Generation of reconstituted human plasma-derived secretory-like IgA and IgM and their protective effect on intestinal epithelium

Les muqueuses sont les membranes tapissant les cavités du corps, tel que le tube digestif, et sont en contact direct avec l'environnement extérieur. Ces surfaces subissent de nombreuses agressions pouvant être provoquées par des agents pathogènes (bactéries, toxines ou virus). Cela étant, les muqueuses sont munies de divers mécanismes de protection dont notamment deux protéines-clés permettant de neutraliser les agents pathogènes : les anticorps ou immunoglobulines sécrétoires A (SIgA) et M (SIgM). Ces anticorps sont, d'une part, fabriqués au niveau de la muqueuse sous forme d'IgA et IgM. Lorsqu'ils sont sécrétés dans l'intestin, ils se lient à une protéine appelée pièce sécrétoire et deviennent ainsi SIgA et SïgM. La présence de la pièce sécrétoire est essentielle pour que les anticorps puissent fonctionner au niveau de la muqueuse. D'autre part, ces anticorps sont également fabriqués dans d'autres parties du corps en général et se retrouvent dans le sang sous forme d'IgA et IgM Chez l'homme, des thérapies basées sur l'injection d'anticorps donnent de bons résultats depuis de nombreuses années notamment dans le traitement des infections. Bien qu'un certain nombre d'études ont montré le rôle protecteur des anticorps de type IgA et IgM, ceux-ci ne sont que rarement utilisés dans les thérapies actuelles. La principale raison de cette faible utilisation réside dans la production ou la purification des IgA/IgM ou SIgA/SIgM (la forme active au niveau des muqueuses) qui est difficile à réaliser à large échelle. Ainsi, le but de la thèse était (1) d'étudier la possibilité d'employer des IgA et des IgM provenant du sang humain pour générer des SIgA et SIgM et (2) de voir si ces anticorps reconstitués pouvaient neutraliser certains agents pathogènes au niveau des muqueuses. Tout d'abord, une analyse biochimique des IgA et des IgM issues du sang a été effectuée. Nous avons observé que ces anticorps avaient des caractéristiques similaires aux anticorps naturellement présents au niveau des muqueuses. De plus, nous avons confirmé que ces anticorps pouvaient être associés à une pièce sécrétoire produite en laboratoire pour ainsi donner des SIgA et SIgM reconstituées. Ensuite, la fonctionnalité des anticorps reconstitués a été testée grâce à un modèle de couche unique de cellules intestinales différenciées (monocouches) en laboratoire imitant la paroi de l'intestin. Ces monocouches ont été infectées par une bactérie pathogène, Shigella flexneri, responsable de la shigellose, une maladie qui provoque des diarrhées sanglantes chez l'homme. L'infection des monocouches par les bactéries seules ou combinées aux SIgA et SIgM reconstituées a été analysée. Nous avons observé que les dommages des cellules étaient moins importants lorsque les SIgA étaient présentes. Il apparaît que les SIgA neutralisent les bactéries en se fixant dessus, ce qui provoque leur agrégation, et diminuent l'inflammation des cellules. La protection s'est montrée encore plus efficace avec les SIgM. De plus, nous avons vu que les SIgA et SIgM pouvaient diminuer la sécrétion de facteurs nocifs produits par les bactéries. Utilisant le même modèle des monocouches, la fonctionnalité des IgA issues du sang humain a aussi été testée contre une toxine sécrétée par une bactérie appelée Clostridium diffìcile. Cette bactérie peut être présente naturellement dans l'intestin de personnes saines, cependant elle peut devenir pathogène dans certaines conditions et être à l'origine de diarrhées et d'inflammations de l'intestin via la sécrétion de toxines. Des préparations d'anticorps contenant une certaine proportion de SIgA reconstituées ont amené à une diminution des dommages et de l'inflammation des monocouches causés par la toxine. L'ensemble de ces résultats prometteurs, montrant que des SIgA et SIgM reconstituées peuvent protéger la paroi de l'intestin des infections bactériennes, nous conduisent à approfondir la recherche sur ces anticorps dans des modèles animaux. L'aboutissement de ce type de recherche permettrait de tester, par la suite, l'efficacité sur l'homme de traitements des infections des muqueuses par injection d'anticorps de type SIgA et SIgM reconstituées. Les muqueuses, telle que la muqueuse gastrointestinale, sont des surfaces constamment exposées à l'environnement et leur protection est garantie par une combinaison de barrières mécaniques, physicochimiques et immunologiques. Parmi les divers mécanismes de protection immunologiques, la réponse humorale spécifique joue un rôle prépondérant et est assurée par les immunoglobulines sécrétoires de type A (SIgA) et M (SIgM). Les thérapies basées sur l'administration d'IgG apportent d'importants bénéfices dans le domaine de la santé. Bien que des études sur les animaux aient montré que l'administration par voie muqueuse d'IgA polymérique (plgA) ou SIgA pouvaient protéger des infections, des IgA/SIgA n'ont été utilisées qu'occasionnellement dans les thérapies. De plus, des études précliniques et cliniques ont démontré que l'administration par voie systémique de préparations enrichies en IgM pouvait aussi protéger des infections. Cependant, l'administration par voie muqueuse d'IgM/SIgM purifiées n'a pas été examinée jusqu'à présent. La principale raison est que la purification ou là production des IgA/SIgA et IgM/SIgM est difficile à réaliser à large échelle. Le but de ce travail de thèse était d'examiner la possibilité d'associer des IgA et IgM polyclonals purifiées à partir du plasma humain avec une pièce sécrétoire recombinante humaine afin de générer des SIgA et SIgM reconstituées fonctionnelles. Tout d'abord, une analyse biochimique des IgA et IgM issues du plasma humain a été effectuée par buvardage de western et Chromatographie. Ces molécules avaient des caractéristiques biochimiques similaires à celles des immunoglobulines issues de la muqueuse. L'association entre plgA ou IgM issues du plasma humain et la pièce sécrétoire recombinante humaine a été confirmée, ainsi que la stoechiométrie 1:1 de l'association. Comme dans les conditions physiologiques, cette association permettait de retarder la dégradation des SIgA et SIgM reconstituées exposées à des protéases intestinales. Ensuite, la fonctionnalité et le mode d'action des IgA et IgM issues du plasma humain, ainsi que des SIgA et SIgM reconstituées, ont été explorés grâce à un modèle in vitro de monocouches de cellules intestinales épithéliales polarisées de type Caco-2, qui imite l'épithélium intestinal. Les monocouches ont été infectées par un pathogène entérique, Shigella flexneri, seul ou combiné aux immunoglobulines issues du plasma humain ou aux immunoglobulines sécrétoires reconstituées. Bien que les dommages des monocouches aient été retardés par les plgA et SIgA reconstituées, les IgM et SIgM reconstituées se sont montrées supérieures dans le maintien de l'intégrité des cellules. Une agrégation bactérienne et une diminution de l'inflammation des monocouches ont été observées avec les plgA et SIgA reconstituées. Ces effets étaient augmentés avec les IgM et SIgM reconstituées. De plus, il s'est révélé que les deux types d'immunoglobulines de type sécrétoire reconstituées agissaient directement sur la virulence des bactéries en réduisant leur sécrétion de facteurs de virulence. La fonctionnalité des IgA issues du plasma humain a aussi été testée contre la toxine A de Clostridium difficile grâce au même modèle de monocouches de cellules épithéliales. Nous avons démontré que des préparations enrichies en IgA provenant du plasma humain pouvaient diminuer les dommages et l'inflammation des monocouches induits par la toxine. L'ensemble de ces résultats démontrent que des IgA et IgM de type sécrétoire peuvent être générées à partir d'IgA et IgM issues du plasma humain en les associant à la pièce sécrétoire et que ces molécules protègent l'épithélium intestinal contre des bactéries pathogènes. Ces molécules pourraient dès lors être testées dans des modèles in vivo. Le but final serait de les utiliser chez l'homme à des fins d'immunisation passive dans le traitement de pathologies associées à la muqueuse telles que les infections. - Mucosal surfaces, such as gastrointestinal mucosa, are constantly exposed to the external environment and their protection is ensured by a combination of mechanical, physicochemical and immunological barriers. Among the various immunological defense mechanisms, specific humoral mucosal response plays a crucial role and is mediated by secretory immunoglobulins A (SIgA) and M (SIgM). Immunoglobulin therapy based on the administration of IgG molecules leads important health benefits. Even though animal studies have shown that mucosal application of polymeric IgA (plgA) or SIgA provided protection against infections, IgA/SIgA have been only used occasionally for therapeutic application. Moreover, preclinical and clinical studies have demonstrated that systemic administration of IgM-enriched preparations could also afford protection against infections. Nevertheless, mucosal application of purified IgM/SIgM has not been examined. The main reason is that the purification or production of IgA/SIgA and IgM/SIgM at large scale is difficult to achieve. The aim of this PhD project was to examine the possibility to associate polyclonal human plasma-derived IgA and IgM with recombinant human secretory component (SC) to generate functional secretoiy-like IgA and IgM. First, biochemical analysis of human plasma IgA and IgM was performed by western blotting and chromatography. These molecules exhibited the same biochemical features as mucosa-derived antibodies (Abs). The association between human plasma plgA or IgM and recombinant human SC was confirmed, as well as the 1:1 stoichiometry of association. Similarly to physiological conditions, this association delayed the degradation of secretory-like IgA or IgM by intestinal proteases. Secondly, the function activity and the mode of action of human plasma IgA and IgM, as well as secretory-like IgA and IgM were explored using an in vitro model of polarized intestinal epithelial Caco-2 cell monolayers mimicking intestinal epithelium. Cell monolayers were infected with an enteropathogen, Shigella flexneri, alone or in combination to plasma Abs or secretory-like Abs. Even though plasma plgA and secretoiy-like IgA resulted in a delay of bacteria-induced damages of cell monolayers, plasma IgM and secretory-like IgM were shown to be superior in maintenance of cell integrity. Polymeric IgA and secretory-like IgA induced bacterial aggregation and decreased cell monolayer inflammation, effects further amplified with IgM and secretory-like IgM. In addition, both secretory-like Abs directly impacted on bacterial virulence leading to a reduction in secretion of virulence factors by bacteria. The functionality of human plasma IgA was also tested against Clostridium difficile toxin A using Caco-2 cell monolayers. Human plasma IgA- enriched preparations led to a diminution of cell monolayer damages and a decrease of cellular inflammation induced by the toxin. The sum of these results demonstrates that secretory-like IgA and IgM can be generated from purified human plasma IgA and IgM associated to SC and that these molecules are functional to protect intestinal epithelium from bacterial infections. These molecules could be now tested using in vivo models. The final goal would be to use them by passive immunization in the treatment of mucosa-associated pathologies like infections in humans.

Transcriptional regulation of MDR1, a gene involved in antifungal drug resistance in Candida albicans

ABSTRACT Upregulation of the Major Facilitator transporter gene MDR1 (Multi_drug Resistance 1) is one of the mechanisms observed in Candida albicans clinical isolates developing resistance to azole antifungal agents. To better understand this phenomenon, the cis-acting regulatory elements present in a modulatable reporter system under the control of the MDR1 promoter were characterized. In an azole-susceptible strain, transcription of this reporter is transiently upregulated in response to either benomyl or H2O2, whereas its expression is constitutively high in an azole-resistant strain (FR2). Two cis-acting regulatory elements, that are necessary and sufficient to convey the same transcriptional responses to a heterologous promoter (CDR2), were identified within the MDR1promoter. The first element, called BRE (for Benomyl Response Element, -296 to -260 with respect to the ATG start codon), is required for benomyl-dependent MDR1 upregulation and for constitutive high expression of MDR1 in FR2. The second element, termed HRE (for H2O2 Response Element, -561 to -520), is required for H2O2-dependent MDR1 upregulation, but is dispensable for constitutive high expression. Two potential binding sites (TTAG/CTAA) for the blip transcription factor Cap1p lie within the HRE. Moreover, inactivation of CAP1 abolished the transient response to H2O2 and diminished significantly the transient response to benomyl. Cap1p, which has been previously implicated in cellular responses to oxidative stress, may thus play a transacting and positive regulatory role in benomyl- and H2O2-dependent transcription of MDR1. However, it is not the only transcription factor involved in the response of MDR1 to benomyl. A minimal BRE element (-290 to -273) that is sufficient to detect in vitro sequence-specific binding of protein complexes in crude extracts prepared from C. albicans was also delimited. Genome-wide transcript profiling analyses undertaken with a matched pair of clinical isolates, one of which being azole-resistant and upregulating MDR1, and with an azole-susceptible strain exposed to benomyl, revealed that genes specifically upregulated by benomyl harbour in their promoters Cap1p binding site(s). This strengthened the idea that Cap1p plays a role in benomyl-dependent upregulation of MDR1. BRE-like sequences were also identified in several genes co-regulated with MDR1 in both conditions, which was consistent with the involvement of the BRE in both processes. A set of 147 mutants lacking a single transcription factor gene was next screened for loss of MDR1response to benomyl. Unfortunately, none of the tested mutants showed a loss of benomyl-dependent MDR1 upregulation. Nevertheless, a significant diminution of the response was observed in the mutants in which the MADS-box transcription factor Mcm1p and the C2H2 zinc finger transcription factor orf19.13374p were inactivated, suggesting that Mcm1p and orf19.13374p are involved in MDR1response to benomyl. Interestingly, the BRE contains a perfect match to the binding consensus of Mcm1p, raising the possibility that MDR1may be a direct target of this transcriptional activator. In conclusion, while the identity of the trans-acting factors that bind to the BRE and HRE remains to be confirmed, the tools we have developed during characterization of the cis-acting elements of the MDR1promoter should now serve to elucidate the nature of the components that modulate its activity. RESUME La surexpression du gène MDR1 (pour Résistance Multidrogue 1), qui code pour un transporteur de la famille des Major Facilitators, est l'un des mécanismes observés dans les isolats cliniques de la levure Candida albicans développant une résistance aux agents antifongiques appelés azoles. Pour mieux comprendre ce phénomène, les éléments de régulation agissant en cis dans un système rapporteur modulable sous le contrôle du promoteur MDR1 ont été caractérisés. Dans une souche sensible aux azoles, la transcription de ce rapporteur est transitoirement surélevée en réponse soit au bénomyl soit à l'agent oxydant H2O2, alors que son expression est constitutivement élevée dans une souche résistante aux azoles (souche FR2). Deux éléments de régulation agissant en cis, nécessaires et suffisants pour transmettre les mêmes réponses transcriptionnelles à un promoteur hétérologue (CDR2), ont été identifiés dans le promoteur MDR1. Le premier élément, appelé BRE (pour Elément de Réponse au Bénomyl, de -296 à -260 par rapport au codon d'initiation ATG) est requis pour la surexpression de MDR1dépendante du bénomyl et pour l'expression constitutive de MDR1 dans FR2. Le deuxième élément, appelé HRE (pour Elément de Réponse à l'H2O2, de -561 à -520), est requis pour la surexpression de MDR1 dépendante de l'H2O2, mais n'est pas impliqué dans l'expression constitutive du gène MDR1. Deux sites de fixation potentiels (TTAG/CTAA) pour le facteur de transcription Cap1p ont été identifiés dans l'élément HRE. De plus, l'inactivation de CAP1 abolit la réponse transitoire à l'H2O2 et diminua significativement la réponse transitoire au bénomyl. Cap1p, qui est impliqué dans les réponses de la cellule au stress oxydatif, doit donc jouer un rôle positif en trans dans la surexpression de MDR1 dépendante du bénomyl et de l'H2O2. Cependant, ce n'est pas le seul facteur de transcription impliqué dans la réponse au bénomyl. Un élément BRE d'une longueur minimale (de -290 à -273) a également été défini et est suffisant pour détecter une interaction spécifique in vitro avec des protéines provenant d'extraits bruts de C. albicans. L'analyse du profil de transcription d'une paire d'isolats cliniques comprenant une souche résistante aux azoles surexprimant MDR1, et d'une souche sensible aux azoles exposée au bénomyl, a révélé que les gènes spécifiquement surexprimés par le bénomyl contiennent dans leurs promoteurs un ou plusieurs sites de fixation pour Cap1p. Ceci renforce l'idée que Cap1p joue un rôle dans la surexpression de MDR1dépendante du bénomyl. Une ou deux séquences ressemblant à l'élément BRE ont également été identifiées dans la plupart des gènes corégulés avec MDR1 dans ces deux conditions, ce qui était attendu compte-tenu du rôle joué par cet élément dans les deux processus. Une collection de 147 mutants dans lesquels un seul facteur de transcription est inactivé a été testée pour la perte de réponse au bénomyl de MDR1. Malheureusement, la surexpression de MDR1 dépendante du bénomyl n'a été perdue dans aucun des mutants testés. Néanmoins, une diminution significative de la réponse a été observée chez des mutants dans lesquels le facteur de transcription à MADS-box Mcm1p et le facteur de transcription à doigts de zinc de type C2H2 orf19.13374p ont été inactivés, suggérant que Mcm1p et orf19.13374p sont impliqués dans la réponse de MDR1au bénomyl. Il est intéressant de noter que la BRE contient une séquence qui s'aligne parfaitement avec la séquence consensus du site de fixation de Mcm1p, ce qui soulève la possibilité que MDR1 pourrait être une cible directe de cet activateur transcriptionnel. En conclusion, alors que l'identité des facteurs agissant en trans en se fixant à la BRE et à la HRE reste à être confirmée, les outils que nous avons développés au cours de la caractérisation des éléments agissant en cis sur le promoteur MDR1 peut maintenant servir à élucider la nature des composants modulant son activité.

Amniotic fluid insulin-like growth factor binding-protein 3 concentration as early indicator of fetal growth restriction

Rapport de synthèse : Introduction : La croissance foetale infra-utérine dépend d'un grand nombre de facteurs maternels, placentaires et foetaux. Une inadéquation d'un ou plusieurs de ces facteurs peut induire un retard de croissance infra-utérin (RCIU) ou au contraire une macrosomie. Les principales causes de RCIU comprennent les infections maternelles, l'éclampsie, les cardiovasculopathies maternelles, la toxicomanie, les malformations foetales et les insuffisances placentaires. Les facteurs endocriniens constituent un petit pourcentage des causes de RCIU, mais méritent que l'on s'y intéresse de plus près. Les facteurs hormonaux les plus importants pour la croissance fatale sont l'insuline et les insuline-like growth factors (IGFs) et non l'hormone de croissance (GH) qui joue un rôle majeur dans la croissance postnatale. Notre attention s'est portée sur IGF-1 qui joue un rôle important dans la croissance intrautérine. Sa biodisponibilité dépend de plusieurs protéines plasmatiques, les IGF-binding proteins (IGFBP 1 à 9). IGFBP-3 est la principale de ces IGFBPs, autant d'un point de vue quantitatif que fonctionnel. Nous avons cherché à déterminer si les concentrations d'IGF-1 et d'IGFBP-3 dans le liquide amniotique au début du deuxième trimestre étaient prédictives de la croissance infra-utérine. Les gènes codant pour IGF-1 et IGFBP-3 contenant certaines séquences polymorphiques, nous avons également étudié leur influence sur la croissance foetale. L'analyse du liquide amniotique présente l'avantage de pouvoir être effectuée dès la 14ème semaine d'aménorrhée alors que la biométrie foetale échographique ne permet pas à ce stade de déceler des anomalies de la croissance infra-utérine. Méthode : Nous avons analysé des échantillons de liquide amniotique prélevés entre la 14ème et la 18ème semaine de grossesse chez 196 patientes. Les concentrations d'IGF-1 et d'IGFBP-3 ont été dosées par ELISA, les polymorphismes analysés par PCR. Ces résultats ont été ensuite analysés en fonction du poids de naissance des nouveaux-nés, répartis en trois groupes normal pour l'âge gestationnel (AGA), petit pour l'âge gestationnel (SGA) et grand pour l'âge gestationnel (LGA). Résultats : Les concentrations d'IGFBP3 dans le liquide amniotique sont significativement plus élevées (p = 0.030) dans le groupe SGA par rapport au groupe AGA, d'autant plus quand les taux sont ajustés en fonction de paramètres tels que l'âge gestationnel lors de l'amniocentèse (ANCOVA analysis : p = 0.009). La distribution du polymorphisme VNTR (variable number of tandem repeat) dans la région promotrice d'IGF-1 au sein du groupe SGA est significativement différente de celle du groupe AGA (p = 0.029). En effet, la fréquence de l'association allélique 19CA/20CA est diminuée dans le groupe SGA. Nous n'avons pas identifié de différence de distribution des séquences polymorphiques d'IGFBP-3 entre les différents groupes. Conclusion : Une concentration élevée d'IGFBP-3 dans le liquide amniotique au début du deuxième trimestre est associée à un risque plus élevé de retard de croissance alors que l'association allélique 19CA/20CA dans la région polymorphique IGF-1 VNTR est un facteur protecteur.

Toll-like receptor 4 polymorphisms and aspergillosis in stem-cell transplantation.

BACKGROUND: Toll-like receptors (TLRs) are essential components of the immune response to fungal pathogens. We examined the role of TLR polymorphisms in conferring a risk of invasive aspergillosis among recipients of allogeneic hematopoietic-cell transplants. METHODS: We analyzed 20 single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in the toll-like receptor 2 gene (TLR2), the toll-like receptor 3 gene (TLR3), the toll-like receptor 4 gene (TLR4), and the toll-like receptor 9 gene (TLR9) in a cohort of 336 recipients of hematopoietic-cell transplants and their unrelated donors. The risk of invasive aspergillosis was assessed with the use of multivariate Cox regression analysis. The analysis was replicated in a validation study involving 103 case patients and 263 matched controls who received hematopoietic-cell transplants from related and unrelated donors. RESULTS: In the discovery study, two donor TLR4 haplotypes (S3 and S4) increased the risk of invasive aspergillosis (adjusted hazard ratio for S3, 2.20; 95% confidence interval [CI], 1.14 to 4.25; P=0.02; adjusted hazard ratio for S4, 6.16; 95% CI, 1.97 to 19.26; P=0.002). The haplotype S4 was present in carriers of two SNPs in strong linkage disequilibrium (1063 A/G [D299G] and 1363 C/T [T399I]) that influence TLR4 function. In the validation study, donor haplotype S4 also increased the risk of invasive aspergillosis (adjusted odds ratio, 2.49; 95% CI, 1.15 to 5.41; P=0.02); the association was present in unrelated recipients of hematopoietic-cell transplants (odds ratio, 5.00; 95% CI, 1.04 to 24.01; P=0.04) but not in related recipients (odds ratio, 2.29; 95% CI, 0.93 to 5.68; P=0.07). In the discovery study, seropositivity for cytomegalovirus (CMV) in donors or recipients, donor positivity for S4, or both, as compared with negative results for CMV and S4, were associated with an increase in the 3-year probability of invasive aspergillosis (12% vs. 1%, P=0.02) and death that was not related to relapse (35% vs. 22%, P=0.02). CONCLUSIONS: This study suggests an association between the donor TLR4 haplotype S4 and the risk of invasive aspergillosis among recipients of hematopoietic-cell transplants from unrelated donors.

Transcriptional activation of the macrophage migration-inhibitory factor gene by the corticotropin-releasing factor is mediated by the cyclic adenosine 3',5'- monophosphate responsive element-binding protein CREB in pituitary cells.

Macrophage migration-inhibitory factor (MIF) has recently been identified as a pituitary hormone that functions as a counterregulatory modulator of glucocorticoid action within the immune system. In the anterior pituitary gland, MIF is expressed in TSH- and ACTH-producing cells, and its secretion is induced by CRF. To investigate MIF function and regulation within pituitary cells, we initiated the characterization of the MIF 5'-regulatory region of the gene. The -1033 to +63 bp of the murine MIF promoter was cloned 5' to a luciferase reporter gene and transiently transfected into freshly isolated rat anterior pituitary cells. This construct drove high basal transcriptional activity that was further enhanced after stimulation with CRF or with an activator of adenylate cyclase. These transcriptional effects were associated with a concomitant rise in ACTH secretion in the transfected cells and by an increase in MIF gene expression as assessed by Northern blot analysis. A cAMP-responsive element (CRE) was identified within the MIF promoter region which, once mutated, abolished the cAMP responsiveness of the gene. Using this newly identified CRE, DNA-binding activity was detected by gel retardation assay in nuclear extracts prepared from isolated anterior pituitary cells and AtT-20 corticotrope tumor cells. Supershift experiments using antibodies against the CRE-binding protein CREB, together with competition assays and the use of recombinant CREB, allowed the detection of CREB-binding activity with the identified MIF CRE. These data demonstrate that CREB is the mediator of the CRF-induced MIF gene transcription in pituitary cells through an identified CRE in the proximal region of the MIF promoter.

Genome organization and gene expression shape the transposable element distribution in the Drosophila melanogaster euchromatin.

The distribution of transposable elements (TEs) in a genome reflects a balance between insertion rate and selection against new insertions. Understanding the distribution of TEs therefore provides insights into the forces shaping the organization of genomes. Past research has shown that TEs tend to accumulate in genomic regions with low gene density and low recombination rate. However, little is known about the factors modulating insertion rates across the genome and their evolutionary significance. One candidate factor is gene expression, which has been suggested to increase local insertion rate by rendering DNA more accessible. We test this hypothesis by comparing the TE density around germline- and soma-expressed genes in the euchromatin of Drosophila melanogaster. Because only insertions that occur in the germline are transmitted to the next generation, we predicted a higher density of TEs around germline-expressed genes than soma-expressed genes. We show that the rate of TE insertions is greater near germline- than soma-expressed genes. However, this effect is partly offset by stronger selection for genome compactness (against excess noncoding DNA) on germline-expressed genes. We also demonstrate that the local genome organization in clusters of coexpressed genes plays a fundamental role in the genomic distribution of TEs. Our analysis shows that-in addition to recombination rate-the distribution of TEs is shaped by the interaction of gene expression and genome organization. The important role of selection for compactness sheds a new light on the role of TEs in genome evolution. Instead of making genomes grow passively, TEs are controlled by the forces shaping genome compactness, most likely linked to the efficiency of gene expression or its complexity and possibly their interaction with mechanisms of TE silencing.

A novel family of dehydrin-like proteins is involved in stress response in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus.

 During a search for genes controlling conidial dormancy in Aspergillus fumigatus, two dehydrin-like genes, DprA and DprB, were identified. The deduced proteins had repeated stretches of 23 amino acids that contained a conserved dehydrin-like protein (DPR) motif. Disrupted DprAΔ mutants were hypersensitive to oxidative stress and to phagocytic killing, whereas DprBΔ mutants were impaired in osmotic and pH stress responses. However, no effect was observed on their pathogenicity in our experimental models of invasive aspergillosis. Molecular dissection of the signaling pathways acting upstream showed that expression of DprA was dependent on the stress-activated kinase SakA and the cyclic AMP-protein kinase A (cAMP-PKA) pathways, which activate the bZIP transcription factor AtfA, while expression of DprB was dependent on the SakA mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, and the zinc finger transcription factor PacC. Fluorescent protein fusions showed that both proteins were associated with peroxisomes and the cytosol. Accordingly, DprA and DprB were important for peroxisome function. Our findings reveal a novel family of stress-protective proteins in A. fumigatus and, potentially, in filamentous ascomycetes.

Dispensable role of myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) and MyD88-dependent toll-like receptors (TLRs) in a murine model of osteoarthritis.

OBJECTIVES: The aim of our study was to evaluate the role of cell-membrane expressed TLRs and the signaling molecule MyD88 in a murine model of OA induced by knee menisectomy (surgical partial removal of the medial meniscus [MNX]). METHODS: OA was induced in 8-10weeks old C57Bl/6 wild-type (WT) female (n=7) mice and in knockout (KO) TLR-1 (n=7), -2 (n=8), -4 (n=9) -6 (n=5), MyD88 (n=8) mice by medial menisectomy, using the sham-operated contralateral knee as a control. Cartilage destruction and synovial inflammation were evaluated by knee joint histology using the OARSI scoring method. Apoptotic chondrocytes and cartilage metabolism (collagen II synthesis and MMP-mediated aggrecan degradation) were analyzed using immunohistochemistry. RESULTS: Operated knees exhibited OA features at 8weeks post-surgery compared to sham-operated ones. In menisectomized TLR-1, -2, -4, and -6 deficient mice, cartilage lesions, synovial inflammation and cartilage metabolism were similar to that in operated WT mice. Accordingly, using the same approach, we found no significant protection in MyD88-deficient mice in terms of OA progression as compared to WT littermates. CONCLUSIONS: Deficiency of TLRs or their signalling molecule MyD88 did not impact on the severity of experimental OA. Our results demonstrate that MyD88-dependent TLRs are not involved in this murine OA model. Moreover, the dispensable role of MyD88, which is also an adaptor for IL-1 receptor signaling, suggests that IL-1 is not a key mediator in the development of OA. This latter hypothesis is strengthened by the lack of efficiency of IL-1β antagonist in the treatment of OA.

Chlamydiaceae and Chlamydia-like organisms in free-living small mammals in Europe and Afghanistan.

Few data are available on the occurrence of chlamydial infections in wild small mammals. We investigated the significance of free-living small mammals as reservoirs or transmission hosts for microorganisms of the phylum/class Chlamydiae. We obtained 3,664 tissue samples from 911 animals in Switzerland, Germany, Austria, the Czech Republic, and Afghanistan. Samples included internal organs (n = 3,652) and feces (n = 12) from 679 rodents (order Rodentia) and 232 insectivores (order Soricomorpha) and were tested by three TaqMan® real-time PCRs specific for members of the family Chlamydiaceae and selected Chlamydia-like organisms such as Parachlamydia spp. and Waddlia spp. Only one of 911 (0.11%) animals exhibited a questionable positive result by Chlamydiaceae-specific real-time PCR. Five of 911 animals were positive by specific real-time PCR for Parachlamydia spp. but could not be confirmed by quantitative PCR targeting the Parachlamydia acanthamoebae secY gene (secY qPCR). One of 746 animals (0.13%) was positive by real-time PCR for Waddlia chondrophila. This result was confirmed by Waddlia secY qPCR. This is the first detection of Chlamydia-like organisms in small wildlife in Switzerland. Considering previous negative results for Chlamydiaceae in wild ruminant species from Switzerland, these data suggest that wild small mammals are unlikely to be important carriers or transport hosts for Chamydiaceae and Chlamydia-like organisms.

Cutting edge: a Toll-like receptor 2 polymorphism that is associated with lepromatous leprosy is unable to mediate mycobacterial signaling.

Toll-like receptors (TLRs) are key mediators of the innate immune response to microbial pathogens. We investigated the role of TLRs in the recognition of Mycobacterium leprae and the significance of TLR2Arg(677)Trp, a recently discovered human polymorphism that is associated with lepromatous leprosy. In mice, TNF-alpha production in response to M. leprae was essentially absent in TLR2-deficient macrophages. Similarly, human TLR2 mediated M. leprae-dependent activation of NF-kappaB in transfected Chinese hamster ovary and human embryonic kidney 293 cells, with enhancement of this signaling in the presence of CD14. In contrast, activation of NF-kappaB by human TLR2Arg(677)Trp was abolished in response to M. leprae and Mycobacterium tuberculosis. The impaired function of this TLR2 variant provides a molecular mechanism for the poor cellular immune response associated with lepromatous leprosy and may have important implications for understanding the pathogenesis of other mycobacterial infections.

Role of the superior parietal lobules in letter-identity processing within strings: FMRI evidence from skilled and dyslexic readers.

Traditionally, the ventral occipito-temporal (vOT) area, but not the superior parietal lobules (SPLs), is thought as belonging to the neural system of visual word recognition. However, some dyslexic children who exhibit a visual attention span disorder - i.e. poor multi-element parallel processing - further show reduced SPLs activation when engaged in visual multi-element categorization tasks. We investigated whether these parietal regions further contribute to letter-identity processing within strings. Adult skilled readers and dyslexic participants with a visual attention span disorder were administered a letter-string comparison task under fMRI. Dyslexic adults were less accurate than skilled readers to detect letter identity substitutions within strings. In skilled readers, letter identity differs related to enhanced activation of the left vOT. However, specific neural responses were further found in the superior and inferior parietal regions, including the SPLs bilaterally. Two brain regions that are specifically related to substituted letter detection, the left SPL and the left vOT, were less activated in dyslexic participants. These findings suggest that the left SPL, like the left vOT, may contribute to letter string processing.

Strategic Plan Iowa Workforce Development October, 2004

For the 2004 strategic planning process at Iowa Workforce Development, Director Richard Running asked for as much input from all staff as possible. As a result, planning staff designed an extensive process to gather input over about a three month period during the late spring and summer: • A Guide to Staff Involvement was drafted and distributed to staff in offices throughout the state. This guide provided a brief explanation of the planning process and quoted extensively from the Vilsack/Pederson Leadership Agenda and the 2003 IWD strategic plan to illustrate each step and to show examples of alignment. The guide also provided suggestions for staff in various locations and work units to conduct their own planning sessions. The structure was designed to solicit feedback regarding elements (vision, mission, guiding principles, goals and strategies) of the existing 2003 plan. Particular attention was devoted to securing non-management staff’s perspective during the internal and external assessment exercises. • Several local offices did conduct their own structured input sessions following the suggested guidelines and sent the results to planning staff in the central administrative offices. • Other work units in many locations opted to ask planning staff to facilitate planning sessions for them. The results of these sessions were also gathered by planning staff. In all, dozens of input sessions were held and hundreds of IWD staff participated directly in the process. Because all the sessions followed similar guidelines, it was relatively easy to combine all of the input received and spot common themes that surfaced from the many sessions. A composite of all the flip chart notes was compiled into one large document (for those who like lots of detail) and another document summarized the key themes that emerged. This information was used in a day-long planning retreat on August 20. Management staff members from throughout the department were invited and each work unit and sub-state region also brought a non-management staff person as well. This group reviewed the themes from the earlier sessions and then addressed each element of the 2003 plan, proposing refinements for almost all sections. Subsequently, senior management reviewed the results of the retreat and made the final decisions for the new 2004 plan. This thorough approach, with its special emphasis on input from line staff, did result in some significant changes to IWD’s plan. Local office staff, for example, consistently expressed the need to step up our marketing efforts, especially with employers. Another need that was expressed clearly and often was the need to beef up staff training efforts, much of the capacity for which had been lost in budget and staff reductions a few years ago. Neither of these issues is new, but the degree of concern expressed by IWD staff has caused us to elevate their importance in this year’s plan.

Presence of an oligodendroglioma-like component in newly diagnosed glioblastoma identifies a pathogenetically heterogeneous subgroup and lacks prognostic value: central pathology review of the EORTC_26981/NCIC_CE.3 trial.

Glioblastoma (GBM) is a morphologically heterogeneous tumor type with a median survival of only 15 months in clinical trial populations. However, survival varies greatly among patients. As part of a central pathology review, we addressed the question if patients with GBM displaying distinct morphologic features respond differently to combined chemo-radiotherapy with temozolomide. Morphologic features were systematically recorded for 360 cases with particular focus on the presence of an oligodendroglioma-like component and respective correlations with outcome and relevant molecular markers. GBM with an oligodendroglioma-like component (GBM-O) represented 15% of all confirmed GBM (52/339) and was not associated with a more favorable outcome. GBM-O encompassed a pathogenetically heterogeneous group, significantly enriched for IDH1 mutations (19 vs. 3%, p = 0.003) and EGFR amplifications (71 vs. 48%, p = 0.04) compared with other GBM, while co-deletion of 1p/19q was found in only one case and the MGMT methylation frequency was alike (47 vs. 46%). Expression profiles classified most of the GBM-O into two subtypes, 36% (5/14 evaluable) as proneural and 43% as classical GBM. The detection of pseudo-palisading necrosis (PPN) was associated with benefit from chemotherapy (p = 0.0002), while no such effect was present in the absence of PPN (p = 0.86). In the adjusted interaction model including clinical prognostic factors and MGMT status, PPN was borderline nonsignificant (p = 0.063). Taken together, recognition of an oligodendroglioma-like component in an otherwise classic GBM identifies a pathogenetically mixed group without prognostic significance. However, the presence of PPN may indicate biological features of clinical relevance for further improvement of therapy.