High level expression, purification, and characterization of the shrimp antimicrobial peptide, Ch-penaeidin, in Pichia pastoris

Penaeidins, members of a new family of antimicrobial peptides constitutively produced and stored in the haemocytes of penaeid shrimp, display antimicrobial activity against bacteria, and fungi. Here, a DNA sequence encoding the mature Ch-penaeidin peptide was cloned into the pPIC9K vector and transformed into Pichia pastoris. The transformed cells were screened for multi-copy plasmids using increasing concentrations of G418. Positive colonies carrying chromosomal integrations of the Chp gene were identified by phenotype and PCR. When transformed cells were induced with methanol, SDS-PAGE and Western blotting revealed the production of a similar to6100 Da recombinant CHP (rCHP) expression product. Large scale expression revealed that rCHP was produced at 108 mg/L under optimal conditions in the highest Chp-producing P. pastoris clone. The antimicrobial activities of rCHP were studied by liquid phase analysis, which revealed that rCHP exhibited activities against some Gram-negative and Gram-positive bacteria, but had a relatively low activity against some fungi. Purification of rCHP by cation exchange chromatography and subsequent automated amino acid sequencing revealed the presence of four additional amino acids (YVEF) at the N-terminus that belonged to the cleaved fusion signal peptide; these residues may account for the observed decrease in antifungal activity. Together, these observations indicate that rCHP is an effective antimicrobial peptide that can be successfully produced at high levels in the yeast, and therefore may be a potential antimicrobial candidate for practical use. (C) 2004 Elsevier Inc. All rights reserved.

Expression, purification, and characterization of recombinant Chinese shrimp crustin-like protein (CruFc) in Pichia pastoris

A crustin-like protein (CruFc) from Fenneropenaeus chinensis was expressed in Pichia pastoris and then purified to electrophoretic homogeneity on a Sephacryl S-100 column with a band corresponding to the expected one (13 kDa) shown by 15% SDS-PAGE. Western blot indicated that the rCruFc specifically reacted with polyclonal rabbit anti-Fenneropenaeus chinensis CruFc. Production in a 5 l bioreactor gave 237 mg rCruFc/l. Antimicrobial assay revealed that 4 mu M rCruFc inhibited growth of Staphylococcus aureus.

中国明对虾免疫系统中抗氧化相关基因的克隆与表达分析

对虾病害在世界范围内的广泛传播，给水产养殖和沿海农村经济造成了重大损失。深入开展对虾免疫机制研究并在此基础上寻找对虾疾病防治的有效方法已成为当务之急。研究表明，当对虾等甲壳动物受到外界病原刺激时，其体内的吞噬细胞在吞噬活动中会激活磷酸己糖支路的代谢，引起呼吸爆发，产生多种活性氧分子。另外，受到病原侵染的对虾还会产生其他多种免疫反应，这些免疫反应将消耗大量的能量（ATP），产能的呼吸链会加速运转，由此也会引发大量活性氧的产生。这些活性氧分子可以杀灭入侵的病原微生物，但同时由于活性氧分子反应的非特异性，它们也会对宿主的细胞、组织和器官造成严重伤害，进而导致对虾生理机能的损伤和免疫系统的破坏。所以，消除对虾体内因过度免疫反应产生的过量氧自由基将能够增强其抵御病原侵染的能力，提高免疫力。本论文从中国明对虾体内克隆了线粒体型超氧化物歧化酶（mMnSOD）、胞质型超氧化物歧化酶（cMnSOD）、过氧化氢酶（Catalase）和过氧化物还原酶（Peroxiredoxin）等四种与免疫系统相关的抗氧化酶基因，分析了它们的分子结构特征，组织分布及应答不同病原刺激的表达变化模式，并对其中的mMnSOD基因和Peroxiredoxin基因进行了体外重组表达、分离纯化和酶活性分析。 采用RACE技术从中国明对虾血细胞中克隆了两个超氧化物歧化酶（SOD）基因，通过序列比对分析发现，其中一个为mMnSOD基因，另一个为cMnSOD基因。mMnSOD基因的cDNA全长为1185个碱基，其中开放阅读框为660个碱基，编码220个氨基酸，其中推测的信号肽为20个氨基酸。多序列比对结果显示中国明对虾mMnSOD基因的推导氨基酸序列与罗氏沼虾、蓝蟹的推导氨基酸序列同源性分别为88%和82%。Northern blot结果表明，该基因在对虾的肝胰脏、血细胞、淋巴器官、肠、卵巢、肌肉和鳃等组织中均有表达。半定量RT-PCR结果显示，对虾感染病毒3 h时，该基因在血细胞和肝胰脏中的转录水平显著升高。此外，通过构建原核表达载体，本研究对该基因进行了体外重组表达，并对纯化的重组蛋白进行了质谱鉴定和酶活分析。cMnSOD基因的cDNA全长为1284个碱基，其中开放阅读框为861个碱基，编码287个氨基酸。多序列比对结果显示中国明对虾cMnSOD基因的推导氨基酸序列与斑节对虾和凡纳滨对虾的同源性高达98%和94%。组织半定量结果显示，cMnSOD基因在对虾被检测的各个组织中均有表达。 另外，半定量RT-PCR结果表明，对虾感染病毒23h时，该基因在肝胰脏中的转录上升到正常水平的3.5倍；而感染后59 h时，该基因在血细胞中的转录上升到正常水平的2.5倍。 利用根据其他生物过氧化氢酶保守氨基酸序列设计的简并引物，结合RACE技术，从中国明对虾肝胰脏中克隆到了过氧化氢酶基因的部分片段，片段长1725个碱基。多序列比对结果发现目前所得中国明对虾Catalase基因部分片段的推导氨基酸序列与罗氏沼虾和皱纹盘鲍Catalase氨基酸序列的同源性分别达到95%和73%。通过实时荧光定量PCR技术对中国明对虾Catalase基因在各个组织中的分布情况及病毒感染后该基因在血细胞和肝胰脏中的转录变化进行了研究。结果发现，该基因在肝胰脏、鳃、肠和血细胞中表达水平较高，在卵巢、淋巴器官和肌肉中的表达水平相对较弱；感染病毒23 h和37 h时，对虾血细胞和肝胰脏中该基因mRNA的表达量分别出现显著性上升。 依据中国明对虾头胸部cDNA文库提供的部分片段信息，结合SMART-RACE技术，从中国明对虾肝胰脏中克隆到了过氧化物还原酶基因（Peroxiredoxin）， 该基因的cDNA全长为942个碱基，其中开放阅读框为594个碱基，编码198个氨基酸。中国明对虾Peroxiredoxin基因的推断氨基酸序列与伊蚊、文昌鱼和果蝇等Peroxiredoxin基因的推断氨基酸序列同源性分别为77%、76%和73%。其蛋白理论分子量为22041.17 Da，pI为5.17。Northern blot结果表明，Peroxiredoxin基因在对虾的肝胰脏、血细胞、淋巴器官、肠、卵巢、肌肉和鳃等组织中均有表达。实时荧光定量PCR结果显示，弧菌感染后，该基因在对虾血细胞和肝胰脏中的转录水平都有明显变化并且表达模式不同。另外，对该基因进行了体外重组表达，并对纯化的重组蛋白进行了质谱鉴定和酶活性分析。酶活性分析表明，复性后的重组蛋白能在DTT存在的条件下还原H2O2。

中国明对虾核转录因子NF-κB家族基因的克隆与表达分析

对虾流行病爆发以来，我国乃至世界的对虾产业一直受到各种虾病的困扰，对虾养殖业严重受阻。解决这一问题的关键是加强对虾免疫机制的研究，并在此基础上寻找对虾疾病防治的有效方法。Rel/NF-κB是一类核转录因子，在无脊椎动物的先天性免疫中，起着极为重要的作用。 本论文根据其他无脊椎动物中NF-κB家族基因Relish和Dorsal的保守氨基酸序列分别设计简并引物，从中国明对虾血细胞cDNA中先后克隆到了Relish和Dorsal基因的部分片段，并结合SMART-RACE技术分别获得了中国明对虾Relish基因（FcRelish）和Dorsal基因（FcDorsal）的cDNA 全长。 FcRelish的cDNA 全长为2157个碱基，其中开放阅读框为1512个碱基，编码504个氨基酸；FcRelish蛋白的推导分子量为57373.5 Da，理论等电点为7.00。FcDorsal基因的cDNA 全长为1627个碱基，其中开放阅读框为1071个碱基，编码357个氨基酸；FcDorsal蛋白的推导分子量为39780.7 Da，理论等电点为8.85。 分析了FcRelish基因和FcDorsal基因的在血细胞、淋巴器官、肠和肌肉等12个组织中的表达水平。组织表达结果表明FcRelish和FcDorsal在淋巴器官和血细胞中表达水平明显高于其他组织，而淋巴器官和血细胞是对虾免疫系统中最重要的两个组织，由此可以推测中国明对虾中的Relish和Dorsal可能与免疫关系密切。 本论文还利用实时荧光定量PCR技术，对灭活鳗弧菌刺激，以及WSSV病毒刺激后，对虾血细胞和淋巴器官中FcRelish基因和FcDorsal基因的转录水平进行了研究。FcRelish基因在WSSV病毒刺激后，在血细胞和淋巴器官中都出现了波浪形变化，说明FcRelish对WSSV病毒刺激产生了应答。在灭活鳗弧菌刺激后，FcRelish在血细胞中变化不明显，而在淋巴器官中出现了两次明显的下调上调交替，出现这种现象的具体原因有待探究。在WSSV病毒刺激后，血细胞和淋巴器官中FcDorsal的转录表达呈波浪形变化。而在鳗弧菌刺激后，FcDorsal在血细胞和淋巴器官中的转录均在短时间内出现明显的上调表达，说明FcDorsal对鳗弧菌非常敏感。 作为核转录因子的NF-κB蛋白的转录激活作用需要在细胞质中通过蛋白水解作用来激活，为了进一步阐明NF-κB对病菌感染的应答机制，需要进一步研究这两种转录因子在蛋白水平的变化，以便从分子水平阐明NF-κB在对虾天然免疫中的作用。

蚯蚓作为饲料成分对对虾生长及其免疫指标的影响

本文以鲜活饵料赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）为研究对象，从营养学和免疫学的角度研究探讨了蚯蚓对对虾生长和抗病力的影响，为目前虾病问题的解决进行了有益的探索，为蚯蚓在规模化养殖生产中的推广应用提供了参考和依据。主要研究结果如下： 1、以鲜活饵料赤子爱胜蚓为主，双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis）和人工配合饵料为对照，比较研究了凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）摄食不同饵料的生长和免疫指标的差异。结果表明：沙蚕和蚯蚓单独投喂或与人工饵料配合投喂都可显著提高凡纳滨对虾的生长速率，提高对虾肌肉蛋白的营养价值，但用沙蚕单独投喂的对虾成活率较低。在增强对虾的免疫功能方面，蚯蚓和沙蚕与人工饵料配合投喂优于蚯蚓和沙蚕单独投喂，同时蚯蚓的饵料效果优于沙蚕。 2、采用鲜活饵料赤子爱胜蚓和人工配合饵料的不同配比投喂处于健康状态下的中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）幼虾，研究了其生长和免疫特征。结果表明：在人工饵料中配合投喂1/4的蚯蚓（干重）可显著加快中国明对虾的生长速率，增加对虾肌肉蛋白质含量，提高对虾肌肉蛋白的营养价值，减少脂肪含量，但对处于健康状态下的中国明对虾幼虾免疫功能的增强无明显效果。 3、考虑到对虾规模化养殖的可行性，采用冰冻蚯蚓赤子爱胜蚓和人工饵料的不同配比投喂处于非健康状态下的凡纳滨对虾，测定分析对虾的生长、营养成分和免疫指标，结果表明：蚯蚓投喂量（干重）占日投喂量的1/4时可以显著提高对虾的生长速率，增加对虾营养，增强对虾免疫功能，提高对虾成活率。 我国蚯蚓资源丰富，来源广泛，研究证实，以蚯蚓作为对虾饵料可增加对虾营养，促进对虾生长，提高机体免疫力，是对虾规模化养殖生产中的优质绿色动物性饵料。

中国对虾育种方法研究与遗传连锁图谱的构建

本研究以中国对虾为材料，以杂交育种和选择育种为目标，进行了系统的中国对虾杂交育种试验、生长性状遗传参数试验及其分子遗传连锁图谱的构建工作。结果表明以不同地理群体杂交作为基础群体，然后采用系统的选择育种方法可以获得较好的选择效果。构建的遗传连锁图谱为中国对虾分子辅助育种提供一定的基础。这些试验结果为中国对虾合理系统的育种工作提供了理论基础和数据支持。其具体结果如下： 1. 试验对中国对虾黄渤海水域乳山湾群体（WYP）和朝鲜半岛南海群体（WKN）的2个群体及其杂交后代不同月龄生长情况和存活率进行了研究，测量体长（TL）、头胸甲长（CL）、头胸甲宽（CW）、第2、3腹节高（HST）、第2、3腹节宽（WST）、体重（BW）和存活率共7个性状，计算各项指标的杂种优势率，并对各性状进行了方差分析和多重比较。其3月龄生长情况和存活率研究结果表明，存活率在乳山湾群体（WYP♀）× 朝鲜半岛南海群体（WKN♂）杂交后代出现杂种劣势外，其他指标都表现出不同程度的杂种优势(4.37%～23.96% )。除了存活率外，杂交后代生长性状均显著高于亲本，乳山湾群体（WYP♀）×朝鲜半岛南海群体（WKN♂）杂交后代高于朝鲜半岛南海群体（WKN♀）× 乳山湾群体（WYP♂）杂交后代，黄渤海水域乳山湾群体高于朝鲜半岛南海群体后代。为确定测量性状与中国对虾体重的相关程度，建立了用体长(X1)，头胸甲宽(X2)，第2、3腹节宽(X3)，头胸甲长(X4)，第2、3腹节高(X5)估计体重的多元回归方程：Y = －2.056 + 0.03X1 + 0.076X2 + 0.078X3 + 0.033X4 + 0.043X5。 2. 中国对虾黄渤海水域乳山湾群体（WYP）和朝鲜半岛南海群体（WKN）2个群体及其杂交后代在4月龄时期的6个生长指标和存活率的杂种优势范围在0.514%到14.95%之间，WYP♀×WKN♂杂交后代在这7个指标中都高于WKN♀×WYP♂杂交后代。5月龄杂交后代也表现出一定程度的杂种优势，其范围在-9.000%～19.090%之间，但头胸甲长、第2、3腹节处高和存活率3个指标出现杂种劣势。不同杂交组合各个阶段生长发育情况和存活率在杂种优势表现出一定的规律。随着月龄的增加，WKN♀×WYP♂杂交后代杂种优势率有所增加，而WYP♀×WKN♂杂交后代的却有所降低。ANOVA分析结果表明，杂交后代在存活率方面与双亲差异不显著。4月龄的分析结果发现杂交后代在WST和BW这2个指标上存在显著差异。LSD多重比较结果显示，WYP♀×WKN♂杂交后代在BW指标上与亲本存在显著差异，在WST指标方面与其他3个组合的后代差异显著。5月龄的数据分析结果发现，杂交后代除体重存在显著差异外，其他各项指标差异均不显著。LSD多重比较结果发现，WKN♀×WYP♂杂交后代体重与其亲本WKN存在显著差异。 3. 对2个野生群体——朝鲜半岛南海岸群体（WKN）和黄渤海群体（WYP）和3个养殖群体——朝鲜半岛群体的养殖一代（FKN），黄海1号（HH1）和即抗98（JK98）进行杂交试验的研究，结果表明JK98 (♀)  WKN (♂)组合在存活率方面最高，其余的依次为WYP (♀) WKN (♂)，WKN (♀) WYP (♂)，FKN (♀)HH1 (♂) 和 WYP (♀) FKN (♂)。而在体重方面FKN(♀)  HH1(♂)组合最高，其余的依次为WKN (♀) WYP (♂)，WYP (♀) WKN (♂)，WYP (♀)FKN (♂) 和 JK98 (♀)WKN (♂)。在所有生长性状方面，JK98 (♀)  WKN (♂)在5个组合中是最低的。方差检测结果表明，TL、CL、HST、LL和BW这5个指标在不同组合间存在差异，而其他指标不存在差异。多重比较结果发现JK98 (♀)WKN (♂)组合的TL与其他组合间差异极显著，HST指标与WKN (♀) WYP (♂)，FKN(♀)  HH1(♂)和 WYP (♀)  WKN (♂)这3个组合差异显著，BW指标与WKN (♀) WYP (♂) 和 FKN(♀)  HH1(♂)差异显著。 4. 通过人工授精的方法建立了中国对虾21个半同胞家系，测量了中国对虾21个半同胞（46个全同胞）家系的TL、CL、CW、HST、WST、第1腹节长（FL）、第6腹节长（LL）。利用MTDFREML软件得到生长性状遗传力在0.15~0.35之间，属于中度遗传力范围。TL的遗传力为0.34±0.071，CL的为0.30±0.070，CW为0.35±0.077，WST为0.33±0.073，HST为0.33±0.073，FL的最低为0.15±0.044，LL的为0.24±0.059。各个性状间表现出高的正相关，其中CW和TL以及HST的遗传相关最大，FL和WST的遗传相关最小。 通过以上杂交育种和选择育种的研究，认为单纯的依靠杂交育种来改善中国对虾的育种工作可能具有一定的局限性。所以在实际的育种过程中，以中国对虾不同群体的杂交后代作为基础群体，并以此为基础进行系统的选择育种应该具有更大的潜力。 5. 本试验利用中国对虾F2群体和AFLP分子标记技术进行了遗传连锁图谱的构建。利用55对AFLP引物组合对F2家系的110个个体进行了研究，结果检测到532个符合作图策略的AFLP标记。利用卡方检验检测分离位点是否符合孟德尔分离定律。对于符合3：1比例的分离位点利用F2自交模型构建性别平均连锁图谱，对于符合1：1比例的分离位点利用拟测交理论分别构建中国对虾的雌性和雄性遗传连锁图谱。雌性、雄性和性别平均遗传图谱分别有28、35和44个连锁群，图谱实际长度分别为1090、1617和1772.1 cM。中国对虾遗传连锁图谱估计基因组长度为2420 cM，符合与人类基因组相比的对虾类基因组长度。中国对虾雄性遗传连锁图谱比雌性遗传连锁图谱长32.6%，这可能说明中国对虾不同性别存在不同的重组率。通过皮尔逊相关系数检测认为AFLP标记在中国对虾图谱上分布均匀。本文利用AFLP标记构建的中国对虾遗传连锁图谱为中国对虾基因组研究和遗传改良提供一定的基础，同时也应该开发微卫星等共显性标记，为遗传连锁图谱的整合提供条件。

中国明对虾病原检测新方法及酚氧化酶通路相关基因的研究

对虾病害在世界范围内肆虐，给水产养殖和沿海农村经济造成了重大损失。在水产养殖的实践中快速检测水产动物的病害并及时采取隔离等措施对于控制病害尤为重要，其中关键的环节就是快速检测出病害，并在对虾免疫机制上寻找对虾疾病防治的有效方法。研究表明当对虾等甲壳动物受到外界病原刺激时，极微量的微生物多糖就可以激活proPO系统。激活过程中涉及和产生一系列活性物质，如黑色素、酚氧化酶原激活因子（PPA）、模式识别蛋白（BGBP、PGBP、LGBP、LBP）及其膜上受体和A2巨球蛋白等，它们可通过多种方式参与防御反应，包括提供调理素，促进血细胞吞噬作用，形成结节或包囊以及介导凝集和凝固，产生杀菌物质并且黑色素化。黑色素常常在节肢动物的体表形成黑色斑点，形成的色素沉着对机体起到保护作用。所以，酚氧化酶原激活的级联反应是节肢动物免疫的关键因素。本论文研究开发了以环等温介导技术（LAMP）为基础的检测对虾白斑病毒（WSSV）和鳗弧菌（V. anguillarum）的快速检测方法。并从对虾对病害的免疫机制为切入点，从中国明对虾体内克隆了酚氧化酶原（PrpPO）和丝氨酸蛋白酶FcSP3这两个免疫系统中重要的基因，分析了它们的分子结构特征，组织分布及应答鳗弧菌病原刺激的表达变化模式。 建立的对虾常见病害对虾白班病毒（WSSV）和鳗弧菌（V. anguillarum）的LAMP检测方法，经过实验比对和Blast检索，发现本研究中使用的引物，比已经报导的LAMP方法或者PCR方法具有更宽的检测范围（更低的假阴性）。检测WSSV的LAMP方法使用病毒的VP28基因设计引物，而鳗弧菌的检测方法使用empA基因设计引物。在方法中，首次提出加入UNG酶和dUTP的措施来预防污染，在实际检测中非常有效。LAMP方法与PCR检测方法的灵敏性比较也进行了研究，二者灵敏性相当。 依据中国明对虾血液cDNA文库提供的部分片段信息，结合SMART-RACE技术，克隆了酚氧化酶原（PrpPO）基因，通过序列比对分析发现，PrpPO基因cDNA全长为3040 bp，其中开放阅读框2061 bp，编码686个氨基酸，其中推测的信号肽为12个氨基酸。推测的序列与斑节对虾（P. monodon）同源性为93%,与短钩对虾（P. semisulcatus.）同源性为92%。real time RT-PCR实验结果表明， ProPO在血细胞中的相对表达量最高，肝胰脏中表达量最低。弧菌刺激实验中注射弧菌，刺激了血细胞和淋巴器官中的ProPO mRNA显著增加，说明在血细胞和淋巴器官中存在快速反应的ProPO通路。而ProPO mRNA量在淋巴器官中在时间上早于血液中升至最高，说明该动物在在病原刚开始入侵的时候先有淋巴器官发挥主要的免疫作用，随着时间推移血细胞便变成主要的免疫器官。 根据中国明对虾肝胰脏cDNA文库提供EST信息，经过SMART-RACE克隆了一个丝氨酸蛋白酶FcSP3基因，通过序列比对分析发现，该丝氨酸蛋白酶基因cDNA全长为1622 bp，其中开放阅读框1431 bp，编码477个氨基酸，其中推测的信号肽为22个氨基酸。推测的序列与疟蚊的丝氨酸蛋白酶（A. gambiae）同源性为33%,与丽蝇蛹集金小蜂的酚氧化酶原激活因子（N. vitripennis）同源性为32%，与东北大黑鳃金龟的酚氧化酶原激活因子（H. diomphalia）同源性为34%。淋巴器官中PPAⅡ表达量约为血液中表达量的47560倍，肝胰脏中的FCSP3表达量为血细胞表达量的6226倍。鳗弧菌注射对虾后，淋巴器官中刺激组和对照组FcSP3的mRNA量在刺激后6小时显著降低，但是刺激组的表达量明显高于对照组。刺激组的血细胞与肝胰脏中FcSP3 mRNA的相对表达量增高。而病原刺激后的血液与肝胰脏中的FcSP3 mRNA的增长趋势也在时间上先与ProPO mRNA。这说明FcSP3对ProPO有正调控的作用，但这个调控有一个时间差，并且在不同组织中有不同的调控效率。

中国明对虾在胁迫条件下肝胰脏的差异蛋白质组学研究

对虾养殖业的发展面临着病害严重和环境恶化的严重挑战。对虾细菌和病毒性疾病的频发已给对虾的养殖业造成了严重损失。养殖环境恶化造成的环境胁迫，不但影响对虾的生长性状，而且导致对虾的抵抗力下降，更容易引发病害的发生。研究对虾在外界胁迫（环境胁迫、病原感染）后蛋白表达模式的变化有助于弄清对虾的抗病抗逆机理，为抗病抗逆对虾的培育提供理论依据。 肝胰脏是对虾的重要器官，参与各种重要的生理活动包括消化、吸收、储存和代谢，并且在启动对虾免疫反应起重要作用，其蛋白质表达的变化与对虾的健康状况密切相关。 本研究运用蛋白质组学技术平台（双向电泳、串联质谱、数据库搜索），对中国明对虾肝胰脏蛋白进行研究，获得了一些重要进展，结果如下： 1.初步构建了覆盖范围广、分辨率高、重复性好的中国明对虾肝胰脏双向电泳参考图谱，并利用质谱分析和多种数据库搜索方法成功鉴定了122个（68种）蛋白质点，包括14个（9种）能量代谢蛋白、15个（9种）氨基酸代谢蛋白、10个（5种）碳水化合物代谢蛋白、2个（1种）多聚糖代谢蛋白、11个（5种）辅酶和维生素代谢蛋白、1个（1种）脂类代谢蛋白、5个（3种）核酸代谢蛋白、7个（3种）消化酶、3个（1种）细胞骨架蛋白、14个（8种）免疫相关蛋白、9个（6种）抗氧化蛋白、19个（7种）伴侣蛋白、4个（3种）信号转导蛋白、3个（3种）翻译功能蛋白和5个（4种）未分组蛋白。 2.在参考图谱的基础上，研究了缺氧胁迫下中国明对虾肝胰脏蛋白质表达模式的变化，成功鉴定了52个（15个上调、37个下调）差异表达的蛋白，包括11个能量产生相关蛋白、13个免疫相关蛋白、11个代谢相关蛋白、6个抗氧化蛋白、7个分子伴侣、2个细胞骨架蛋白和2个未分类蛋白，利用实时定量PCR技术，研究了缺氧胁迫下10个差异蛋白的基因在转录水平上的变化；同时研究了金属镉胁迫后中国明对虾肝胰脏蛋白质表达模式的变化，成功鉴定了29个（4个上调、25个下调）差异表达的蛋白，包括9个能量产生相关蛋白、3个免疫相关蛋白、9个代谢相关蛋白、5个抗氧化蛋白、2个分子伴侣和1个未分类蛋白。 3.分别进行了灭活鳗弧菌和WSSV感染后中国明对虾肝胰脏的差异蛋白质组学研究。灭活鳗弧菌刺激后，45个差异表达的蛋白质（4个上调、41个下调）被成功鉴定出，包括6个能量产生相关蛋白、4个免疫相关蛋白、22个代谢相关蛋白、4个抗氧化蛋白、7个分子伴侣、1个翻译相关蛋白和2个未分类蛋白；WSSV感染后， 48个差异表达的蛋白质（11个上调、37个下调）被成功鉴定出，包括7个能量产生相关蛋白、9个免疫相关蛋白、20个代谢相关蛋白、5个抗氧化蛋白和7个分子伴侣。 通过对上述实验数据的分析，初步探讨了中国明对虾对虾对环境胁迫和病原感染的应答机理。为下一步筛选中国明对虾环境胁迫及免疫应答关键蛋白并研究其功能奠定了基础。

中国明对虾重要分子伴侣蛋白基因的克隆及表达研究

对虾养殖业的可持续发展面临着种质退化、病害严重和养殖环境恶化等问题的严重挑战。养殖环境恶化造成的环境胁迫，不但影响对虾的生长性状，而且导致对虾的抵抗力下降，更容易引发病害的发生。养殖环境恶化已经严重影响了对虾养殖业的健康可持续发展。本论文针对环境恶化造成的环境胁迫对对虾影响的分子机理进行了研究。 克隆了中国明对虾对环境胁迫应答的重要伴侣蛋白基因，包括钙网蛋白（FcCRT）、葡萄糖调节蛋白78 （FcGrp78）、热休克蛋白70（FcHsp70）和热休克蛋白90（FcHsp90）的全长cDNA，研究了这些基因的组织表达特征，并对这些基因在不同胁迫条件下的转录表达特征进行了分析。 钙网蛋白是一种多功能的内质网钙结合蛋白，负责蛋白折叠和糖蛋白修饰。本论文首次在中国明对虾报道了钙网蛋白FcCRT基因的全长cDNA序列，编码406个氨基酸，具有保守的N-，P-和C-功能域，以及信号肽和保守的HDEL内质网回收标签。FcCRT基因与其它物种的钙网蛋白具有高度的相似性，系统进化分析表明，FcCRT在亲缘关系上更接近昆虫的钙网蛋白。Northern blot和原位杂交结果显示，FcCRT基因在中国明对虾各组织中均有表达，且在卵巢中发育早起的卵母细胞中表达量最高，说明FcCRT很可能参与了卵母细胞的成熟。FcCRT基因在不同胁迫条件下，其转录表达均呈现明显的变化。在WSSV感染实验中，中国明对虾肝胰脏和淋巴器官中FcCRT转录表达均明显上调；热休克、重金属处理均可引起FcCRT基因转录表达的变化，但不同重金属处理引起FcCRT转录表达变化的模式不同。铜离子处理6小时，会引起FcCRT基因的下调表达，但在12小时之后出现明显上调；镉离子处理12小时后引起FcCRT基因的下调表达，但在24小时又出现明显的上调表达。 葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是内质网重要的伴侣蛋白。中国明对虾的Grp78基因（FcGrp78）的cDNA全长为2325bp，编码665个氨基酸。FcGrp78具有三个Hsp70蛋白家族标签，并含有KDEL内质网回收标签。FcGrp78基因与中国明对虾已有的Hsc70和Hsp70具有高度相似性。Northern blot杂交结果显示FcGrp78基因在中国明对虾各组织中均有表达。FcGrp78基因在WSSV感染的中国明对虾肝胰脏中呈上调表达，在血细胞中下调表达，说明FcGrp78可能与对虾的免疫应答有关。热休克处理会诱导FcGrp78基因转录的上调。不同重金属离子胁迫引起的FcGrp78转录表达有所不同：铜离子处理可以诱导FcGrp78基因在处理后24小时的上调表达；镉离子的处理导致FcGrp78基因处理后12小时的下调以及处理后24小时的上调表达变化。短期低氧胁迫则抑制对虾FcGrp78基因的转录表达。 本论文报道的中国明对虾FcHsp90基因 cDNA全长2552bp，编码726个氨基酸，具有保守的N端功能域、中间功能域和C端功能域，具有五个保守的Hsp90蛋白家族标签，序列上与其他物种Hsp90相似性高。Real-time RT-PCR结果显示FcHsp90基因在发育的卵巢中表达量较高，说明Hsp90可能参与了对虾卵母细胞成熟过程中的蛋白合成和卵黄蛋白原的分泌。WSSV感染引起中国明对虾肝胰脏的FcHsp90的转录表达明显上调，说明FcHsp90很可能与对虾的免疫相关。热休克处理诱导FcHsp90基因转录表达的迅速上调。铜离子处理也可诱导FcHsp90基因转录的上调表达，而镉离子处理首先引起FcHsp90基因的下调表达，24小时后开始上调。低氧胁迫也会抑制FcHsp90基因在对虾体内的转录表达。 诱导型FcHsp70基因cDNA全长2511bp，编码629个氨基酸，具有三个保守的Hsp70蛋白家族标签和C末端EEVD序列。与其他物种的Hsp70蛋白具有高度的相似性。FcHsp70基因转录表达对于热休克处理和铜离子的处理非常敏感：热休克处理2小时后FcHsp70基因的转录水平是对照组的80倍；铜离子处理12小时FcHsp70基因转录表达达到对照组的15倍。而镉离子处理后没有诱导FcHsp70显著的上调表达。 以上研究结果为阐明对虾对环境胁迫应答的机制奠定了重要基础，并可为抗逆对虾的培育提供依据。

软甲纲动物和星虫动物线粒体基因组特征及分子进化研究

在过去的几十年间，利用线粒体基因组序列探讨后生动物深层次的系统发育关系已取得初步进展。这主要得益于，线粒体基因组与其它分子标记相比具备诸多优势。迄今为止，超过1,200个后生动物的线粒体基因组已被测定，然而所获得的数据分布极不均衡。 软甲纲历来是甲壳动物分类学和系统发育学研究的重要类群，在形态学特征和分子生物学各方面取得广泛的发展。尽管软甲纲本身作为单系群已得到大多数甲壳动物学家认可，但是软甲纲内部各个类群之间的系统发育关系迄今仍颇有争议。本文报道了凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei、中国明对虾Fenneropenaeus chinensis、脊尾白虾Exopalaemon carinicauda、太平洋磷虾Euphausia pacifica和采自南极普里兹湾南极磷虾Euphausia superba的线粒体基因组，其长度分别为15,989 bp、16,004 bp、15,730 bp、16,898 bp和15,498 bp以上（部分非编码区没有测定）。 本研究发现凡纳滨对虾、中国明对虾、脊尾白虾和太平洋磷虾的线粒体基因组包含后生动物线粒体基因组典型的基因组成（13个蛋白质编码基因、22个转运RNA、2个核糖体RNA和一个非编码的AT富含区）；然而，南极磷虾与后生动物线粒体基因组典型的基因组成相比，存在1个trnN基因的重复。与泛甲壳动物线粒体基因组的原始排列相比，凡纳滨对虾和中国明对虾线粒体基因组的基因排列完全一致；脊尾白虾的线粒体基因组发生罕见的trnP和trnH易位，从而说明在真虾下目中线粒体基因组的基因排列并不保守；太平洋磷虾线粒体基因组的基因排列出现3个转运RNA的重排 （trnL1、trnL2和trnW）；南极磷虾线粒体基因组的基因排列除了出现太平洋磷虾具有的这3个转运RNA重排之外，还有1个trnN的重复和1个trnI基因的重排。另外，在太平洋磷虾线粒体基因组最大的非编码区中存在一个154 bp×4.7的串连重复区域，如此大片段的串联重复区域（>150 bp）在软甲纲动物线粒体基因组中是首次报道。 目前所获得的线粒体基因组数据强有力地支持口足目、对虾科、真虾下目和短尾下目为单系群。通过比较基因排列及蛋白质编码基因核苷酸和氨基酸序列的系统发育分析得知真虾类和龙虾类为腹胚亚目的原始类群，并支持“（（Penaeus＋Fenneropenaeus）＋Litopenaeus）＋Marsupenaeus”的系统发育关系。此外，线粒体基因组的数据也强有力地支持磷虾目为单系群。但对于磷虾目在软甲纲中的分类地位及与其它类群的系统发育关系存在一些分歧：基于蛋白质编码基因核苷酸和氨基酸数据的贝叶斯分析强有力地支持磷虾目和十足目近缘，这个结果和传统的分类系统完全一致；然而，基于核苷酸序列的邻接法、氨基酸序列的邻接法和最大似然法均强有力地支持磷虾类和对虾类亲缘关系较近，从而破坏了十足目的单系性，与传统的认识并不一致，但由于自展值的支持率非常高，所以深层次的分析需要进一步加强。 星虫动物属于海洋生物中的一个小门类，自1555年被记载以来，其在后生动物中的分类地位就备受争议。本研究测定了星虫动物门的第一条线粒体基因组：革囊星虫Phascolosoma esculenta的线粒体基因组，全长为15,494 bp，包含13个蛋白质编码基因、22个转运RNA、2个核糖体RNA和1个非编码的AT富含区，所有37个基因在同一条链上编码。与后生动物线粒体基因组的典型组成相比，存在一个trnR基因的缺失和一个trnM基因的重复。比较星虫动物和其它后生动物的线粒体基因组，可以得到以下结论：1）星虫动物和环节动物（包括螠虫动物）的线粒体基因组有相近的基因排列，而且所有基因都在同一链上编码；2）基于蛋白质编码基因的系统发育分析强有力地支持星虫动物和环节动物（包括螠虫动物）组成一个单系群，而将软体动物排除在外。因此，本研究认为以前许多星虫动物和软体动物“共享”的特征，包括发育特征和缺乏分节等，需要重新考虑。

中国明对虾三倍体性腺发育机理的初步研究

三倍体培育是水产动物遗传改良的重要途径之一，它在提高养殖产量、改良品质方面发挥着重要作用。对虾三倍体在性腺发育和性别比率方面与二倍体之间存在明显差异。本论文对三倍体性腺发育的分子机理进行了初步探讨，为阐明甲壳动物的性腺发育和性别控制机理提供重要依据。本论文取得的主要进展如下： 利用联会复合体的分析技术，比较分析了雄性二倍体和三倍体中精母细胞的减数分裂行为。二倍体对虾具有典型的真核生物联会复合体的形态，联会复合体在二价体联会处沿同源染色体长轴分布；未见明显的异型性别染色体；三倍体对虾精母细胞的联会行为复杂，可见二价体、单价体、非同源联会的三价体、同源转换和同源区完全配对的双联会复合体等不同形态；三倍体对虾在晚粗线期普遍表现为三价体同源区完全配对的双联会复合体形态，这种联会行为可能是导致其产生 3n 倍性精子的关键原因。 利用抑制性消减杂交技术，建立了对虾二倍体和三倍体卵巢间的2个消减文库；在正向消减文库（以三倍体卵巢作为实验组，二倍体卵巢作为驱动组）中，鉴定到54个基因；在反向消减文库（以二倍体卵巢为实验组，三倍体卵巢为驱动组）中，鉴定到16个基因；选取11个差异表达的基因，利用半定量RT-PCR的方法对其在二倍体和三倍体卵巢间的表达进行了检测，均能很好地与消减结果相吻合；这些差异基因编码多种功能的蛋白，分析表明染色体的三倍化使三倍体卵巢中的基因调控网络受到了影响；为深入揭示维持卵巢正常发育的关键分子调控事件奠定了基础。 为进一步分析特定基因对对虾性腺发育的调控机制，选取了在对虾三倍体和二倍体卵巢中差异表达显著的 3 个不同基因，PCNA （proliferating cell nuclear antigen）、CAS/CSE1 （cellular apoptosis susceptibility protein/chromosome segregation 1）和 SSRF （spermatogonial stem-cell renewal factor），进行了相关研究分析，为深入探讨特定基因对对虾性腺发育的调控机制以及三倍体中的基因表达调控机制奠定了基础； 中国明对虾PCNA基因在增殖旺盛的性腺组织及造血组织中表达量最高；在二倍体卵巢中的表达水平显著高于三倍体卵巢；在不同病原刺激下的造血组织中的表达模式不同，与对虾对抗不同病原刺激的免疫反应相关；PCNA在序列上的高度保守性，提示了其功能的保守性；利用PCNA基因可以指示细胞的增殖活性的特点，将辅助我们在对虾发育生物学和二倍体、三倍体对虾比较发育生物学的研究； 中国明对虾CAS/CSE1基因在二倍体卵巢中高表达；在卵母细胞中，其mRNA大量分布于细胞质及细胞核周围；是早期胚胎发育的母源性因子；在其氨基酸序列的N端具有importin-β 家族蛋白的保守结构，提示其可能通过参与核质运输在发育过程中发挥重要作用；利用原核表达系统成功地对其进行了体外重组表达，为进一步在蛋白水平上的功能研究提供了条件； 中国明对虾SSRF（暂时命名）基因在三倍体卵巢中高表达；在正常二倍体对虾的神经组织中表达量最高，提示该基因在神经发育中可能发挥重要作用；在氨基酸序列上与胸苷磷酸化酶（TP）具有最高的相似性；利用原核表达系统成功地对其进行了体外重组表达，为进一步在蛋白水平上的功能研究奠定了基础；对对虾SSRF活性蛋白的酶活及功能验证亟待进行。

中国明对虾Toll样受体基因的克隆与表达分析

对虾病害在世界范围内的广泛传播，给水产养殖和沿海农村经济造成了重大损失。自1993 年对虾白斑病暴发以来，中国明对虾的养殖一直一蹶不振。引起对虾大规模死亡的原因是多方面的，其主要原因是养殖环境恶化、对虾种质退化和抗病力下降。因此，深入开展对虾免疫机制研究，并在此基础上寻找对虾疾病防治的有效方法，改良种质和培育抗病品系，已成为对虾养殖业走可持续发展之路的当务之急。 Toll 样受体（Toll-like receptors, TLRs）家族是进化保守的哺乳动物模式识别蛋白（pattern recognition receptors, PRR），在先天免疫系统中起着非常重要的作用。本研究采用同源克隆和RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术从中国明对虾中克隆到Toll 样受体同源基因，并将其命名为FcToll。它全长4115 bp，3’UTR 包含16 个poly A 尾巴，开放阅读框编码931 个氨基酸的多肽。预测的该多肽包含典型的Toll 样受体结构，分为胞外区、跨膜区和胞内区。其中胞外区有信号肽，有16 个富含亮氨酸的重复序列eucine-rich repeats, LRR），并含有2个LRR-C 末端基序和2 个LRR-N 末端基序；跨膜区是23 个氨基酸的一次跨膜结构域；胞内区是含有139 个氨基酸的TIR 结构域（Toll/Interleukin-1R）。克隆 发现FcToll 的基因组结构包含5 个外显子和4 个内含子。系统发生分析揭示FcToll归属于“昆虫型”的无脊椎动物Toll 样受体家族。组织分布研究发现FcToll 在中国明对虾中是组成型表达的，在淋巴器官中表达量较显著。分别利用不同病原体刺激健康的中国明对虾，Real-time PCR 发现该基因在刺激后表达水平呈现不同的表达谱：灭活鳗弧菌（Vibrio anguillarum）注射后5 小时，该基因表达显著 上调；而WSSV（white spot syndrome virus）注射后该基因表达则迅速下调，感染后23 小时内其表达水平均低于对应时间点的对照组。这就表明FcToll 可能参与中国明对虾的先天免疫防御，尤其可能参与入侵弧菌的免疫应答。

The manganese superoxide dismutase gene in bay scallop Argopecten irradians: Cloning, 3D modelling and mRNA expression

A novel manganese superoxide dismutase (MnSOD) was cloned from bay scallop Argopecten irradians by 3' and 5' rapid amplification of cDNA ends (RACE) PCR. The full-length cDNA of MnSOD was of 1207 bp with a 678 bp open reading frame encoding 226 amino acids. The deduced amino acid sequence contained a putative signal peptide of 26 amino acids. Sequence comparison showed that the MnSOD of A. irradians shared high identity with MnSOD in invertebrates and vertebrates, such as MnSOD from abalone Haliotis discus discus (ABG88843) and frog Xenopus laevis (AAQ63483). Furthermore, the 3D structure of bay scallop MnSOD was predicted by SWISS-MODEL Protein Modelling Server and compared with those of other MnSODs. The overall structure of bay scallop MnSOD was similar to those of zebrafish Danio rerio, fruit fly Drosophila melanogaster, Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis, human Homo sapiens, and had the highest similarity to scallop Mizuhopecten yessoensis and abalone H. discus discus. A quantitative real-time PCR (qRT-PCR) assay was developed to detect the mRNA expression of MnSOD in different tissues and the temporal expression in haemocytes following challenge with the bacterium Vibrio anguillarum. A higher-level of mRNA expression of MnSOD was detected in gill and mantle. The expression of MnSOD reached the highest level at 3 h post-injection with V. anguillarum and then slightly recovered from 6 to 48 h. The results indicated that bay scallop MnSOD was a constitutive and inducible protein and thus could play an important role in the immune responses against V anguillarum infection. (c) 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Variação espaço temporal da comunidade zooplanctônica em viveiros de cultivo de camarão branco, Litopenaeus vannamei (Boone, 1931), no município Curuçá, Pará-Brasil

Ao longo das últimas décadas, a carcinicultura vem apresentando um grande crescimento em diversas partes do mundo, com o Brasil seguindo esta tendência mundial (FAO, 2004). Nesta atividade três espécies de camarão têm se destacado como as mais cultivadas, sendo elas Penaeus monodon (Fabricius, 1798), Fenneropenaeus chinensis (Osbeck, 1765) e Litopenaeus vannamei (Boone, 1931), responsáveis por cerca de 80% da produção mundial (FAO, 2004). No Brasil L. vannamei é a espécie mais cultivada, com a produção brasileira correspondendo a 5% da produção mundial (FAO, 2004). L. vannamei é uma espécie marinha originária do Oceano Pacífico, distribuída do México ao Peru. Por ser eurihalino, este camarão pode se adaptar às mais diversas condições de cultivo, desde águas salgadas até de menores salinidades (BRAY et al., 1993; PONCE-PALAFOX et al., 1997), característica que tem aumentado o interesse dos produtores. Embora seja exótica no Brasil, L. vannamei, mostra maior resistência à variação de temperatura e salinidade do que outros camarões peneídeos nativos (BRITO et al., 2000). O alimento do camarão e as estratégias de seu fornecimento têm merecido uma atenção especial do setor, gerando novas técnicas ou seu aperfeiçoamento. A ração nos sistemas de cultivo intensivo e semi-intensivo, por exemplo, é responsável por 50-60% dos custos totais de produção, demonstrando a importância de novas estratégias para minimizar sue uso. O aumento da biomassa do plâncton (alimento natural), e conseqüentemente, da cadeia alimentar, reduz os custos com a alimentação suplementar, influenciando diretamente os custos finais de produção (AVAULT, 2003). Segundo Nunes (1995), o incremento da produtividade natural é tão importante quanto o uso de uma ração nutricionalmente completa e bem balanceada. Logo após a introdução nos viveiros de cultivo, a base da alimentação de L. vannamei é composta, em parte, pelo alimento natural disponível (NUNES et al. 1997; MARTINEZ-CORDOVA et al. 1997; ROTHLISBERG, 1998) complementada com ração comercial. Martinez-Cordova et al. (2002) mostraram que as concentrações de clorofila ‘a’ diminuem cerca de 50% do início ao fim do cultivo, provavelmente devido a pastagem pelo zooplâncton e por alguns invertebrados bentônicos. Além da importância do zooplâncton como alimento para as pós-larvas de camarão nos viveiros de engorda, o uso destes organismos (principalmente copépodes) como alimento vivo na aqüicultura marinha vem recebendo grande atenção nos últimos anos (DELBARE et al. 1996). Tal fato ocorre por serem ricos em fosfolipídios, ácidos graxos essenciais altamente insaturados e antioxidantes naturais, sendo nutricionalmente superiores aos rotíferos e aos náuplios de artemia, comumente usados na larvicultura marinha (SARGENT et al. 1997, STOTTRUP e NOSKER, 1997) promovendo o sucesso as larviculturas de camarão (PAYNE et al. 1998; SCHIPP et al. 1999; PAYNE e RIPPINGALE, 2000). Desta forma, estudos sobre o cultivo intensivo de camarões marinhos que enfoquem a composição da comunidade planctônica, as variáveis bióticas e abióticas no sistema, e a característica dos efluentes gerados, são de grande importância. Assim, os resultados obtidos podem incrementar a produtividade aquática no cultivo, alem de fornecer subsídios para pesquisas posteriores de avaliação e mitigação dos impactos ambientais causados por esta atividade.

Lack of genetic differentiation in the shrimp Penaeus chinensis in the northwestern pacific

Genetic differentiation of the shrimp Penaeus chinensis in the Yellow Sea and Bohai Sea was investigated using the mitochondrial control region (CR). RFLP of a partial CR segment (613 bp) shows that 106 out of 122 (86.9%) individuals from six sampling localities along the coast of northern China and the west coast of the Korean Peninsula share the same haplotype, and the haplotype frequencies among localities are not significantly different. The findings are further confirmed by sequencing the complete CR. Divergence of the complete CR (992 bp) is less than 1.6% in 14 individuals from the six localities. F-statistics based on RFLP data and the TCS network of sequencing data suggest little genetic differentiation of P. chinensis in the Yellow Sea and Bohai Sea. Mismatch analysis suggests a rapid expansion of P. chinensis population to the Yellow Sea and the Bohai Sea, which probably occurred with the rapid rise in sea level after the last glacial maximum. Despite the lack of genetic heterogeneity, we propose that P. chinensis populations in this region should be treated as separate management units, as fishery management programs have to be applied on a local basis by different governments.