DNA-Array-Technologie

Es wurde ein genomischer DNA-Array der Modellpflanze Arabidopsis thaliana mit einer 13.800 EST-Klone umfassenden cDNA-Bibliothek entwickelt und in der Genexpressionsanalyse der pflanzlichen Pathogenabwehr eingesetzt. Mittels PCR-Amplifikation sind 13.000 PCR-Produkte der cDNA-Fragmente hergestellt worden, mit denen 66 genomische Arabidopsis-Arrays auf Nylon und Polypropylen als Trägermaterial hergestellt werden konnten. Die Validierung mit Fluoreszenz- und Radiaktivhybridisierung sowie der Vergleich von drei Normalisierungsmethoden führte zu reproduzierbaren Ergebnissen bei hohem Korrelationskoeffizienten. Die etablierte DNA-Array-Technologie wurde zur Genexpressionsanalyse der pathogeninduzierten Abwehrmechanismen der Pflanze Arabidopsis thaliana in den ersten 24 Stunden nach Infektion mit dem avirulenten Bakterium Pseudomonas syringae pv. tomato eingesetzt. In einer Auswahl von 75 Genen der Stoffwechselwege Glycolyse, Citrat-Cyclus, Pentosephosphat-Cyclus und Glyoxylatmetabolismus konnte für 25 % der Gene, im Shikimat-, Tryptophan- und Phenylpropanoidsyntheseweg für 60 % der Gene eine erhöhte Transkriptionsrate nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit stimmen mit experimentellen Daten verschiedener unabhängiger Studien zur pflanzlichen Pathogenantwort überein. Darüberhinaus sind erstmals Transkriptionsprofile von bisher auf Transkriptionsebene nicht untersuchten Genen erstellt worden. Diese Ergebnisse bestätigen die transkriptionelle Aktivierung ganzer Stoffwechselwege und gewähren erstmals einen Einblick in die koordinierte differentielle Transkription ganzer Stoffwechselwege während der Pathogenabwehr.

Untersuchungen zur genetischen Differenzierung von Vitis Genotypen und Unterlagsrebsorten sowie deren Klone mit Hilfe der RAPD-, AFLP- und SAMPL-Analyse

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Routinemethode zur Differenzierung und Identifizierung von Unterlagssorten in jedem Verarbeitungsstadium, wie Holz, Pfropfrebe, bereits im Weinberg gepflanzte Rebe, entwickelt. Hierfür wurde eine Methode erarbeitet, die es ermöglicht, DNA aus Blättern, Holz und Wurzeln gleichermaßen zu extrahieren. Vermischungen von Unterlagssorten in einem Unterlagenholzbündel konnten bis zu 10% Fremd-Unterlagenholz durch eine RAPD-PCR nachgewiesen werden. Mit den 12mer Primer #722b und #722c wurden sortenspezifische Banden für die Unterlagssorten Börner, 8B, 3309C und 5BB festgestellt. Der Primers # 751 war in der Lage von 151 Unterlagssorten und Wildarten 144 Genotypen zu unterschieden. Mit Hilfe der Optimierung von RAMP-Zeiten konnten die Bandenmuster der sieben in Deutschland am häufigsten verwendeten Unterlagssorten auf zwei unterschiedlichen Thermocyclern reproduziert werden. Aufgrund der Optimierung der RAPD-PCR war es möglich, die zur Unterscheidung notwendigen Banden durch eine lineare Transformation anhand einer ermittelten Referenzbande mathematisch und graphisch darzustellen. Klone der Unterlagssorten SO4, 125AA und 5C, sowie die Unterlagssorte Binova, wurden auf die Unterscheidungsmöglichkeit hin mit RAPD, AFLP und SAMPL untersucht. Innerhalb der AFLP-/SAMPL-Methode bildeten die zu einer Sorte gehörenden Unterlagenklone ein Cluster, wobei Binova innerhalb der SO4 Klone zu finden war. Es wurden ‚unterlagssortenspezifische Banden’, ‚wiederholende Banden’ und ‚Einzelbanden’ gefunden.

Klonierung und funktionelle Charakterisierung von zwei Zelladhäsionsmolekülen aus den marinen Schwämmen Geodia cydonium und Suberites domuncula

ZusammenfassungAus dem Schwamm Geodia cydonium konnte die vollständige cDNA-Sequenz eines mutmaßlichen Bestandteiles des Aggregationsfaktors kloniert werden. Durch einen Northern-Blot konnte gezeigt werden, daß der gefundene Klon das vollständige Transkript repräsentiert. Das entsprechende Protein wurde in E. coli als Fusionsprotein rekombinant hergestellt. Mit einem Western-Blot-Experiment wurde der Nachweis geführt, daß es sich bei dem gefundenen Protein tatsächlich um einen Bestandteil des Aggregationsfaktors handelt. Der in diesem Western-Blot eingesetzte Antikörper wurde verwendet, um das Protein in histologischen Schnitten nachzuweisen. Das rekombinante Protein wurde in einem Aggregationsassay auf seine Funktionalität hin untersucht. Es stellte sich heraus, daß es einen Einfluß auf die Zellaggregation hat. Die Bindung des rekombinanten Aggregationsfaktors an das Lektin aus Geodia cydonium konnte gezeigt werden. Aus dem Schwamm Suberites domuncula wurde ein cDNA-Klon isoliert. Das durch diese cDNA kodierte Protein zeigt eine hohe Übereinstimmung mit einem in Vertebraten und in Limulus polyphemus vorkommendem Protein der extrazellulären Matrix, welches dort eine Rolle bei der Zellaggregation spielt. Die Vollständigkeit des Klons konnte anhand eines Northern-Blot gezeigt werden. Das Protein wurde in E. coli rekombinant hergestellt. Das rekombinante Protein führt in vitro zu einer verstärkten Aggregation von dissoziierten Schwammzellen.

Molekulare Untersuchung des Wolf-Hirschhorn-Syndroms

Das Wolf-Hirschhorn-Syndrom (WHS) ist ein komplexes und variables Fehlbildungs- Retardierungssyndrom, das durch Deletion in der distalen Chromosomenregion 4p16.3 hervorgerufen wird und dessen Ätiologie und Pathogenese bisher weitgehend unverstanden sind. Die Zielsetzung in der vorliegenden Arbeit bestand in der Identifizierung und vorläufigen Charakterisierung neuer Gene, die an der Entstehung des Syndroms beteiligt sein könnten. Die Wolf-Hirschhorn-Syndrom-kritische Region (WHSCR) konnte zu Beginn der vorliegenden Arbeit auf einen ca. 2 Mb großen Bereich zwischen den Markern D4S43 und D4S142 eingegrenzt werden. Für die Identifizierung neuer Gene wurden zunächst drei größere genomische Cosmid-/PAC-Contigs (I-III) im Bereich der Marker D4S114 bis D4S142 erstellt und mittels Exonamplifikation auf transkribierte Bereiche (Exons) untersucht. Es konnten insgesamt 67 putative 'Exons' isoliert werden, von denen einige bereits bekannten Genen (ZNF141, PDEB, MYL5, GAK, DAGK4 und FGFR3) entsprechen. Zwei dieser Gene konnten im Rahmen dieser Arbeit erstmals (DAGK4) bzw. genauer (GAK) in die distale Region 4p16.3 kartiert werden. Die restlichen Exons können aufgrund von Homologievergleichen und/oder EST-cDNA-Homologien vermutlich neuen Genen oder auch Pseudogenen (z. B. YWEE1hu) zugeordnet werden. Durch die im Verlaufe der vorliegenden Arbeit publizierte weitere Eingrenzung der WHSCR auf einen 165 Kb-großen Bereich proximal des FGFR3-Gens konzentrierten sich weitere Untersuchungen auf die detaillierte Analyse der WHSCR zwischen dem Marker D4S43 und FGFR3. Mit Hilfe von Exonamplifikation bzw. computergestützter Auswertung vorliegender Sequenzdaten aus diesem Bereich ('GRAIL', 'GENSCAN' und Homologievergleiche in den EST-Datenbanken des NCBI) konnten mehrere neue Gene identifiziert werden. In distaler-proximaler Reihenfolge handelt es sich dabei um die Gene LETM1, 51, 43, 45, 57 und POL4P. LETM1 kodiert für ein putatives Transmembran-Protein mit einem Leucin-Zipper- und zwei EF-Hand-Motiven und könnte aufgrund seiner möglichen Beteiligung an der Ca2+-Homeostase und/oder der Signal-transduktion zu Merkmalen des WHS (Krampfanfällen, mentale Retardierung und muskuläre Hypotonie) beitragen. Das Gen 51 entspricht einem in etwa zeitgleich durch Stec et al. (1998) und Chesi et al. (1998) als WHSC1 bzw. MMSET bezeichnetem Gen und wurde daher nicht weiter charakterisiert. Es wird genauso wie das Gen 43, das zeitgleich von Wright et al. (1999b) als WHSC2 beschrieben werden konnte und eine mögliche Rolle bei der Transkriptionselongation spielt, ubiquitär exprimiert. Das in der vorliegenden Arbeit identifizierte Gen 45 zeigt demgegenüber ein ausgesprochen spezifisches Expressionsmuster (in Nervenzellen des Gehirns sowie in Spermatiden). Dies stellt zusammen mit der strukturellen Ähnlichkeit des putativen Genprodukts zu Signalmolekülen einen interessanten Zusammenhang zu Merkmalen des WHS (beispielsweise Kryptorchismus, Uterusfehlbildungen oder auch neurologische Defekte) her. Demgegenüber handelt es sich bei dem Gen 57 möglicherweise um ein trunkiertes Pseudogen des eRFS-Gens auf Chromosom 6q24 (Wallrapp et al., 1998). Das POL4P-Gen schließlich stellt allein aufgrund seiner genomischen Lokalisation sowie seiner möglichen Funktion (als DNA-Polymerase-ähnliches Gen) kein gutes Kandidatengen für spezifische Merkmale des Syndroms dar und wurde daher nicht im Detail charakterisiert. Um die Beteiligung der Gene an der Ätiologie und Pathogenese des Syndroms zu verstehen, ist die Entwicklung eines Mausmodells (über das Einfügen gezielter Deletionen in das Mausgenom) geplant. Um dies zu ermöglichen, wurde in der vorliegenden Arbeit die Charakterisierung der orthologen Region bei der Maus vorgenommen. Zunächst wurden die orthologen Gene der Maus (Letm1, Whsc1, Gen 43 (Whsc2h), Gen 45 und Pol4p) identifiziert. Durch die Erstellung sowie die genaue Kartierung eines murinen genomischen P1/PAC-Klon-Contigs konnte gezeigt werden, daß die murinen Gene Fgfr3, Letm1, Whsc1, Gen 43 (Whsc2h), Gen 45 und Pol4p sowie einige weitere der überprüften EST-cDNA-Klone der Maus in einem durchgehenden Syntänieblock zwischen Mensch (POL4P bis FGFR3) und Maus (Mmu 5.20) enthalten sind, der in seiner genomischen Ausdehnung in etwa den Verhältnissen beim Menschen (zwischen POL4P und FGFR3) entspricht.

A single chain antibody against a viral RNA polymerase (TBSV-BS3-Statice)

Expression of antibodies in plant against essential viral proteins could provide an alternative approach to engineered viral resistance. Engineered single chain Fv antibodies scFV are particularly suitable for expression in plant because of their small size and the lack of assembly requirements. RNA-dependent RNA polymerases (RdRps) function as the catalytic subunit of viral replicases required for the replication of all positive strand RNA viruses. By using Phage technology we selected scFvs from a phage library using purified E.coli expressed TBSV(Tomato bushy stunt virus) replicase as antigen. The scFvs mediated-inhibition of RdRp activity was studied in vitro and in planta. In vitro experiments showed the inhibition of CNV(Cucumber necrosis virus) and TCV(Turnip crinkle virus) RdRp. Transient in planta assays based on agroinfiltration and an infectious clone of TBSV demonstrated the inhibition of the replication of TBSV(Tomato bushy stunt virus). Epitope mapping showed that the selected scFvs target the motif E of RdRp which is involved in template binding.Moreover T1 plants of transgenic lines of N. benthamiana expressing different scFvs either in the cytoplasm or the ER (endoplasmic reticulum) showed a high level of resistance against infection with TBSV and RCNMV(Red clover necrotic mosaic virus) upon inoculation with virus particles. This is the first report that scFvs against a RdRp of a plant viruses can inhibit viral replication in vivo. The resistance is even efficient against viruses belonging to different virus families.

Etablierung von Expressionsystemen für Gene der Indolalkaloid-Biosynthese unter besonderer Berücksichtigung von Cytochrom P450-Enzymen

Etablierung von Expressionsystemen für Gene der Indolalkaloid-Biosynthese unter besonderer Berücksichtigung von Cytochrom P450-Enzymen In der vorliegenden Arbeit wurden Enzyme aus der Arzneipflanze Rauvolfia serpentina bearbeitet. Es wurde versucht, das an der Biosynthese des Alkaloids Ajmalin beteiligte Cytochrom P450-Enzym Vinorin-Hydroxylase heterolog und funktionell zu exprimieren. Ein zunächst unvollständiger, unbekannter Cytochrom P450-Klon konnte komplettiert und eindeutig mittels heterologer Expression in sf9-Insektenzellen als Cinnamoyl-Hydroxylase identifiziert werden. Die Tauglichkeit des Insektenzellsystems für die Untersuchung der Vinorin-Hydroxylase ist auf Grund der deacetylierenden Wirkung der Insektenzellen auf das Substrat Vinorin nicht gegeben. Im Rahmen des Homology Cloning Projektes konnten mehrere Volllängenklone und diverse Teilsequenzen von neuen Cytochrom P450-Klonen ermittelt werden. Ausserdem wurde durch das unspezifische Binden eines degenerierten Primers ein zusätzlicher Klon gefunden, der der Gruppe der löslichen Reduktasen zugeordnet werden konnte. Diese putative Reduktase wurde auf die Aktivität von mehreren Schlüsselenzymen der Ajmalin-Biosynthese durch heterologe Expression in E.coli und anschliessende HPLC-gestützte Aktivitätstests ohne Erfolg geprüft. Bedingt durch die Untauglichkeit des Insektenzellsystems für die Identifizierung der Vinorin-Hydroxylase, wurde ein neuartiges Modul-gestütztes, pflanzliches Expressionsystem etabliert, um vorhandene P450-Volllängenklone auf Vinorin- Hydroxylaseaktivität testen zu können. Die Funktionalität des Systems konnte durch die heterologe Expression der Polyneuridinaldehyd Esterase bestätigt werden. Trotzdem war es bis jetzt nicht möglich, die Cinnamoyl-Hydroxylase als Kontrollenzym für das pflanzliche System oder aber die gesuchte Vinorin- Hydroxylase in aktiver Form zu exprimieren.

Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese

Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese Die Rezeptor-Tyrosinkinase ERBB2 ist in einer Vielzahl epithelialer Tumore, wie Mamma- und Ovarialkarzinomen, überexprimiert. Diese erhöhte Expression korreliert mit aggressivem Tumorwachstum, verstärkter Metastasierung und schlechter Prognose für den Patienten. Zur genaueren Untersuchung molekularer Mechanismen, die zur Tumorentstehung infolge der ERBB2-Überexpression führen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des Tet-Systems induzierbare MCF-7 Zelllinien generiert. Diese exprimieren bei Gabe von Doxyzyklin ERBB2 bzw. die zum humanen ERBB2 homologe und durch Punktmutation onkogen aktivierte Rattenvariante NeuT. Nachdem die stringente Regulierbarkeit durch Doxyzyklin für die untersuchten Zellklone gezeigt werden konnte, stellte sich bei der Charakterisierung der Zelllinien heraus, dass die Induktion von ERBB2 erstaunlicherweise nicht zur Proliferation der Zellen, sondern zum Wachstumsarrest führt. Bei der Untersuchung verschiedener Zellzyklusregulatoren konnte dieser Zellzyklusarrest dem CDK-Inhibitor P21 zugeordnet werden, dessen Expression durch ERBB2 induziert wird. In P21-Antisense-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass P21 eine Schlüsselrolle beim ERBB2-induzierten Zellzyklusarrest spielt. Neben der Induktion von P21 und der daraus resultierenden Wachstumsinhibition zeigten die Zellen starke morphologische Veränderungen und waren positiv beim Nachweis der Seneszenz-assoziierten -Galaktosidase. Erstmals konnte gezeigt werden, dass die Induktion des Onkogens ERBB2 nicht zur Proliferation, sondern zur Aktivierung eines verfrühten Seneszenz-Programms führt, welches der Zelle Schutz gegen die Onkogeneinwirkung bietet. Bei der Untersuchung verschiedener Signaltransduktionskaskaden mit Inhibitormolekülen konnte die Aktivierung dieses Seneszenz-Programms der Stress-aktivierten Proteinkinase P38 zugeordnet werden. Zur Identifizierung von Genen, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sind, wurde die differenzielle Genexpression eines NeuT-Klons nach 8- bzw. 48-stündiger Induktion mit Doxyzyklin in einem cDNA-Array untersucht. Dabei zeigte sich eine besonders starke Induktion von Integrin 5 und Integrin 1, die zusammen den Fibronektinrezeptor bilden. Der funktionale Nachweis des Rezeptors in einem Adhäsionsassay demonstrierte ein stark erhöhtes Adhäsionsverhalten ERBB2-überexprimierender Zellen an Fibronektin. Bei der Untersuchung von Mamma-, Ovarial- und Endometriumkarzinomen konnte die Expression von ERBB2 mit der von Integrin 5 korreliert werden. Diese Ergebnisse machen Integrin 5 zu einem potenziellen neuen Tumormarker und Therapieziel in ERBB2-überexprimierenden Tumoren. Ein weiteres interessantes Gen, das sich im Array durch ERBB2 überexprimiert zeigte, war die Matrix-Metalloproteinase MMP-9. In einem Zymografieassay konnte die erhöhte Gelatinaseaktivität von MMP-9 in Dox-induzierten Zellen nachgewiesen werden. Der Einsatz verschiedener Signaltransduktionsinhibitoren ergab, dass auch die ERBB2-induzierte Expression von MMP-9 über die Aktivierung von P38 läuft. Bei der Suche nach weiteren MMPs, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sein könnten, wurde MMP-13 untersucht. Erstmals konnte gezeigt werden, dass diese Matrix-Metalloproteinase von ERBB2 induziert wird. Dieser interessante Befund wurde auch in einem anderen Zellmodell in NIH3T3 Mausfibroblasten verifiziert. Durch ihre Matrix-degradierenden Eigenschaften sind MMPs potente „Werkzeuge“ für Tumorzellen und stellen ein wichtiges Ziel zur Unterbindung der Invasion und Metastasierung dieser Zellen dar. Neben den Zellkulturarbeiten wurden im Rahmen dieser Dissertation transgene Responder-Mäuse generiert, die NeuT unter Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors exprimieren. Von vier transgenen Gründerlinien zeigten zwei eine unerwünschte, basale NeuT-Expression, für die beiden anderen Linien konnte sowohl in MEF-Assays, als auch nach Kreuzung mit rtTA- bzw. tTA-Effektor-Mäusen eine Dox-abhängige Regulation des Transgens gezeigt werden. Die Tiere dieser Linien sollen in Zukunft mit Effektor-Mäusen gepaart werden, die den rtTA bzw. tTA spezifisch in für die ERBB2-Tumorgenese relevanten Geweben, wie Ovarial- oder Lungenepithelzellen, exprimieren. So können individuelle Tumormodelle für die verschiedenen epithelialen Tumore, bei denen die Überexpression von ERBB2 von Bedeutung ist, entwickelt und untersucht werden.

Funktionelle und morphologische Untersuchungen der Silikataufnahme und Nadelbildung im marinen Schwamm Suberites domuncula

Die für Metazoen einzigartige Fähigkeit, hochdifferenzierte Silikatstrukturen herzustellen und als Gerüstsubstanz zu verwenden, steht bei den Porifera in einem scheinbaren Gegensatz zu der niedrigen Konzentration an Silizium in dem die Schwämme umgebenden Medium. In der zweiten bedeutenden silikatpolymerisierenden Species, den einzelligen Kieselalgen (Diatomeen), konnte bereits ein Silikattransporter identifiziert werden, dessen Sequenzdaten jedoch aufgrund der phylogenetisch geringen Verwandtschaft der Demospongien mit den Diatomeen keine Verwendung finden konnte Im Zuge der Suche nach einem Silikat-Transportsystem im Schwamm Suberites domuncula wurde ein potentielles Kandidatengen mittels molekularbiologischer Techniken aus einer cDNA Bank des Instituts isoliert, vervollständigt und analysiert. Es zeigte sich, dass dieser Transporter durch seine Sequenzdaten der Familie der Bikarbonattransporter angehörte, und somit membranständig war. Seine Transportfunktion zeigte sich mittels spezifischer Inhibitoren hemmbar. Damit der Schwamm in der Lage ist, eine regulierbare und schnelle Anreicherung von Silikat durchführen zu können, lag eine Annahme einer Induzierbarkeit der Transportergene durch das Substrat Silikat nahe. Mittels Northern-Blot Analyse konnte in einem Primmorphensystem des Schwammes eine Hochregulation der Transkription der Transportergene festgestellt werden. Die Lokalisation der Exprimierung des Transporters innerhalb des Schwammgewebes konnte mittels In situ Hybridisierung untersucht werden und zeigte eine direkte Nähe zu den Polysilikatstrukturen des Schwammes. Um Hinweise auf eine Bifunktionalität des Transporters aufgrund der Ähnlichkeit von Carbonat und Silikat zu erhärten, wurden fluoreszenzmikroskopische Studien an isolierten Zellkulturen des Schwammes durchgeführt. Es kam zu einer intensive Reaktion der Zellen auf Silikat als Substrat. Dieser Effekt konnte nicht nur durch einen spezifischen Transportinhibitor (DIDS) gehemmt werden, sondern zeigt auch eine deutliche Temperaturabhängigkeit. Um den potentiellen Silikattransporter in Zusammenhang mit dem Gesamtmechanismus der Silikatnadelherstellung in Schwämmen zu bringen, wurden zusätzliche elektronenmikroskopische Studien angestellt. Hier konnte zunächst gezeigt werden, wie sich das die Polykondensation auslösende und dirigierende Proteinfilament des Schwammes bei der Nadelbildung entwickelt. Mittels einer darauf folgenden Immunogold-Markierung des Hauptaxialfilamentproteins des Schwammes in elektronenmikroskopischen Gewebepräparaten, konnte dessen Vorkommen nicht nur im Zentrum der Silikatnadel, sondern auch in den die Nadel umgebenden Strukturen nachgewiesen werden

Charakterisierung von T-Zell-Antworten gegen humane Nierenzellkarzinome sowie Identifizierung von HLA-G als tumorassoziiertes Antigen und Immunevasionsmechanismus des Nierenzellkarzinoms

Humane Nierenzellkarzinom-(NZK)-Zelllinien wurden etabliert, um sie zur Generierung von autologen zytotoxischen T-Zelllinien einzusetzen. Erst nach Modifikation mit dem kostimulierenden B7-1-Molekül wurden mit der NZK-Zelllinie MZ1257RC autologe, tumorspezifische T-Zelllinien generiert und charakterisiert. Die Aufklärung eines T-Zell-definierten TAA eines autologen, zytotoxischen T Zellklons wurde mittels Expressionsklonierung einer hergestellten cDNS-Expressionsbank begonnen. Nach in vitro-Sensibilisierung von peripheren Blutmonozyten mit der autologen NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde die HLA-Klasse I-restringierte T Zelllinie XIE6 generiert, die die autologe und verschiedene allogene NZK- sowie Zervixkarzinom-Zelllinien, jedoch nicht autologe Nierenzellen lysiert. Die T Zellen exprimieren TZR Vβ13.6-Ketten und sezernieren GM-CSF und IL-10 nach Antigenstimulation. Jedoch ist die NZK-Zelllinie MZ2733RC wenig sensitiv gegenüber autologen und allogenen Effektorzellen. Erst die Blockade ihrer HLA Klasse I-Moleküle auf der Zelloberfläche erhöht ihre Sensitivität gegenüber allogenen lymphokin-aktivierten Killer-Zellen. Verantwortlich dafür können nicht-klassische HLA Klasse Ib-Moleküle, insbesondere HLA-G sein, dessen Transkripte in der RNS der NZK-Zellen, jedoch nicht in Nierenzellen detektiert wurden. In einer detaillierten Studie wurden HLA-G-Transkripte in NZK-Zelllinien (58%), in NZK-Biopsien (80%), und nur in wenigen Nierenepithelbiopsien (10%) nachgewiesen. In der NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde eine konstitutive HLA-G1-Proteinexpression beobachtet, die durch eine IFN-γ-Behandlung induzierbar ist.

Reverse genetic studies of Benyvirus - Polymyxa betae molecular interaction: Role of the RNA4-encoded protein in virus transmission

Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV), the leading infectious agent that affects sugar beet, is included within viruses transmitted through the soil from plasmodiophorid as Polymyxa betae. BNYVV is the causal agent of Rhizomania, which induces abnormal rootlet proliferation and is widespread in the sugar beet growing areas in Europe, Asia and America; for review see (Peltier et al., 2008). In this latter continent, Beet soil-borne mosaic virus (BSBMV) has been identified (Lee et al., 2001) and belongs to the benyvirus genus together with BNYVV, both vectored by P. betae. BSBMV is widely distributed only in the United States and it has not been reported yet in others countries. It was first identified in Texas as a sugar beet virus morphologically similar but serologically distinct to BNYVV. Subsequent sequence analysis of BSBMV RNAs evidenced similar genomic organization to that of BNYVV but sufficient molecular differences to distinct BSBMV and BNYVV in two different species (Rush et al., 2003). Benyviruses field isolates usually consist of four RNA species but some BNYVV isolates contain a fifth RNA. RNAs -1 contains a single long ORF encoding polypeptide that shares amino acid homology with known viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRp) and helicases. RNAs -2 contains six ORFs: capsid protein (CP), one readthrough protein, triple gene block proteins (TGB) that are required for cell-to-cell virus movement and the sixth 14 kDa ORF is a post-translation gene silencing suppressor. RNAs -3 is involved on disease symptoms and is essential for virus systemic movement. BSBMV RNA-3 can be trans-replicated, trans-encapsidated by the BNYVV helper strain (RNA-1 and -2) (Ratti et al., 2009). BNYVV RNA-4 encoded one 31 kDa protein and is essential for vector interactions and virus transmission by P. betae (Rahim et al., 2007). BNYVV RNA-5 encoded 26 kDa protein that improve virus infections and accumulation in the hosts. We are interest on BSBMV effect on Rhizomania studies using powerful tools as full-length infectious cDNA clones. B-type full-length infectious cDNA clones are available (Quillet et al., 1989) as well as A/P-type RNA-3, -4 and -5 from BNYVV (unpublished). A-type BNYVV full-length clones are also available, but RNA-1 cDNA clone still need to be modified. During the PhD program, we start production of BSBMV full-length cDNA clones and we investigate molecular interactions between plant and Benyviruses exploiting biological, epidemiological and molecular similarities/divergences between BSBMV and BNYVV. During my PhD researchrs we obtained full length infectious cDNA clones of BSBMV RNA-1 and -2 and we demonstrate that they transcripts are replicated and packaged in planta and able to substitute BNYVV RNA-1 or RNA-2 in a chimeric viral progeny (BSBMV RNA-1 + BNYVV RNA-2 or BNYVV RNA-1 + BSBMV RNA-2). During BSBMV full-length cDNA clones production, unexpected 1,730 nts long form of BSBMV RNA-4 has been detected from sugar beet roots grown on BSBMV infected soil. Sequence analysis of the new BSBMV RNA-4 form revealed high identity (~100%) with published version of BSBMV RNA-4 sequence (NC_003508) between nucleotides 1-608 and 1,138-1,730, however the new form shows 528 additionally nucleotides between positions 608-1,138 (FJ424610). Two putative ORFs has been identified, the first one (nucleotides 383 to 1,234), encode a protein with predicted mass of 32 kDa (p32) and the second one (nucleotides 885 to 1,244) express an expected product of 13 kDa (p13). As for BSBMV RNA-3 (Ratti et al., 2009), full-length BSBMV RNA-4 cDNA clone permitted to obtain infectious transcripts that BNYVV viral machinery (Stras12) is able to replicate and to encapsidate in planta. Moreover, we demonstrated that BSBMV RNA-4 can substitute BNYVV RNA-4 for an efficient transmission through the vector P. betae in Beta vulgaris plants, demonstrating a very high correlation between BNYVV and BSBMV. At the same time, using BNYVV helper strain, we studied BSBMV RNA-4’s protein expression in planta. We associated a local necrotic lesions phenotype to the p32 protein expression onto mechanically inoculated C. quinoa. Flag or GFP-tagged sequences of p32 and p13 have been expressed in viral context, using Rep3 replicons, based on BNYVV RNA-3. Western blot analyses of local lesions contents, using FLAG-specific antibody, revealed a high molecular weight protein, which suggest either a strong interaction of BSBMV RNA4’s protein with host protein(s) or post translational modifications. GFP-fusion sequences permitted the subcellular localization of BSBMV RNA4’s proteins. Moreover we demonstrated the absence of self-activation domains on p32 by yeast two hybrid system approaches. We also confirmed that p32 protein is essential for virus transmission by P. betae using BNYVV helper strain and BNYVV RNA-3 and we investigated its role by the use of different deleted forms of p32 protein. Serial mechanical inoculation of wild-type BSBMV on C. quinoa plants were performed every 7 days. Deleted form of BSBMV RNA-4 (1298 bp) appeared after 14 passages and its sequence analysis shows deletion of 433 nucleotides between positions 611 and 1044 of RNA-4 new form. We demonstrated that this deleted form can’t support transmission by P. betae using BNYVV helper strain and BNYVV RNA-3, moreover we confirmed our hypothesis that BSBMV RNA-4 described by Lee et al. (2001) is a deleted form. Interesting after 21 passages we identifed one chimeric form of BSBMV RNA-4 and BSBMV RNA-3 (1146 bp). Two putative ORFs has been identified on its sequence, the first one (nucleotides 383 to 562), encode a protein with predicted mass of 7 kDa (p7), corresponding to the N-terminal of p32 protein encoded by BSBMV RNA-4; the second one (nucleotides 562 to 789) express an expected product of 9 kDa (p9) corresponding to the C-terminal of p29 encoded by BSBMV RNA-3. Results obtained by our research in this topic opened new research lines that our laboratories will develop in a closely future. In particular BSBMV p32 and its mutated forms will be used to identify factors, as host or vector protein(s), involved in the virus transmission through P. betae. The new results could allow selection or production of sugar beet plants able to prevent virus transmission then able to reduce viral inoculum in the soil.

Recombinant expression of molluscan hemocyanin (KLH) substructures in a prokaryotic system: E. coli

The recombinant expression of 19 different substructures of KLH in the prokaryotic sys-tem E. coli has been successfully achieved: each one of the eight single FUs a to h of both isoforms, KLH1 and KLH2, two substructures consisting of two consecutive FUs (KLH1-bc and KLH1-gh) as well as a cDNA encompassing KLH1-abc. All recombinant proteins, fused to an N-terminal 6xHis tag, have successfully been detected by immuno precipitation using monoclonal α-His-antibodies and polyclonal α-KLH1- and α-KLH2-antibodies. One exception remained: SP-KLH2-a, which was not detected by the α-His-antibodies. This allows speculations as to whether the coexpressed signal peptide can lead, at one hand, to the secretion of the recombinant protein, and on the other to the simultaneous cut-off of the leader peptide, which results in the splitting off of even more N-terminal 6xHis tag, leading to failed recognition by the appropriate antibodies. The comparison of native KLH with recombinantly expressed prokaryotic (E. coli) and eukaryotic (Sf9 insect cells) KLH was done using FU-1h. The weak detection by the polyclonal α-KLH1-antibodies of both recombinantly expressed proteins showed that the native protein was the best recognized. For the prokaryotic one, both the denaturation applied for solubilisation of the bacterial inclusion bodies and the inability of bacterial cells to add N-linked glycosylation, are the reason for the poor hybridization. In contrast, KLH1-h expressed in eukaryotic insect cells is likely to be glycosylated. The incubation with the α-KLH1-antibodies resulting in the same weak detection, however, revealed that the linked carbohydrate side chains are not those expected. The establishment of SOE-PCR, together with further improvement, has enabled the generation of a clone encompassing the complete subunit KLH1-abcdefgh. The se-quence analysis compared to the original KLH1 sequence showed, however, that the resulting recombinant protein is defective in two histidines, required for the copper bind-ing sites in FU-1b and FU-1d and in three disulfide bridges (FU-1a, FU-1b and FU 1g). This is due to polymerase-related nucleotide exchanges, resulting in a changed amino acid sequence. Nevertheless, all eight potential N-glycosylation sites are present, leading to the speculation that the recombinant protein can in theory be fully glycosylated, which is the most important aspect for the clinical applicability of recombinant KLH as an im-munotherapeutic agent. The improvement of this method elaborated during the present work indicates bright prospects for the future generation of a correct cDNA sequence encoding for the complete KLH2 subunit.

A novel specific genetic translocation in epithelioid hemangioendotelioma, showing a fusion of the WWTR1 and CAMTA1 genes, supports the monoclonality of multifocal epithelioid hemangioendotelioma.

Like other vascular tumors, epithelioid hemangioendothelioma (EHE) is multifocal in approximately 50% of cases, and it is unclear whether the separate lesions represent multifocal disease or metastases. We hypothesized that the identification of an identical WWTR1-CAMTA1 rearrangement in different EHEs from the same patient supports the monoclonal origin of EHE. To test our hypothesis, we undertook a molecular analysis of two multicentric EHEs of the liver, including separate tumor samples from each patient. Matherial and Methods: We retrieved two cases of EHE with available tissue for molecular analysis. In both cases, fluorescence in situ hybridization (FISH) was performed to identify the presence of the WWTR1-CAMTA1 rearrangement to confirm the histologic diagnosis of EHE, as previously described. The reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) products were analyzed by electrophoresis and the RT-PCR–amplified products were sequenced using the Sanger method. Results: FISH analysis revealed signal abnormalities in both WWTR1 and CAMTA1. Combined results confirmed the presence of the t(1;3)(1p36.23;3q25.1) translocation in both cases of EHE. Using RT-PCR analysis, we found that the size of the rearranged bands was identical in the different tumors from each patient. The sequence of the fusion gene confirmed a different WWTR1-CAMTA1 rearrangement in each patient, but an identical WWTR1-CAMTA1 rearrangement in the different lesions from each patient. Discussion: Because of its generally indolent clinical course, EHE is commonly classified as a multifocal, rather than metastatic, disease. In this study, we examined two cases of multifocal liver EHE and found an identical WWTR1-CAMTA1 rearrangement in each lesion from the same patient, but not between the two patients. These findings suggest that multifocal EHE arises from metastasis of the same neoplastic clone rather than from the simultaneous formation of multiple neoplastic clones, which supports the monoclonal origin of multifocal EHE.

Phytoremediation by poplar: polyphenols polyamines and oxidative damage in the response to heavy metals in in vitro and in hydroponic cultures.

Poplar is considered a good candidate for phytoremediation, but its tolerance to heavy metals has not been fully investigated yet. In the present work, two different culture systems (in vitro and aeroponic/hydroponic) and two different stress tolerant clones of Populus alba (AL22 and Villafranca) were investigated for their total polyphenol and flavonoid content, individual phenolic compounds, polyamine, lipid peroxidation and hydrogen peroxide levels in response to Cu. In AL22 poplar plants cultured in vitro in the presence or absence of 50 μM Cu, total leaves polyphenol and flavonoid content was higher in treated samples than in controls but unaltered in the roots. Equally the same clone, grown under aeroponic conditions and hydroponically treated for 72 h with 100 μM Cu, displayed increased amount of polyphenols and flavonoids in the leaves, in particular chlorogenic acid and quercetin, and no differences in the roots. In exudates from treated roots total polyphenols and flavonoids, in particular catechin and epicatechin, were more abundant than in controls. Polyamine levels show an increase in conjugated putrescine (Put) and spermidine (Spd) was found. In the Villafranca clone, treated with 100 μM Cu for 6, 24 and 72 h, the pattern of polyphenol and flavonoid accumulation was the same as in AL22; in Cu-treated roots these compounds decreased compared with controls while they increased in root exudates. Free polyamine levels rose at 24 and 72 h while only conjugated Put increased at 24 h. Cu-treated Villafranca plants exhibited a higher malondialdehyde production than controls indicative of membrane lipid peroxidation and, therefore, oxidative stress. An in vitro experiment was carried to investigate the antioxidant effect of the polyamine spermidine (Spd). Exogenous Spd, supplied together with 100 μM Cu, reduced the accumulation of polyphenols and flavonoids, MDA and hydrogen peroxide induced by Cu.

Identifizierung von T-Zell-erkannten Nierenzellkarzinom-Antigenen

Eine Voraussetzung für die Entwicklung neuer immunmodulatorischer Therapieverfahren ist die Kenntnis immunogener Tumorantigene, die von tumorreaktiven T-Zellen erkannt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden tumorreaktive CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTL, cytotoxic T-lymphocytes) aus dem Blut eines HLA (human leukocyte antigen)-kompatiblen Fremdspenders generiert. Methodisch wurden hierzu CD8-selektionierte periphere Blutlymphozyten repetitiv mit der klarzelligen Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC (RCC, renal cell carcinoma) in einer allogenen gemischten Lymphozyten-Tumorzell Kultur (MLTC, mixed lymphocyte tumor cell culture) stimuliert. Aus den Responderlymphozyten wurden mit Hilfe des Grenzverdünnungsverfahrens klonale zytotoxische T-Zellen generiert und expandiert. Die CTL-Klone wurden anschließend phänotypisch mittels Durchflußzytometrie sowie funktionell mittels HLA-Antikörper-Blockadeexperimenten und Kreuzreaktivitätstests detailliert charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß aus dem Blut eines allogenen gesunden Spenders CD8+ T-Zellen isoliert werden können, welche Reaktivität gegen Nierenzellkarzinome (NZK) aufweisen und über verschiedene HLA-Klasse-I-Allele restringiert sind. Die von den einzelnen CTL-Klonen erkannten Zielstrukturen zeigten entweder ubiquitäre (z.B. HLA-Cw*0704-reaktiver CTL-Klon E77) oder eine tumorspezifische (z.B. HLA-B*0702-restringierter CTL-Klon A4) Gewebeexpression. Zur Identifizierung der natürlich prozessierten Peptidliganden wurden die HLA-B/C-Allele unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers B123.2 aus einem zuvor hergestellten Detergenslysat der Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC immunchromatographisch aufgereinigt. Aus den so isolierten HLA-Peptid-Komplexen wurden die tumorassoziierten Peptidliganden nach Säureeluation und Filtration abgespalten und über eine „reverse phase“-HPLC (high performance liquid chromatography) fraktioniert. Die Überprüfung der einzelnen HPLC-Fraktionen auf Bioaktivität erfolgte mit den korrespondierenden CTL-Klonen in 51Cr-Zytotoxizitätstests. Dabei wurde eine HPLC-Fraktion identifiziert, die die lytische Funktion des HLA-B*0702-restringierten CTL-Klons A4 auslösen konnte. Die bioaktive HPLC-Fraktion wurde dazu durch eine zweite (second dimension) Kapillar-Flüssigkeitschromatographie (Cap-LC, capillar liquid chromatography) in Subfraktionen geringerer Komplexität aufgetrennt und die darin enthaltenen Peptidepitope durch das MALDI-TOF/TOF (matrix assisted laser desorption/ionization- time of flight/time of flight)-Analyseverfahren sequenziert. Innerhalb dieser HPLC-Fraktion wurden eine Vielzahl von HLA-B/C-assoziierten Peptidliganden erfolgreich sequenziert, was die Effektivität dieser Verfahrenstechnik zur Identifizierung natürlich prozessierter HLA-Klasse-I-bindender Peptide unter Beweis stellt. Leider war es mit dieser Methode bisher nicht möglich, das von CTL-Klon A4 detektierte Peptidepitop zu sequenzieren. Dies liegt möglicherweise in der unzureichenden Konzentration des Peptidepitops in der bioaktiven HPLC-Fraktion begründet. In Folgearbeiten soll nun mit erhöhter Probenmenge beziehungsweise verbesserter Analytik der erneute Versuch unternommen werden, das Zielantigen des CTL-Klons A4 zu identifizieren. Die Kenntnis von Antigenen, die tumorspezifisch exprimiert und von CD8+ CTL aus gesunden Spendern erkannt werden, eröffnet neue therapeutische Möglichkeiten, das spezifische Immunsystem des Stammzellspenders nach allogener Blutstammzelltransplantation gezielt zur Steigerung von Tumorabstoßungsreaktionen (z.B. durch Vakzinierung oder adoptivem T-Zelltransfer) zu nutzen.

Respiratory chain complex I dysfunction in tumorigenesis

Diseases due to mutations in mitochondrial DNA probably represent the most common form of metabolic disorders, including cancer, as highlighted in the last years. Approximately 300 mtDNA alterations have been identified as the genetic cause of mitochondrial diseases and one-third of these alterations are located in the coding genes for OXPHOS proteins. Despite progress in identification of their molecular mechanisms, little has been done with regard to the therapy. Recently, a particular gene therapy approach, namely allotopic expression, has been proposed and optimized, although the results obtained are rather controversial. In fact, this approach consists in synthesis of a wild-type version of mutated OXPHOS protein in the cytosolic compartment and in its import into mitochondria, but the available evidence is based only on the partial phenotype rescue and not on the demonstration of effective incorporation of the functional protein into respiratory complexes. In the present study, we took advantage of a previously analyzed cell model bearing the m.3571insC mutation in MTND1 gene for the ND1 subunit of respiratory chain complex I. This frame-shift mutation induces in fact translation of a truncated ND1 protein then degraded, causing complex I disassembly, and for this reason not in competition with that allotopically expressed. We show here that allotopic ND1 protein is correctly imported into mitochondria and incorporated in complex I, promoting its proper assembly and rescue of its function. This result allowed us to further confirm what we have previously demonstrated about the role of complex I in tumorigenesis process. Injection of the allotopic clone in nude mice showed indeed that the rescue of complex I assembly and function increases tumor growth, inducing stabilization of HIF1α, the master regulator of tumoral progression, and consequently its downstream gene expression activation.