche con la selettività d’azione e la struttura chimica degli inibitori somministrati alle cellule. In particolare, SAHA e MC1855, inibitori delle HDAC di classi I e II a struttura idrossamica, hanno causato l’iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MC1568 (inibitore selettivo per HDAC di classe II) ha prodotto l’iperacetilazione solo di H4. Inoltre la potenza e la selettività degli inibitori nel provocare un aumento dei livelli di acetilazione a livello delle distinte classi istoniche è stata correlata al destino biologico della cellula, tramite studi di vitalità cellulare. E’ stato osservato che il SAHA e MC1855, inibitori potenti e non selettivi, somministrati alla coltura HT29 a dose 50 μM producono morte cellulare, mentre MS275 alla stessa dose produce accumulo citostatico in G1/G0. MC1568, invece, non produce effetti significatici sul ciclo cellulare. Questo studio ha perciò dimostrato che l’analisi tramite HPLC-ESI-MS delle proteine istoniche permette di caratterizzare finemente la potenza e la selettività di nuovi composti inibitori delle HDAC, prevedendone l’effetto sul ciclo cellulare. In maggiore dettaglio è risultato che l’iperacetilazione di H4 non è in grado di provocare modifiche significative sul ciclo cellulare. Questo metodo, insieme alle analisi MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS che permettono di individuare l’ordine di acetilazione delle lisine della coda N-terminale, potrà fornire importanti informazioni sugli inibitori delle HDAC e potrà essere applicato per delineare la potenza, la selettività e il meccanismo di azione di nuovi potenziali inibitori di questa classe enzimatica in colture cellulari tumorali.