In vivo analysis of interactions between trans-acting factors and their target genes

The investigations presented in this thesis use various in vivo techniques to understand how trans-acting factors control gene expression. The first part addresses the transcriptional regulation of muscle creatine kinase (MCK). MCK expression is activated during the course of development and is found only in differentiated muscle. Several in vivo footprints are observed at the enhancer of this gene, but all of these interactions are limited to cell types that express MCK. This is interesting because two of the footprints appear to represent muscle specific use of general transcription factors, while the other two correspond to sites that can bind the myogenic regulator, MyoD1, in vitro. MyoD1 and these general factors are present in myoblasts, but can bind to the enhancer only in myocytes. This suggests that either the factors themselves are post-translationally modified (phosphorylation or protein:protein interactions), or the accessibility of the enhancer to the factors is limited (changes in chromatin structure). The in vivo footprinting study of MCK was performed with a new ligation mediated, single-sided PCR (polymerase chain reaction) technique that I have developed.

The second half of the thesis concerns the regulation of mouse metallothionein (MT). Metallothioneins are a family of highly conserved housekeeping genes whose expression can be induced by heavy metals, steroids, and other stresses. By adapting a primer extension method of genomic sequencing to in vivo footprinting, I've observed both metal inducible and noninducible interactions at the promoter of MT-I. From these results I've been able to limit the possible mechanisms by which metal responsive trans-acting factors induce transcription. These interpretations correlate with a second line of experiments involving the stable titration of positive acting factors necessary for induction of MT. I've amplified the promoter of MT to 10^2-10^3 copies per cell by fusing the 5' and 3' ends of the MT gene to the coding region of DHFR and selecting cells for methotrexate resistance. In these cells, there is a metal-specific titration effect, and although it acts at the level of transcription, it appears to be independent of direct DNA binding factors.

A polidez e a preservação de face em trocas de e-mails entre gerentes e sua relação com a cultura organizacional

Dado o crescente uso da Internet e a importância da linguagem do e-mail no ambiente corporativo, o presente trabalho tem como objetivo principal analisar as estratégias de polidez e os mecanismos de preservação de face em trocas de e-mails entre um grupo de gerentes de uma instituição privada de ensino de língua inglesa no Brasil. A pesquisa é um estudo de caso e faz uso de uma abordagem interpretativista, assim como, em partes, também usa dados quantitativos. Para tanto, neste estudo foram integradas à Pragmática outras áreas de pesquisa como a Linguística Sistêmico-Funcional e a Linguística de Corpus. O enfoque nos mecanismos de polidez e proteção de face tem o objetivo de estudar de que forma estes elementos da linguagem utilizada nas trocas de e-mails entre o grupo de gerentes envolvido no estudo estão refletidos na cultura organizacional da instituição. Para tal foram usados os conceitos de Brown e Levinson (1987) para polidez, o de Goffman (1998) para footing e enquadre. Na área de categorização de grupos padronizados de palavras achados frequentemente dentro de um corpus foram usados os parâmetros de Hyland (2008), parâmetros esses que são calcados nas três metafunções de Halliday. Por fim tecem-se comentários sobre as trocas escritas dentro da instituição através de e-mails, buscando entender se essas trocas fazem parte de um gênero estabelecido ou de uma forma de comunicação única e com características próprias. As análises realizadas neste estudo estudam formas de polidez e proteção de face nas saudações e fechos de e-mails do corpus de estudo, a linguagem usada em pedidos de ajuda/informações, na resolução de conflitos e em outras situações do cotidiano dos gerentes da instituição alvo. Os resultados das análises da linguagem usada nas mensagens eletrônicas trocadas pelo grupo sugerem uma relação direta entra a cultura organizacional e os típicos mecanismos característicos de proteção de face e polidez adotados nas mensagens dos gerentes da empresa