Caracterização de genes de quitanases do entomopatógeno e acaricida Metarhizium anisopliae

O fungo entomopatogênico e acaricida Metarhizium anisopliae é patógeno de uma vasta gama de insetos, sendo extensivamente utilizado em experimentos, bem como, no controle efetivo de alguns insetos-praga. Seu potencial uso para o controle de carrapatos como Boophilus microplus é também considerável. O processo de infecção de M. anisopliae é o melhor caracterizado entre os fungos entomopatogênicos, e combina pressão mecânica, por diferenciação do apressório, síntese e secreção de enzimas hidrolíticas altamente reguladas como proteases e, provavelmente, quitinases e lipases. As quitinases em fungos também são importantes em processos que requerem digestão celular, como germinação, crescimento e ramificação das hifas e autólise, visto que a quitina é o maior constituinte da parede celular desses organismos, sendo um sistema altamente regulado. Objetivamos neste trabalho, obter mais informações sobre o sistema quitinolitico do fungo M. anisopliae var. anisopliae linhagem E6 durante o processo de infecção do hospedeiro ou na morfogênese e crescimento. Com o objetivo de analisarmos o gene chi2 de M. anisopliae E6, clonamos e caracterizamos sua seqüência genômica, incluindo a região flanqueadora 5’. O gene chi2 é interrompido por dois pequenos íntrons típicos, de 210 pb e 75 pb, respectivamente. A ORF do gene chi2 apresenta 1.545 pb e codifica uma proteína predita de 419 aminoácidos (denominada CHI2), com massa molecular estimada de 44 kDa. Um peptídeo sinal característico com sítio de clivagem no aminoácido V19 está presente. A forma madura dessa proteína tem uma massa molecular estimada de 42 kDa e um pI teórico de 4,8. Análise por Southern de DNA genômico indica cópia única de chi2 no genoma de M. anisopliae. A seqüência de consenso SXGG, correspondendo ao sítio de ligação à quitina, foi identificada e a seqüência NGFDFDIE, que compõem o domínio catalítico de quitinases, está presente em CHI2. A construção de uma árvore filogenética determinou que a quitinase CHI2 pertence a um grupo diferente daquele da CHIT42 a qual provavelmente não está envolvida na patogenicidade. Uma análise in sílico da seqüência 5’ franqueadora do gene chi2 para determinação de possíveis elementos regulatórios foi efetuada. A regulação da transcrição dos genes chit1 e chi2 em M. ansisoplaie frente a diferentes fontes de carbono e em diferentes tempos de cultivo foi analisada. Os genes chit1 e chi2 apresentaram uma expressão tardia no fungo, a partir de 30 horas. O gene chi2 foi expresso majoritariamente em cultivos com quitina e sua expressão foi reprimida por glicose. O gene chit1 foi induzido em presença de fontes de carbono facilmente assimiláveis, como glicose e NAcGlc. Ambos os genes, chit1 e chi2, apresentaram alta expressão quando a fonte de carbono já estava exaurida e o fungo estava em autólise, sugerindo o requerimento dessas enzimas nessa fase. O cDNA do chit1 foi inserido em um vetor de expressão, em ambas orientações senso e antisenso, sob regulação do promotor do gene tef1α de M. anisopliae e o terminador do gene trpC de A. nidulans. Os transformantes com o gene chit1 na orientação senso mostraram superexpressão de atividade de quitinase e o transformante com o gene na orientação antisenso apresentou uma redução na atividade de quitinase. Também construímos quatro deleções na região flanqueadora 5’ do gene chit1 fusionadas com a proteína repórter SGFP, para localizar seqüências reguladoras no promotor e, destas construções, três foram transformadas em M. anisopliae.

Efeito do exercício físico sobre a liberação de interleucina-1[beta], interleucina-6 e fator de necrose tumoral-[alfa] em homens portadores de doença pulmonar obstrutiva crônica

A atividade física intensa pode induzir resposta inflamatória subclínica e aumento nos níveis plasmáticos de citocinas pró-inflamatórias. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre a liberação de citocinas (IL-1β, IL-6, e TNF-α), o exercício físico agudo e o exercício regular em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Foram estudados 18 pacientes do sexo masculino com DPOC moderada a muito grave, divididos em dois grupos: 11 pacientes foram incluídos em programa de reabilitação pulmonar (RP) durante 8 semanas e 7 pacientes sem atividade física regular foram incluídos como grupo controle (C). Todos os pacientes realizaram espirometria, teste de exercício cardiopulmonar incremental máximo e teste de endurance em cicloergômetro com carga constante (60% da carga máxima do teste incremental) no início do projeto e após oito semanas. Foi coletado sangue venoso periférico para dosagem de citocinas, antes e 15 minutos após os testes de endurance (TE1 e TE2). IL-1β, IL-6, e TNF-α foram dosadas com kits ELISA específicos (Quantikine®, R&D Systems). Os pacientes submetidos à RP liberaram menos IL-1β que os controles após o treinamento (RP: TE1 0,96±0,66; TE2 -0,24±0,27 pg/ml; grupo C: TE1 -1,48±1,14; TE2 0,66±0,61 pg/ml; p=0,03). Não houve diferença significativa na liberação de IL-6 quando comparados os dois testes de endurance (RP: TE1 0,44±1,21; TE2 0,80±1,24 pg/ml; grupo C: TE1 0,88±0,85; TE2 0,78±0,95 pg/ml; p=0,68). Não foi observada diferença na liberação de IL-6 entre os dois grupos. Apenas cinco pacientes (quatro no grupo da RP) liberaram TNF-α e o exercício não modificou o seu padrão de liberação (RP: TE1 2,86±1,18; TE2 2,57±1,37pg/ml; grupo C: TE1 4,98; TE2 6,84 pg/ml; p=0,14). Não houve associação significativa entre intensidade de exercício e liberação de citocinas (IL-1β r=0,10; IL-6 r=-0,23). Houve maior liberação de IL-6 após o TE2 nos pacientes que apresentaram exacerbação da DPOC (exacerbados 9,59±1,32; estáveis 6,31±0,92 pg/ml; p=0,03) e não houve diferença nos níveis de IL-1β. Apenas pacientes com exacerbação da DPOC liberaram TNF-α (2,82±1,48 pg/ml). Concluiu-se que o exercício físico regular reduz a liberação de IL-1β e as exacerbações estimulam a liberação de IL-6 e TNF-α em pacientes com DPOC.

Execução de túneis nas formações vulcânicas da Ilha da Madeira: o caso do túnel 1 da nova ligação Vasco Gil-Fundoa à cota 500

Este trabalho pretende contribuir para um melhor conhecimento ao nível da execução de túneis em formações vulcânicas, mais especificamente na Ilha da Madeira, visto esta região ter sido nos últimos anos palco da construção de inúmeros túneis rodoviários, que forneceram novos dados, experiencias e metodologias na execução de túneis em maciços vulcânicos. Assim sendo, esta tese foca inicialmente a geologia da Ilha da Madeira com o objectivo de dar a conhecer as características litológicas das rochas que compõem os maciços vulcânicos assim como é feita uma abordagem à história e evolução dos túneis existentes na região, com realce para os vários tipos de túneis executados e para os acidentes mais comuns que acontecem durante a escavação neste tipo de maciços. Depois são abordados os estudos geológicos e geotécnicos que são indispensáveis antes do inicio da execução dos túneis e também os métodos de escavação utilizados em maciços vulcânicos. É ainda abordado o estudo das vibrações causadas pelo uso de explosivos na escavação de túneis visto ser o método mais usado na região. Por fim é relatado o acompanhamento realizado durante a execução de um túnel na Ilha da Madeira, com particular destaque ao estudo das vibrações causadas devido à detonação de explosivos.

Efeito do consumo de farinha de linhaça (Linum usitatissimum) no crescimento de ratos Wistar e relação com a digestibilidade de globulinas e fatores antinutricionais protéicos

Linseed is an important oilseed consumed raw as nutritional supplement, that although represents a rich source of nutrients, its nutritional value could be impaired due to the presence of antinutritional factors. In this study, protein fractions from raw linseed flour were extracted and isolated being obtained 12% of albumins, 82% of globulins, 5% of glutelins and 1% of prolamins. These proteins were visualized by SDS-PAGE and albumins showed low molecular mass protein bands around 21 kDa and minor bands, similar to that of trypsin inhibitor; Globulins presented protein bands with high molecular masses, which possibly are constituents of multimeric proteins, such as legumins. After determination of the centesimal composition of raw linseed, it was used as exclusive protein source for young rats to evaluate its effect on animal growth. The results showed negative effects on rat growth (weight gain 73% less than the control group) and reduction of intestinal villus (35%), that could be related with in vitro and in vivo globulin digestibility and proteinaceous antinutritional factors (mammalian digestive enzymes inhibitors and lectins) in albumin fraction. Native globulins showed, by SDS-PAGE, low susceptibility in vitro to trypsin and chymotrypsin, however presented high degradation by pancreatin. Thermal treatment of globulins for 5 and 15 minutes at 100ºC improved considerably its digestibility by trypsin and pancreatin. Globulins presented 93.2% in vivo digestibility, similar to the control protein. Albumin fraction had high trypsin inhibition activity (100%) and chymotrypsin inhibition of 28.3%; haemagglutinating activity was not detected. The results of this study indicate the negative action of trypsin inhibitors on animal growth, but can not be discarded its combined action with other antinutritional factors, which could compromise the raw linseed utilization as an alternative food

Determinação de motivos de ligação à quitina em vicilinas de Canavalia ensiformis e Vigna unguiculata através de métodos in silico e relação com suas toxicidades para o bruquídeo Callosobruchus maculatus (Coleoptera:Bruchidae)

Chitin is an important structural component of the cellular wall of fungi and exoskeleton of many invertebrate plagues, such as insects and nematodes. In digestory systems of insects it forms a named matrix of peritrophic membrane. One of the most studied interaction models protein-carbohydrate is the model that involves chitin-binding proteins. Among the involved characterized domains already in this interaction if they detach the hevein domain (HD), from of Hevea brasiliensis (Rubber tree), the R&R consensus domain (R&R), found in cuticular proteins of insects, and the motif called in this study as conglicinin motif (CD), found in the cristallography structure of the β-conglicinin bounded with GlcNac. These three chitin-binding domains had been used to determine which of them could be involved in silico in the interaction of Canavalia ensiformis and Vigna unguiculata vicilins with chitin, as well as associate these results with the WD50 of these vicilins for Callosobruchus maculatus larvae. The technique of comparative modeling was used for construction of the model 3D of the vicilin of V. unguiculata, that was not found in the data bases. Using the ClustalW program it was gotten localization of these domains in the vicilins primary structure. The domains R&R and CD had been found with bigger homology in the vicilins primary sequences and had been target of interaction studies. Through program GRAMM models of interaction ( dockings ) of the vicilins with GlcNac had been gotten. The results had shown that, through analysis in silico, HD is not part of the vicilins structures, proving the result gotten with the alignment of the primary sequences; the R&R domain, although not to have structural similarity in the vicilins, probably it has a participation in the activity of interaction of these with GlcNac; whereas the CD domain participates directly in the interaction of the vicilins with GlcNac. These results in silico show that the amino acid number, the types and the amount of binding made for the CD motif with GlcNac seem to be directly associates to the deleterious power that these vicilins show for C. maculatus larvae. This can give an initial step in the briefing of as the vicilins interact with alive chitin in and exert its toxic power for insects that possess peritrophic membrane

Papel da proteína de reparo XPC na regulação das proteínas de reparo APE1, OGG1 e PARP-1 em células humanas e de camundongos

studies using UV as a source of DNA damage. However, even though unrepaired UV-induced DNA damages are related to mutagenesis, cell death and tumorigenesis, they do not explain phenotypes such as neurodegeneration and internal tumors observed in patients with syndromes like Xeroderma Pigmentosum (XP) and Cockayne Syndrome (CS) that are associated with NER deficiency. Recent evidences point to a role of NER in the repair of 8-oxodG, a typical substrate of Base Excision Repair (BER). Since deficiencies in BER result in genomic instability, neurodegenerative diseases and cancer, it was investigated in this research the impact of XPC deficiency on BER functions in human cells. It was analyzed both the expression and the cellular localization of APE1, OGG1 e PARP-1, the mainly BER enzymes, in different NER-deficient human fibroblasts. The endogenous levels of these enzymes are reduced in XPC deficient cells. Surprisingly, XP-C fibroblasts were more resistant to oxidative agents than the other NER deficient fibroblasts, despite presenting the highest of 8-oxodG. Furthermore, subtle changes in the nuclear and mitochondrial localization of APE1 were detected in XP-C fibroblasts. To confirm the impact of XPC deficiency in the regulation of APE1 and OGG1 expression and activity, we constructed a XPC-complemented cell line. Although the XPC complementation was only partial, we found that XPC-complemented cells presented increased levels of OGG1 than XPC-deficient cells. The extracts from XPC-complemented cells also presented an elevated OGG1 enzimatic activity. However, it was not observed changes in APE1 expression and activity in the XPCcomplemented cells. In addition, we found that full-length APE1 (37 kDa) and OGG1- α are in the mitochondria of XPC-deficient fibroblasts and XPC-complemented fibroblasts before and after induction of oxidative stress. On the other hand, the expression of APE1 and PARP-1 are not altered in brain and liver of XPC knockout mice. However, XPC deficiency changed the APE1 localization in hypoccampus and hypothalamus. We also observed a physical interaction between XPC and APE1 proteins in human cells. In conclusion, the data suggest that XPC protein has a role in the regulation of OGG1 expression and activity in human cells and is involved mainly in the regulation of APE1 localization in mice. Aditionally, the response of NER deficient cells under oxidative stress may not be only associated to the NER deficiency per se, but it may include the new functions of NER enzymes in regulation of expression and cell localization of BER proteins

Farelo de canola em dietas para o pacu Piaractus mesopotamicus (Holmberg 1987): efeitos sobre o crescimento e a composição corporal

Avaliaram-se os efeitos da inclusão de farelo de canola em dietas de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) sobre parâmetros de crescimento e composição corporal. Um total de 192 alevinos (9 a 15g) foram estocados em 24 tanques de cimento, de 100l de capacidade, durante 103 dias. O farelo de canola foi utilizado em quatro proporções: zero; 9,5%; 19% e 38% da dieta, com ou sem farinha de peixe (12%/dieta), totalizando oito tratamentos. A presença de farinha de peixe não afetou os parâmetros de crescimento avaliados. A inclusão de 38% de farelo de canola na dieta diminuiu o ganho de peso dos peixes, valores médios de 28,74g a 50,70g, e piorou a conversão alimentar aparente, de 1,66 para 2,85. A taxa de eficiência protéica também foi menor nos peixes alimentados com 38% de farelo de canola. As várias proporções de farelo de canola das dietas alteraram os teores de umidade, proteína bruta e lipídios dos peixes. A presença da farinha de peixe, nas dietas, somente influiu no teor de lipídios dos peixes alimentados com dietas contendo 9,5% de farelo de canola. Conclui-se que até 19% de farelo de canola pode ser adicionado às dietas de juvenis de pacu, sem que seu desenvolvimento seja prejudicado.

Expression of the sigma35 and cry2AB genes involved in Bacillus thuringiensis virulence

Muitos genes estão envolvidos nos mecanismos de esporulação da bactéria Bacillus thuringiensis. A regulação e expressão desses genes resultam em uma produção massiva da proteína Cry, responsável pela morte das larvas de muitos insetos. Neste trabalho monitorou-se a expressão de genes de Bacillus thuringiensis, ao longo de três fases de seu desenvolvimento. Foram construídos macroarrays de DNA dos genes selecionados, cujas seqüências estão disponibilizadas no GenBank. Estes genes foram hibridizados com cDNAs obtidos de B. thuringiensis kurstaki HD-1. As sondas de cDNA foram sintetizadas a partir da transcrição reversa do RNA da bactéria, extraído durante as fases de crescimento logarítmico, estacionária e esporulativa, marcadas com 33PadCTP. A expressão diferencial encontrada foi significativa para dois genes de B.thuringiensis, um relacionado aos fatores sigma (sigma35) e outro ao gene cry (cry2Ab). Detectaram-se diferenças entre as médias de expressão do fator sigma e do gene cry2Ab. Os valores máximos de expressão diferencial foram obtidos para o gene codificador do fator sigma35 na fase log e na fase esporulativa. Na análise de médias observou-se expressão do gene cry2Ab apenas na fase log; no entanto, de forma bem mais baixa quando comparado com a expressão de sigma35, nas três fases.

Associação do receptor toll-like 2 com o estado pró-inflamatório do diabetes tipo 1

Inflammation has been pointed out as an important factor in development of chronic diseases, as diabetes. Hyperglycemia condition would be responsible by toll-like receptors, TLR2 and TLR4, and, consequently by local and systemic inflammation induction. Thus, the objective of present study was to evaluate type 1 Diabetes mellitus (T1DM) pro-inflammatory state through mRNA expression of TLRs 2 and 4 and proinflammatory cytokines IL-1β, IL-6 and TNF-α correlating to diabetic nephropathy. In order to achieve this objective, 76 T1DM patients and 100 normoglycemic (NG) subjects aged between 6 and 20 years were evaluated. T1DM subjects were evaluated as a total group DM1, and considering glycemic control (good glycemic control DM1G, and poor glycemic control DM1P) and considering time of diagnosis (before achieving 5 years of diagnosis DM1< 5yrs, and after achieving 5 years of diagnosis DM1 <5yrs). Metabolic control was evaluated by glucose and glycated hemoglobin concentrations; to assess renal function serum urea, creatinine, albumin, total protein and urinary albumin-to-creatinine ratio were determined and to evaluate hepatic function, AST and ALT serum activities were measured. Pro-inflammatory status was assessed by mRNA expression of TLRs 2 and 4 and the inflammatory cytokines IL-1β, IL-6 and TNF-α. Except for DM1G group (18.4%), DM1NC patients (81.6%) showed a poor glycemic control, with glycated hemoglobin (11,2%) and serum glucose (225,5 md/dL) concentrations significantly increased in relation to NG group (glucose: 76,5mg/dL and glycated hemoglobin: 6,9%). Significantly enhanced values of urea (20%) and ACR (20,8%) and diminished concentrations of albumin (5,7%) and total protein (13,6%) were found in T1DM patients, mainly associated to a poor glycemic control (DM1P increased values of urea: 20% and ACR:49%, and diminished of albumin: 13,6% and total protein:13,6%) and longer disease duration (DM1 <5yrs - increased values of urea: 20% and ACR:20,8%, and diminished of albumin: 14,3% and total protein:13,6%). As regarding pro-inflammatory status evaluation, significantly increased mRNA expressions were presented for TLR2 (37,5%), IL-1β (43%), IL-6 (44,4%) and TNF-α (15,6%) in T1DM patients in comparison to NG, mainly associated to DM1P (poor glycemic control TLR2: 82%, IL-1β: 36,8% increase) and DM1 <5yrs (longer time of diagnosis TLR2: 85,4%, IL-1β: 46,5% increased) groups. Results support the existence of an inflammatory state mediated by an increased expression of TLR2 and pro-inflammatory cytokines IL-1β, IL-6 and TNF-α in T1DM

Fixação biológica do nitrogênio e crescimento de plantas de leucena (Leucaena leucocephala (Lam.) de wit.) sob salinidade

This study aimed to evaluate the effects of salinity in the growth and nitrogen fixation in leucaena. Plants were cultivated in Leonard pots containing clean and sterilized sand. The treatments were distributed in a completely randomized design, in a 3x3 factorial, with five replicates. The first factor corresponded to no inoculation and inoculation with Bradyrhizobium sp SEMIA 6070 and SEMIA 6153 strains. The second factor corresponded to NaCl concentrations: 0, 25 and 50 mol m(-3). Were analyzed the height and dry matter accumulation, the number of nodules and nitrogen in plants. The inoculation of plants with the strain SEMIA 6070 provided higher growth and greater nitrogen accumulation in plants thar were not subject to salinity. Nodulation was not affected by salinity. Inoculation with SEMIA 6153 strain provided greater tolerance to salinity.

Equações de Predição das Exigências de Proteína Bruta para Matrizes Pesadas em Crescimento

The objective of this work was to determine the crude protein requirements for broiler breeder pullets, using the factorial method. The protein requirements for maintenance were obtained by comparative slaughter technique and also by nitrogen balance technique, as usual. In the case of comparative slaughter technique we have examined the nitrogen retained as function of different nitrogen intake levels (ad libitum, 54, 24 and 19% of the ad libitum). For the nitrogen balance technique it has been investigated the nitrogen balance as function of nitrogen intake, at different protein levels (16, 10 6 and 3% CP). The results obtained were 3.77 and 2.02 CP/kg(0.75)/day for comparative slaughter and nitrogen balance techniques, respectively. The protein requirements for weight gain were achieved by weekly following the nitrogen level in the body, during the period from 3 to 20 weeks of age. The results were 350, 406 and 463 mg of CP/g of gain in the phases of 3 to 8, 9 to 14 and 15 to 20 weeks, respectively.

Efeitos da restrição alimentar protéica ou energética sobre o crescimento de frangos de corte criados em diferentes temperaturas ambiente

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Pegamento e crescimento inicial de enxertos do pessegueiro 'Aurora-1' em clones de umezeiro (Prunus mume Sieb. et Zucc.) e 'Okinawa' [Prunus persica (L.) Batsch] propagados por estacas herbáceas

O presente estudo teve por objetivo avaliar o pegamento e o crescimento inicial de enxertos do pessegueiro 'Aurora-1' em clones de umezeiro (Prunus mume Sieb. et Zucc.) e 'Okinawa' [Prunus persica (L.) Batsch] propagados por estacas herbáceas. Realizaram-se dois experimentos, adotando-se a enxertia de borbulhia por escudo (março) e borbulhia por escudo modificada (julho). Com os resultados obtidos, pode-se concluir que é viável a realização da enxertia do 'Aurora-1' nos Clones 05; 10 e 15 de umezeiro e no 'Okinawa', tanto em março quanto em julho, com as metodologias utilizadas. O 'Okinawa' induz crescimento mais rápido ao enxerto, de forma que o ponto máximo do comprimento é atingido em tempo menor.

Avaliação do crescimento e do custo da alimentação do pacu (Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887) submetido a ciclos alternados de restrição alimentar e realimentação

Avaliaram-se os efeitos da utilização de ciclos alternados de restrição alimentar e realimentação no crescimento do pacu, durante o período de engorda, e a viabilidade desta prática na produção comercial da espécie. Juvenis foram distribuídos em três tanques e submetidos a diferentes manejos alimentares, constituindo os tratamentos: A (alimentado ad libitum), B (restrição alimentar de 4 semanas, realimentado por 9 semanas) e C (6 semanas de restrição alimentar, realimentado por 7 semanas), em um total de 13 semanas por ciclo (4 ciclos experimentais). No final de cada ciclo alimentar, 20 peixes de cada tratamento foram amostrados e os dados biométricos registrados. Os valores obtidos para peso, comprimento total e fator de condição (K) foram submetidos a ANOVA e as médias comparadas pelo teste de Duncan. Os resultados mostraram que o tratamento C é o mais indicado somente para outono/inverno, promovendo maior crescimento, menor custo com ração, baixa conversão alimentar e maior receita líquida parcial. Entretanto, durante as estações mais quentes do ano (primavera/verão) outros programas de alimentação devem ser testados, utilizando-se períodos mais curtos de restrição alimentar. Quando se tratou da produção anual, o tratamento A respondeu melhor em termos de biomassa produzida, apesar do maior gasto com alimentação, visto que, com o aumento da temperatura, o crescimento dos peixes dos demais tratamentos ficou prejudicado.

Crescimento e deposição de nutrientes nos órgãos de frangos de corte de duas linhagens comerciais

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)