Improvement in clinical signs and cellular immunity of dogs with visceral leishmaniasis using the immunomodulator P-MAPA

This study investigated the immunotherapeutic potential of the protein aggregate magnesium-ammonium phospholinoleate-palmitoleate anhydride immuno-modulator (P-MAPA) on canine visceral leishmaniasis. Twenty mongrel dogs presenting clinical symptoms compatible with leishmaniasis and diagnosis confirmed by the detection of anti-leishmania antibodies were studied. Ten dogs received 15 doses of the immunomodulator (2.0mg/kg) intramuscularly, and 10 received saline as a placebo. Skin and peripheral blood samples were collected following administration of the immunomodulator. The groups were followed to observe for clinical signals of remission; parasite load in the skin biopsies using real-time PCR, the cytokines IL-2, IL-10 and IFN-γ in the supernatant of peripheral blood mononuclear cells stimulated in vitro with either total promastigote antigen or phytohemagglutinin measured by capture ELISA, and changes in CD4+ and CD8+ T cell subpopulations evaluated by flow cytometry. Comparison between the groups showed that treatment with the immunomodulator promoted improvement in clinical signs and a significant reduction in parasite load in the skin. In peripheral blood mononuclear cell cultures, supernatants showed a decrease in IL-10 levels and an increase in IL-2 and IFN-γ. An increase in CD8+ T cells was observed in peripheral blood. In addition, the in vitro leishmanicidal action of P-MAPA was investigated using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and no leishmanicidal activity was detected. These findings suggest that P-MAPA has potential as an immunotherapeutic drug in canine visceral leishmaniasis, since it assists in reestablishing partial immunocompetence of infected dogs. © 2013 Elsevier B.V.

Leishmaniasis causes oxidative stress and alteration of oxidative metabolism and viability of neutrophils in dogs

The aim of the present study was to test the hypothesis that oxidative stress and alteration of oxidative metabolism and apoptosis of neutrophils in dogs vary with the stage of leishmaniasis and to determine the contribution of uremia to such alterations. Dogs with leishmaniasis were classified into two stages: moderate (Leish II, n = 20) or very severe (i.e. with concurrent uremia; Leish IV, n = 20) according to the LeishVet Consensus. The two leishmaniasis groups were compared with uremic dogs without leishmaniasis (Uremic, n = 10) and to healthy dogs (Control, n = 30). To determine oxidative stress, total antioxidant/oxidant capacity, lipid peroxidation, total glutathione and the plasma antioxidants albumin, uric acid and bilirubin were quantified. Superoxide production was determined using the hydroethidine probe and viability and apoptosis were measured using annexin V-PE by capillary flow cytometry. Oxidative stress was present in both uremia and leishmaniasis with reduced total antioxidant capacity and was associated with increased induced production of superoxide and apoptosis. The greatest amount of oxidants was observed in animals with moderate disease only. Neutrophils from uremic dogs with and without leishmaniasis had decreased viability and an increased apoptosis rate in addition to increased lipid peroxidation. In conclusion, oxidative stress occurs in both stages of leishmaniasis with differences in intensity and levels of plasma markers; however, uremia does contribute to the decreased spontaneous viability of neutrophils in dogs in the final stage of the disease. © 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Longitudinal analysis of serological tests officially adopted by the Brazilian Ministry of Health for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in dogs vaccinated with Leishmune®

Development of vaccines against canine visceral leishmaniasis (CVL) may provide a prophylactic barrier, but antibody response detected by standard diagnostic techniques may not separate vaccinated from naturally infected dogs. Moreover, anti-Leishmania antibody levels in vaccinated dogs may be detectable for months. Accordingly, the aim of the present study was to comparatively evaluate an in-house ELISA with three serological tests officially adopted by the Brazilian Ministry of Health for the diagnosis of CVL in dogs vaccinated with Leishmune®. A total of 18 mongrel dogs were submitted to a complete protocol of the vaccine, monitored and evaluated in 5 times (T0-T4) up to 180 days after T0. Twenty-one days after the first dose (T1), 50% of the dogs were seropositive by the in-house ELISA and 5.5% by IFAT, while by the official ELISA and DPP® CVL rapid test all dogs tested negative. At time T2, 42 days after of the first dose, 100%, 83.3%, 11.1%, and 5.5% of the dogs were seropositive by the in-house ELISA, IFAT, official ELISA kit and the DPP® CVL rapid test, respectively. Ninety days after the first dose (T3), 100%, 83.3%, 72.2% and 33.3% of the dogs were seropositive by the in-house ELISA, official ELISA kit, IFAT, and the DPP® CVL rapid test, respectively. Finally, at time T4, 88.8%, 33.3%, 11.1% and 5.5% of the dogs were seropositive by the in-house ELISA, official ELISA kit, DPP® CVL rapid test and IFAT, respectively. In conclusion, dogs vaccinated with Leishmune® cross-react by an in-house ELISA and by the three official Brazilian serological tests for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis up to six months after the first vaccine dose, and may be mistakenly diagnosed and removed. © 2013 Elsevier B.V.

Avaliação dos padrões histopatológicos da pele e imunomarcação de células CD3+ e CD79a+ em cães infectados naturalmente por Leishmania spp

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Identificação de Leishmania spp. em amostras de diferentes regiões do tecido cutâneo de cães

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FMVZ

Leishmaniose visceral canina-LVC, em Campina Grande-PB/Brasil: avalição epidemiológica e diagnóstica

Pós-graduação em Doenças Tropicais - FMB

Leishmaniose felina e sua associação com imunodeficiência viral e toxoplasmose em gatos provenientes de área endêmica para leishmaniose visceral

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Diagnóstico da leishmaniose visceral canina pelas técnicas de imunoistoquímica e PCR em tecidos cutâneos em associação com a Rifi e Elisa-teste

Pós-graduação em Ciência Animal - FMVA

Infecção por Leishmania chagasi em gatos com dermatopatias provenientes de área endemica para Leishmaniose visceral

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Fatores de risco e análise espacial para a leishmaniose visceral no município de Juazeiro - Bahia - Brasil

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FCAV

Distribution of phlebotomine fauna (Diptera: Psychodidae) across an urban-rural gradient in an area of endemic visceral leishmaniasis in northern Brazil

The number of visceral leishmaniasis (VL) cases has increased over the past 10 years in Brazil, especially in the North and Northeast regions of the country. The aim of this study was to evaluate the urbanisation of VL vectors in Barcarena, Pará, an area in northern Brazil where VL is endemic. Sandflies were captured using Centers for Disease Control (CDC) light traps along an urban-rural gradient. The CDC traps were installed inside hen houses at a height of 150 cm. A total of 5,089 sandflies were collected and 11 species were identified. The predominant species was Lutzomyia longipalpis (rate of 95.15%), which suggests its participation in the transmission of VL. A total of 1,451 Lu. longipalpis females were dissected and no Leishmania infections were detected. Most of the sandflies were captured at the border of a forest (88.25%) and no flies were captured in the urban area, which suggests that transmission is still restricted to rural sites. However, the fact that a specimen was collected in an intermediate area indicates that urbanisation is a real possibility and that vector monitoring is important.

Estudo in vitro da infectividade de espécies de Leishmania do subgênero Viannia em macrófagos peritoneais de camundongo BALB/c

Os parasitos do gênero Leishmania apresentam variações de infectividade intra e inter específicas. Entretanto, são escassas as informações a respeito da infectividade das espécies de Leishmania do Novo Mundo, principalmente, daquelas encontradas na região Amazônica brasileira, onde, até o presente momento são conhecidas seis espécies pertencentes ao subgênero Viannia causadoras de LTA. Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi investigar, in vitro, o comportamento da infectividade de 5 espécies de Leishmania do subgênero Viannia em macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c e sua correlação com a produção de óxido nítrico pelos macrófagos infectados. Trinta cepas de Leishmania foram distribuídas em seis grupos iguais, de acordo com as espécies seguintes: I- L. (V) braziliensis/LCL, II- L. (V) braziliensis/LCM, III- L. (V) guyanensis, IV- L. (V) shawi, V -L. (V) naiffi e VI- L. (V) lainsoni. As cepas foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-gentamicina, até atingir a fase estacionária de cultivo, quando foram usadas para infectar macrófagos na proporção de 4 parasitos/macrófago. As culturas foram incubadas a 35°C e 5% de CO2 e após 24h, as lamínulas foram coradas com Giemsa para contagem do número de parasitos e determinação do índice de infecção, enquanto a concentração de NO (nitrito) foi calculada pelo método de Griess. Observou-se que as cepas de L. (V) braziliensis/LCM apresentaram o maior índice de infecção (385), sendo este significativamente maior (P<0,005) que as cepas de L. (V) braziliensis/LCL (264), L. (V) naiffi (215) e L. (V) lainsoni (272), porém, não significativamente maior que os índices das espécies L. (V) shawi (292) e L. (V) guyanensis (300). Quanto aos níveis de NO (nitrito), detectou-se maior concentração para a espécie L. (V) naiffi (4,1µM e menor concentração para as cepas de L. (V) braziliensis/LCM (2,15µM). As demais espécies tiveram concentrações de: L. (v:) lainsom (3,14µM), L. (V) shawi (2,96µM), L. (V) guyanensis (2,76µM) e cepas de L. (V) braziliensis/LCL (3,1µM). Diante do exposto, concluímos que cepas de L. (V) braziliensis/LCM são mais infectivas do que as demais espécies estudadas e, também, mais infectivas que cepas homólogas isoladas de casos clínicos de LCL. Além disso, observou-se menor infectividade da espécie L. (V) naiffi. Desse modo, notou-se que os níveis de NO produzidos pelos macrófagos infectados foram inversamente proporcionais ao grau do parasitismo.

Leishmaniose visceral no município de Barcarena, Pará: importância do comportamento da enzootia canina por Leishmania (Leishmania) chagasi e de outros fatores para a infecção humana

A leishmaniose é uma doença infecciosa não contagiosa de evolução crônica com altos índices de mortalidade, sendo que o Brasil notifica cerca de 90% dos casos do continente Americano. Sua importância no contexto da saúda publica tem aumentado em função do crescente número de casos que vem ocorrendo não só na zona rural como também na periferia de grandes centros urbanos. A epidemiologia do LV no Brasil é baseada na ocorrência de casos clínicos. Neste sentido o presente estudo propôs-se a estudar o comportamento da enzootia como sua importância e de outros fatores para a infecção humana. Pois pouco se conhece sobre os determinantes de infecção e sua importância na manutenção da doença. Para isso foi definido de uma localidade município de Barcarena, onde a população é estável, ocorrendo a doença de forma endêmica. O estudo acompanhou durante um ano duas coortes, sendo uma para caninos, com 172 cães, e uma para humanos, com 1064 pessoas das quais apenas 1012 participaram da coleta de material, pois 52 pessoas estavam fora da faixa de idade compatível para a realização dos procedimentos. A realização do teste sorológico de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), teve como finalidade a determinação de prevalência inicial de infecção e as incidências em dois momentos do estudo, tanto da população humana quanto canina. Também foi realizado na população humana a Intradermo Reação de Montenegro (IDRM) com a mesma finalidade, aferir a prevalência e incidência de infecção através deste método. Outros fatores também foram analisados e podem estar associados ao risco para a infecção. A análise estatística dos dados foi realizada com auxilio dos programas EPI INFO versão 6.04 e BIOESTAT versão 3.0 e os testes aplicados foram o Qui - Quadrado e o cálculo de prevalência e incidência. No inquérito sorológico canino foi observado uma prevalência de infecção canina de 37,2% e, a incidência seis meses após, foi de 29,2%. No intervalo da segunda para a terceira coleta foi realizada a eutanásia dos cães sorologicamente positivos, num total de 70 cães, pois 15 haviam morrido antes da intervenção. A incidência calculada após a intervenção mostrou uma taxa de 14,6%, o que caracteriza uma redução de cerca de 50%. Quanto à titulação, em todas as etapas foram observados títulos considerados elevados. Vale ressaltar que dos 54 animais que não apresentavam sinais clínicos, 30 estavam infectados (55,5%). Quando realizado o inquérito sorológico humano, foi observada uma prevalência de infecção humana de 5,25%, e a incidência seis meses após foi de 1,8% e na ultima avaliação 7,0%, com aumento de cerca de 300%. Em relação às características da população foi observado que entre os infectados não houve predomínio de nenhuma faixa etária. A variável sexo não foi significativa para a ocorrência de infecção. Sobre os infectados tanto pela RIFI, quanto a IDRM, destaca-se a significância estatística da variável ocupação, e neste contexto, a categoria agricultor foi a que se apresentou com maior proporção. As variáveis tempo residência no local, proximidade de residência com a mata, destino do lixo e dejetos também mostraram- se significativas. Quanto a variável faixa etária, a distribuição dos infectados pela RIFI não foi predominante em nenhuma faixa; na IDRM, observou-se que à medida que aumenta a idade aumenta também a proporção de infectados. Outros resultados foram observados de grande relevância para a associação ao risco de infecção, mas a observação quanto a infectados pela RIFI e IDRM foi a que mereceu destaque em função da significância estatística. O estudo mostrou-se adequado para o conhecimento da prevalência e incidência de infecção canina e humana na localidade, assim como o comportamento de alguns fatores que associados podem constituir-se em risco para infecção.

Further observations on clinical, histopathological, and immunological features of borderline disseminated cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania (Leishmania) amazonensis

ABSTRACT: Leishmania (Leishmania) amazonensis has for some time been considered as the causative agent of two distinct forms of American cutaneous leishmaniasis (ACL): localized cutaneous leishmaniasis (LCL), and anergic diffuse cutaneous leishmaniasis (ADCL). Recently, a new intermediate form of disease, borderline disseminated cutaneous leishmaniasis (BDCL), was introduced into the clinical spectrum of ACL caused by this parasite, and in this paper we record the clinical, histopathological, and immunological features of eight more BDCL patients from Brazilian Amazonia, who acquired the disease in the Pará state, North Brazil. Seven of them had infections of one to two years' evolution and presented with primary skin lesions and the occurrence of metastases at periods varying from six to 12 months following appearance of the first lesion. Primary skin lesions ranged from 1-3 in number, and all had the aspect of an erythematous, infiltrated plaque, variously located on the head, arms or legs. There was lymphatic dissemination of infection, with lymph node enlargement in seven of the cases, and the delayed hypersensitivity skin-test (DTH) was negative in all eight patients prior to their treatment. After that, there was a conversion of DTH to positive in five cases re-examined. The major histopathological feature was a dermal mononuclear infiltration, with a predominance of heavily parasitized and vacuolated macrophages, together with lymphocytes and plasma cells. In one case, with similar histopathology, the patient had acquired his infection seven years previously and he presented with the largest number of disseminated cutaneous lesions. BDCL shows clinical and histopathological features which are different from those of both LCL and ADCL, and there is a good prognosis of cure which is generally not so in the case of frank ADCL.

Canine visceral leishmaniasis due to Leishmania (L.) infantum chagasi in Amazonian Brazil: comparison of the parasite density from the skin, lymph node and visceral tissues between symptomatic and asymptomatic, seropositive dogs

A leishmaniose visceral canina (LVC) é reconhecida pelas características clínicas da doença e é altamente letal. A infecção, entretanto, pode ser totalmente assintomática em alguns cães soropositivos, o que tem levantado questão polêmica sobre a possibilidade desses animais, serem ou não uma fonte importante da infecção para o flebotomíneo, Lutzomyia longipalpis, o principal vetor da leishmaniose visceral americana (LVA). Neste estudo foram examinados 51 cães com LVC aguda, provenientes de área endêmica de LVA no Estado do Pará, Brasil, e a carga parasitária, formas amastigotas de, na pele, linfonodo poplíteo e vísceras (fígado e baço) foi comparada com a de nove cães assintomáticos soropositivos (IFAT-IgG). Fragmentos de biópsia desses tecidos obtidos post-mortem foram processados para análise através de imunohistoquímica, usando um anticorpo policlonal contra Leishmania sp. Os testes do Qui-quadrado (X²) e Mann Whitney foram usados para avaliar as médias da densidade de macrófagos infectados (p < 0,05). Os resultados mostraram que não houve diferença (p > 0,05) na densidade de macrófagos infectados da pele (10,7/mm² x 15,5/mm²) e do linfonodo (6,3/mm² x 8,3/mm²) entre cães assintomáticos e sintomáticos. Entretanto, a densidade de macrófagos infectados da víscera de cães sintomáticos (5,3/mm²) foi maior (p < 0,05) que a de cães assintomáticos (1,4/mm²). Estes resultados sugerem, fortemente, que cães naturalmente infectados por L. (L.) i. chagasi, assintomáticos ou sintomáticos, podem servir como fonte de infecção, principalmente, considerando-se que a densidade de macrófagos infectados da pele (10,7/mm² x 15,5/mm²), local onde o flebotomíneo vetor Lu. longipalpis realiza a hematofagia, foi maior (p < 0,05) que as do linfonodo (6,3/mm² x 8.3/mm²) e vísceras (1,4/mm2x 5,3/mm2).