Association entre les dérégulations des cellules dendritiques et les altérations des lymphocytes B présentes chez les patients infectés par le VIH

La dérégulation du compartiment B est une conséquence importante de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), qui peut mener à des manifestations autoimmunes et ultimement à des lymphomes B. Parmi les premières anomalies détectées, on dénote l’activation polyclonale, reflétée par la présence d’hyperglobulinémie (hyper-Ig) et des titres élevés d’autoanticorps chez les patients. On observe également une altération des dynamiques des populations, notamment une expansion de la population des cellules matures activées. De plus, les patients évoluent vers l’incapacité de générer une réponse humorale efficace, et sont sujets à une perte de la mémoire immunologique en phase chronique, caractérisée par une diminution de la population des cellules mémoires et par l’épuisement cellulaire. Toutefois, on connaît très peu les mécanismes impliqués dans de telles altérations. Les cellules dendritiques (DC) sont parmi les premières populations cellulaires à rencontrer et à propager le VIH lors d’une infection, et s’en trouvent affectées directement et indirectement, par le virus et ses composantes. On retrouve en effet une diminution des fréquences de DC dans le sang, les muqueuses et les organes lymphoïdes de patients infectés par le VIH, ainsi qu’un blocage au niveau de la maturation cellulaire. Toutefois, un débat perdure quant à l’apparition de ces altérations durant la phase aigüe de l’infection, et à la restauration des fréquences et des fonctions des DC chez les patients sous traitement. Cette controverse est due à la rareté des études longitudinales incluant des suivis qui s’échelonnent de la phase aigüe à la phase chronique de l’infection. Les DC jouent un rôle important dans le développement, la survie et l’activation des lymphocytes B, de façon T-dépendante et T-indépendante, notamment via des facteurs de croissance tel que BLyS (B lymphocyte stimulator). Par conséquent, nous formulons l’hypothèse que dans le cadre d’une infection VIH, les altérations observées au niveau des cellules B sont modulées par les DC. L’objectif majeur de cette étude est donc d’évaluer l’implication potentielle des DC dans les altérations des cellules B au cours de l’infection par le VIH. Pour ce faire, nous avons d’abord caractérisé de façon longitudinale le statut des populations de DC du sang périphérique de patients infectés au VIH et présentant différents types de progression de la maladie. Cela nous a permis d’évaluer la présence d’une corrélation entre les dynamiques de DC et le type de progression. Par la suite, nous avons évalué la capacité des DC à exprimer BLyS, puis mesuré sa concentration ainsi que celles d’autres facteurs de croissance des cellules B dans le plasma des patients. Enfin, nous avons caractérisé le statut des lymphocytes B, en fonction du stade de l’infection et du taux de progression clinique des patients. Cette étude démontre une diminution de la fréquence des populations de DC myéloïdes (mDC) dans le sang de patients infectés par le VIH sujets à une progression clinique. Cette diminution est observée dès le stade aigu de l’infection et au-delà du traitement antirétroviral (ART). Des concentrations élevées de MCP-1 (monocyte chemotactic protein), MIP (macrophage inflammatory protein) -3α et MIP-3β suggèrent la possibilité d’un drainage vers des sites périphériques. Nous observons également des niveaux supérieurs à la normale de précurseurs CD11c+CD14+CD16- en phase chronique, possiblement liés à une tendence de régénération des DC. Les patients en phase chronique présentent de hautes concentrations plasmatiques de BLyS, reflétée par un haut taux d’expression de cette cytokine par les mDC et leurs précurseurs. Parallèlement, nous observons une expansion des cellules B matures activées ainsi que des taux élevés d’IgG et IgA dans le sang de ces patients. De plus, nous constatons l’expansion d’une population de cellules B qui présente à la fois des caractéristiques de cellules B immatures transitionnelles (TI, transitional immature), et de cellules B recirculantes activées de la zone marginale (MZ, marginal zone), considérées ici comme des «précurseurs/activées de la MZ». Cette étude démontre aussi, chez les progresseurs lents, une meilleure préservation du compartiment des DC du sang périphérique, accompagnée d’une augmentation de précurseurs des DC de phénotype CD11c+CD14+CD16+, ainsi que des concentrations plasmatiques et niveaux d’expression normaux de BLyS. Conséquemment, nous n’avons pas observé d’augmentation des cellules B matures activées et des cellules B précurseurs/activées de la MZ. Toutefois, la fréquence des cellules B matures de la MZ est diminuée, reflétant possiblement leur recrutement vers des sites périphériques et leur contribution à un mécanisme actif de contrôle de la progression de la maladie. L’ensemble de ce travail suggère que dans le cadre d’une infection au VIH, les altérations observées au niveau des DC modulent les anomalies des cellules B. Par conséquent, le maintien de l’équilibre des fonctions DC, notamment les fonctions noninflammatoires, pourrait avoir un impact important dans la prévention de la progression de maladies associées aux altérations du compartiment des cellules B.

Rôle du gène Polycomb BMI1 dans le maintien et la radiorésistance des cellules souches cancéreuses

Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur cérébrale la plus commune et létale chez l’adulte. Malgré les avancés fulgurantes dans la dernière décennie au niveau des thérapies contre le cancer, le pronostique reste inchangé. Le manque de spécificité des traitements est la cause première de la récurrence de cette tumeur. Une meilleure compréhension au niveau des mécanismes moléculaires et biologiques de cette tumeur est impérative. La découverte des cellules souches cancéreuses (CD133+) au niveau du GBM offre une nouvelle opportunité thérapeutique contre cette tumeur. Effectivement, les cellules CD133+ seraient responsables de l’établissement, le maintien et la progression du GBM. De plus, elles sont également la cause de la résistance du GBM faces aux traitements de radiothérapies. Ces cellules représentent une cible de choix dans le but d’éradiquer le GBM. L’oncogène BMI1 a été associé à plusieurs types de tumeurs et est également essentielle au maintien de différentes populations de cellules souches normales et cancéreuses. Une forte expression de BMI1 est observée au niveau du GBM et plus précisément, un enrichissement préférentiel de cette protéine est noté au niveau des cellules CD133+. L’objectif principal de cette thèse est d’évaluer le rôle potentiel de BMI1 dans le maintien et la radiorésistance des cellules souches cancéreuses (CSC), CD133+ du GBM. La fonction principale de BMI1 est la régulation négative du locus INK4A/ARF. Ce locus est impliqué dans l’activation de deux voies majeurs anti-tumorales : P53 et RB. Or, la perte de BMI1 induit in vitro une diminution des capacités prolifératives, une augmentation de la différentiation et de l’apoptose, ainsi qu’une augmentation de la radiosensibilité des CSC du GBM indépendamment de la présence du locus INK4A/ARF. Effectivement, deux tumeurs sur trois possèdent une délétion de ce locus, ce qui suggère que BMI1 possède d’autre(s) cible(s) transcriptionnelle(s). Parmi ces nouvelles cibles ont retrouve la protéine P21, un régulateur négatif du cycle cellulaire. De plus, la perte de BMI1 inhibe l’établissement d’une tumeur cérébrale lors d’études de xénogreffe chez la souris NOD/SCID. Également, une nouvelle fonction de BMI1 indépendante de son activité transcriptionnel a été démontrée. Effectivement, suite à l’induction d’un bris double brin (BDB) de l’ADN, BMI1 est rapidement recruté au niveau de la lésion et influence le recrutement des protéines de reconnaissance du dommage à l’ADN. La perte de BMI1 mène à un défaut au niveau de la reconnaissance et la réparation de l’ADN, alors que sa surexpression induit plutôt une augmentation de ces mécanismes et procure une radiorésistance. Ces résultats décrivent pour la première fois l’importance de BMI1 au niveau du maintien, de l’auto-renouvellement et la radiorésistance des CSC du GBM. Ainsi, ces travaux démontrent que la protéine BMI1 représente une cible thérapeutique de choix dans le but d’éradiquer le GBM, une tumeur cérébrale létale.

Contrôle de l'expression de la protéine PHEX et rôle de PHEX et FGF23 dans la minéralisation par les cellules MC3T3

PHEX est une protéine importante dans le processus de minéralisation osseuse. Des mutations ou la délétion d’une partie de ce gène causent l’hypophosphatémie liée au chromosome X (XLH). Cette maladie est caractérisée par une hypophosphatémie, accompagnée de défauts de minéralisation, de rachitisme et de lésions ostéomalaciques. Avec l’hypophosphatémie, les taux circulants de vitamine D devraient être augmentés, ce qui n’est pas le cas d’où une régulation anormale de la production de vitamine D a lieu. Cependant, malgré le fait que cette protéine soit une peptidase, aucun substrat physiologique n’a encore été répertorié pour PHEX. PHEX est une protéine membranaire de type II de la famille M13 des métalloendopeptidases à zinc possédant un court domaine N-terminal cytosolique, un segment transmembrannaire d’environ 20 acides aminés et une large portion C-terminale extracellulaire où se trouve le site actif de l’enzyme. PHEX est exprimée de façon majoritaire dans les os et dans les dents et elle apparaît à l’initiation de la minéralisation. Les patients souffrant de XLH et la souris Hyp, qui est un modèle animal de la maladie humaine, montrent des quantités importantes de la protéine FGF23. De plus, FGF23 est impliqué dans une autre maladie reliée au métabolisme du phosphate, l’hypophosphatémie rachitique autosomale dominante (ADHR) où des mutations de FGF23 causent sensiblement les mêmes symptômes que XLH. FGF23 est produit principalement par les ostéoblastes et les ostéocytes. FGF23 cause une hypophosphatémie par la diminution de l’expression du cotransporteur NaPi de type II, responsable de la réabsorption du phosphate rénal. L’hypothèse proposée dans la littérature serait que PHEX activerait ou inactiverait des peptides importants pour la minéralisation osseuse. Plus spécifiquement, l’activation ou l’inactivation de ces peptides aurait pour rôle de réguler les quantités de FGF23. Selon l’hypothèse mentionnée précédemment, la régulation de PHEX pourrait donc avoir un effet sur la minéralisation. Une quantité croissante de données sur la régulation de PHEX sont maintenant disponibles. Par exemple, la vitamine D diminue l’expression de PHEX tandis que les glucocorticoïdes et l’hormone de croissance augmentent son expression. Dans une première étude, nous avons voulu déterminer si un peptide relié à la minéralisation osseuse, le PTHrP1-34, pouvait réguler l’expression de PHEX. Nous avons déterminé que le PTHrP1-34 peut réguler de façon négative l’expression de PHEX dans les cellules UMR-106, une lignée cellulaire ostéoblastique. Cette régulation passe par la voie de l’AMPc/protéine kinase A. De plus, cette diminution d’expression est également observée au jour 7 dans des cultures primaires d’ostéoblastes de rat en minéralisation. Par la suite, nous avons étudié un mutant de PHEX, le mutant E4Q retrouvé chez un patient souffrant de XLH, où la mutation se retrouve dans le domaine cytosolique de PHEX. Cette mutation n’interfère pas avec le site catalytique de l’enzyme puisque ce mutant de PHEX peut tout aussi bien cliver un substrat synthétique que la protéine sauvage. Il a été déterminé que cette mutation annule un motif di-acide. Nous avons démontré que ce motif di-acide est responsable de la liaison de PHEX à COPII, responsable de la formation de vésicules de sécrétion. De plus, il semblerait que ce motif soit important, probablement par son interaction avec COPII, à l’incorporation de PHEX dans des vésicules de calcification, lesdites vésicules étant importantes dans le processus de minéralisation. Finalement, des essais de compétitions ont démontré que la minéralisation pouvait être perturbée lorsque l’on surexprimait la queue cytosolique sauvage de PHEX, contrairement à la queue mutée. Ceci suggère possiblement que l’interaction avec COPII menant à l’incorporation de PHEX dans les vésicules de calcification ou d’autres protéines comprenant de tels motifs pourrait être importante pour la minéralisation. Finalement, la dernière étude porte sur la protéine FGF23. Nous avons démontré, par la surexpression de FGF23 dans la lignée MC3T3 d’ostéoblastes de souris, que cette surexpression a un effet sur la sénescence de ces cellules. En effet, des essais de sénescence ont montré l’augmentation de celle-ci lorsque FGF23 est surexprimé. Par contre, la prolifération n’est pas altérée. De plus, il semblerait que la différenciation soit plus rapide, tel qu’observé par une minéralisation survenant plus tôt, mais n’étant pas plus importante. Bref, la surexpression de FGF23 semblerait faire en sorte que les ostéoblastes se différencient plus rapidement et passent donc à un état de sénescence prématuré comparativement aux cellules sauvages. Ceci est en accord avec la littérature où KLOTHO, un cofacteur de FGF23 permettant sa liaison avec une plus grande affinité sur son récepteur, lorsqu’inactivé démontre un phénotype similaire au vieillissement incluant un phénotype de sénescence.

Rôle de la synthèse de l'acide rétinoïque dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation des cellules épithéliales mammaires

L’acide rétinoïque (AR) est le ligand des récepteurs nucléaires RAR et RXR qui agissent comme facteurs de transcription ligand-inductibles et médient ses effets biologiques. Il est connu que l’AR a des propriétés prodifférenciatrices et antiprolifératives, notamment sur les cellules de l’épithélium mammaire. Une perte de sensibilité de l’AR a toutefois été mise en évidence dans plusieurs lignées cellulaires mammaires cancéreuses, ce qui pourrait faciliter la croissance des tumeurs. Or jusqu’ici cette perte de sensibilité avait été attribuée à des défauts de la voie de signalisation de l’AR, causée par la perte de l’expression des récepteurs à l’AR dans la tumeur, bien que plusieurs lignées de cellules cancéreuses y soient tout de même très sensibles. Peu d’études se sont intéressées au rôle de la voie de synthèse de l’AR dans la transformation des cellules mammaires. En effet, l’AR est synthétisé à partir de la vitamine A, ou rétinol, son précurseur sanguin provenant de la diète. Les cellules de l’épithélium mammaire normales ont la capacité de synthétiser l’AR à partir du rétinol. Nos rapportons pour la première fois que l’épithélium mammaire est probablement le siège de la synthèse et de la signalisation de l’AR. Cela est dû, au moins en partie, à l’expression d’une enzyme de synthèse de l’AR, RALDH3, dans l’épithélium mammaire normal. Dans cette étude, nous démontrons que les cellules cancéreuses de type luminal, qui ont sensibles à l’AR (et qui expriment le récepteur des estrogènes ER, catégorie qui regroupe 75 % des tumeurs diagnostiquées) n’ont au contraire pas la capacité de sythétiser l’AR, probablement en raison d’une faible expression de RALDH3 dans les tumeurs, sous l’effet des estrogènes. Cela pourrait représenter un nouveau mécanisme favorisant la croissance des tumeurs luminales dont les cellules proliférent en présence du rétinol sanguin. RALDH1, une autre enzyme de la voie de synthèse de l’AR, et qui partage 70 % d’identité de séquence avec RALDH3, est un marqueur de tumeurs plus agressives et de la formation de métastase. Nous montrons au contraire, que RALDH3 est un marqueur d’une moindre probabilité de développer des métastases chez les patientes atteintes d’une tumeur luminale. Cela suggère des rôles different pour ces deux enzymes dans la glande mammaire. Nos résultats indiquent que RALDH1 et 3 ont des propriétés enzymatiques très différentes, ce qui est en accord avec cette dernière hypothèse. Nos données suggèrent aussi que RALDH1 et 3 pourraient être des marqueurs de populations distinctes de cellules dans la glande mammaire normale. Nous proposons d’exploiter les diffèrences entre RALDH1 et 3 afin de mettre au point des méthodes de séparation des différentes population de cellules de l’épithélium mammaire ce qui pourrait aider à comprendre le rôle de la synthèse d’AR dans ce tissu.

Cartographie du réseau d'interactions protéiques de la machinerie de transcription dans les cellules humaines

Les protéines sont les macromolécules les plus polyvalentes de la cellule. Elles jouent un rôle fondamental dans la majorité des processus biologiques à travers la formation de complexes multi-protéiques. Durant la transcription, une multitude de facteurs sont impliquées dans le contrôle de l’activité des complexes ARN polymérases. Notre laboratoire s’est intéressé au réseau d’interaction de la machinerie de transcription des ARN polymérases nucléaires, dans le but de mieux comprendre leurs mécanismes de régulation. Pour ce faire, une procédure protéomique comprenant la purification de complexes protéiques par affinité couplée à la spectrométrie de masse et à l’analyse bioinformatique a été développée. La méthode de purification TAP (Tandem Affinity Purification) a été adaptée pour permettre la purification de complexes protéiques solubles assemblés in vivo à partir de cellules humaines. L’objectif de mon projet de maîtrise était de purifier le complexe de l’ARN Pol I ainsi que de poursuivre l’expansion du réseau d’interactions protéine-protéine de la machinerie de transcription de l’ARN Pol II humaine. À l’aide des protéines POLR1E, TWISTNB, POLR2E, PFDN4, MBD2, XPA, CAND1 et PDCD5 étiquetées (TAP-tag) exprimées dans des lignées cellulaires ECR-293, plusieurs complexes protéiques solubles ont été purifiés et analysés par spectrométrie de masse. Les interactions protéiques ont été triées et validées bioinformatiquement pour donner en final une liste d’interactions ayant un haut degré de confiance à partir de laquelle des réseaux d’interactions protéine-protéine ont été créés. Le réseau créé au cours de ce projet connecte plusieurs composantes de la machinerie transcriptionnelle tels que les ARN Pol I, II et III, les complexes RPAP3/R2TP/prefoldin-like, TRiC/CCT, Mi-2/NuRD et des facteurs de transcription et de réparation de l’ADN. Ce type d’analyse nous a permis d’identifier et de caractériser de nouveaux régulateurs de la machinerie de transcription de l’ARN Pol I et II et de mieux comprendre son fonctionnement.

L’œstrogène : un rôle potentiel dans la modulation de l’activation pro-inflammatoire des cellules endothéliales vasculaires par la voie du Toll-Like Receptor 2

Grâce aux nombreuses études sur le sujet, nous savons qu’une stimulation inflammatoire vasculaire excessive entraîne un débalancement des fonctions homéostatiques de l’endothélium. Ce débalancement est à l’origine d’une dysfonction endothéliale définie comme étant l’étape clé contribuant au développement de l’athérosclérose. Le Toll-like receptor-2 (TLR2) est impliqué dans l’activation cellulaire via la transcription des gènes liés à l’inflammation. Il reconnaît des molécules microbiennes mais également des facteurs endogènes non-infectieux tels que sécrétés par les tissus endommagés provenant de la dysfonction endothéliale. Ainsi, l’activation et la signalisation du TLR2 sont en étroite relation avec le développement de l’athérosclérose. Les études épidémiologiques ont confirmé le rôle athéroprotecteur de l’œstrogène via de nombreux mécanismes d’action. Ainsi, nous avons cherché à identifier de nouvelles cibles moléculaires permettant de mieux interpréter les bénéfices potentiels de l’œstrogène sur le système cardiaque. Pour la première fois chez les cellules endothéliales (CE) vasculaires de souris, nos travaux ont confirmé l’effet anti-inflammatoire de l’œstrogène via la diminution de l’expression et de l’activité du TLR2. Nous avons également déterminé l’influence de l’œstrogène sur le profil de la réponse inflammatoire de ce récepteur en mesurant les potentiels endothéliaux de migration et d’adhésion. De plus, nous avons caractérisé les voies de signalisation impliquées en démontrant l’influence négative de l’œstrogène sur la phosphorylation des kinases activées par le TLR2; illustrant l’interaction entre l’œstrogène et la signalisation de ce récepteur. Nos travaux amènent ainsi de nouvelles connaissances sur la régulation endothéliale du TLR2 et mettent en lumière les effets anti-inflammatoires et vasculaires rapides de l’œstrogène.

Les cellules dendritiques plasmacytoides dans le sang de cordon et après greffe de sang de cordon

La greffe de sang de cordon est de plus en plus utilisée et a permis de traiter avec succès chez l’enfant des déficits immunitaires ainsi que des hémopathies malignes comme les leucémies. Malgré d’importants avantages tels que l’absence de risque pour le donneur ou la plus faible incidence de maladie du greffon contre l’hôte (GvHD), utiliser le sang de cordon comporte certains inconvénients. En effet, une reconstitution immunitaire retardée, des infections opportunistes en plus grand nombre et un risque de rechute sont des complications qui peuvent survenir et engendrer un risque pour le pronostic vital du patient. Par conséquent, de nouvelles stratégies d’immunothérapies doivent être envisagées. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes particulièrement intéressés aux cellules dendritiques plasmacytoides (pDC) dont les fonctions sont importantes pour l’initiation des réponses immunitaires innée et adaptative et particulièrement pour leur capacité à activer les cellules NK. Afin d’élucider le rôle et l’impact de ces cellules dans les greffes de sang de cordon, le nombre et la fonction des pDC et des NK a été suivi longitudinalement chez des patients ayant subi une greffe de sang de cordon comparativement à des patients transplantés avec de la moelle osseuse. Nous avons ainsi démontré que les pDC et les NK apparaissent précocement suite à une greffe de sang de cordon et que ces cellules sont fonctionnelles. Ces résultats mettent donc en lumière que ces cellules pourraient être de bons outils pour l’établissement d’une immunothérapie après greffe de sang de cordon. De plus, la caractérisation fonctionnelle des pDC du greffon de sang de cordon a permis de révéler une plus faible production d’IFN-α par les pDC, comparativement aux pDC de sang d’adulte. Cette différence pourrait jouer un rôle dans la plus faible incidence de GvHD après les greffes de sang de cordon. Dans le but de préciser les mécanismes moléculaires de régulation négative de la production d’IFN-α par les pDC de sang de cordon, nous avons étudié les protéines de la voie de signalisation TLR9-IRF7. L’expression similaire de l’ARN du TLR9, MyD88, IRAK1 et IRF7 contraste avec la plus faible expression des protéines correspondantes. De plus, l’expression des MicroARNs miR-146a et miR-155 est plus élevé dans les pDC de sang de cordon comparativement aux pDC de sang d’adultes. Ensemble, ces données pointent une régulation négative post-transcriptionnelle de la voie TLR9-IRF7 qui pourrait expliquer la plus faible production d’IFN-α des pDC du sang de cordon. L’ensemble des ces travaux suggère que les pDC pourraient représenter une cible de choix dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques dans les greffes de sang de cordon.

Rôles des protéines Staufen 1 et 2 dans la plasticité synaptique des cellules pyramidales hippocampiques

La mémoire et l’apprentissage sont des phénomènes complexes qui demeurent encore incertains quant aux origines cellulaire et moléculaire. Il est maintenant connu que des changements au niveau des synapses, comme la plasticité synaptique, pourraient déterminer la base cellulaire de la formation de la mémoire. Alors que la potentialisation à long-terme (LTP) représente un renforcement de l’efficacité de transmission synaptique, la dépression à long-terme (LTD) constitue une diminution de l’efficacité des connexions synaptiques. Des études ont mis à jour certains mécanismes qui participent à ce phénomène de plasticité synaptique, notamment, les mécanismes d’induction et d’expression, ainsi que les changements morphologiques des épines dendritiques. La grande majorité des synapses excitatrices glutamatergiques se situe au niveau des épines dendritiques et la présence de la machinerie traductionnelle près de ces protubérances suggère fortement l’existence d’une traduction locale d’ARNm. Ces ARNm seraient d’ailleurs acheminés dans les dendrites par des protéines pouvant lier les ARNm et assurer leur transport jusqu’aux synapses activées. Le rôle des protéines Staufen (Stau1 et Stau2) dans le transport, la localisation et dans la régulation de la traduction de certains ARNm est bien établi. Toutefois, leur rôle précis dans la plasticité synaptique demeure encore inconnu. Ainsi, cette thèse de doctorat évalue l’importance des protéines Staufen pour le transport et la régulation d’ARNm dans la plasticité synaptique. Nous avons identifié des fonctions spécifiques à chaque isoforme; Stau1 et Stau2 étant respectivement impliquées dans la late-LTP et la LTD dépendante des récepteurs mGluR. Cette spécificité s’applique également au rôle que chaque isoforme joue dans la morphogenèse des épines dendritiques, puisque Stau1 semble nécessaire au maintien des épines dendritiques matures, alors que Stau2 serait davantage impliquée dans le développement des épines. D’autre part, nos travaux ont permis de déterminer que la morphogenèse des épines dendritiques dépendante de Stau1 était régulée par une plasticité synaptique endogène dépendante des récepteurs NMDA. Finalement, nous avons précisé les mécanismes de régulation de l’ARNm de la Map1b par Stau2 et démontré l’importance de Stau2 pour la production et l’assemblage des granules contenant les transcrits de la Map1b nécessaires pour la LTD dépendante des mGluR. Les travaux de cette thèse démontrent les rôles spécifiques des protéines Stau1 et Stau2 dans la régulation de la plasticité synaptique par les protéines Stau1 et Stau2. Nos travaux ont permis d’approfondir les connaissances actuelles sur les mécanismes de régulation des ARNm par les protéines Staufen dans la plasticité synaptique. MOTS-CLÉS EN FRANÇAIS: Staufen, hippocampe, plasticité synaptique, granules d’ARN, traduction, épines dendritiques.

La dérivation de cellules souches embryonnaires chez le cheval

Les cellules souches embryonnaires (ES) sont porteuses de grands espoirs en recherche biomédicale dans le but d’apporter un traitement définitif à l’ostéoarthrose. Parce que certaines articulations des chevaux sont similaires à celles des humains, cet animal représente un modèle important dans l’évaluation de stratégies de régénération du cartilage. Cependant, pour expérimenter un traitement par les cellules ES chez le cheval, des cellules ES équines (eES) n’ont toujours pas pu être dérivées. Dans ce contexte, l’objectif principal de cette étude est de dériver des lignées de cellules eES. Le premier objectif de notre étude consiste à optimiser la technique de dérivation des cellules eES. Nous démontrons que la lignée de cellules nourricières et le stade de développement des embryons influencent l’efficacité de la technique de dérivation tandis que l’inhibition de voies de signalisation menant à la différenciation des cellules ES ne l’influence pas sous nos conditions. Le deuxième objectif de notre étude est de caractériser de façon plus approfondie les lignées de cellules eES obtenues. Nous démontrons que les cellules eES dérivées expriment autant des marqueurs associés aux cellules pluripotentes qu’aux cellules différenciées et que l’inhibition de voies de signalisation menant à la différenciation n’influence pas l’expression de ces marqueurs. Pour conclure, nous confirmons avoir dérivé des lignées de cellules semblables au cellules eES (eES-like) ne correspondant pas complètement aux critères des cellules ES.

L’étude du rôle d’ARF1 dans la migration et la prolifération des cellules du cancer du sein

Les facteurs d’ADP-ribosylation (ARFs) sont des petites GTPases impliquées dans le transport vésiculaire, la synthèse des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. Les isoformes 1 (ARF1) et 6 (ARF6) sont les plus étudiées. ARF1 est connue pour être distribuée à l’appareil de Golgi, alors qu’ARF6 est confinée principalement à la membrane plasmique. Récemment, il a été démontré qu’ARF6 est hautement exprimée et activée dans plusieurs cellules de cancer du sein invasif et que celle-ci contrôle les processus de migration et d’invasion. Cependant, le rôle d’ARF1 dans ces processus biologiques impliqués dans la formation de métastases du cancer du sein demeure méconnu. Dans la présente étude, nous avons utilisé comme modèle d’étude pour ARF1 les MDA-MB-231, une lignée de cellules invasives du cancer du sein exprimant de haut niveau de récepteurs au facteur de croissance épidermique (EGFR). Afin d’évaluer le rôle d’ARF1 dans la migration, dans la transition épithéliale mésenchymateuse (EMT) et dans la prolifération cellulaire, nous avons procédé à deux types d’approches expérimentales, soit l’inhibition de l’expression endogène d’ARF1 par l’interférence à l’ARN de même que la surexpression de formes mutantes dominante négative (ARF1T31N) et constitutivement active d’ARF1 (ARF1Q71L), qui miment les formes inactive et active de la GTPase, respectivement. De manière intéressante, la suppression d’ARF1 et la surexpression de la forme inactive d’ARF1 induisent l’arrêt de la migration et de la prolifération des MDA-MB-231 de manière dépendante à l’activation de l’EGFR et ce, en bloquant l’activation de la voie PI3Kinase. De plus, nous démontrons qu’ARF1, de même que les ARF GEFs Cytohésine-1 et Cytohésine-2, contribuent au phénotype invasif des cellules tumorales de cancer du sein. Dans les mêmes approches expérimentales, nous montrons que l’inactivation d’ARF1 dans les MDA-MB-231 déclenche un arrêt de croissance irréversible associé à l’induction de la sénescence et ce, en régulant la fonction de la protéine du rétinoblastome pRb. Enfin, cette étude a permis de mettre en évidence le rôle physiologique d’ARF1 dans les processus de migration et de prolifération cellulaire, deux événements biologiques responsables de la progression du cancer du sein.

Étude de la collaboration entre les facteurs de transcription hématopoïétiques lors du développement et de la différenciation des cellules érythroïdes

La régulation transcriptionnelle des gènes est cruciale pour permettre le bon fonctionnement des cellules. Afin que les cellules puissent accomplir leurs fonctions, les gènes doivent être exprimés adéquatement dans le bon type cellulaire et au stade de développement et de différenciation approprié. Un dérèglement dans l’expression de un ou plusieurs gènes peut entraîner de graves conséquences sur le destin de la cellule. Divers éléments en cis (ex : promoteurs et enhancers) et en trans (machinerie transcriptionnelle et facteurs de transcription) sont impliqués dans la régulation de la transcription. Les gènes du locus humain beta-globine (hub) sont exprimés dans les cellules érythroïdes et sont finenement régulés lors du développement et de la différenciation. Des mutations dans différentes régions du locus causent entre autres les beta-thalassémies. Nous avons utilisé ce modèle bien caractérisé afin d’étudier différents mécanismes de régulation favorisés par les facteurs de transcription qui sont exprimés dans les cellules érythroïdes. Nous nous sommes intéressés à l’importance de l’élément en cis HS2 du Locus control region. Cet élément possède plusieurs sites de liaison pour des facteurs de transcription impliqués dans la régulation des gènes du locus hub. Nos résultats montrent que HS2 possède un rôle dans l’organisation de la chromatine du locus qui peut être dissocié de son rôle d’enhancer. De plus, HS2 n’est pas essentiel pour l’expression à haut niveau du gène beta alors qu’il est important pour l’expression des gènes gamma. Ceci suggère que le recrutement des différents facteurs au site HS2 lors du développement influence différement les gènes du locus. Dans un deuxième temps, nous avons investigué l’importance de HS2 lors de la différenciation des cellules érythroïdes. Il avait été rapporté que l’absence de HS2 influence grandement la potentialisation de la chromatine du gène beta. La potentialisation dans les cellules progénitrices favorise l’activation transcriptionnelle du gène dans les cellules matures. Nous avons caractérisé le recrutement de différents facteurs de transcription au site HS2 et au promoteur beta dans les cellules progénitrices hématopoïétiques (CPH) ainsi que dans les cellules érythroïdes matures. Nos résultats montrent que le facteur EKLF est impliqué dans la potentialisation de la chromatine et favorise le recrutement des facteurs BRG1, p45 et CBP dans les CPH. L’expression de GATA-1 dans les cellules érythroïdes matures permet le recrutement de GATA-1 au locus hub dans ces cellules. Ces données suggèrent que la combinaison de EKLF et GATA-1 est requise pour permettre une activation maximale du gène beta dans les cellules érythroïdes matures. Un autre facteur impliqué dans la régulation du locus hub est Ikaros. Nous avons étudié son recrutement au locus hub et avons observé que Ikaros est impliqué dans la répression des gènes gamma. Nos résultats montrent aussi que GATA-1 est impliqué dans la répression de ces gènes et qu’il interagit avec Ikaros. Ensemble, Ikaros et GATA-1 favorisent la formation d’un complexe de répression aux promoteurs gamma. Cette étude nous a aussi permis d’observer que Ikaros et GATA-1 sont impliqués dans la répression du gène Gata2. De façon intéressante, nous avons caractérisé le mécanisme de répression du gène Hes1 (un gène cible de la voie Notch) lors de la différenciation érythroïde. Similairement à ce qui a été observé pour les gènes gamma, Hes1 est aussi réprimé par Ikaros et GATA-1. Ces résultats suggèrent donc que la combinaison de Ikaros et GATA-1 est associée à la répression de plusieurs de gènes dans les cellules érythroïdes. Globalement cette thèse rapporte de nouveaux mécanismes d’action de différents facteurs de transcription dans les cellules érythroïdes. Particulièrement, nos travaux ont permis de proposer un modèle pour la régulation des gènes du locus hub lors du développement et de la différenciation. De plus, nous rapportons pour la première fois l’importance de la collaboration entre les facteurs Ikaros et GATA-1 dans la régulation transcriptionnelle de gènes dans les cellules érythroïdes. Des mutations associées à certains des facteurs étudiés ont été rapportées dans des cas de beta-thalassémies ainsi que de leucémies. Nos travaux serviront donc à avoir une meilleure compréhension des mécanismes d’action de ces facteurs afin de potentiellement pouvoir les utiliser comme cibles thérapeutiques.

Rôle différentiel des cellules épithéliales intestinales et pulmonaires dans le recrutement des cellules Th17 vers les sites de réplication du virus de l'immunodéficience humaine de type 1

L’infection à VIH-1 est associée à une forte déplétion des lymphocytes T CD4+ à polarisation Th17 au niveau des tissus lymphoïdes associés aux muqueuses intestinales (GALT, gut-associated lymphoid tissues). Ceci conduit à la translocation microbienne, qui est une cause d’activation immunitaire chronique et de progression de la maladie. Les cellules épithéliales (CE) jouent un rôle critique dans le maintien de l’intégrité et de l’homéostasie au niveau des muqueuses intestinales via le recrutement des cellules de l’immunité innée (e.g., neutrophiles) et adaptative (e.g., cellules Th17). Les neutrophiles produisent des molécules antivirales (e.g., défensines-) et ont la capacité de limiter la réplication virale au niveau des muqueuses. Les cellules Th17 jouent un double rôle lors de l’infection à VIH. Elles contribuent d’une part à la défense contre différents pathogènes opportunistes en augmentant, via la production d’IL-17, la capacité des CE à attirer les cellules Th17 et les neutrophiles. D’autre part, les cellules Th17 jouent un rôle délétère en tant que cibles de réplication virale et sources de cytokines pro-inflammatoires. La fréquence des cellules Th17 est diminuée dans les GALT mais pas dans les poumons des patients infectés par le VIH, suggérant qu’il existe des mécanismes différents par lesquels les cellules Th17 sont recrutées vers ces sites anatomiques. Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle le VIH interfère avec la capacité des CE intestinales et non pas pulmonaires à produire des chimiokines (CK) responsables de l’attraction des cellules Th17 et des neutrophiles. Nous avons démontré que les CE intestinales et pulmonaires produisent des CK spécifiques pour les cellules Th17 (CCL20) et les neutrophiles (CXCL8) en réponse à des stimuli pro-inflammatoires tels que l’IL-1 et le TNF-. Le TNF- agit en synergie avec l’IL-17, un « signal de danger » récemment identifié, et augmente la capacité des CE intestinales mais pas pulmonaires à produire la chimiokine CCL20. Cette synergie s’explique par l’augmentation préférentielle de l’expression du récepteur à l’IL-17 à la surface des CE intestinales suite à la stimulation par le TNF-. L’exposition au VIH n’affecte pas la production de CCL20 et de CXCL8 par les CE intestinales, mais altère la capacité des CE alvéolaires à produire ces chimiokines en accord avec la permissivité sélective de ces dernières à l’infection par le VIH. En conclusion, nos résultats démontrent que (i) le VIH n’interfère pas directement avec la capacité des CE intestinales à recruter des cellules Th17 et des neutrophils et que (ii) la production de CCL20 par ces cellules est dépendantes de la synergie entre le TNF- et l’IL-17. Ainsi, la déplétion des cellules Th17 et la pénurie en IL-17 dans les GALT des sujets infectés pourrait causer de façon préférentielle des altérations fonctionnelles au niveau des CE intestinales, se traduisant par l’altération du recrutement des cellules Th17 en réponse au CCL20.

Dissecting cell cycle protein complexes using the pptimized yeast cytosine deaminase protein-fragment complementation assay “You too can play with an edge”

Les protéines sont les produits finaux de la machinerie génétique. Elles jouent des rôles essentiels dans la définition de la structure, de l'intégrité et de la dynamique de la cellule afin de promouvoir les diverses transformations chimiques requises dans le métabolisme et dans la transmission des signaux biochimique. Nous savons que la doctrine centrale de la biologie moléculaire: un gène = un ARN messager = une protéine, est une simplification grossière du système biologique. En effet, plusieurs ARN messagers peuvent provenir d’un seul gène grâce à l’épissage alternatif. De plus, une protéine peut adopter plusieurs fonctions au courant de sa vie selon son état de modification post-traductionelle, sa conformation et son interaction avec d’autres protéines. La formation de complexes protéiques peut, en elle-même, être déterminée par l’état de modifications des protéines influencées par le contexte génétique, les compartiments subcellulaires, les conditions environmentales ou être intrinsèque à la croissance et la division cellulaire. Les complexes protéiques impliqués dans la régulation du cycle cellulaire sont particulièrement difficiles à disséquer car ils ne se forment qu’au cours de phases spécifiques du cycle cellulaire, ils sont fortement régulés par les modifications post-traductionnelles et peuvent se produire dans tous les compartiments subcellulaires. À ce jour, aucune méthode générale n’a été développée pour permettre une dissection fine de ces complexes macromoléculaires. L'objectif de cette thèse est d'établir et de démontrer une nouvelle stratégie pour disséquer les complexes protéines formés lors du cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Dans cette thèse, je décris le développement et l'optimisation d'une stratégie simple de sélection basée sur un essai de complémentation de fragments protéiques en utilisant la cytosine déaminase de la levure comme sonde (PCA OyCD). En outre, je décris une série d'études de validation du PCA OyCD afin de l’utiliser pour disséquer les mécanismes d'activation des facteurs de transcription et des interactions protéine-protéines (IPPs) entre les régulateurs du cycle cellulaire. Une caractéristique clé du PCA OyCD est qu'il peut être utilisé pour détecter à la fois la formation et la dissociation des IPPs et émettre un signal détectable (la croissance des cellules) pour les deux types de sélections. J'ai appliqué le PCA OyCD pour disséquer les interactions entre SBF et MBF, deux facteurs de transcription clés régulant la transition de la phase G1 à la phase S. SBF et MBF sont deux facteurs de transcription hétérodimériques composés de deux sous-unités : une protéine qui peut lier directement l’ADN (Swi4 ou Mbp1, respectivement) et une protéine commune contenant un domain d’activation de la transcription appelée Swi6. J'ai appliqué le PCA OyCD afin de générer un mutant de Swi6 qui restreint ses activités transcriptionnelles à SBF, abolissant l’activité MBF. Nous avons isolé des souches portant des mutations dans le domaine C-terminal de Swi6, préalablement identifié comme responsable dans la formation de l’interaction avec Swi4 et Mbp1, et également important pour les activités de SBF et MBF. Nos résultats appuient un modèle où Swi6 subit un changement conformationnel lors de la liaison à Swi4 ou Mbp1. De plus, ce mutant de Swi6 a été utilisé pour disséquer le mécanisme de régulation de l’entrée de la cellule dans un nouveau cycle de division cellulaire appelé « START ». Nous avons constaté que le répresseur de SBF et MBF nommé Whi5 se lie directement au domaine C-terminal de Swi6. Finalement, j'ai appliqué le PCA OyCD afin de disséquer les complexes protéiques de la kinase cycline-dépendante de la levure nommé Cdk1. Cdk1 est la kinase essentielle qui régule la progression du cycle cellulaire et peut phosphoryler un grand nombre de substrats différents en s'associant à l'une des neuf protéines cycline régulatrice (Cln1-3, Clb1-6). Je décris une stratégie à haut débit, voir à une échelle génomique, visant à identifier les partenaires d'interaction de Cdk1 et d’y associer la cycline appropriée(s) requise(s) à l’observation d’une interaction en utilisant le PCA OyCD et des souches délétées pour chacune des cyclines. Mes résultats nous permettent d’identifier la phase(s) du cycle cellulaire où Cdk1 peut phosphoryler un substrat particulier et la fonction potentielle ou connue de Cdk1 pendant cette phase. Par exemple, nous avons identifié que l’interaction entre Cdk1 et la γ-tubuline (Tub4) est dépendante de Clb3. Ce résultat est conforme au rôle de Tub4 dans la nucléation et la croissance des faisceaux mitotiques émanant des centromères. Cette stratégie peut également être appliquée à l’étude d'autres IPPs qui sont contrôlées par des sous-unités régulatrices.

Amélioration de la prise de greffe hématopoïétique par une thérapie cellulaire à base de cellules souches mésenchymateuses

Le traitement du cancer à l’aide d’une exposition aux radiations ionisantes peut mener au développement de plusieurs effets secondaires importants, dont un retard de réparation et de régénération du tissu hématopoïétique. Les mécanismes responsables de ces effets demeurent encore inconnus, ce qui limite le développement de nouvelles approches thérapeutiques. À l’aide d’un modèle murin de prise de greffe, nos résultats démontrent que l’endommagement du microenvironnement par l’irradiation a un impact limitant sur le nichage hématopoïétique. Parce que le microenvironnement est composé principalement de cellules dérivées des cellules souches mésenchymateuses (CSM), nous avons évalué le potentiel des CSM à régénérer le tissu hématopoïétique par la reconstitution de la niche osseuse. Cette thérapie a mené à une augmentation remarquable du nichage hématopoïétique chez les souris irradiées. Les causes moléculaires impliquées dans le nichage hématopoïétiques sont encore inconnues, mais nous avons remarqué l’augmentation de la sécrétion de la cytokine « granulocyte-colony stimulating factor » (G-CSF) dans l’espace médullaire suite à l’irradiation. Le G-CSF est impliqué dans la mobilisation cellulaire et est fort possiblement nuisible à une prise de greffe. Nous avons évalué le potentiel d’une thérapie à base de CSM sécrétant le récepteur soluble du G-CSF afin de séquestrer le G-CSF transitoirement et les résultats obtenus démontrent que le blocage du G-CSF favorise le nichage hématopoïétique. Globalement, les données présentées dans ce mémoire démontrent que le microenvironnement osseux et le niveau de G-CSF dans la moelle sont importants dans le processus de nichage hématopoïétique et que la baisse du potentiel de régénération du tissu hématopoïétique suite à l’irradiation peut être renversée à l’aide d’une thérapie cellulaire de CSM génétiquement modifiées ou non.

Influence des facteurs immuno-modulateurs d'origine placentaire sur la différenciation et la maturation des cellules dendritiques plasmacytoïdes

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont des cellules dendritiques spécialisées, aussi connues sous le nom de cellules productrices d’interféron-α (IFN-α). Les pDC jouent un rôle essentiel dans l’induction de la réponse immunitaire antivirale, en reconnaissant les antigènes viraux via les Toll-like receptors (TLR) 7 et 9. Toutefois, les pDC du sang de cordon sont incapables de produire de l’IFN-α en réponse à une stimulation du TLR9, mais leur maturation en cellules présentatrices d’antigènes est normale. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés aux effets des facteurs immuno-régulateurs sécrétés par le placenta sur la différenciation et la fonction des pDC. Nous avons analysé l’effet, seules ou en combinaison, de la progestérone (PG), de l'interleukine (IL)-10 et du tumor growth factor (TGF)-β sur la différenciation et la fonction des pDC. Nous démontrons qu’à des niveaux supra-physiologiques ces trois facteurs modulent la différenciation et la production d’IFN-α des pDC. À des niveaux observés dans le sang de cordon, ces facteurs ont peu d’impact sur les pDC lorsque utilisés individuellement. Toutefois lorsque utilisés en combinaison, ils diminuent la production d’IFN-α. Nous avons aussi démontré que la PG, l’IL-10 et le TGF-β n’induisent pas l’expression des micro-ARN 146a et 155 par les pDC. Finalement nous démontrons que les niveaux de ces molécules sont plus élevés dans le sang de cordon que dans le sang d’adulte. Nos résultats révèlent le rôle important des facteurs immuno-régulateurs sécrétés par le placenta sur la fonction des pDC et en conséquence, sur la réponse immunitaire fœtale et néonatale.