Gene discovery and gene function assignment in filamentous fungi

Filamentous fungi are a large group of diverse and economically important microorganisms. Large-scale gene disruption strategies developed in budding yeast are not applicable to these organisms because of their larger genomes and lower rate of targeted integration (TI) during transformation. We developed transposon-arrayed gene knockouts (TAGKO) to discover genes and simultaneously create gene disruption cassettes for subsequent transformation and mutant analysis. Transposons carrying a bacterial and fungal drug resistance marker are used to mutagenize individual cosmids or entire libraries in vitro. Cosmids are annotated by DNA sequence analysis at the transposon insertion sites, and cosmid inserts are liberated to direct insertional mutagenesis events in the genome. Based on saturation analysis of a cosmid insert and insertions in a fungal cosmid library, we show that TAGKO can be used to rapidly identify and mutate genes. We further show that insertions can create alterations in gene expression, and we have used this approach to investigate an amino acid oxidation pathway in two important fungal phytopathogens.

Organization and expression of the double-stranded RNA genome of Helminthosporium victoriae 190S virus, a totivirus infecting a plant pathogenic filamentous fungus.

The complete nucleotide sequence, 5178 bp, of the totivirus Helminthosporium vicotoriae 190S virus (Hv190SV) double-stranded RNA, was determined. Computer-assisted sequence analysis revealed the presence of two large overlapping ORFs; the 5'-proximal large ORF (ORF1) codes for the coat protein (CP) with a predicted molecular mass of 81 kDa, and the 3'-proximal ORF (ORF2), which is in the -1 frame relative to ORF1, codes for an RNA-dependent RNA polymerase (RDRP). Unlike many other totiviruses, the overlap region between ORF1 and ORF2 lacks known structural information required for translational frameshifting. Using an antiserum to a C-terminal fragment of the RDRP, the product of ORF2 was identified as a minor virion-associated polypeptide of estimated molecular mass of 92 kDa. No CP-RDRP fusion protein with calculated molecular mass of 165 kDa was detected. The predicted start codon of the RDRP ORF (2605-AUG-2607) overlaps with the stop codon (2606-UGA-2608) of the CP ORF, suggesting RDRP is expressed by an internal initiation mechanism. Hv190SV is associated with a debilitating disease of its phytopathogenic fungal host. Knowledge of its genome organization and expression will be valuable for understanding its role in pathogenesis and for potential exploitation in the development of biocontrol measures.

The effects of stress on social preferences are sexually dimorphic in prairie voles.

Prairie voles (Microtus ochrogaster) are monogamous rodents that form pair bonds characterized by a preference for a familiar social partner. In male prairie voles, exposure to either the stress of swimming or exogenous injections of corticosterone facilitate the development of a social preference for a female with which the male was paired after injection or swimming. Conversely, adrenalectomy inhibits partner preference formation in males and the behavioral effects of adrenalectomy are reversed by corticosterone replacement. In female prairie voles, swim stress interferes with the development of social preferences and corticosterone treatments inhibit the formation of partner preferences, while adrenalectomized females form preferences more quickly than adrenally intact controls. Because sex differences in both behavior and physiology are typically reduced in monogamous species, we initially predicted that male and female prairie voles would exhibit similar behavioral responses to corticosterone. However, our findings suggest an unanticipated sexual dimorphism in the physiological processes modulating social preferences. This dimorphic involvement of stress hormones in pair bonding provides a proximate mechanism for regulating social organization, while permitting males and females to adapt their reproductive strategies in response to environmental challenges.

Unique chromosomal regions associated with virulence of an avian pathogenic Escherichia coli strain.

The avian pathogenic Escherichia coli strain (chi)7122 (serotype O78:K80:H9) causes airsacculitis and colisepticemia in chickens. To identify genes associated with avian disease, a genomic subtraction technique was performed between strain (chi)7122 and the E. coli K-12 strain (chi)289. The DNA isolated using this method was found only in strain (chi)7122 and was used to identify cosmid clones carrying unique DNA from a library of (chi)7122 that were then used to map the position of unique DNA on the E. coli chromosome. A total of 12 unique regions were found, 5 of which correspond to previously identified positions for unique DNA sequence in E. coli strains. To assess the role each unique region plays in virulence, mutants of (chi)7122 were constructed in which a segment of unique DNA was replaced with E. coli K-12 DNA by cotransduction of linked transposon insertions in DNA flanking the unique sequence. The resulting replacement mutants were assessed for inability to colonize the air sac and cause septicemia in 2-week-old white Leghorn chickens. Two mutants were found to be avirulent when injected into the right caudal air sac of 2-week-old chickens. One avirulent mutant, designated (chi)7145, carries a replacement of the rfb locus at 44 min, generating a rough phenotype. The second mutant is designated (chi)7146, and carries a replacement at position 0.0 min on the genetic map. Both mutants could be complemented to partial virulence by cosmids carrying sequences unique to (chi)7122.

Mapping rat megalin: the second cluster of ligand binding repeats contains a 46-amino acid pathogenic epitope involved in the formation of immune deposits in Heymann nephritis.

Megalin (gp330), an epithelial endocytic receptor, is a major target antigen of Heymann nephritis (HN), an autoimmune disease in rats. To elucidate the mechanisms of HN, we have mapped a pathogenic epitope in megalin that binds anti-megalin antibodies. We focused our attention on four clusters of cysteine-rich, low density lipoprotein receptor (LDLR) ligand binding repeats in the extracellular domain of megalin because they represent putative ligand binding regions and therefore would be expected to be exposed in vivo and to be able to bind circulating antibodies. Rat megalin cDNA fragments I through IV encoding the first through fourth clusters of ligand-binding repeats, respectively, were expressed in a baculovirus system. All four expression products were detected by immunoblotting with two antisera capable of inducing passive HN (pHN). When antibodies eluted from glomeruli of rats with pHN were used for immunoblotting, only the expression product encoded by fragment II was detected. This indicates that the second cluster of LDLR ligand binding repeats is directly involved in binding anti-megalin antibodies and in the induction of pHN. To narrow the major epitope in this domain, fragment II was used to prepare proteins sequentially truncated from the C- and N-terminal ends by in vitro translation. Analysis of the truncated translation products by immunoprecipitation with anti-megalin IgG revealed that the fifth ligand-binding repeat (amino acids 1160-1205) contains the major epitope recognized. This suggests that a 46-amino acid sequence in the second cluster of LDLR ligand binding repeats contains a major pathogenic epitope that plays a key role in pHN. Identification of this epitope will facilitate studies on the pathogenesis of HN.

Congruence of fatty acid methyl ester profiles and morphological characters of arbuscular mycorrhizal fungi in Gigasporaceae.

Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi (Order Glomales, Class Zygomycetes) are a diverse group of soil fungi that form mutualistic associations with the roots of most species of higher plants. Despite intensive study over the past 25 years, the phylogenetic relationships among AM fungi, and thus many details of evolution of the symbiosis, remain unclear. Cladistic analysis was performed on fatty acid methyl ester (FAME) profiles of 15 species in Gigaspora and Scutellospora (family Gigasporaceae) by using a restricted maximum likelihood approach of continuous character data. Results were compared to a parsimony analysis of spore morphological characters of the same species. Only one tree was generated from each character set. Morphological and developmental data suggest that species with the simplest spore types are ancestral whereas those with complicated inner wall structures are derived. Spores of those species having a complex wall structure pass through stages of development identical to the mature stages of simpler spores, suggesting a pattern of classical Haeckelian recapitulation in evolution of spore characters. Analysis of FAME profiles supported this hypothesis when Glomus leptotichum was used as the outgroup. However, when Glomus etunicatum was chosen as the outgroup, the polarity of the entire tree was reversed. Our results suggest that FAME profiles contain useful information and provide independent criteria for generating phylogenetic hypotheses in AM fungi. The maximum likelihood approach to analyzing FAME profiles also may prove useful for many other groups of organisms in which profiles are empirically shown to be stable and heritable.

Peptide analogs to pathogenic epitopes of the human acetylcholine receptor alpha subunit as potential modulators of myasthenia gravis.

Myasthenia gravis is an autoimmune disease in which T cells specific to epitopes of the autoantigen, the human acetylcholine receptor, play a role. We identified two peptides, p195-212 and p259-271, from the alpha subunit of the receptor, which bound to major histocompatibility complex (MHC) class II molecules on antigen-presenting cells (APCs) from peripheral blood lymphocytes of myasthenia gravis patients and stimulated lymphocytes of >80% of the patients. We have prepared analogs of these myasthenogenic peptides and tested their ability to bind to MHC class II determinants and to interfere specifically with T-cell stimulation. We first determined relative binding efficiency of the myasthenogenic peptides and their analogs to APCs of patients. We found that single substituted analogs of p195-212 (Ala-207) and p259-271 (Lys-262) could bind to human MHC molecules on APCs as efficiently as the original peptides. Moreover, dual analogs containing the two single substituted analogs in one stretch (either sequentially, Ala-207/Lys-262, or reciprocally, Lys-262/Ala-207) could also bind to APCs of patients, including those that failed to bind one of the single substituted analogs. The single substituted analogs significantly inhibited T-cell stimulation induced by their respective myasthenogenic peptides in >95% of the patients. The dual analogs were capable of inhibiting stimulation induced by either of the peptides: They inhibited the response to p195-212 and p259-271 in >95% and >90% of the patients, respectively. Thus, the dual analogs are good candidates for inhibition of T-cell responses of myasthenia gravis patients and might have therapeutic potential.

Comparative interleukin (IL-2)/interferon IFN-gamma and IL-4/IL-10 responses during acute infection of macaques inoculated with attenuated nef-truncated or pathogenic SICmac251 virus.

Comparison of immune responses to infection by a pathogenic or a nonpathogenic immunodeficiency virus in macaques may provide insights into pathogenetic events leading to simian AIDS. This work is aimed at exploring cytokine expression during infection by simian immunodeficiency virus (SIV). We used semiquantitative reverse transcription-PCR to monitor interleukin (IL)-2/interferon (IFN)-gamma (Th1-like), and IL-4/IL-10 (Th2-like) expression in unmanipulated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), during the acute phase of infection of eight cynomolgus macaques (Macaca fascicularis) with a pathogenic primary isolate of SIVmac251 (full-length nef), and of four other cynomolgus macaques by an attenuated molecular clone of SIVmac251 (nef-truncated). All the monkeys became infected, as clearly shown by the presence of infected PBMCs and by seroconversion. Nevertheless, PBMC-associated virus loads and p27 antigenemia in monkeys infected by the attenuated virus clone remained lower than those observed in animals infected with the pathogenic SIVmac251 isolate. A rise of IL-10 mRNA expression occurred in both groups of monkeys coincident with the peak of viral replication. In monkeys infected with the pathogenic SIVmac251, IL-2, IL-4, and IFN-gamma mRNAs were either weakly detectable or undetectable. On the contrary, animals infected by the attenuated virus exhibited an overexpression of these cytokine mRNAs during the first weeks after inoculation. The lack of expression of these cytokines in monkeys infected with the pathogenic primary isolate may reflect early immunodeficiency.

Pathogenic autoantibodies are routinely generated during the response to foreign antigen: a paradigm for autoimmune disease.

The immune system's ability to distinguish self and nonself is essential for both host defense against foreign agents and protection of self-antigens from autoimmune destruction. Such discrimination is complicated by extensive structural homology shared between foreign and self antigens. One hypothesis to explain the development of an autoimmune response is that some B cells activated by foreign antigen acquire, through somatic mutation, specificity for both the eliciting foreign antigen and self antigen. If such clones arise frequently, there must be a mechanism for their elimination. We have analyzed the extent of autoreactivity arising in a nonautoimmune host during the response to a foreign antigen. To overcome the process of apoptosis in primary B cells that might routinely eliminate autoreactive clones, we generated B-cell hybridomas from spleen cells of immunized mice by using a fusion partner constitutively expressing bcl-2. Multiple lines were obtained that recognize simultaneously the hapten phosphorylcholine and the self antigen double-stranded DNA. This dual specificity was not present early but was detected by day 10 after immunization. Some of these cross-reactive antibodies deposit in kidneys in a pattern similar to what is seen in autoimmune disease. These results demonstrate that autoantibodies arise at a high frequency as part of a response to foreign antigen. It has previously been shown that autoreactivity is regulated by central deletion; these data demonstrate a need for negative selection in peripheral lymphoid organs also, to regulate autoantibodies acquiring their self-specificity by somatic mutation.

Disparate responses to oxidative stress in saprophytic and pathogenic mycobacteria.

To persist in macrophages and in granulomatous caseous lesions, pathogenic mycobacteria must be equipped to withstand the action of toxic oxygen metabolites. In Gram-negative bacteria, the OxyR protein is a critical component of the oxidative stress response. OxyR is both a sensor of reactive oxygen species and a transcriptional activator, inducing expression of detoxifying enzymes such as catalase/hydroperoxidase and alkyl hydroperoxidase. We have characterized the responses of various mycobacteria to hydrogen peroxide both phenotypically and at the levels of gene and protein expression. Only the saprophytic Mycobacterium smegmatis induced a protective oxidative stress response analogous to the OxyR response of Gram-negative bacteria. Under similar conditions, the pathogenic mycobacteria exhibited a limited, nonprotective response, which in the case of Mycobacterium tuberculosis was restricted to induction of a single protein, KatG. We have also isolated DNA sequences homologous to oxyR and ahpC from M. tuberculosis and Mycobacterium avium. While the M. avium oxyR appears intact, the oxyR homologue of M. tuberculosis contains numerous deletions and frameshifts and is probably nonfunctional. Apparently the response of pathogenic mycobacteria to oxidative stress differs significantly from the inducible OxyR response of other bacteria.

Correlation of peptide specificity and IgG subclass with pathogenic and nonpathogenic autoantibodies in pemphigus vulgaris: a model for autoimmunity.

Pemphigus vulgaris (PV) is a rare, potentially fatal, autoimmune disease that affects the skin and mucous membranes. The PV antigen (PVA) has been characterized as desmoglein 3. PV patients carry HLA-DR4- or HLA-DR6-bearing extended haplotypes. We recently demonstrated that patients with active disease have high titers of PV autoantibodies of the IgG1 and IgG4 subclasses. Patients in remission, healthy unaffected relatives, and some MHC-matched normal individuals have low levels of PV autoantibodies, which are IgG1 only. Furthermore, intraperitoneal injection of IgG from patients with active disease caused clinical disease in mice, but IgG from patients in remission, healthy relatives, or MHC-matched normal individuals did not. We prepared 12 peptides of 30 amino acids each (peptides Bos 1-12) spanning the extracellular domain of PVA. Patients with active disease recognize peptides Bos 1 and Bos 6 with high titers of IgG1 and IgG4 autoantibodies. Patients in remission have IgG1 autoantibodies to peptide Bos 1 only, in statistically significantly lower titers (P < 0.01). They no longer have IgG4 subclass autoantibodies to peptide Bos 6. Healthy relatives and normal unrelated individuals have low levels of only IgG1 autoantibodies that recognize only Bos 1. In vitro studies indicate that Bos 6-specific IgG and, to a lesser extent, Bos 1-specific IgG can cause acantholysis. Our data suggest that Bos 6-specific IgG4 is probably the main acantholytic autoantibody, while Bos 1-specific IgG4 may act as a facilitator or enhancer of the process. In this study we illustrate some of the paradigms that demonstrate the interactions between the MHC, subclass of autoantibodies, and peptide specificities of the autoantibodies in the autoimmune process. Thus, PV provides an important model to study the pathogenesis of autoimmunity.

Molecular cloning and characterization of chitinase genes from Candida albicans.

Chitinase (EC 3.2.1.14) is an important enzyme for the remodeling of chitin in the cell wall of fungi. We have cloned three chitinase genes (CHT1, CHT2, and CHT3) from the dimorphic human pathogen Candida albicans. CHT2 and CHT3 have been sequenced in full and their primary structures have been analyzed: CHT2 encodes a protein of 583 aa with a predicted size of 60.8 kDa; CHT3 encodes a protein of 567 aa with a predicted size of 60 kDa. All three genes show striking similarity to other chitinase genes in the literature, especially in the proposed catalytic domain. Transcription of CHT2 and CHT3 was greater when C. albicans was grown in a yeast phase as compared to a mycelial phase. A transcript of CHT1 could not be detected in either growth condition.

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Caracterização anatomopatológica, microbiológica e parasitológica de ratos Wistar (Rattus norvegicus) em diferentes idades

Os ratos Wistar são amplamente empregados como modelo animal na pesquisa biomédica e o controle sanitário dos biotérios é essencial para garantir a qualidade dos experimentos. O objetivo do estudo foi a caracterização do estado sanitário da colônia de ratos Wistar em sistema de criação convencional e para tanto determinar as bactérias, fungos, virus e parasitos, bem como caracterizar as lesões anatomopatológicas do sistema respiratório. Foram utilizados 273 ratos (N), machos (M) e fêmeas (F), das faixas etárias 4, 8, 12, 16 a 20 semanas e entre 12 a 18 meses, para as determinações de peso e condição corpórea (N=273, 140M, 133F); avaliação bacteriológica de orofaringe, mucosa intestinal e lavado traqueobrônquico (N=40, 20M, 20F); determinação de anticorpos para vírus e bactérias (N=20, 10M, 10F); exame parasitológico (N=60, 30M, 30F); identificação molecular de Mycoplasma pulmonis em amostras de pulmão (N=25, 15M, 10F), e caracterização anatomopatológica da cavidade nasal, orofaringe, laringe, traqueia e pulmão (N=106, 53M, 53F). Foram realizadas ainda avaliações microbiológicas das salas dos ratos em três períodos com isolamento de Micrococcus spp., Staphylococcus spp., Bacillus spp., Aspergillus spp. e Penicillium spp. O peso se mostrou homogêneo dentro da faixa etária e gênero, com apenas sete animais magros (2,56%) e nove em sobrepeso (3,30%). Não foram isoladas bactérias patogênicas na orofaringe, mucosa intestinal e lavado traqueobrônquico por cultivo. Mycoplasma pulmonis foi determinado em 72% das amostras pulmonares e em 100% dos soros testados. Em 35% foram detectados anticorpos para Reovirus tipo III e em 100% para bacilos associados ao epitélio respiratório ciliado. Syphacia muris foi diagnosticada em 91,67%, Eimeria spp. em 3,33% e Entamoeba muris em 1,67%. Lesões relacionadas a infecção por agentes exógenos foram observadas em cavidade nasal e na orofaringe, laringe e traqueia a partir da 4 semanas de idade e, em pulmão desde as 12 semanas, com aumento de frequência de ocorrência e do grau de progressão, com o avançar da idade, nos vários segmentos estudados. Concluímos que a caracterização do estado sanitário dos ratos permite conhecer as particularidades do modelo biológico utilizado e compor base de dados para auxiliar no desenho e na interpretação experimental dos pesquisadores, além de garantir uma base para o programa de monitorização sanitária de biotérios em condições similares

Gene cloning, molecular modeling, and phylogenetics of serine protease P32 and serine carboxypeptidase SCP1 from nematophagous fungi Pochonia rubescens and Pochonia chlamydosporia

The fungi Pochonia chlamydosporia and Pochonia rubescens are parasites of nematode eggs and thus are biocontrol agents of nematodes. Proteolytic enzymes such as the S8 proteases VCP1 and P32, secreted during the pathogenesis of nematode eggs, are major virulence factors in these fungi. Recently, expression of these enzymes and of SCP1, a new putative S10 carboxypeptidase, was detected during endophytic colonization of barley roots by these fungi. In our study, we cloned the genomic and mRNA sequences encoding P32 from P. rubescens and SCP1 from P. chlamydosporia. P32 showed a high homology with the serine proteases Pr1A from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae and VCP1 from P. chlamydosporia (86% and 76% identity, respectively). However, the catalytic pocket of P32 showed differences in the amino acids of the substrate-recognition sites compared with the catalytic pockets of Pr1A and VCP1 proteases. Phylogenetic analysis of P32 suggests a common ancestor with protease Pr1A. SCP1 displays the characteristic features of a member of the S10 family of serine proteases. Phylogenetic comparisons show that SCP1 and other carboxypeptidases from filamentous fungi have an origin different from that of yeast vacuolar serine carboxypeptidases. Understanding protease genes from nematophagous fungi is crucial for enhancing the biocontrol potential of these organisms.