Immunotherapies for uro-genital cancers

Les cancers du col utérin et de la vessie prennent tous deux leur origine dans les sites muqueux et peuvent évoluer lentement de lésions superficielles (lésions squameuses intra-épithéliales de bas à haut grade (HSIL) et carcinomes in situ du col utérin (CIS); ou tumeurs non musculo-invasives de la vessie (NMIBC)) à des cancers invasifs plus avancés. L'éthiologie de ces deux cancers est néanmoins très différente. Le cancer du col utérin est, à l'échelle mondiale, le deuxième cancer le plus mortel chez la femme. Ce cancer résulte de l'infection des cellules basales de l'épithélium stratifié du col utérin par le papillomavirus humain à haut risque (HPV). Les vaccins prophylactiques récemment développés contre le HPV (Gardasil® et Cervarix®) sont des moyens de prévention efficaces lorsqu'ils sont administrés chez les jeunes filles qui ne sont pas encore sexuellement actives; cependant ces vaccins ne permettent pas la régression des lésions déjà existantes. Malgré un développement actif, les vaccins thérapeutiques ciblant les oncogènes viraux E6/E7 n'ont montré qu'une faible efficacité clinique jusqu'à présent. Nous avons récemment démontré qu'une immunisation sous-cutanée (s.c.) était capable de faire régresser les petites tumeurs génitales chez 90% des souris, mais chez seulement 20% des souris présentant de plus grandes tumeurs. Dans cette étude, nous avons développé une nouvelle stratégie où la vaccination est associée à une application locale (intra-vaginale (IVAG)) d'agonistes de TLR. Celle-ci induit une augmentation des cellules T CD8 totales ainsi que T CD8 spécifiques au vaccin, mais pas des cellules T CD4. L'attraction sélective des cellules T CD8 est permise par leur expression des récepteurs de chemokines CCR5 et CXCR3 ainsi que par les ligants E-selectin. La vaccination, suivie de l'application IVAG de CpG, a conduit, chez 75% des souris, à la régression de grandes tumeurs établies. Le cancer de la vessie est le deuxième cancer urologique le plus fréquente. La plupart des tumeurs sont diagnostiquées comme NMIBC et sont restreintes à la muqueuse de la vessie, avec une forte propension à la récurrence et/ou progression après une résection locale. Afin de développer des vaccins contre les antigènes associés à la tumeur (TAA), il est nécessaire de trouver un moyen d'induire une réponse immunitaire CD8 spécifique dans la vessie. Pour ce faire, nous avons comparé différentes voies d'immunisation, en utilisant un vaccin composé d'adjuvants et de l'oncogène de HPV (E7) comme modèle. Les vaccinations s.c. et IVAG ont toutes deux induit un nombre similaire de cellules T CD8 spécifiques du vaccin dans la vessie, alors que l'immunisation intra-nasale fut inefficace. Les voies s.c. et IVAG ont induit des cellules T CD8 spécifiques du vaccin exprimant principalement aL-, a4- et le ligand d'E-selectin, suggérant que ces intégrines/sélectines sont responsables de la relocalisation des cellules T dans la vessie. Une unique immunisation avec E7 a permis une protection tumorale complète lors d'une étude prophylactique, indépendemment de la voie d'immunisation. Dans une étude thérapeutique, seules les vaccinations s.c. et IVAG ont efficacement conduit, chez environ 50% des souris, à la régression de tumeurs de la vessie établies, alors que l'immunisation intra-nasale n'a eu aucun effet. La régression de la tumeur est correlée avec l'infiltration dans la tumeur des cellules T CD8 spécifiques au vaccin et la diminution des cellules T régulatrices (Tregs). Afin d'augmenter l'efficacité de l'immunisation avec le TAA, nous avons testé une vaccination suivie de l'instillation d'agonistes de TLR3 et TLR9, ou d'un vaccin Salmonella Typhi (Ty21a). Cette stratégie a entraîné une augmentation des cellules T CD8 effectrices spécifiques du vaccin dans la vessie, bien qu'à différentes échelles. Ty21a étant l'immunostimulant le plus efficace, il mérite d'être étudié de manière plus approfondie dans le contexte du NMIBC. - Both cervical and bladder cancer originates in mucosal sites and can slowly progress from superficial lesions (low to high-grade squamous intra-epithelial lesions (HSIL) and carcinoma in situ (CIS) in the cervix; or non-muscle invasive tumors in the bladder (NMIBC)), to more advanced invasive cancers. The etiology of these two cancers is however very different. Cervical cancer is the second most common cause of cancer death in women worldwide. This cancer results from the infection of the basal cells of the stratified epithelium of the cervix by high-risk human papillomavirus (HPV). The recent availability of prophylactic vaccines (Gardasil® and Cervarix®) against HPV is an effective strategy to prevent this cancer when administered to young girls before sexual activity; however, these vaccines do not induce regression of established lesions. Despite active development, therapeutic vaccines targeting viral oncogenes E6/E7 had limited clinical efficacy to date. We recently reported that subcutaneous (s.c.) immunization was able to regress small genital tumors in 90% of the mice, but only 20% of mice had regression of larger tumors. Here, we developed a new strategy where vaccination is combined with the local (intravaginal (IVAG)) application of TLR agonists. This new strategy induced an increase of both total and vaccine-specific CD8 T cells in cervix-vagina, but not CD4 T cells. The selective attraction of CD8 T cells is mediated by the expression of CCR5 and CXCR3 chemokine receptors and E-selectin ligands in these cells. Vaccination followed by IVAG application of CpG resulted in tumor regression of large established tumors in 75% of the mice. Bladder cancer is the second most common urological malignancy. Most tumors are diagnosed as NMIBC, and are restricted to the mucosal bladder with a high propensity to recur and/or progress after local resection. Aiming to develop vaccines against tumor associated antigens (TAA) it is necessary to investigate how to target vaccine-specific T-cell immune responses to the bladder. Here we thus compared using an adjuvanted HPV oncogene (E7) vaccine, as a model, different routes of immunization. Both s.c. and IVAG vaccination induced similar number of vaccine-specific CD8 T-cells in the bladder, whereas intranasal (i.n.) immunization was ineffective. S.c. and IVAG routes induced predominantly aL-, a4- and E-selectin ligand-expressing vaccine-specific CD8 T-cells suggesting that these integrin/selectin are responsible for T-cell homing to the bladder. A single E7 immunization conferred full tumor protection in a prophylactic setting, irrespective of the immunization route. In a therapeutic setting, only ivag and s.c. vaccination efficiently regressed established bladder-tumors in ca. 50 % of mice, whereas i.n. immunization had no effect. Tumor regression correlated with vaccine- specific CD8 T cell tumor-infiltration and decrease of regulatory T cells (Tregs). To increase efficacy of TAA immunization, we tested vaccination followed by the local instillation of TLR3 or TLR9 agonist or of a Salmonella Typhi vaccine (Ty21a). This strategy resulted in an increase of vaccine-specific effector CD8 T cells in the bladder, although at different magnitudes. Ty21a being the most efficient, it deserves further investigation in the context of NMIBC. We further tested another strategy to improve therapies of NMIBC. In the murine MB49 bladder tumor model, we replaced the intravesical (ives) BCG therapy by another vaccine strain the Salmonella Ty21a. Ives Ty21a induced bladder tumor regression at least as efficiently as BCG. Ty21a bacteria did not infect nor survive neither in healthy nor in tumor-bearing bladders, suggesting its safety. Moreover, Ty21a induced a transient inflammatory response in healthy bladders, mainly through infiltration of neutrophils and macrophages that rapidly returned to basal levels, confirming its potential safety. The tumor regression was associated to a robust infiltration of immune cells, and secretion of cytokines in urines. Infection of murine tumor cell lines by Ty21a resulted in cell apoptosis. The infection of both murine and human urothelial cell lines induced secretion of in vitro inflammatory cytokines. Ty21a may be an attractive alternative for the ives treatment of NMIBC after transurethral resection and thus deserves more investigation.

Waddlia chondrophila induces systemic infection, organ pathology, and elicits Th1-associated humoral immunity in a murine model of genital infection.

Waddlia chondrophila is a known bovine abortigenic Chlamydia-related bacterium that has been associated with adverse pregnancy outcomes in human. However, there is a lack of knowledge regarding how W. chondrophila infection spreads, its ability to elicit an immune response and induce pathology. A murine model of genital infection was developed to investigate the pathogenicity and immune response associated with a W. chondrophila infection. Genital inoculation of the bacterial agent resulted in a dose-dependent infection that spread to lumbar lymph nodes and successively to spleen and liver. Bacterial-induced pathology peaked on day 14, characterized by leukocyte infiltration (uterine horn, liver, and spleen), necrosis (liver) and extramedullary hematopoiesis (spleen). Immunohistochemistry demonstrated the presence of a large number of W. chondrophila in the spleen on day 14. Robust IgG titers were detected by day 14 and remained high until day 52. IgG isotypes consisted of high IgG2a, moderate IgG3 and no detectable IgG1, indicating a Th1-associated immune response. This study provides the first evidence that W. chondrophila genital infection is capable of inducing a systemic infection that spreads to major organs, induces uterus, spleen, and liver pathology and elicits a Th1-skewed humoral response. This new animal model will help our understanding of the mechanisms related to intracellular bacteria-induced miscarriages, the most frequent complication of pregnancy that affects one in four women.

Anatomia macroscòpica i microscòpica de l'aparell genital femení d'Ophidion barbatum (L.) (Pisces, Ophididae)

S'ha realitzat un estudi de l'anatomia macroscòpica i microscòpica de I'ovari d'Ophidion barbatum (L.) (Pisces, Ophidiidae), utilitzant material recollit per pescadors del port de Blanes (mar català) durant el mes d'octubre de 1985. L'absència d'òrgan copulador en els mascles d'aquesta espècie i la posició de l'orifici nasal anterior, a una certa alçada respecte al llavi superior, ens permet identificar-la com una espècie ovípara, del subordre Ophidioidei, dins de l'ordre Ophidiiformes. L'ovari és únic i continuat caudalment per l'oviducte. Els nombrosos cordons intraovarics que tapien la cavitat augmenten considerablement la superfície germinal. El desenvolupament de l'ovari es correspon amb el tipus asincrònic (Marza, 1938) i la fresa repetida al llarg d'una estació reproductiva més o menys llarga és una estrategia que augmenta la fecunditat, normalment limitada pel volum corporal de la femella. Dins de l'ordre Ophidiiformes, el tipus d'ovari únic sense restes de paret mitjana sembla ser la norma entre les espècies de reproducció ovípara. Aquest fet esta en contradicció amb la teoria de Mendoza (1943) que, fora d'algunes excepcions, l'ovari únic es troba principalment en els teleostis vivípars

Fatores de risco para recidiva após tratamento de lesões provocadas pelo HPV no trato genital feminino

Objetivos: avaliação de fatores de risco [grau da lesão e associação com o vírus da imunodeficiência adquirida tipo 1 (HIV-1) e gestação] para recidiva após tratamento de lesões provocadas pelo papilomavírus humano (HPV) no trato genital feminino. Material e métodos: foram avaliadas 70 pacientes com diagnóstico clínico, colposcópico e citológico de infecção pelo HPV. O seguimento clínico foi de no mínimo 6 meses após o tratamento inicial, possibilitando avaliar os resultados terapêuticos. Neste grupo, 26 pacientes eram grávidas, sendo 12 com sorologia positiva para o HIV-1. As 44 pacientes restantes encontravam-se fora do período gravídico-puerperal, sendo que destas, 14 eram contaminadas pelo HIV-1. Segundo os critérios citológicos as lesões de colo foram classificadas em alterações associadas ao HPV ou neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) graus I (lesões de baixo grau) ou NIC II/III (lesões de alto grau). A análise estatística foi realizada pelo teste exato de Fisher com nível de significância para p< 0.05. O esquema terapêutico para lesões restritas ao colo do útero foi crio ou eletrocautério (EC), já a presença de lesões difusas pelos fórnices vaginais implicou o uso de 5-fluoruracil tópico; nas lesões da região vulvo-perineal utilizou-se o ácido tricloroacético 80% e caso fossem lesões volumosas realizava-se o EC. Nas gestantes foi utilizado o criocautério para lesões restritas ao colo e EC para lesões difusas. Resultados: das pacientes grávidas HIV-1 negativas, tivemos 87,5% de recidiva quando a lesão estava em colo-vagina, e nenhum caso quando de lesões vulvo-perineais. Já as pacientes grávidas com sorologia positiva apresentaram 100% de recidiva independente do sítio de lesão. Nos casos de pacientes não-grávidas, HIV negativas, tivemos 24 e 20% de recidiva nos sítios colo-vagina e vulvo-perineais, respectivamente, ao passo que nas pacientes HIV positivas, as recidivas foram de 87,5 e 100% respectivamente para estes mesmos sítios. As lesões associadas a NIC apresentaram uma maior freqüência de recidivas com o aumento do grau da NIC e um efeito sinérgico com a associação com o HIV-1 e gravidez. Conclusões: a taxa de recidiva de lesões induzidas por HPV em mulheres tratadas é alta; a associação com a gravidez, com o HIV e o aumento do grau das lesões intra-epiteliais são fatores sinérgicos no determinismo da falha terapêutica. O sítio de implantação das lesões induzidas por HPV só tem significado prognóstico fora da associação com HIV.

Lesões induzidas por papilomavírus humano em parceiros de mulheres com neoplasia intra-epitelial do trato genital inferior

RESUMO Objetivos: pesquisar a presença de lesões induzidas por papilomavírus (HPV) e os fatores associados em parceiros de mulheres com neoplasia intra-epitelial genital. Métodos: foram avaliados 337 homens por meio de citologia uretral, peniscopia e biópsia, quando necessário. Analisou-se a presença de lesão induzida por HPV correlacionando-a com a idade, escolaridade, tabagismo, estabilidade conjugal, início da atividade sexual, número de parceiras, antecedente de doença sexualmente transmissível (DST), postectomia, imagens peniscópicas e grau das lesões nas mulheres. Resultados: a peniscopia foi positiva em 144 homens (42,7%) e 105 (31,2%) apresentaram lesões induzidas por HPV. Somente o tabagismo, a estabilidade conjugal menor ou igual a seis meses e o antecedente de mais de uma parceira sexual estiveram associados com a presença de lesão induzida por HPV (p<0,05). A citologia uretral foi suspeita para HPV em 4,2% dos casos, sendo este achado significativamente associado com tabagismo, peniscopia ou biópsias positivas e com parceiros de mulheres com lesão de alto grau. Das 229 biópsias realizadas, 72,1% foram positivas para HPV, independentemente da imagem peniscópica e do grau de lesão na mulher. Conclusões: as lesões induzidas por HPV foram diagnosticadas em 31,2% dos casos e estiveram associadas com o tabagismo, tempo de união conjugal menor ou igual a seis meses e mais de uma parceira sexual. O grau de lesão na mulher, escolaridade, antecedente de DST, postectomia e imagem peniscópica não se mostraram correlacionados com a presença de lesão induzida por HPV.

Histerectomia vaginal versus histerectomia abdominal em mulheres sem prolapso genital, em maternidade-escola do Recife: ensaio clínico randomizado

OBJETIVO: comparar os resultados intra e pós-operatórios em pacientes sem prolapso genital ou doenças anexiais, submetidas a histerectomia vaginal ou abdominal. MÉTODOS: realizou-se estudo do tipo ensaio clínico aberto, randomizado, em pacientes sem prolapso genital que se submeteram a histerectomia total, indicada por doenças benignas, no IMIP, em Recife, Pernambuco. Incluíram-se 35 pacientes, alocadas aleatoriamente em dois grupos, sendo 19 submetidas a histerectomia vaginal e 16 a histerectomia abdominal. Foram estudadas as seguintes variáveis: volume de perda sangüínea, necessidade de hemotransfusão, tempo operatório, dor pós-operatória (intensidade e uso de analgésicos), tempo de permanência hospitalar, complicações operatórias, tempo de retorno às atividades e grau de satisfação das pacientes. Para análise estatística, utilizaram-se os testes chi2 de associação, exato de Fisher e Mann-Whitney para comparação dos grupos, considerando-se significativo erro alfa menor que 5%. RESULTADOS: o volume de sangue perdido durante as histerectomias por via abdominal (mediana de 902 mL) foi significativamente maior em relação à perda durante as histerectomias vaginais (mediana de 520 mL), e nenhuma paciente neste último grupo requereu hemotransfusão, contra 19% no primeiro grupo. A duração da cirurgia foi semelhante, com mediana de 120 minutos nos dois grupos. A intensidade da dor, verificada pelos escores da escala analógica visual, foi significativamente menor entre as pacientes submetidas a histerectomia vaginal, que também apresentaram menor freqüência de utilização de analgésicos. Não houve diferença na freqüência de complicações intra ou pós-operatórias entre os dois grupos, encontrando-se apenas um caso de infecção em cada grupo e um caso de trombose venosa profunda no grupo das histerectomias vaginais. O tempo de retorno às atividades das pacientes submetidas à histerectomia vaginal foi significativamente menor (mediana de 35 dias) em relação ao outro grupo (mediana de 40 dias). O grau de satisfação foi semelhante nos dois grupos. CONCLUSÕES: os benefícios da histerectomia vaginal no presente estudo incluíram menor volume de perda sanguínea intra-operatória, menor intensidade da dor pós-operatória, menor freqüência de solicitação de analgésicos e menor tempo de retorno às atividades após a cirurgia. A via vaginal pode substituir com vantagens a via abdominal em pacientes com indicação de histerectomia.

Reprodutibilidade interobservador da classificação da distopia genital proposta pela Sociedade Internacional de Continência

OBJETIVO: testar a reprodutibilidade entre observadores das medidas e do estádio da distopia genital pela classificação do prolapso pélvico feminino preconizada pela Sociedade Internacional de Continência (ICS). MÉTODOS: foram avaliadas 51 pacientes atendidas no setor de Uroginecologia e Cirurgia Vaginal do Departamento de Ginecologia da UNIFESP/EPM durante investigação uroginecológica. Descrevemos a localização dos pontos propostos pela classificação da ICS, sendo dois na parede vaginal anterior, dois no ápice vaginal, dois na parede vaginal posterior, além do hiato genital, corpo perineal e comprimento vaginal total. A seguir, realizamos o estadiamento da distopia genital baseada nesta classificação. O procedimento foi realizado por dois investigadores diferentes sem contato prévio entre eles. A reprodutibilidade das nove medidas sítio-específicas e do estádio final foi analisada pela correlação de Pearson e a média dos pontos específicos pelo teste de t-pareado. RESULTADOS: houve correlação significativa e substancial para as medidas avaliadas. O índice de correlação para o ponto Aa foi de 0,89 (p<0,0001), ponto Ba de 0,90 (p<0,0001), ponto C de 0,97 (p<0,0001), ponto Ap de 0,72 (p<0,0001), ponto Bp de 0,84 (p<0,0001), ponto D de 0,91 (p<0,0001), hiato genital de 0,65 (p<0,0001), corpo perineal de 0,66 (p<0,0001) e comprimento vaginal total de 0,73 (p<0,0001). Também não se observou variação na média das medidas realizadas pelos dois examinadores. Da mesma forma, o estádio final da distopia foi altamente reprodutível (r = 0,81, p<0,0001). Em nenhuma paciente houve variação maior que um estádio, sendo idênticos em 86,2% dos casos. CONCLUSÕES: existe reprodutibilidade nas medidas obtidas pelo sistema de classificação da distopia genital da Sociedade Internacional de Continência.

Determinação ultra-sonográfica do sexo fetal pela medida dos ângulos do apêndice genital

OBJETIVO: avaliar a acurácia da ultra-sonografia para predição do sexo fetal entre a 11ª e a 13ª semana e 6 dias por meio da medida dos ângulos anterior e posterior do apêndice genital. MÉTODOS: os ângulos anterior e posterior do apêndice genital foram medidos em corte sagital de 455 fetos entre a 11ª e a 13ª semana e 6 dias. A probabilidade de predição correta do sexo fetal (confirmado após o nascimento) foi categorizada de acordo com a medida dos ângulos, idade gestacional e comprimento crânio-caudal. Os pontos de corte de melhor acurácia para predizer o sexo fetal foram obtidos por meio de curva ROC. A variação interobservador foi avaliada pelo método de Bland-Altman. RESULTADOS: a taxa de predição correta do sexo fetal se elevou com a idade gestacional e comprimento crânio-nádegas. Utilizando o ponto de corte de 42 graus para o ângulo anterior (curva ROC), a predição correta do sexo fetal ocorreu em 72% dos fetos da 11ª à 11ª semana e 6 dias, 86% da 12ª à 12ª semana e 6 dias e 88% da 13ª à 13ª semana e 6 dias. As taxas de predição obtidas com o ângulo posterior (ponto de corte de 24 graus) foram, respectivamente: 70, 87 e 87%. A avaliação da variação interobservador revelou diferença média entre medidas pareadas de 15,7 e 9 graus para as medidas dos ângulos posterior e anterior, respectivamente. CONCLUSÃO: a acurácia da medida dos ângulos do apêndice genital na predição do sexo fetal foi elevada a partir da 12ª semana de gestação mas ainda insuficiente para sua aplicação em gestações com risco de doenças graves ligadas ao cromossomo X.

Fatores de risco para o prolapso genital em uma população brasileira

OBJETIVO: avaliar os fatores de risco para o desenvolvimento de prolapso genital na população brasileira. MÉTODOS: estudo caso-controle envolvendo 316 pacientes que foram submetidas a estadiamento de prolapso, utilizando-se o sistema de quantificação de prolapso dos órgãos pélvicos. As pacientes foram divididas em dois grupos. No Grupo Caso, foram incluídas 107 pacientes com prolapso nos estádios III ou IV, e no Controle, 209 mulheres com estádios 0 ou I. As mulheres selecionadas respondiam à anamnese na qual eram questionadas sobre a presença de possíveis fatores de risco para prolapso genital, tais como: idade, idade da menopausa, paridade, tipos de parto (vaginal, cesariana ou fórcipe), ocorrência de macrossomia fetal, história familiar em parentes de primeiro grau de distopia genital, tosse crônica e constipação intestinal. RESULTADOS: as variáveis que se mostraram diferentes entre os grupos foram: idade, índice de massa corpórea, paridade, número de partos vaginais, de cesarianas, de partos fórcipe, peso do recém-nascido e história familiar positiva para prolapso. Raça, idade da menopausa, tosse crônica e constipação intestinal não se mostraram diferentes entre os grupos. Após a regressão logística, somente três variáveis se apresentaram como fatores de risco independentes: presença de pelo menos um parto vaginal, macrossomia fetal e história familiar positiva. A cesariana se mostrou como fator protetor. CONCLUSÕES: na população brasileira, os fatores de risco independentes para prolapso foram a presença de pelo menos um parto normal, macrossomia fetal e história familiar positiva para distopia.

Hábitos e costumes de mulheres universitárias quanto ao uso de roupas íntimas, adornos genitais, depilação e práticas sexuais

OBJETIVO: Descrever as práticas e cuidados com a área genital de mulheres universitárias. MÉTODOS: Estudo analítico descritivo, que analisou os hábitos e costumes de 364 estudantes de uma universidade pública do Estado de São Paulo quanto ao uso de roupas íntimas, piercings corporais, tatuagens, depilação e práticas sexuais. Um questionário com 42 perguntas avaliou as práticas habituais mais comuns das universitárias. Todas as perguntas foram autorrespondidas e os questionários, sem qualquer identificação, foram colocados em urnas lacradas para garantir o sigilo das informações. As respostas foram tabuladas em planilha Microsoft® Excel 2007 para obtenção de análise univariável. RESULTADOS: A média de idade das universitárias estudadas foi de 21 anos (DP±2,7), sendo 84% brancas. Participaram do estudo voluntárias das áreas de biológicas (50%), exatas (29%) e humanas (21%). Observou-se que 61,8% das entrevistadas usam calcinhas de algodão, porém, ao mesmo tempo, 75,4% usam calças jeans apertadas, e que somente 18,4% deixam de usar calcinha para dormir. Apenas uma participante relatou ter piercing genital e nenhuma tinha tatuagem. A maioria das universitárias faz depilação genital, sendo que aproximadamente um terço delas o faz de forma completa. Após depilar, dois terços usam produtos como anti-inflamatórios e/ou hidratantes na região. Apenas 62% usam camisinha masculina e 17,6% lubrificante na relação sexual. Metade pratica sexo oral receptor; 17,9% sexo anal e 26,6% delas relatam ter dor no ato sexual. Corrimento vaginal foi relatado após a relação sexual em 25,6% dos casos. CONCLUSÃO:Mulheres jovens de universidade pública brasileira têm muitos hábitos inadequados de cuidados relacionados à sua área genital. Não costumam usar piercings ou tatuagens genitais, mas relatam ter dor no ato sexual e corrimento vaginal após o sexo em um grande número de casos.