Estratégias para minimização do estresse oxidativo em sistemas de produção in vitro de embriões bovinos destinados à vitrificação

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Alterações celulares induzidas pelo estresse térmico em embriões bovinos

Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Melatonin in maturation media fails to improve oocyte maturation, embryo development rates and DNA damage of bovine embryos

Melatonin (MEL) acts as a powerful scavenger of free radicals and direct gonadal responses to melatonin have been reported in the literature. Few studies, however, have evaluated the effect of MEL during in vitro maturation (IVM) on bovine embryos. This study tested the addition of MEL to maturation medium (MM) with no gonadotropins on nuclear maturation and embryo development rates and the incidence of DNA damage in resulting embryos. Cumulus-oocyte complexes were aspirated from abattoir ovaries and cultured in MM (TCM-199 medium supplemented with 10% fetal calf serum - FCS) at 39ºC and 5% CO2 in air. After 24 hours of culture in MM with 0.5 µg mL-1 FSH and 5.0 µg mL-1 LH; 10-9 M MEL) or 10-9 M MEL, 0.5 µg mL-1 FSH and 5.0 µg mL-1 LH, the oocytes were stained with Hoechst 33342 to evaluate nuclear maturation rate. After in vitro fertilization and embryo culture, development rates were evaluated and the blastocysts were assessed for DNA damage by Comet assay. There was no effect of melatonin added to the MM, alone or in combination with gonadotropins, on nuclear maturation, cleavage and blastocyst rates. These rates ranged between 88% to 90%, 85% to 88% and 42% to 46%, respectively. The extent of DNA damage in embryos was also not affected by MEL supplementation during IVM. The addition of 10-9 M MEL to the MM failed to improve nuclear maturation and embryo development rates and the incidence of DNA damage in resulting embryos, but was able to properly substitute for gonadotropins during IVM.

Os histricomorfos sul-americanos: uma análise comparativa do desenvolvimento embriológico

O objetivo do estudo foi realizar uma análise embriológica dos roedores histricomorfos (paca, cutia, preá e capivara), a fim de comparar com a de outros roedores e com a morfogênese humana um padrão embriológico. Utilizaram-se 8 espécimes de roedores sendo, 2 embriões para cada espécie coletada, ambas em inicio de gestação. Estes foram retirados dos úteros gestantes através de ovariosalpingohisterectomia parcial, seguido de fixação em solução de paraformaldeído 4%. Para as mensurações de Crow-Rump, adotou-se como referência a crista nucal numa extremidade e da última vértebra sacral na extremidade oposta. De forma geral, os embriões analisados mostraram as seguintes características morfológicas: divisão dos arcos branquiais, o não fechamento do neuróporo cranial em alguns embriões estudados, a curvatura cranial acentuada e os somitos delimitados e individualizados. O broto dos membros apresentava-se em desenvolvimento em formato de remo, além da impressão cardíaca e fígado. Na região caudal, visualizou-se a curvatura crânio-caudal, a vesícula óptica com e sem pigmentação da retina, a abertura do tubo neural na região do quarto ventrículo encefálico, a fosseta nasal e a formação das vesículas encefálicas. Concluímos que desenvolvimento embriológico dos roedores histricomorfos pode ser comparado à morfogênese de ratos, cobaios, coelhos e humanos nos diferentes estágios de desenvolvimento, tomando apenas o cuidado com as particularidades de cada espécie, além da implementação de tecnologias reprodutivas, especialmente a de embriões, a qual requer o conhecimento do desenvolvimento pré-implantação referente às fases de desenvolvimento.

Alguns aspectos da biologia de Biomphalaria glabrata (Say, 1818) e Biomphalaria tenagophila (D'Orbigny, 1835) (Pulmonata, Planorbidae): I - Duração do período embrionário

Foram realizadas observações sobre a duração do período embrionário de Biomphalaria glabrata e Biomphalaria tenagophila, durante um ano, em condições de laboratório. As médias, expressas em dias, encontradas para Biomphalaria glabrata e Biomphalaria tenagophila foram respectivamente de 7,6 e 8,0 dias. Essas diferenças não foram significativas ao nível de 5%. O desenvolvimento mais rápido dos embriões até a eclosão verificou-se na estação quente, em ambas as espécies, quando a temperatura média da água foi de aproximadamente 28°C. Após a análise da matriz de correlação verificou-se que a influência da temperatura sobre o tempo de desenvolvimento embrionário foi pouco intensa: Biomphalaria glabrata apresentou maior correlação com a temperatura mínima do ambiente (36,2%) e com a temperatura da água (36,0%) enquanto Biomphalaria tenagophila apresentou maior correlação com a temperatura mínima do ambiente (27,0%).

Influência da temperatura e umidade no desenvolvimento ninfal de Rhodnius robustus

OBJETIVO: Avaliar as diferenças significativas de desenvolvimento ninfal da espécie Rhodnius robustus Larrousse, 1927, submetida a diferentes condições de temperatura e umidade, que se encontra distribuída na região Norte do Brasil (Acre, Amazonas e Pará) e na Colômbia, no Equador, no Peru e na Venezuela. MÉTODOS: Formaram-se três grupos de Rhodnius robustus, mantidos em diferentes condições de laboratório: 33/40 (33+/-1°C e 40+/-5% UR -- umidade relativa), 33/70 (33+/-1°C e 70+/-5% UR) e 28/70 (28+/-1°C e 70+/-5% UR), para observar o período de incubação dos ovos, o desenvolvimento de cada estádio, os percentuais de mortalidade e os número de repastos realizados. RESULTADOS: O menor período médio de desenvolvimento ninfal foi observado no grupo 28/70 com as médias: 14,4; 17,3; 20,3; 22,8 e 40. O desenvolvimento embrionário apresentou diferenças significativas entre os tratamentos utilizados (p<0,01). O número de repastos teve aumento gradual com a aproximação da fase adulta em todos os grupos testados, exceto no terceiro estádio do grupo 33/70. Os menores percentuais de mortalidade foram os do grupo 28/70. CONCLUSÕES: Temperaturas elevadas, independentes das umidades associadas, podem acelerar o ciclo biológico da espécie. Entretanto, elas podem prejudicar a sobrevivência das colônias, impedindo sua manutenção em laboratório.

Diagnóstico Pré-Natal de Uropatia: Importância do Desenvolvimento Embriológico Renal

As uropatias malformativas constituem a principalcausa de anomalia neonatal nao letal. Estas anomalias do desenvolvimento devem ser interpretadas com base no conhecimento da morbilidade e, em alguns casos, a mortalidade associada a este tipo de patologia 1,2. As malformações congénitas devem ser pensadas com base no conhecimento da dinâmica do normal desenvolvimento embrionário e dos múltiplos factores reguladores intervenientes, so assim será possivel estabelecer estratégias eficazes de investigação e terapêutica.

Os histricomorfos sul-americanos: uma análise comparativa do desenvolvimento embriológico

O objetivo do estudo foi realizar uma análise embriológica dos roedores histricomorfos (paca, cutia, preá e capivara), a fim de comparar com a de outros roedores e com a morfogênese humana um padrão embriológico. Utilizaram-se 8 espécimes de roedores sendo, 2 embriões para cada espécie coletada, ambas em inicio de gestação. Estes foram retirados dos úteros gestantes através de ovariosalpingohisterectomia parcial, seguido de fixação em solução de paraformaldeído 4%. Para as mensurações de Crow-Rump, adotou-se como referência a crista nucal numa extremidade e da última vértebra sacral na extremidade oposta. De forma geral, os embriões analisados mostraram as seguintes características morfológicas: divisão dos arcos branquiais, o não fechamento do neuróporo cranial em alguns embriões estudados, a curvatura cranial acentuada e os somitos delimitados e individualizados. O broto dos membros apresentava-se em desenvolvimento em formato de remo, além da impressão cardíaca e fígado. Na região caudal, visualizou-se a curvatura crânio-caudal, a vesícula óptica com e sem pigmentação da retina, a abertura do tubo neural na região do quarto ventrículo encefálico, a fosseta nasal e a formação das vesículas encefálicas. Concluímos que desenvolvimento embriológico dos roedores histricomorfos pode ser comparado à morfogênese de ratos, cobaios, coelhos e humanos nos diferentes estágios de desenvolvimento, tomando apenas o cuidado com as particularidades de cada espécie, além da implementação de tecnologias reprodutivas, especialmente a de embriões, a qual requer o conhecimento do desenvolvimento pré-implantação referente às fases de desenvolvimento.

Desenvolvimento e padronização do Dot-ELISA usando peptídeos recombinantes para o diagnóstico sorológico de Neospora caninum

A neosporose é reconhecida como uma das maiores causas de aborto e perdas neonatais em bovinos de leite e corte em todo o mundo. Nos últimos anos esta doença tem atraído o interesse de pesquisadores com foco na epidemiologia e métodos eficazes de diagnóstico desta doença. No presente estudo objetivou-se desenvolver e padronizar um teste Dot-ELISA para o diagnóstico sorológico de Neospora caninum com um peptídeo recombinate como antígeno, visando o desenvolvimento de um kit para diagnóstico a campo. O peptídeo recombinante (rNcGRA1) foi desenhado com base na metodologia de genética reversa de epítopos antigênicos originados de uma proteína de grânulos densos de N. caninum, e sintetizado pela GenScript (USA). Produzido mediante o processo fermentativo em leveduras Pichia pastoris KM71. Para a padronização do Dot-ELISA, membranas de nitrocelulose de 0.22µm foram sensibilizadas com 1µL do antígeno e posteriormente os soros foram diluídos em solução de lavagem e incubados durante 1 hora. A revelação foi feita mediante a adição de Proteína G marcada com peroxidase por 30 minutos, seguido da solução reveladora a base de 3,3’-Diaminobenzidine (DAB). Logo após a padronização foram testados 44 soros bovinos diagnosticados por imunofluorescência indireta (RIFI), obtendo-se uma concordância nos resultados do teste de 95,5% e uma sensibilidade e especificidade de 100% e 92% respectivamente. Quanto ao Kit para diagnóstico a campo na Plataforma Tecnológica RapidFlow-Through Miriad®, o peptídeo rNcGRA1 apresentou marcações visíveis ao reagir com os soros positivos, e não apresentou marcações usando os soros negativos. Este estudo é o primeiro a utilizar peptídeos recombinantes e mostrar-se eficiente para o diagnóstico sorológico de bovinos naturalmente infetados por N. caninum.

Avaliação toxicológica da preparação fitoterápica contendo Piper methysticum Forst, piperaceae (Kava Kava ) sobre o desenvolvimento pré-natal de ratos winstar.

A kava kava (Piper methysticum Forst), pertencente à família Piperaceae, é utilizada para diminuir a ansiedade e medo e tratar distúrbios comportamentais. É um fitoterápico utilizado em vários países, entretanto pouco se sabe, sobre seus efeitos no desenvolvimento embrionário. O presente trabalho avaliou o possível efeito teratogênico da formulação fitoterápica contendo Piper methysticum Forst durante o período de organogênese em ratas Wistar. As ratas foram tratadas com 0mg.kg –1 (controle), 5mg.kg –1 ; 35mg.kg –1 e 50mg.kg –1 da preparação fitoterápica (kava kava®), por via oral, do 6° ao 15° dia de prenhez. Os resultados revelaram ausência de toxicidade sistêmica e reprodutiva nas variáveis avaliadas, fundamentados pela ausência de alterações no desenvolvimento ponderal, consumos de ração e água, na massa relativa dos órgãos, nas reabsorções embrionárias, na massa corporal, na vitalidade, no número de fetos por progenitora e nas alterações macroscópicas externas e esqueléticas dos fetos. Adicionalmente as enzimas alanina aminotrasferase (ALT) e fosfatase alcalina (FA) foram determinadas no soro das ratas tratadas, para avaliar o possível efeito hepatotóxico da preparação fitoterápica. Não houve alteração na atividade das enzimas ALT e FA, bem como alterações histopatológicas do fígado das ratas, não confirmando a hepatotoxicidade. Conclui-se que o fitoterápico kava kava, até 35mg.kg –1, não determina o aparecimento de teratogenicidade.

Desenvolvimento de Oligonychus ilicis em Coffea canephora sob diferentes temperaturas

Oligonychus ilicis (McGregor) (Acari) (Tetranychidae) é uma das principais pragas de Coffea canephora Pierre & Froehner. Neste trabalho, avaliou-se o efeito de diferentes temperaturas no desenvolvimento desse ácaro-vermelho em folhas de C. canephora, em laboratório. Confinaram-se 80 fêmeas em 40 arenas, constituídas de disco foliar de 4 cm, para oviposição nas temperaturas de 21, 24, 27, 30 e 33 ºC. Foram selecionados ao acaso pelo menos dois ovos para avaliar o desenvolvimento embrionário. Após a eclosão da larva, foram realizadas avaliações a cada 12 horas para obtenção da duração e sobrevivência larval. Para avaliar a longevidade foi transferido um ácaro macho da criação para as arenas com uma fêmea para acasalamento. O limite térmico de desenvolvimento inferior e a constante térmica foram determinados para a duração do desenvolvimento de ovo a adulto. O tempo de desenvolvimento das fases imaturas diminuiu com o aumento da temperatura. As fases de ovo, larva, protocrisálida, protoninfa, deutocrisálida, deutoninfa e teleiocrisálida variaram, respectivamente, de 10,4 a 4,3; 2,4 a 1,2; 2,0 a 1,0; 2,3 a 1,2; 1,9 a 1,0; 3,0 a 1,5 e 2,3 a 1,0 dias. O aumento da temperatura afetou o período de desenvolvimento, reduzindo a duração de ovo-adulto e a longevidade. O limite térmico inferior foi de 9,0 ºC para o período de ovo-adulto e constante térmica de 256,4 graus-dias. em condições de laboratório, a faixa de temperatura que favorece o desenvolvimento do ácaro em C. canephora foi de 24 a 30 ºC. O limite térmico inferior não é limitante para ocorrência de O. ilicis em áreas cultivadas com C. canephora no estado do Espírito Santo.

Oocyte activation and preimplantation development of bovine embryos obtained by specific inhibition of cyclin-dependent kinases

Realizaram-se dois experimentos para avaliar a eficiência da bohemina e roscovitina associadas à ionomicina para ativação partenogenética e desenvolvimento embrionário inicial de bovinos. No primeiro, foram testadas diferentes concentrações (0, 50, 75 ou 100µM) e diferentes tempos de exposição (2, 4 ou 6 horas) à bohemina ou à roscovitina na ativação de oócitos bovinos maturados in vitro (MIV) pré-expostos à ionomicina. Os melhores tratamentos, bohemina 75µM e roscovitina 50µM, ambos por seis horas, foram utilizados no segundo experimento, no qual oócitos bovinos MIV foram expostos à ionomicina seguido ou não pelo tratamento com inibidores específicos das quinases dependentes de ciclina (CDKI), e avaliados quanto à configuração nuclear, taxa de ativação e desenvolvimento até blastocisto. Os tratamentos combinados (ionomicina+CDKI) apresentaram melhor taxa de ativação (77,3%) e desenvolvimento embrionário inicial (35,2%) do que a ionomicina sozinha (69,4% e 21,9%, respectivamente), e também promoveram ativação mais uniforme (aproximadamente 90% de formação de um pronúcleo). Estes resultados demonstram que os CDKIs potencializam o efeito da ionomicina na ativação e desenvolvimento embrionário inicial e podem auxiliar na obtenção de protocolos de ativação mais eficientes, aumentando a capacidade de desenvolvimento de embriões produzidos por meio de biotécnicas reprodutivas.

Effect of insulin-like growth factor-1 during in vitro oocyte maturation and in vitro culture of bovine embryos

Avaliaram-se o efeito do IGF-I na maturação in vitro (MIV) (experimento I) e no desenvolvimento embrionário (DE) (experimento II) de oócitos bovinos fecundados in vitro, quanto às taxas de clivagem (TC), de blastocistos (TB) e de eclosão (TE). Para MIV, complexos cumulus-oócitos imaturos foram cultivados em meio TCM-199 suplementado com HEPES, bicarbonato e piruvato de sódio, aditivos, soro fetal bovino (meio B-199) e gonadotrofinas 14U/ml de PMSG e 7U/ml de hCG). Para o desenvolvimento embrionário, os oócitos/zigotos foram cultivados em meio B-199 com células epiteliais do oviduto bovino em suspensão sob óleo de silicone. As condições de cultivo in vitro para ambos os experimentos seguiram os tratamentos: 1- meio B-199 + 200 ng/ml IGF-I; 2- B-199 + 100 ng/ml IGF-I; 3- B-199 + 50 ng/ml IGF-I; 4- B-199 + 10 ng/ml IGF-I; 5- B-199 + 0 ng/ml IGF-I. Todas as culturas foram realizadas a 38,5° C em atmosfera com 5% de CO2 e os dados foram analisados pelo teste do qui-quadrado. No experimento I, não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos quanto às TC, TB e TE, quando o meio de MIV foi suplementado com IGF-I. No experimento II, a adição de IGF-I ao meio de DE resultou em aumento na TC (P<0,05) mas não influenciou a TB e a TE. A adição de 200 ng/ml de IGF-I ao meio DE melhorou a TC (71,1%) quando comparada com a TC dos grupos de 100 ng/ml de IGF-I (57,6%) ou controle (56,7%), entretanto não houve diferença quando comparada com a dos grupos de 50 ng/ml (69,4%) ou 10 ng/ml (73,1%) de IGF-I. Não houve efeito benéfico na adição de 10 a 200 ng/ml de IGF-I nos meios de MIV e de DE com relação ao desenvolvimento de embriões produzidos a partir de oócitos maturados e fecundados in vitro.

Desenvolvimento folicular de embriões de frangos de corte de diferentes genótipos expostos ao estresse térmico crônico

O objetivo do trabalho foi avaliar as alterações tegumentares (morfogênese da pena), em embriões de frangos de corte de linhagens de diferentes padrões de crescimento, obtidos de ovos incubados sob diferentes temperaturas. Os ovos foram obtidos de matrizes das linhagens Cobb 500 e ISA JA57, distribuídos proporcionalmente em três incubadoras. do primeiro (D1) ao sexto dia (D6) de incubação, utilizou-se uma temperatura padrão (37,8°C). A partir do sétimo dia (D7) e até o momento do nascimento aos 21 dias (D21), uma das incubadoras teve a temperatura reduzida para 36,8°C (fria) e uma outra alterada para 38,8°C (quente). A terceira incubadora foi mantida a 37,8°C (controle). O delineamento adotado foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3 x 2 (temperatura de incubação e linhagem). A temperatura de incubação e a linhagem não alteraram a densidade dos folículos da pena (número médio de folículos por área de 337,5µm²) nas regiões femural e dorsopélvica dos embriões até os 11 dias (D11). Entretanto, observou-se aumento na densidade folicular na região dorsal dos embriões aos 16 dias (D16) devido ao aumento da temperatura, permanecendo até o momento do nascimento. É possível oncluirque embriões incubados em temperatura acima da recomendada (38,8°C) apresentam uma maior densidade de folículos na região dorsopélvica. Apesar disso, a morfogênese dos folículos permaneceu inalterada.

Os histricomorfos sul-americanos: uma análise comparativa do desenvolvimento embriológico

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)