Linguaggio e numero: traiettorie evolutive e relazioni tra competenze in bambini con sviluppo tipico e a rischio

Linguaggio e numero rappresentano due aspetti centrali nella storia del genere umano, dal momento che competenze precoci sono già descritte a partire dalla preistoria, accompagnano l’uomo durante la sua esistenza e non sono condivise pienamente da altre specie. I neonati mostrano già delle predisposizioni per gli stimoli linguistici e numerici, queste abilità si sviluppano precocemente nei primi anni di vita e accompagnano il bambino durante l’iter scolastico e l’adulto nella vita di tutti i giorni. Linguaggio e numero condividono, quindi, molte caratteristiche e lo studio di tali competenze e delle loro relazioni aggiunge importanti riflessioni alle teorie dello sviluppo. Inoltre lo studio di questi aspetti in popolazioni con sviluppo tipico, atipico e a rischio permette una migliore comprensione della complessità dinamica dello sviluppo all’interno di una prospettiva neurocostruttivista interessata ai processi sottostanti e non agli esiti finali. La tesi analizza la letteratura sulle competenze linguistiche (orali: cap. 1; scritte: cap. 2; relazioni: cap. 3), numeriche (sistema numerico approssimativo: cap. 4; sistema numerico esatto: cap. 5; relazioni: cap. 6) e sulle loro relazioni (cap. 7), descrivendo le ricerche che si sono occupate delle popolazioni con sviluppo tipico, atipico e a rischio. In ogni singolo capitolo sono confrontate le competenze linguistiche e numeriche e le loro reciproche relazioni in bambini con sviluppo tipico (nati a termine) e bambini nati pretermine sani, caratterizzati da un’elevata immaturità neonatale. I dati sono stati raccolti alla fine della scuola dell’infanzia e dopo due anni di scolarizzazione per comprendere le traiettorie evolutive in due momenti rilevanti di transizione. I risultati emersi hanno aggiunto nuove considerazioni interessanti per i bambini con sviluppo tipico, soprattutto rispetto alle relazioni tra linguaggio e numero che rappresentano un campo non ancora esplorato. I dati emersi con i nati pretermine hanno mostrato che questi bambini non presentano un ritardo cognitivo generalizzato, ma difficoltà specifiche e relazioni diverse da quelle descritte nello sviluppo tipico, indicando la presenza di una traiettoria che possiamo definire atipica. I risultati ottenuti aggiungono importanti considerazioni teoriche rispetto alle relazioni tra competenze innate ed apprese e tra fasi di acquisizione e di consolidamento delle abilità. Al tempo stesso emergono importanti indicazioni cliniche per la programmazione di interventi specifici per il recupero delle competenze maggiormente compromesse nei nati pretermine.

Dinamica sedimentaria torbiditica in bacini confinati: margine orientale della Sardegna

La sedimentazione clastica di mare profondo è attualmente uno dei principali argomenti della ricerca sedimentologica sia in ambito puramente accademico che in ambito petrolifero-industriale. Gli studi recenti hanno enfatizzato l'influenza fondamentale della topografia preesistente del fondo marino sulla crescita e la morfologia sui fan di mare profondo; si è visto come, in molti systemi torbiditici, l’evoluzione dei processi deposizionali sia stata da moderatamente a fortemente controllata dall’ effetto di confinamento di scarpate tettoniche, ridge strutturali e seamounts. Scopo di questo lavoro è studiare l'effetto del confinamento alla scala di bacino sui principali sistemi torbiditici del margine orientale della Sardegna che rappresenta un margine passivo articolato di bacini di intraslope confinati verso mare da seamounts. Lo studio dei sistemi deposizionali è stato eseguito attraverso l'interpretazione di dati di batimetria multibeam ad alto dettaglio acquisiti dall’ISMAR di Bologna durante la crociera Tir99. L’ interpretazione multibeam è stata integrata con l’ analisi di profili sismici a riflessione per comprendere la morfologia l’organizzazione interna e l’evoluzione nel tempo dei principali elementi deposizionali dei sistemi torbiditici. Tre bacini di intraslope (Olbia, Baronie e il settore settentrionale del bacino Ogliastra) sono stati investigati. Il bacino di Olbia è il bacino più settentrionale del margine orientale della Sardegna ed è limitato verso mare dai seamount Etruschi e Baronie. Il principale sistema torbiditico del bacino di Olbia è costituito dal Caprera, articolato in un sistema di canyon alimentatori nella piattaforma e nella scarpata continentale e da un ampio canale con argini alla base della scarpata. Il Caprera è fiancheggiato da un ampia piattaforma continentale, e questa, fungendo da “magazzino” per il materiale piu grossolando, può spiegare la peculiare architettura sedimentaria del suo fan. L'effetto di confinamento del bacino sulla forma e sull'evoluzione del fan del Caprera è evidente soprattutto sull'asimmetria dei leve e su fenomeni di avulsione che hanno coinvolto il canale. Il bacino di intraslope di Olbia appare completamente riempito, e, nel bordo orientale, è presente il canyon di intrabacino verso il bacino sottostante. Gli effetti dell'abbassamento del livello di base sono visibili nel settore distale del sistema, dove si ha lo sviluppo di canali distributari e di valli erosive a basso rilievo, che rappresentano le porzioni "upslope" dei canyon di "bypass". Il bacino di intraslope del Baronie è il bacino centrale del margine, confinato verso mare dal seamount delle Baronie, e presenta una via di fuga laterale rappresentato dal sistema di canyon di Gonone-Orosei. Il Posada è il sistema torbiditico principale, consiste di un canyon profondamente inciso nella piattaforma e nella scarpata, e sviluppa alla base della scarpata un piccolo fa radiale. La morfologia del è il risultato dell'interazione complessa tra la geoemtria del bacino ricevente ed il comportamento dei flussi sedimentari. La forma del bacino ha costretto il sistema torbiditico a cambiare la direzione di sviluppo, da est verso sud. Processi di framanento in massa a grande scala hanno inoltre contribuito alla riorganizzazione del sistema torbiditico. Il bacino dell’Ogliastra è localizzato nel settore meridionale del margine, limitato verso mare dal seamount Quirra. Il settore settentrionale della scarpata continentale del bacino Ogliastra è caratterizzato da canyon e incisioni di carattere ibrido, con tratti deposizionali ed erosivi. L'Arbatax è il principale sistema torbiditico del bacino di Ogliastra caratterizzato da un settore meridionale dominato da un canale alimentatore e da un settore settentrionale abbandonato, caratterizzato da fenomeni di smantellamento e instabilità gravitativa. In generale i risultati dello studio evidenziano l'importanza della combinazione dei fattori di controllo esterni, e della topografia preesistente, nello sviluppo dei processi sedimentari e degli elementi deposizionali dei sistemi torbiditici. In particolare, appare evidente come lo stile deposizionale dei sistemi torbiditici in ambiente confinato diverga sostanzialmente da quello previsto dai modelli di fan sottomarini usati come strumenti predittivi nella esplorazione e sfruttamento dei giacimenti di idrocarburi.

Study of the antioxidant fraction in edible olive oils obtained from different technological systems and parameters

Questo lavoro di tesi è stato suddiviso in tre parti. L’argomento principale è stato lo “Studio della componente antiossidante di oli ottenuti da olive mediante l’utilizzo di diversi sistemi e parametri tecnologici”. E’ ben noto come la qualità ossidativa di un olio di oliva dipenda oltre che dalla sua composizione in acidi grassi, dalla presenza di composti caratterizzati da un elevata attività antiossidante, ovvero le sostanze fenoliche. I composti fenolici contribuiscono quindi in maniera preponderante alla shelf life dell’olio extravergine di oliva. Inoltre sono state riscontrate delle forti correlazione tra alcune di queste sostanze e gli attributi sensoriali positivi di amaro e piccante. E’ poi da sottolineare come il potere antiossidante dei composti fenolici degli oli vergini di oliva, sia stato negli ultimi anni oggetto di considerevole interesse, poiché correlato alla protezione da alcune patologie come ad esempio quelle vascolari, degenerative e tumorali. Il contenuto delle sostanze fenoliche negli oli di oliva dipende da diversi fattori: cultivar, metodo di coltivazione, grado di maturazione delle olive e ovviamente dalle operazioni tecnologiche poiché possono variare il quantitativo di questi composti estratto. Alla luce di quanto appena detto abbiamo valutato l’influenza dei fattori agronomici (metodi di agricoltura biologica, integrata e convenzionale) e tecnologici (riduzione della temperatura della materia prima, aggiunta di coadiuvanti in fase di frangitura e di gramolatura, confronto tra tre oli extravergini di oliva ottenuti mediante diversi sistemi tecnologici) sul contenuto in composti fenolici di oli edibili ottenuti da olive (paper 1-3-4). Oltre alle sostanze fenoliche, negli oli di oliva sono presenti altri composti caratterizzati da proprietà chimiche e nutrizionali, tra questi vi sono i fitosteroli, ovvero gli steroli tipici del mondo vegetale, che rappresentano la frazione dell’insaponificabile quantitativamente più importante dopo gli idrocarburi. La composizione quali-quantitativa degli steroli di un olio di oliva è una delle caratteristiche analitiche più importanti nella valutazione della sua genuinità; infatti la frazione sterolica è significativamente diversa in funzione dell’origine botanica e perciò viene utilizzata per distinguere tra di loro gli oli e le loro miscele. Il principale sterolo nell’olio di oliva è il β- sitosterolo, la presenza di questo composto in quantità inferiore al 90% è un indice approssimativo dell’aggiunta di un qualsiasi altro olio. Il β-sitosterolo è una sostanza importante dal punto di vista della salute, poiché si oppone all’assorbimento del colesterolo. Mentre in letteratura si trovano numerosi lavori relativi al potere antiossidante di una serie di composti presenti nell’olio vergine di oliva (i già citati polifenoli, ma anche carotenoidi e tocoferoli) e ricerche che dimostrano invece come altri composti possano promuovere l’ossidazione dei lipidi, per quanto riguarda il potere antiossidante degli steroli e dei 4- metilsteroli, vi sono ancora poche informazioni. Per questo è stata da noi valutata la composizione sterolica in oli extravergini di oliva ottenuti con diverse tecnologie di estrazione e l’influenza di questa sostanza sulla loro stabilità ossidativa (paper 2). E’ stato recentemente riportato in letteratura come lipidi cellulari evidenziati attraverso la spettroscopia di risonanza nucleare magnetica (NMR) rivestano una importanza strategica da un punto di vista funzionale e metabolico. Questi lipidi, da un lato un lato sono stati associati allo sviluppo di cellule neoplastiche maligne e alla morte cellulare, dall’altro sono risultati anche messaggeri di processi benigni quali l’attivazione e la proliferazione di un normale processo di crescita cellulare. Nell’ambito di questa ricerca è nata una collaborazione tra il Dipartimento di Biochimica “G. Moruzzi” ed il Dipartimento di Scienze degli Alimenti dell’Università di Bologna. Infatti, il gruppo di lipochimica del Dipartimento di Scienze degli Alimenti, a cui fa capo il Prof. Giovanni Lercker, da sempre si occupa dello studio delle frazioni lipidiche, mediante le principali tecniche cromatografiche. L’obiettivo di questa collaborazione è stato quello di caratterizzare la componente lipidica totale estratta dai tessuti renali umani sani e neoplastici, mediante l’utilizzo combinato di diverse tecniche analitiche: la risonanza magnetica nucleare (1H e 13C RMN), la cromatografia su strato sottile (TLC), la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e la gas cromatografia (GC) (paper 5-6-7)

Messa a punto di processi biotecnologici per la produzione di biocombustibili da matrici organiche di rifiuto

The bioproduction of materials and energy from renewable sources (industrial biotechnology) is getting more and more interest in order to improve environmental sustainability of chemical industrial processes and to decrease their dependence from oil. Anaerobic digestion of organic waste matrices (agricultural and industrial wastes, organic fraction of municipal wastes, sewage sludges etc.) may play an important role in the implementation of industrial biotechnology being a well developed strategy in the valorization of complex matrices, as it can mineralize them while producing bioenergy in the form of a biogas rich in methane. In this research the potential of anaerobic digestion in the treatment of polluted sewage sludge was studied by developing three set of anaerobic microcosms with sludges differently contaminated by xenobiotic compounds. The effect of different incubating temperatures and of exogenous carbon and vitamine sources was investigated along with the role of the occurring microbial populations in the pollutant degradation activity. So, while confirming the potential of anaerobic digestion for the biomethanization of sewage sludges, this work proved the effectiveness of this technology in the removal of pollutants too. Moreover, since the degradation of lignocellulose appears to be a limiting step in the anaerobic treatment of a wide range of biomass, the possibility of optimizing anaerobic digestion of lignocellulosic substrates was also studied. To this aim a research was carried out at the BOKUUniversity of Natural Resources and Applied Life Sciences, Department for Agrobiotechnology, IFA - Tulln, where mixed cellulolytic cultures were isolated from biogas plants while assessing the metabolic pathway leading to cellulose degradation and verifying their capability to grow on lignocellulose too, proving that on the long term such bacterial cultures could be used as inoculum in order to improve the hydrolysis of lignocellulose in anaerobic digestion plants.

Processi di biorefining per l'estrazione di secondary chemical building blocks da sottoprotti dell'agro-industria

Phenol and cresols represent a good example of primary chemical building blocks of which 2.8 million tons are currently produced in Europe each year. Currently, these primary phenolic building blocks are produced by refining processes from fossil hydrocarbons: 5% of the world-wide production comes from coal (which contains 0.2% of phenols) through the distillation of the tar residue after the production of coke, while 95% of current world production of phenol is produced by the distillation and cracking of crude oil. In nature phenolic compounds are present in terrestrial higher plants and ferns in several different chemical structures while they are essentially absent in lower organisms and in animals. Biomass (which contain 3-8% of phenols) represents a substantial source of secondary chemical building blocks presently underexploited. These phenolic derivatives are currently used in tens thousand of tons to produce high cost products such as food additives and flavours (i.e. vanillin), fine chemicals (i.e. non-steroidal anti-inflammatory drugs such as ibuprofen or flurbiprofen) and polymers (i.e. poly p-vinylphenol, a photosensitive polymer for electronic and optoelectronic applications). European agrifood waste represents a low cost abundant raw material (250 millions tons per year) which does not subtract land use and processing resources from necessary sustainable food production. The class of phenolic compounds is essentially constituted by simple phenols, phenolic acids, hydroxycinnamic acid derivatives, flavonoids and lignans. As in the case of coke production, the removal of the phenolic contents from biomass upgrades also the residual biomass. Focusing on the phenolic component of agrifood wastes, huge processing and marketing opportunities open since phenols are used as chemical intermediates for a large number of applications, ranging from pharmaceuticals, agricultural chemicals, food ingredients etc. Following this approach we developed a biorefining process to recover the phenolic fraction of wheat bran based on enzymatic commercial biocatalysts in completely water based process, and polymeric resins with the aim of substituting secondary chemical building blocks with the same compounds naturally present in biomass. We characterized several industrial enzymatic product for their ability to hydrolize the different molecular features that are present in wheat bran cell walls structures, focusing on the hydrolysis of polysaccharidic chains and phenolics cross links. This industrial biocatalysts were tested on wheat bran and the optimized process allowed to liquefy up to the 60 % of the treated matter. The enzymatic treatment was also able to solubilise up to the 30 % of the alkali extractable ferulic acid. An extraction process of the phenolic fraction of the hydrolyzed wheat bran based on an adsorbtion/desorption process on styrene-polyvinyl benzene weak cation-exchange resin Amberlite IRA 95 was developed. The efficiency of the resin was tested on different model system containing ferulic acid and the adsorption and desorption working parameters optimized for the crude enzymatic hydrolyzed wheat bran. The extraction process developed had an overall yield of the 82% and allowed to obtain concentrated extracts containing up to 3000 ppm of ferulic acid. The crude enzymatic hydrolyzed wheat bran and the concentrated extract were finally used as substrate in a bioconversion process of ferulic acid into vanillin through resting cells fermentation. The bioconversion process had a yields in vanillin of 60-70% within 5-6 hours of fermentation. Our findings are the first step on the way to demonstrating the economical feasibility for the recovery of biophenols from agrifood wastes through a whole crop approach in a sustainable biorefining process.

Caratterizzazione e stimolazione dei processi di declorurazione riduttiva dei policlorobifenili in sedimenti marini

I policlorobifenili (PCB) sono un gruppo di 209 congeneri di bifenili policlorurati altamente tossici e persistenti che, a causa della loro elevata lipofilia, tendono ad accumularsi in sedimenti anaerobici marini, tramite i quali possono entrare nella catena alimentare. I PCB possono essere degradati mediante processi di declorurazione riduttiva mediati da popolazioni microbiche anaerobiche in grado di utilizzarli fortuitamente come accettori finali della catena respiratoria. Il processo consiste quindi nella bioconversione di congeneri ad alto grado di clorurazione in PCB basso clorurati, meno tossici, meno bioaccumulabili e più facilmente biodegradabili in condizioni aerobiche. Nel presente elaborato è stata investigata la capacità di una popolazione microbica arricchita su congeneri coplanari di PCB da un sedimento contaminato del Canale Brentella (Prima Zona Industriale di Porto Marghera, laguna di Venezia), di declorurare miscele commerciali di PCB (Aroclor 1254) in condizioni geobiochimiche di laboratorio che riproducono quelle presenti in sito. Il processo è quindi stato studiato in microcosmi anaerobici slurry di sedimento sospeso nella stessa acqua del sito e monitorato con un approccio chimico e microbiologico integrato. Ai fini di caratterizzare e stimolare i microganismi responsabili del processo degradativo sono state utilizzate tecniche convenzionali basate sull’inibizione selettiva di diversi gruppi microbici. Dopo una fase di latenza di 7 settimane, la coltura microbica ha declorurato velocemente ed estesamente la miscela commerciale di PCB saggiata, bioconvertendo il 70% dei congeneri ad alto grado di clorurazione (da penta- a octa- clorurati) in PCB di- e tri-clorurati. Il processo ha esibito selettività nei confronti delle posizioni meta dei gruppi 2,3- e 2,3,4-clorofenile e para dei gruppi 3,4- e 3,4,5-clorofenile, secondo il modello di declorurazione H’. Il monitoraggio delle attività microbiche in presenza dei diversi inibitori saggiati ha permesso inoltre di concludere che i batteri metanogeni e i batteri solfato-riduttori non sono direttamente coinvolti nel processo degradativo, suggerendo invece che le specie decloruranti siano appartenenti o strettamente correlate al genere Dehalococcoides. Poiché lo studio è stato eseguito in condizioni geobiochimiche di laboratorio che mimano quelle presenti in sito, i risultati ottenuti indicano che la popolazione microbica dei sedimenti del canale Brentella, se opportunamente stimolata, è potenzialmente in grado di mediare in situ la declorurazione riduttiva dei PCB preesistenti nel sedimento, contribuendo alla natural attenuation dei sedimenti contaminati.

Studi funzionali e strutturali sul wildtype e sul mutante γM23-K della ATP sintasi di Rhodobacter capsulatus: ruolo dell'ADP e della forza protonmotiva nell'attivazione dell’enzima e nell'accoppiamento dell'idrolisi di ATP alla traslocazione protonica

Nel presente lavoro di tesi sono state messe a confronto le ATP sintasi wild-type e γM23-K in cromatofori del batterio fotosintetico Rhodobacter capsulatus sotto gli aspetti funzionale e regolatorio. Si pensava inizialmente che la mutazione, in base a studi riportati in letteratura condotti sull’omologa mutazione in E. coli, avrebbe indotto disaccoppiamento intrinseco nell’enzima. Il presente lavoro ha chiarito che il principale effetto della mutazione è un significativo aumento dell’affinità dell’enzima per l’ADP inibitorio, che ne determina il ridotto livello di ATP idrolisi e la rapidissima reinattivazione in seguito ad attivazione da forza protonmotiva. Il residuo 23 della subunità γ si trova posizionato in prossimità della regione conservata DEELSED carica negativamente della subunità β, e l’introduzione nel mutante di una ulteriore carica positiva potrebbe determinare una maggiore richiesta di energia per indurre l’apertura del sito catalitico. Un’analisi quantitativa dei dati di proton pumping condotta mediante inibizione parziale dell’idrolisi del wildtype ha inoltre mostrato come il grado di accoppiamento del mutante in condizioni standard non differisca sostanzialmente da quello del wild-type. D’altro canto, è stato recentemente osservato come un disaccoppiamento intrinseco possa venire osservato in condizioni opportune anche nel wild-type, e cioè a basse concentrazioni di ADP e Pi. Nel presente lavoro di tesi si è dimostrato come nel mutante l’osservazione del fenomeno del disaccoppiamento intrinseco sia facilitata rispetto al wild-type. È stato proprio nell’ambito delle misure condotte sul mutante che è stato possibile dimostrare per la prima volta il ruolo fondamentale della componente elettrica della forza protonmotiva nel mantenere lo stato enzimatico ad elevato accoppiamento. Tale ruolo è stato successivamente messo in luce anche nel wild-type, in parte anche grazie all’uso di inibitori specifici di F1 e di FO. Il disaccoppiamento intrinseco nel wild-type è stato ulteriormente esaminato anche nella sua dipendenza dalla rimozione di ADP e Pi; in particolare, oltre all’amina fluorescente ACMA, è stata utilizzata come sonda di ΔpH anche la 9-aminoacridina e come sonda di Δψ l’Oxonolo VI. In entrambi i casi il ruolo accoppiante di questi due ligandi è stato confermato, inoltre utilizzando la 9-aminoacridina è stato possibile calibrare il segnale di fluorescenza con salti acido-base, dando quindi una base quantitativa ai dati ottenuti. Noi riteniamo che il più probabile candidato strutturale coinvolto in questi cambiamenti di stato enzimatici sia la subunità ε, di cui è noto il coinvolgimento in processi di regolazione e in cambiamenti strutturali indotti da nucleotidi e dalla forza protonmotiva. In collaborazione con il Dipartimento di Chimica Fisica dell’Università di Friburgo è in atto un progetto per studiare i cambiamenti strutturali presumibilmente associati al disaccoppiamento intrinseco tramite FRET in singola molecola di complessi ATP-sintasici marcati con fluorofori sia sulla subunità ε che sulla subunità γ. Nell’ambito di questa tesi sono stati creati a questo fine alcuni doppi mutanti cisteinici ed è stato messo a punto un protocollo per la loro marcatura con sonde fluorescenti.

Caratterizzazione mediante HPLC-MS di modifiche post-trasduzionali di proteine istoniche

Gli istoni sono proteine basiche che possono essere classificate in varie classi: H1, H2A, H2B, H3 e H4. Queste proteine formano l’ottamero proteico attorno al quale si avvolge il DNA per formare il nucleosoma che è l’unità fondamentale della cromatina. A livello delle code N-terminali, gli istoni possono essere soggetti a numerose modifiche posttraduzionali quali acetilazioni, metilazioni, fosforilazioni, ADP-ribosilazioni e ubiquitinazioni. Queste modifiche portano alla formazione di diversi siti di riconoscimento per diversi complessi enzimatici coinvolti in importanti processi come la riparazione e la replicazione del DNA e l’assemblaggio della cromatina. La più importante e la più studiata di queste modifiche è l’acetilazione che avviene a livello dei residui amminici della catena laterale dell’amminoacido lisina. I livelli corretti di acetilazione delle proteine istoniche sono mantenuti dall’attività combinata di due enzimi: istone acetil transferasi (HAT) e istone deacetilasi (HDAC). Gli enzimi appartenenti a questa famiglia possono essere suddivisi in varie classi a seconda delle loro diverse caratteristiche, quali la localizzazione cellulare, la dimensione, l’omologia strutturale e il meccanismo d’azione. Recentemente è stato osservato che livelli aberranti di HDAC sono coinvolti nella carcinogenesi; per questo motivo numerosi gruppi di ricerca sono interessati alla progettazione e alla sintesi di composti che siano in grado di inibire questa classe enzimatica. L’inibizione delle HDAC può infatti provocare arresto della crescita cellulare, apoptosi o morte cellulare. Per questo motivo la ricerca farmaceutica in campo antitumorale è mirata alla sintesi di inibitori selettivi verso le diverse classi di HDAC per sviluppare farmaci meno tossici e per cercare di comprendere con maggiore chiarezza il ruolo biologico di questi enzimi. Il potenziale antitumorale degli inibitori delle HDAC deriva infatti dalla loro capacità di interferire con diversi processi cellulari, generalmente non più controllati nelle cellule neoplastiche. Nella maggior parte dei casi l’attività antitumorale risiede nella capacità di attivare programmi di differenziamento, di inibire la progressione del ciclo cellulare e di indurre apoptosi. Inoltre sembra essere molto importante anche la capacità di attivare la risposta immunitaria e l’inibizione dell’angiogenesi. Gli inibitori delle HDAC possono essere a loro volta classificati in base alla struttura chimica, alla loro origine (naturale o sintetica), e alla loro capacità di inibire selettivamente le HDAC appartenenti a classi diverse. Non è ancora chiaro se la selettività di queste molecole verso una specifica classe di HDAC sia importante per ottenere un effetto antitumorale, ma sicuramente inibitori selettivi possono essere molto utili per investigare e chiarire il ruolo delle HDAC nei processi cellulari che portano all’insorgenza del tumore. Nel primo capitolo di questa tesi quindi è riportata un’introduzione sull’importanza delle proteine istoniche non solo da un punto di vista strutturale ma anche funzionale per il destino cellulare. Nel secondo capitolo è riportato lo stato dell’arte dell’analisi delle proteine istoniche che comprende sia i metodi tradizionali come il microsequenziamento e l’utilizzo di anticorpi, sia metodi più innovativi (RP-LC, HILIC, HPCE) ideati per poter essere accoppiati ad analisi mediante spettrometria di massa. Questa tecnica consente infatti di ottenere importanti e precise informazioni che possono aiutare sia a identificare gli istoni come proteine che a individuare i siti coinvolti nelle modifiche post-traduzionali. Nel capitolo 3 è riportata la prima parte del lavoro sperimentale di questa tesi volto alla caratterizzazione delle proteine istoniche mediante tecniche cromatografiche accoppiate alla spettrometria di massa. Nella prima fase del lavoro è stato messo a punto un nuovo metodo cromatografico HPLC che ha consentito di ottenere una buona separazione, alla linea di base, delle otto classi istoniche (H1-1, H1-2, H2A-1, H2A-2, H2B, H3-1, H3-2 e H4). La separazione HPLC delle proteine istoniche ha permesso di poter eseguire analisi accurate di spettrometria di massa mediante accoppiamento con un analizzatore a trappola ionica tramite la sorgente electrospray (ESI). E’ stato così possibile identificare e quantificare tutte le isoforme istoniche, che differiscono per il tipo e il numero di modifiche post-traduzionali alle quali sono soggette, previa estrazione da colture cellulari di HT29 (cancro del colon). Un’analisi così dettagliata delle isoforme non può essere ottenuta con i metodi immunologici e permette di eseguire un’indagine molto accurata delle modifiche delle proteine istoniche correlandole ai diversi stadi della progressione del ciclo e alla morte cellulare. Il metodo messo a punto è stato convalidato mediante analisi comparative che prevedono la stessa separazione cromatografica ma accoppiata a uno spettrometro di massa avente sorgente ESI e analizzatore Q-TOF, dotato di maggiore sensibilità e risoluzione. Successivamente, per identificare quali sono gli specifici amminoacidi coinvolti nelle diverse modifiche post-traduzionali, l’istone H4 è stato sottoposto a digestione enzimatica e successiva analisi mediante tecniche MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS. Queste analisi hanno permesso di identificare le specifiche lisine acetilate della coda N-terminale e la sequenza temporale di acetilazione delle lisine stesse. Nel quarto capitolo sono invece riportati gli studi di inibizione, mirati a caratterizzare le modifiche a carico delle proteine istoniche indotte da inibitori delle HDAC, dotati di diverso profilo di potenza e selettività. Dapprima Il metodo messo a punto per l’analisi delle proteine istoniche è stato applicato all’analisi di istoni estratti da cellule HT29 trattate con due noti inibitori delle HDAC, valproato e butirrato, somministrati alle cellule a dosi diverse, che corrispondono alle dosi con cui sono stati testati in vivo, per convalidare il metodo per studi di inibizione di composti incogniti. Successivamente, lo studio è proseguito con lo scopo di evidenziare effetti legati alla diversa potenza e selettività degli inibitori. Le cellule sono state trattate con due inibitori più potenti, SAHA e MS275, alla stessa concentrazione. In entrambi i casi il metodo messo a punto ha permesso di evidenziare l’aumento dei livelli di acetilazione indotto dal trattamento con gli inibitori; ha inoltre messo in luce differenti livelli di acetilazione. Ad esempio il SAHA, potente inibitore di tutte le classi di HDAC, ha prodotto un’estesa iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MS275 selettivo per la classe I di HDAC, ha prodotto modifiche molto più blande. E’ stato quindi deciso di applicare questo metodo per studiare la dose e la tempo-dipendenza dell’effetto di quattro diversi inibitori delle HDAC (SAHA, MS275, MC1855 e MC1568) sulle modifiche post-traduzionali di istoni estratti da cellule HT29. Questi inibitori differiscono oltre che per la struttura chimica anche per il profilo di selettività nei confronti delle HDAC appartenenti alle diverse classi. Sono stati condotti quindi studi di dose-dipendenza che hanno consentito di ottenere i valori di IC50 (concentrazione capace di ridurre della metà la quantità relativa dell’istone meno acetilato) caratteristici per ogni inibitore nei confronti di tutte le classi istoniche. E’ stata inoltre calcolata la percentuale massima di inibizione per ogni inibitore. Infine sono stati eseguiti studi di tempo-dipendenza. I risultati ottenuti da questi studi hanno permesso di correlare i livelli di acetilazione delle varie classi istoniche con la selettività d’azione e la struttura chimica degli inibitori somministrati alle cellule. In particolare, SAHA e MC1855, inibitori delle HDAC di classi I e II a struttura idrossamica, hanno causato l’iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MC1568 (inibitore selettivo per HDAC di classe II) ha prodotto l’iperacetilazione solo di H4. Inoltre la potenza e la selettività degli inibitori nel provocare un aumento dei livelli di acetilazione a livello delle distinte classi istoniche è stata correlata al destino biologico della cellula, tramite studi di vitalità cellulare. E’ stato osservato che il SAHA e MC1855, inibitori potenti e non selettivi, somministrati alla coltura HT29 a dose 50 μM producono morte cellulare, mentre MS275 alla stessa dose produce accumulo citostatico in G1/G0. MC1568, invece, non produce effetti significatici sul ciclo cellulare. Questo studio ha perciò dimostrato che l’analisi tramite HPLC-ESI-MS delle proteine istoniche permette di caratterizzare finemente la potenza e la selettività di nuovi composti inibitori delle HDAC, prevedendone l’effetto sul ciclo cellulare. In maggiore dettaglio è risultato che l’iperacetilazione di H4 non è in grado di provocare modifiche significative sul ciclo cellulare. Questo metodo, insieme alle analisi MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS che permettono di individuare l’ordine di acetilazione delle lisine della coda N-terminale, potrà fornire importanti informazioni sugli inibitori delle HDAC e potrà essere applicato per delineare la potenza, la selettività e il meccanismo di azione di nuovi potenziali inibitori di questa classe enzimatica in colture cellulari tumorali.

Regioni e Unione europea

La tesi mira ad analizzare e valutare le attuali relazioni esistenti tra le regioni e l’Unione europea, alla luce dei processi di riforma in atto sia sul versante interno sia su quello europeo. In particolare, essa prende spunto dalla riforma del Titolo V della Costituzione italiana e dalle leggi di attuazione della stessa, che hanno ridisegnato i contorni del regionalismo italiano. Nell’introduzione si analizza il contesto europeo delle relazioni dell’Unione con le entità sub-statali; in tal senso si è voluto preliminarmente chiarire il senso in cui si è utilizzato il termine “regione”: non tutti gli Stati europei infatti accolgono una tale nozione nel senso in cui essa è utilizzata nell’ordinamento italiano, né i poteri conferiti alle regioni sono i medesimi in tutti gli Stati che utilizzano ripartizioni territoriali simili alle regioni italiane. Prendendo come punto di riferimento per la prima parte della ricerca le entità territoriali dotate di competenze legislative, trascurando le relazioni dell’UE con i soggetti sub-statali con attribuzioni meramente amministrative. La ricerca prende dunque le mosse dal concetto di “regionalismo comunitario”. La questione regionale ha sempre costituito un problema aperto per le istituzioni comunitarie (legato alla problematica del “deficit democratico” dei processi legislativi comunitari). Le istituzioni, soprattutto agli inizi del cammino di integrazione europea, risentivano infatti delle origini internazionali delle Comunità, e consideravano quale unici interlocutori possibili i governi centrali degli Stati membri. Si è quindi voluta mettere in luce la rapida evoluzione dell’attitudine regionale dell’Unione, provocata da una nuova coscienza comunitaria legata alla prima fase di attuazione della politica dei fondi strutturali, ma soprattutto all’ingresso sulla scena europea del principio di sussidiarietà, e degli effetti che esso è stato in grado di produrre sull’intero sistema di relazioni Stati/Regioni/Unione europea: l’Unione è giunta di recente ad accogliere una nozione più ampia di Stato, comprensiva – anche se in modo limitato e solo per alcuni fini – delle entità sub-statali. Lo studio si concentra poi sull’ordinamento italiano, presentando lo stato attuale della legislazione nazionale relativa alla partecipazione delle regioni al sistema del diritto comunitario. All’inizio del capitolo si precisa la fondamentale distinzione tra fase ascendente, cioè partecipazione di rappresentanti regionali alle procedure legislative dell’Unione, e fase discendente, cioè relativa al ruolo delle regioni nell’attuazione del diritto comunitario; tale distinzione appare necessaria al fine di chiarire le diverse modalità che può assumere il ruolo delle regioni nel sistema comunitario, e sarà ripresa durante tutta la ricerca. Il secondo capitolo esamina la riforma costituzionale del 2001, complessivamente orientata verso una ridefinizione del nostro sistema delle autonomie e delle loro relazioni con l’Unione europea. Nel nuovo testo costituzionale le prerogative regionali risultano ormai “costituzionalizzate”, trovano ora definitiva collocazione nell’art. 117 Cost. La riforma del 2001 comporta alcuni elementi innovativi circa la complessiva strutturazione del rapporto tra l’ordinamento nazionale e quello comunitario, in particolare prevedendo che “le regioni, nelle materie di loro competenza, partecipano alle decisioni dirette alla formazione degli atti normativi comunitari, nel rispetto delle norme di procedura stabilite con legge dello Stato”. Grazie a questa previsione il coinvolgimento delle regioni assume rango costituzionale e si impone al legislatore ordinario, il quale può continuare a determinarne le modalità procedurali ma non cancellarlo o pregiudicarlo in modo sostanziale. In secondo luogo l’art. 117 Cost. propone, all’interno del nostro ordinamento, una definizione complessiva del rapporto tra le fonti statali e quelle regionali, rimodulando le sfere e le modalità di “interferenza” tra lo Stato e le autonomie regionali. Con riferimento alla ripartizione di competenze, l’evoluzione è evidente: da un sistema in cui la competenza generale era statale, e veniva fornita un’elencazione di dettaglio delle materie che facevano eccezione, si è giunti oggi ad un sistema capovolto, in cui per ogni materia non contenuta nell’elencazione dell’articolo 117 la competenza può essere regionale; in tale sistema può leggersi una forma di “sussidiarietà legislativa”, come messo in luce dalla ricerca. Lo studio passa poi ad analizzare le concrete modalità di partecipazione regionale nelle disposizioni delle leggi primarie che hanno dato attuazione alla novella costituzionale, con riferimento tanto alla fase ascendete quanto a quella discendente. La fase ascendente, osservata nel secondo capitolo della tesi, può verificarsi tramite la partecipazione diretta di rappresentanti regionali alle riunioni del Consiglio, così come previsto da una disposizione della legge n. 131/2003 (“La Loggia”), i cui risultati si sono rivelati però piuttosto modesti e privi, in assenza di una radicale revisione dei Trattati, di serie prospettive di sviluppo. Ma esiste altresì un'altra tipologia di relazioni sviluppabili in fase ascendente, relazioni “indirette”, cioè svolte tramite l’intermediazione dello Stato, che si fa portavoce delle istanze regionali a Bruxelles. In tale prospettiva, la ricerca si concentra sulle disposizioni della legge n. 11/2005 (“Buttiglione”), che riformano il sistema delle conferenze, prevedono precisi obblighi informativi per il Governo nei confronti delle regioni in relazione all’adozione di atti comunitari ed introducono nel panorama legislativo italiano l’istituto della riserva d’esame, al fine di dare maggior peso alle istituzioni regionali al momento dell’adozione di atti comunitari. La tesi passa poi all’analisi della fase discendente. Le funzioni regionali in materia di attuazione del diritto comunitario risultano altresì ampliate non soltanto alla luce della nuova formulazione dell’art. 117 Cost., ma anche e soprattutto grazie ad una disposizione della legge “Buttiglione”, che introduce la possibilità di adottare “leggi comunitarie regionali”, da adottarsi sul modello di legge comunitaria nazionale vigente nel nostro ordinamento fin dal 1989. Tale disposizione ha dato il via ad una serie di processi di riforma all’interno degli ordinamenti giuridici regionali, volti a predisporre tutti gli strumenti legislativi utili all’adozione delle leggi comunitarie regionali, di gran lunga la novità più importante contenuta nella disciplina della legge “Buttiglione”. Perciò, dopo un’analisi approfondita relativa al nuovo riparto di competenze tra Stato e regioni, oggetto della prima parte del capitolo terzo, ed uno studio relativo al locus standi delle regioni nel sistema giurisdizionale europeo, svolto nella seconda parte dello stesso capitolo, l’ultima parte della tesi è rivolta ad individuare gli atti regionali di maggior interesse nella prospettiva dell’attuazione del diritto comunitario realizzata tramite leggi comunitarie regionali. In quest’ambito particolare attenzione è stata rivolta alla legislazione della regione Emilia-Romagna, che si è dimostrata una delle regioni più attente e capaci di cogliere le potenzialità presenti nel “nuovo” sistema di relazioni delle regioni con il sistema comunitario.