Differential vulnerability of neurochemically identified subpopulations of retinal neurons in a monkey model of glaucoma.

The vulnerability of subpopulations of retinal neurons delineated by their content of cytoskeletal or calcium-binding proteins was evaluated in the retinas of cynomolgus monkeys in which glaucoma was produced with an argon laser. We quantitatively compared the number of neurons containing either neurofilament (NF) protein, parvalbumin, calbindin or calretinin immunoreactivity in central and peripheral portions of the nasal and temporal quadrants of the retina from glaucomatous and fellow non-glaucomatous eyes. There was no significant difference between the proportion of amacrine, horizontal and bipolar cells labeled with antibodies to the calcium-binding proteins comparing the two eyes. NF triplet immunoreactivity was present in a subpopulation of retinal ganglion cells, many of which, but not all, likely correspond to large ganglion cells that subserve the magnocellular visual pathway. Loss of NF protein-containing retinal ganglion cells was widespread throughout the central (59-77% loss) and peripheral (96-97%) nasal and temporal quadrants and was associated with the loss of NF-immunoreactive optic nerve fibers in the glaucomatous eyes. Comparison of counts of NF-immunoreactive neurons with total cell loss evaluated by Nissl staining indicated that NF protein-immunoreactive cells represent a large proportion of the cells that degenerate in the glaucomatous eyes, particularly in the peripheral regions of the retina. Such data may be useful in determining the cellular basis for sensitivity to this pathologic process and may also be helpful in the design of diagnostic tests that may be sensitive to the loss of the subset of NF-immunoreactive ganglion cells.

Sensitization of endothelial cells to TNFα-induced death

RESUME L'angiogénèse tumorale est un processus essentiel au développement des tumeurs. Les intégrines, molécules d'adhésions transmembranaires, sont d'importants effecteurs de l'angiogenèse. En permettant l'adhésion à la matrice extra-cellulaire, les intégrines transmettant des signaux de survie, de migration, et de prolifération. Le facteur de nécrose tumorale α (TNFα) est utilisé pour le traitement régional de cancers chez l'homme. II agit en détruisant sélectivement les vaisseaux angiogéniques. Cependant, son administration systémique chez l'homme est limitée par les réactions de vaso-dilatation sévères qu'il provoque. Le but de mon travail fut de rechercher des conditions permettant la sensibilisation des cellules endothéliales au TNFα et qui pourraient être applicables en clinique, ceci afin d'accroître l'efficacité de cette molécule. Nous avons testé la possibilité d'interférer avec les signaux de survie provenant des intégrines. Pour cela, des cellules endothéliales furent cultivées dans des conditions d'adhésion ou en suspension, ou alors exposées dans des conditions d'adhésion au zoledronate (biphosphonate contenant du nitrogène). Dans ces conditions, les effets du TNFα sur les cellules endothéliales furent étudiés, en particulier l'induction de la mort cellulaire. Dans ce travail, nous montrons que le zoledronate sensibilise les cellules endothéliales à la nécrose induite par TNFα. Cet effet s'accompagne de l'inhibition de la phosphorylation de FAK, PKB, et JNK, ainsi que de l'inhibition de la prénylation des protéines. En revanche, l'activation de NF-kB et p38 n'est pas perturbée. La restoration de la prénylation des protéines empêche la mort des HUVEC traitées par zoledronate et TNFα, et rétablit la phosphorylation de FAK, PKB, et JNK. Des essais d'angiogénèse in vivo montrent que le zoledronate inhibe l'angiogénèse induite par FGF-2. Le zoledronate encapsulé dans des liposomes permet de ralentir la croissance tumorale et synergise avec le TNFα en l'inhibant. L'inihibtion de la prénylation des protéines est un des mécanismes de sensibilisation du zoledronate au TNFα. In vivo, la synergie de leur association sur la croissance tumorale est efficace. Ces résultats encouragent la poursuite de l'étude des effets de ces deux drogues sur la croissance tumorale. SUMMARY The formation of tumor-associated vessels is essential for tumor progression. Cell adhesion molecules of the integrin family are important mediators of angiogenesis, by providing adhesive signals necessary for endothelial cell migration, proliferation and survival. Anti-angiogenic therapies are currently considered as highly promising in the treatment of human cancer. Tumor Necrosis Factor α (TNFα) is used for the regional treatment of human cancer, whose mechanisms of action involved selective disruption of angiogenic tumor vessels. Systemic administration of TNFα in humans, however, induces a severe inflammatory condition that prevents its use far the treatments of tumors localized outside of limbs. The aim of my work was to find strategies to sensitize angiogenic endothelial cells to TNFα-induced death, which could be potentially translated into clinical setting to improve the therapeutic efficacy of TNFα. We specifically tested the hypothesis whether interference with integrin-mediated adhesion and signaling may sensitize endothelial cells to TNFα-induced death. To test this hypothesis we cultured endothelial cells (EC) under conditions of cell-matrix or cell-cell adhesion or exposed matrix-adherent EC to the nitrogen-containing bisphosphonate zoledronate, and characterized the effect on TNFα-mediated signaling events and cell death. We show that zoledronate sensitizes HUVEC to TNFα-induced necrosis-like programmed cell death. This effect was associated with suppression of sustained phosphorylation of PKB and JNK and decreased protein prenylation, whereas TNFα-induced activation of NF-kB and p38 were not inhibited. Restoration of protein prenylation rescued HUVEC from zoledronate and TNFα-induced death, and restored FAK, PKB and JNK phosphorylation. By using in vivo angiogenesis assay we showed that zoledronate suppressed FGF-2-induced angiogenesis. Liposome-encapulated zoledronate partially inhibited tumor growth and synergized with TNFα to fully suppress tumor growth. Taken together, this work has identified protein prenylation as a mechanisms by which zoledronate sensitizes endothelial cells to TNFα-induced death in vitro and provides initial evidence that zoledronate synergizes with TNFα in vivo resulting in improved anti-tumor activity. These results warrant further study of the anti-tumor effects of zoledronate and TNFα and should be further studies in view of their clinical relevance.

Expertises croisées dans la dégénérescence maculaire liée à l'âge. Focus sur la physiopathologie, l'angiogenèse, les données pharmacologiques et cliniques [Review and expert opinion in age related macular degeneration. Focus on the pathophysiology, angiogenesis and pharmacological and clinical data].

Age related macular degeneration (AMD) is a pathological aging of the macula, brought about by the interaction of genetic and environmental factors. It induces geographic atrophy of the retina and/or choroidal neovascularization. In the latter, abnormal vessels develop from the choriocapillaris, with the involvement of VEGF (vascular endothelial growth factor). The VEGF family includes several factors, including VEGF-A, B, C, D, F and PlGF (placental growth factor). Their biological properties and their affinities to the VEGFR1, VEGFR2 and VEGFR3 receptors found on endothelial cells differ. Exudative AMD involves mainly VEGF-A and VEGF-R2. Anti-VEGF agents used in ophthalmology (ranibizumab, bevacizumab and aflibercept) are designed to primarily target this pathway. In vitro, all have sufficient affinity to their ligands. Their therapeutic efficacy must therefore be judged based on clinical criteria. In clinical practice, the minimum number of injections required for a satisfactory result appears to be comparable with all the three. The few available studies on therapeutic substitutions of anti-VEGF compounds suggest that some patients may benefit from substituting the anti-VEGF in cases of an unsatisfactory response to an initial molecule. Although local side effects, including increased risk of geographic atrophy, and systemic effects, including vascular accidents, have been suggested, these risks remain low, specially compared to the benefits of the treatment. Differences in safety between anti-VEGF are theoretically possible but unproven.

Crescimento e acúmulo de crômio em alface cultivada em dois latossolos tratados com CrCl3 e resíduos de curtume

Resíduos sólidos de curtume e CrCl3 foram aplicados em dois solos, Latossolo Roxo eutrófico (LRe) unidade Ribeirão Preto e Latossolo Vermelho-Amarelo (LVA) unidade Laranja Azeda, que se diferenciaram, dentre outros atributos, pelo teor de manganês facilmente redutível. Os resíduos utilizados foram lodo do efluente de caleiro com concentração 0,06 g kg-1 de crômio (LCL) e um lodo do decantador primário (LCR), contendo 17,4 g kg-1 de crômio, ambos na matéria seca, aplicados em doses correspondentes a 10, 20 e 30 Mg ha-1 e 19, 38 e 57 Mg ha-1 (base seca), respectivamente, de acordo com o teor de nitrogênio total de cada um. O CrCl3 foi aplicado nas doses de 330, 660 e 990 kg ha-1 de Cr, equivalentes às doses do metal aplicadas na forma de lodo (LCR). Realizou-se o experimento em vasos alocados em casa de vegetação (blocos ao acaso), que foram monitorados quanto à formação de Cr6+, aos 1, 6, 14, 28, 54 e 86 dias da instalação. Após o 56° dia de incubação, foi transplantada uma muda de alface (Lactuca sativa L.) para cada vaso, cultivada por um período de trinta dias. A oxidação do Cr3+ a Cr6+ foi verificada apenas para o LRe nos tratamentos que receberam doses crescentes de CrCl3. A formação de Cr6+ teve máximo entre 0,72 e 1,16% do Cr3+ aplicado, após um dia de incubação, decrescendo com o tempo, não sendo detectada a sua presença, para nenhuma das doses, após o 54° dia. A aplicação dos resíduos elevou a condutividade elétrica do extrato de saturação (2:1) de 1,40 a 5,07 Ds m-1 e a RAS de 3,05 a 14,12, afetando o desenvolvimento da alface e causando a morte das plantas nas doses mais altas, sendo tais efeitos mais pronunciados no LVA. A concentração de crômio na parte aérea das plantas aumentou, nem sempre de forma proporcional, com o aumento das doses aplicadas na forma de lodo ou sal, com efeito mais acentuado para o LVA do que para o LRe. A aplicação de resíduos de curtume no experimento, para ambos os solos, mostrou-se mais limitante pelo seu conteúdo de sais do que pela presença de crômio.

Frações de fósforo e atividade da fosfatase ácida em plantas de feijoeiro cultivadas em solos de várzea

Foi realizado um experimento em casa de vegetação do Departamento de Ciência do Solo da Universidade Federal de Lavras, com o objetivo de verificar a influência dos atributos de quatro solos de várzea sobre a distribuição de algumas frações de fósforo nas folhas de feijoeiro, determinar suas respectivas concentrações críticas e a relação dessas frações com a atividade da fosfatase ácida foliar e a relação entre a atividade da fosfatase ácida determinada "In vitro" e "in vivo". O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4 x 5 x 2, com quatro repetições, sendo quatro solos [Glei Húmico (GH), Orgânico (O), Aluvial (A) e Glei Pouco Húmico (GP)], cinco doses de P (75, 150, 300, 500 e 800 mg dm-3 de P) e dois níveis de calagem (sem e com). Cada parcela foi constituída por um vaso com três dm³, onde foram cultivadas três plantas de feijoeiro. Uma das plantas foi colhida no florescimento, determinando-se, nas folhas, as concentrações de P total (Pt), P total solúvel em ácido (Pts), P orgânico (Po) e P inorgânico solúvel em ácido (Pi). Nas demais plantas, colhidas no final do ciclo, foi avaliada a produção de grãos. Os níveis críticos das frações de P no feijoeiro cultivado nos solos GH, O, A e GP, sem calagem, foram, respectivamente: Pt = 2,3, 2,2, 2,0, e 1,3 mg g-1; Pts = 110, 67, 78 e 63; Po = 32, 19, 20 e 21 e Pi = 77, 47, 58 e 43 µg g-1. Com calagem, os níveis críticos respectivos foram: Pt = 2,8, 3,0, 3,5 e 4,2 mg g-1; Pts = 105, 96, 130 e 154; Po = 47, 38, 42 e 52 e Pi = 59, 58, 88 e 103 µg g-1. A atividade da fosfatase ácida não foi uma boa característica de diagnose nutricional de fósforo em condições de severa deficiência desse elemento.

Crescimento radicular de espécies utilizadas como cobertura decorrente da compactação do solo

O experimento foi realizado em vasos com terra proveniente de um Latossolo Vermelho-Escuro textura franco-arenosa, com o objetivo de avaliar o efeito da compactação subsuperficial do solo no crescimento radicular de seis espécies utilizadas para cobertura em sistemas de semeadura direta (aveia preta, guandu, milheto, mucuna preta, sorgo granífero e tremoço azul). Os tratamentos foram constituídos por três densidades do solo: 1,12, 1,36 e 1,60 Mg m-3, aplicadas a 15 cm de profundidade. As espécies foram cultivadas durante 37 a 39 dias, quando então foram colhidas, avaliando-se a produção de matéria seca, comprimento e diâmetro das raízes em cada camada do vaso, bem como a matéria seca da parte aérea das plantas. Os estados de compactação impostos em subsuperfície não impediram o crescimento de raízes de aveia preta, guandu, milheto, mucuna preta, sorgo e tremoço azul, indicando que, em solo arenoso, a densidade crítica para essas espécies é superior a 1,6 Mg m-3 (correspondente à resistência à penetração de 1,22 MPa). O milheto apresentou-se como a espécie mais indicada para cobertura, por suas características de produção de matéria seca e crescimento radicular.

Subconjunctival Injection of XG-102, a c-Jun N-Terminal Kinase Inhibitor Peptide, in the Treatment of Endotoxin-Induced Uveitis in Rats.

Abstract Purpose: XG-102, a TAT-coupled dextrogyre peptide inhibiting the c-Jun N-terminal kinase, was shown efficient in the treatment of experimental uveitis. Preclinical studies are now performed to determine optimal XG-102 dose and route of administration in endotoxin-induced uveitis (EIU) in rats with the purpose of clinical study design. METHODS: EIU was induced in Lewis rats by lipopolysaccharides (LPS) injection. XG-102 was administered at the time of LPS challenge by intravenous (IV; 3.2, 35 or 355 μg/injection), intravitreal (IVT; 0.08, 0.2 or 2.2 μg/eye), or subconjunctival (SCJ; 0.2, 1.8 or 22 μg/eye) routes. Controls received either the vehicle (saline) or dexamethasone phosphate injections. Efficacy was assessed by clinical scoring, infiltrating cells count, and expression of inflammatory mediators [inducible nitric oxide synthase (iNOS), cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1 (CINC-1)]. The effect of XG-102 on phosphorylation of c-Jun was evaluated by Western blot. RESULTS: XG-102 demonstrated a dose-dependent anti-inflammatory effect in EIU after IV and SCJ administrations. Respective doses of 35 and 1.8 μg were efficient as compared with the vehicle-injected controls, but only the highest doses, respectively 355 and 22 μg, were as efficient as dexamethasone phosphate. After IVT injections, the anti-inflammatory effect of XG-102 was clinically evaluated similar to the corticoid's effect with all the tested doses. Regardless of the administration route, the lowest efficient doses of XG-102 significantly decreased the ration of phospho c-Jun/total c-Jun, reduced cells infiltration in the treated eyes, and significantly downregulated iNOS and CINC-1 expression in the retina. CONCLUSION: These results confirm that XG-102 peptide has potential for treating intraocular inflammation. SCJ injection appears as a good compromise to provide a therapeutic effect while limiting side effects.

Influência da compactação do solo em subsuperfície sobre o crescimento aéreo e radicular de plantas de adubação verde de inverno

A compactação do solo é um problema comum nas lavouras e que influi tanto no crescimento e na produtividade das culturas, como na conservação do solo e da água. A fim de estudar esse problema, cinco espécies de plantas de adubação verde de inverno (ervilhaca, nabo forrageiro, tremoço branco, aveia preta e aveia branca) foram cultivadas em quatro perfis de solo com crescentes níveis de compactação em subsuperfície (Ds: 1,31, 1,43, 1,58 e 1,70 Mg m-3). O experimento foi realizado em vaso e sob condição de casa de vegetação na FCA/UNESP, em Botucatu (SP), em 1998, utilizando um LE de textura média. Com o aumento da compactação do solo, o comprimento e a matéria seca das raízes aumentaram acima da camada compactada e diminuíram abaixo dela, concentrando o sistema radicular das plantas próximo à superfície. O diâmetro radicular médio do tremoço e das duas aveias aumentou na camada compactada com o aumento da densidade do solo, diminuiu para o caso da ervilhaca e não se alterou para o caso do nabo. O nabo forrageiro e a aveia preta sobressaíram-se com maiores valores de densidade de comprimento radicular na camada compactada e inferior e no vaso como um todo, mesmo com o aumento da compactação. Concluiu-se, neste estudo, que o nabo forrageiro e a aveia preta apresentaram-se como bons materiais, para melhorar as características de solos com compactação subsuperficial, mostrando vigor no crescimento de raízes dentro e abaixo da camada compactada do solo, devendo-se, entretanto, validar estes resultados no campo, em condições diferentes de clima e solo.

Doses e modos de adubação com manganês e seus efeitos na produção da cultura do arroz

O presente trabalho foi realizado em casa de vegetação, com o objetivo de estudar doses e modos de aplicação de manganês sobre variáveis vegetativas e componentes da produção de cultivares de arroz de terras altas. Os tratamentos constaram de cinco doses de manganês, sendo quatro aplicadas via solo (0, 4, 8 e 16 mg dm-3 de solo) e uma via foliar (três aplicações de 4 g L-1), e dois cultivares de arroz de sequeiro (Canastra e Confiança). O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com quatro repetições, com os tratamentos dispostos em esquema fatorial 2 x 5. Cada parcela foi constituída por um vaso com 8 dm³ de solo (Latossolo Vermelho-Amarelo, sob vegetação primitiva de cerrado), com seis plantas. Comparando a aplicação de 8 mg dm-3 via solo e via foliar, nas dosagens recomendadas pela literatura, notou-se que a aplicação via solo propiciou os maiores incrementos nos valores das variáveis estudadas. As máximas produções das variáveis foram obtidas pela aplicação de 8,75 a 9,93 mg dm-3 de Mn via solo, evidenciando que, para as condições estudadas, a dose recomendada pela literatura mostrou-se adequada, visto que os valores supracitados ficam na faixa de pequenos incrementos. Houve diferença, embora não muito acentuada, entre os cultivares testados no tocante à aplicação de manganês. O cultivar Canastra mostrou-se mais responsivo, apresentando maior produção de grãos cheios que o Confiança a partir da aplicação de 6,81 mg dm-3 de Mn via solo. O efeito negativo das maiores doses de Mn via solo sobre as características avaliadas deve estar associado à deficiência de Fe e não à toxidez de Mn propriamente dita.

Establishment of models to study mouse and human retinogenesis "in vitro" : isolation and characterization of retinal stem cells

SUMMARY IN FRENCH Les cellules souches sont des cellules indifférenciées capables a) de proliférer, b) de s'auto¬renouveller, c) de produire des cellules différenciées, postmitotiques et fonctionnelles (multipotencialité), et d) de régénérer le tissu après des lésions. Par exemple, les cellules de souches hematopoiétiques, situées dans la moelle osseuse, peuvent s'amplifier, se diviser et produire diverses cellules différenciées au cours de la vie, les cellules souches restant dans la moelle osseuse et consentant leur propriété. Les cellules souches intestinales, situées dans la crypte des microvillosités peuvent également régénérer tout l'intestin au cours de la vie. La rétine se compose de six classes de neurones et d'un type de cellule gliale. Tous ces types de cellules sont produits par un progéniteur rétinien. Le pic de production des photorécepteurs se situe autour des premiers jours postnatals chez la souris. A cette période la rétine contient les cellules hautement prolifératives. Dans cette étude, nous avons voulu analyser le phénotype de ces cellules et leur potentiel en tant que cellules souches ou progénitrices. Nous nous sommes également concentrés sur l'effet de certains facteurs épigéniques sur leur destin cellulaire. Nous avons observé que toutes les cellules prolifératives isolées à partir de neurorétines postnatales de souris expriment le marqueur de glie radiaire RC2, ainsi que des facteurs de transcription habituellement trouvés dans la glie radiaire (Mash1, Pax6), et répondent aux critères des cellules souches : une capacité élevée d'expansion, un état indifférencié, la multipotencialité (démontrée par analyse clonale). Nous avons étudié la différentiation des cellules dans différents milieux de culture. En l'absence de sérum, l'EGF induit l'expression de la β-tubulin-III, un marqueur neuronal, et l'acquisition d'une morphologie neuronale, ceci dans 15% des cellules présentes. Nous avons également analysé la prolifération de cellules. Seulement 20% des cellules incorporent le bromodéoxyuridine (BrdU) qui est un marqueur de division cellulaire. Ceci démontre que l'EGF induit la formation des neurones sans une progression massive du cycle cellulaire. Par ailleurs, une stimulation de 2h d'EGF est suffisante pour induire la différentiation neuronale. Certains des neurones formés sont des cellules ganglionnaires rétiniennes (GR), comme l'indique l'expression de marqueurs de cellules ganglionnaires (Ath5, Brn3b et mélanopsine), et dans de rare cas d'autres neurones rétiniens ont été observés (photorécepteurs (PR) et cellules bipolaires). Nous avons confirmé que les cellules souches rétiniennes tardives n'étaient pas restreintes au cours du temps et qu'elles conservent leur multipotencialité en étant capables de générer des neurones dits précoces (GR) ou tardifs (PR). Nos résultats prouvent que l'EGF est non seulement un facteur contrôlant le développement glial, comme précédemment démontré, mais également un facteur efficace de différentiation pour les neurones rétiniens, du moins in vitro. D'autre part, nous avons voulu établir si l'oeil adulte humain contient des cellules souches rétiniennes (CSRs). L'oeil de certains poissons ou amphibiens continue de croître pendant l'âge adulte du fait de l'activité persistante des cellules souches rétiniennes. Chez les poissons, le CSRs se situe dans la marge ciliaire (CM) à la périphérie de la rétine. Bien que l'oeil des mammifères ne se développe plus pendant la vie d'adulte, plusieurs groupes ont prouvé que l'oeil de mammifères adultes contient des cellules souches rétiniennes également dans la marge ciliaire plus précisément dans l'épithélium pigmenté et non dans la neurorétine. Ces CSRs répondent à certains critères des cellules souches. Nous avons identifié et caractérisé les cellules souches rétiniennes résidant dans l'oeil adulte humain. Nous avons prouvé qu'elles partagent les mêmes propriétés que leurs homologues chez les rongeurs c.-à-d. auto-renouvellement, amplification, et différenciation en neurones rétiniens in vitro et in vivo (démontré par immunocoloration et microarray). D'autre part, ces cellules peuvent être considérablement amplifiées, tout en conservant leur potentiel de cellules souches, comme indiqué par l'analyse de leur profil d'expression génique (microarray). Elles expriment également des gènes communs à diverses cellules souches: nucleostemin, nestin, Brni1, Notch2, ABCG2, c-kit et son ligand, aussi bien que cyclin D3 qui agit en aval de c-kit. Nous avons pu montré que Bmi1et Oct4 sont nécessaires pour la prolifération des CSRs confortant leur propriété de cellules souches. Nos données indiquent que la neurorétine postnatale chez la souris et l'épithélium pigmenté de la marge ciliaire chez l'humain adulte contiennent les cellules souches rétiniennes. En outre, nous avons développé un système qui permet d'amplifier et de cultiver facilement les CSRs. Ce modèle permet de disséquer les mécanismes impliqués lors de la retinogenèse. Par exemple, ce système peut être employé pour l'étude des substances ou des facteurs impliqués, par exemple, dans la survie ou dans la génération des cellules rétiniennes. Il peut également aider à disséquer la fonction de gènes ou les facteurs impliqués dans la restriction ou la spécification du destin cellulaire. En outre, dans les pays occidentaux, la rétinite pigmentaire (RP) touche 1 individu sur 3500 et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) affecte 1 % à 3% de la population âgée de plus de 60 ans. La génération in vitro de cellules rétiniennes est aussi un outil prometteur pour fournir une source illimitée de cellules pour l'étude de transplantation cellulaire pour la rétine. SUMMARY IN ENGLISH Stem cells are defined as undifferentiated cells capable of a) proliferation, b) self maintenance (self-renewability), c) production of many differentiated functional postmitotic cells (multipotency), and d) regenerating tissue after injury. For instance, hematopoietic stem cells, located in bone marrow, can expand, divide and generate differentiated cells into the diverse lineages throughout life, the stem cells conserving their status. In the villi crypt, the intestinal stem cells are also able to regenerate the intestine during their life time. The retina is composed of six classes of neurons and one glial cell. All these cell types are produced by the retinal progenitor cell. The peak of photoreceptor production is reached around the first postnatal days in rodents. Thus, at this stage the retina contains highly proliferative cells. In our research, we analyzed the phenotype of these cells and their potential as possible progenitor or stem cells. We also focused on the effect of epigenic factor(s) and cell fate determination. All the proliferating cells isolated from mice postnatal neuroretina harbored the radial glia marker RC2, expressed transcription factors usually found in radial glia (Mash 1, Pax6), and met the criteria of stem cells: high capacity of expansion, maintenance of an undifferentiated state, and multipotency demonstrated by clonal analysis. We analyzed the differentiation seven days after the transfer of the cells in different culture media. In the absence of serum, EGF led to the expression of the neuronal marker β-tubulin-III, and the acquisition of neuronal morphology in 15% of the cells. Analysis of cell proliferation by bromodeoxyuridine incorporation revealed that EGF mainly induced the formation of neurons without stimulating massively cell cycle progression. Moreover, a pulse of 2h EGF stimulation was sufficient to induce neuronal differentiation. Some neurons were committed to the retinal ganglion cell (RGC) phenotype, as revealed by the expression of retinal ganglion markers (Ath5, Brn3b and melanopsin), and in few cases to other retinal phenotypes (photoreceptors (PRs) and bipolar cells). We confirmed that the late RSCs were not restricted over-time and conserved multipotentcy characteristics by generating retinal phenotypes that usually appear at early (RGC) or late (PRs) developmental stages. Our results show that EGF is not only a factor controlling glial development, as previously shown, but also a potent differentiation factor for retinal neurons, at least in vitro. On the other hand, we wanted to find out if the adult human eye contains retina stem cells. The eye of some fishes and amphibians continues to grow during adulthood due to the persistent activity of retinal stem cells (RSCs). In fish, the RSCs are located in the ciliary margin zone (CMZ) at the periphery of the retina. Although, the adult mammalian eye does not grow during adult life, several groups have shown that the adult mouse eye contains retinal stem cells in the homologous zone (i.e. the ciliary margin), in the pigmented epithelium and not in the neuroretina. These RSCs meet some criteria of stem cells. We identified and characterized the human retinal stem cells. We showed that they posses the same features as their rodent counterpart i.e. they self-renew, expand and differentiate into retinal neurons in vitro and in vivo (indicated by immunostaining and microarray analysis). Moreover, they can be greatly expanded while conserving their sternness potential as revealed by the gene expression profile analysis (microarray approach). They also expressed genes common to various stem cells: nucleostemin, nestin, Bmil , Notch2, ABCG2, c-kit and its ligand, as well as cyclin D3 which acts downstream of c-kit. Furthermore, Bmil and Oct-4 were required for RSC proliferation reinforcing their stem cell identity. Our data indicate that the mice postnatal neuroretina and the adult pigmented epithelium of adult human ciliary margin contain retinal stem cells. We developed a system to easily expand and culture RSCs that can be used to investigate the retinogenesis. For example, it can help to screen drugs or factors involved, for instance, in the survival or generation of retinal cells. This could help to dissect genes or factors involved in the restriction or specification of retinal cell fate. In Western countries, retinitis pigmentosa (RP) affects 1 out of 3'500 individuals and age-related macula degeneration (AMD) strikes 1 % to 3% of the population over 60. In vitro generation of retinal cells is thus a promising tool to provide an unlimited cell source for cellular transplantation studies in the retina.

Silício e cloreto de sódio na nutrição mineral e produção de matéria seca de plantas de moringa (Moringa oleifera Lam.)

Realizou-se um experimento em casa de vegetação do Departamento de Ciência do Solo da Universidade Federal de Lavras, para avaliar o efeito do silício na nutrição mineral e na produção de matéria seca de plantas de moringa submetidas ao estresse salino. Utilizaram-se o esquema fatorial e o delineamento de blocos casualizados, com três repetições, e uma planta por vaso de 3 L de capacidade, em que o primeiro fator referiu-se às doses de NaCl (0, 30, 60, 90 e 120 mol m-3) e o segundo às doses de SiO2 (0, 0,5, 1,0 e 1,5 mol m-3), em solução de Hoagland & Arnon (1950) a 50 % da concentração normal. As soluções foram renovadas em intervalos de 10 dias e, aos 35 dias, após a aplicação dos tratamentos, as plantas foram colhidas, separadas em folhas, caule e raízes, secas, para determinação da produção de matéria seca, e moídas, para determinação dos teores de N, P, K, Ca, Mg, S, Na, Cl e Si. A partir dos teores, determinaram-se as relações Na/K, Na/Ca e Na/Mg e a translocação dos nutrientes para a parte aérea. Observou-se que a adição do Si elevou os teores de K e de Ca nas folhas e reduziu os de Na e as relações Na/K, Na/Ca e Na/Mg. O Si não reduziu os efeitos depressivos do NaCl na produção de matéria seca das plantas de moringa.

Zebrafish hmx1 promotes retinogenesis.

Ocular development is controlled by a complex network of transcription factors, cell cycle regulators, and diffusible signaling molecules. Together, these molecules regulate cell proliferation, apoptosis and specify retinal fate. In the zebrafish (Danio rerio), hmx1 is a homeobox transcription factor implicated in eye and brain development. Hmx1 transcripts were detected in the nasal retina and lens as well as otic vesicles and pharyngeal arches by 24-32 hpf. Before this stage, transcripts were more uniformly expressed in the optic vesicle. Knockdown of hmx1 led to microphthalmia. Delayed withdrawal of retinal progenitors from the cell cycle resulting in retarded retinal differentiation was observed in morphant. The retina and brain also showed an increased cell death at 24 hpf. The polarized expression of hmx1 to the nasal part in the zebrafish retina strongly suggested an involvement in the nasal-temporal patterning. However, the key patterning genes tested so far were not regulated by hmx1. Altogether, these results suggest an important role for hmx1 in retinogenesis.

Preretinal partial pressure of oxygen gradients before and after experimental pars plana vitrectomy.

PURPOSE: To evaluate preretinal partial pressure of oxygen (PO2) gradients before and after experimental pars plana vitrectomy. METHODS: Arteriolar, venous, and intervascular preretinal PO2 gradients were recorded in 7 minipigs during slow withdrawal of oxygen-sensitive microelectrodes (10-μm tip diameter) from the vitreoretinal interface to 2 mm into the vitreous cavity. Recordings were repeated after pars plana vitrectomy and balanced salt solution (BSS) intraocular perfusion. RESULTS: Arteriolar, venous, and intervascular preretinal PO2 at the vitreoretinal interface were 62.3 ± 13.8, 22.5 ± 3.3, and 17.0 ± 7.5 mmHg, respectively, before vitrectomy; 97.7 ± 19.9, 40.0 ± 21.9, and 56.3 ± 28.4 mmHg, respectively, immediately after vitrectomy; and 59.0 ± 27.4, 25.2 ± 3.0, and 21.5 ± 4.5 mmHg, respectively, 2½ hours after interruption of BSS perfusion. PO2 2 mm from the vitreoretinal interface was 28.4 ± 3.6 mmHg before vitrectomy; 151.8 ± 4.5 mmHg immediately after vitrectomy; and 34.8 ± 4.1 mmHg 2½ hours after interruption of BSS perfusion. PO2 gradients were still present after vitrectomy, with the same patterns as before vitrectomy. CONCLUSION: Preretinal PO2 gradients are not eliminated after pars plana vitrectomy. During BSS perfusion, vitreous cavity PO2 is very high. Interruption of BSS perfusion evokes progressive equilibration of vitreous cavity PO2 with concomitant progressive return of preretinal PO2 gradients to their previtrectomy patterns. This indicates that preretinal diffusion of oxygen is not altered after vitrectomy. The beneficial effect of vitrectomy in ischemic retinal diseases or macular edema may be related to other mechanisms, such as increased oxygen convection currents or removal of growth factors and cytokines secreted in the vitreous.

Metais pesados do solo após aplicação de biossólido: I - Fracionamento

Foi realizado experimento em casa de vegetação da FCAV-UNESP, Campus de Jaboticabal, com o objetivo de estudar o efeito do pH e da aplicação de biossólido sobre a distribuição de Cu, Mn, Ni, Pb e Zn nas frações: trocável, orgânica, de óxidos de Fe e Al não-cristalinos, óxidos de Fe e Al cristalinos e residual de dois solos (Neossolo Quartzarênico órtico típico - RQ e Latossolo Vermelho eutroférrico argiloso - LV), coletados da camada arável do terreno, e relacionar esses teores dos metais nas frações com aqueles extraídos pelas soluções de DTPA, HCl 0,1 mol L-1, Mehlich-1 e Mehlich-3 e acumuladas na parte aérea de plantas de milho (Zea mays L.). O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com três repetições, segundo o esquema fatorial 2 × 2 × 5 (dois solos, presença ou ausência de corretivos e cinco doses de biossólido). Nos tratamentos com calagem, foram adicionados materiais corretivos para elevar o pH(CaCl2) do solo a 5,3. As doses de biossólido utilizadas foram de 0; 13; 26; 52 e 78 g vaso-1 (equivalentes a 0; 10; 20; 40 e 60 t ha-1), com base no material seco. O estudo de fracionamento dos metais mostrou que a maior parte dos metais encontrava-se nas frações com ligações mais estáveis (ligados a óxidos e residual), tendo as frações (trocável e orgânica) apresentado menor representatividade, em relação ao total encontrado. No solo arenoso (RQ), maiores proporções dos metais foram encontradas nas frações mais fitodisponíveis (trocável e orgânica), quando comparado ao solo argiloso (LV). A elevação do pH do solo provocou a redistribuição dos metais da forma trocável para a orgânica e, ou, de óxidos. Por meio de ajustes de regressões múltiplas, verificou-se que as frações, trocável e orgânica, foram as maiores responsáveis pelos teores dos metais extraídos do solo pelas soluções de DTPA, HCl 0,1 mol L-1, Mehlich-1 e Mehlich-3 e pelo acumulado na parte aérea do milho.