Cloning of the Bone Gla Protein gene from the teleost fish Sparus aurata (gilthead seabream). Molecular organization, developmental appearance and evolutionary implications

Tese de Doutoramento, Biologia Molecular, Faculdade de Ciências do Mar e do Ambiente, Universidade do Algarve, 2001

Using genomics for drug discovery in medulloblastoma

Tese de doutoramento, Medicina (Neurocirurgia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

Long-term follow-up of high-dose chemotherapy with autologous stem-cell transplantation and response-adapted whole-brain radiotherapy for newly diagnosed primary CNS lymphoma: results of the multicenter Ostdeutsche Studiengruppe Hamato-Onkologie OSHO-53 phase II study

Introduction: We previously reported the results of a phase II study for patients with newly diagnosed primary CNS lymphoma (PCNSL) treated with autologous peripheral blood stem-cell transplantation (aPBSCT) and responseadapted whole brain radiotherapy (WBRT). The purpose of this report is to update the initial results and provide long-term data regarding overall survival, prognostic factors, and the risk of treatment-related neurotoxicity.Methods: A long-term follow-up was conducted on surviving primary central nervous system lymphoma patients having been treated according to the ,,OSHO-53 study", which was initiated by the Ostdeutsche Studiengruppe Hamatologie-Onkologie. Between August 1999 and October 2004 twentythree patients with an average age of 55 and median Karnofsky performance score of 70% were enrolled and received high-dose mthotrexate (HD-MTX) on days 1 and 10. In case of at least a partial remission (PR), high-dose busulfan/ thiotepa (HD-BuTT) followed by aPBSCT was performed. Patients without response to induction or without complete remission (CR) after HD-BuTT received WBRT. All patients (n=8), who are alive in 2011, were contacted and Mini Mental State examination (MMSE) and the EORTC QLQ-C30 were performed.Results: Eight patients are still alive with a median follow-up of 116,9 months (79 - 141, range). One of them suffered from a late relapse eight and a half years after initial diagnosis of PCNSL, another one suffers from a gall bladder carcinoma. Both patients are alive, the one with the relapse of PCNSL has finished rescue therapy and is further observed, the one with gall baldder carcinoma is still under therapy. MMSE and QlQ-C30 showed impressive results in the patients, who were not irradiated. Only one of the irradiated patients is still alive with a clear neurologic deficit but acceptable quality of life.Conclusions: Long-term follow-up of our patients, who were included in the OSHO-53 study show an overall survival of 30 percent. If WBRT can be avoided no long-term neurotoxicity has been observed and the patients benefit from excellent Quality of Life. Induction chemotherapy with two cycles of HD-MTX should be intensified to improve the unsatisfactory OAS of 30 percent.

Neo/adjuvant chemotherapy does not improve outcome in resected primary synovial sarcoma: a study of the French Sarcoma Group.

BACKGROUND: There are only scarce data about the benefit of adjunctive chemotherapy in patients with localized synovial sarcoma (SS). PATIENTS AND METHODS: Data from 237 SS patients recorded in the database of the French Sarcoma Group were retrospectively analyzed. The respective impact of radiotherapy, neo-adjuvant chemotherapy and adjuvant chemotherapy on overall survival (OS), local recurrence-free survival (LRFS) and distant recurrence-free survival (DRFS) were assessed after adjustment to prognostic factors. RESULTS: The median follow-up was 58 months (range 1-321). Adjuvant, neo-adjuvant chemotherapy and postoperative radiotherapy were administered in 112, 45 and 181 cases, respectively. In all, 59% of patients treated with chemotherapy received an ifosfamide-containing regimen. The 5-year OS, LRFS and DRFS rates were 64.0%, 70% and 57%, respectively. On multivariate analysis, age >35 years old, grade 3 and not-R0 margins were highly significant independent predictors of worse OS. After adjustment to prognostic factors, radiotherapy significantly improved LRFS but not DRFS or OS. Neither neo-adjuvant nor adjuvant chemotherapy had significant impact on OS, LRFS or DRFS. CONCLUSION: As for other high-grade soft-tissue sarcomas, well-planned wide surgical excision with adjuvant radiotherapy remains the cornerstone of treatment for SS. Neo-adjuvant or adjuvant chemotherapy should not be delivered outside a clinical trial setting.

Gene expression mapping in neuropathic pain : molecular plasticity in nociceptors and superficial dorsal horn

RESUME : La douleur neuropathique est le résultat d'une lésion ou d'un dysfonctionnement du système nerveux. Les symptômes qui suivent la douleur neuropathique sont sévères et leur traitement inefficace. Une meilleure approche thérapeutique peut être proposée en se basant sur les mécanismes pathologiques de la douleur neuropathique. Lors d'une lésion périphérique une douleur neuropathique peut se développer et affecter le territoire des nerfs lésés mais aussi les territoires adjacents des nerfs non-lésés. Une hyperexcitabilité des neurones apparaît au niveau des ganglions spinaux (DRG) et de la corne dorsale (DH) de la moelle épinière. Le but de ce travail consiste à mettre en évidence les modifications moléculaires associées aux nocicepteurs lésés et non-lésés au niveau des DRG et des laminae I et II de la corne dorsale, là où l'information nociceptive est intégrée. Pour étudier les changements moléculaires liés à la douleur neuropathique nous utilisons le modèle animal d'épargne du nerf sural (spared nerve injury model, SNI) une semaine après la lésion. Pour la sélection du tissu d'intérêt nous avons employé la technique de la microdissection au laser, afin de sélectionner une sous-population spécifique de cellules (notamment les nocicepteurs lésés ou non-lésés) mais également de prélever le tissu correspondant dans les laminae superficielles. Ce travail est couplé à l'analyse à large spectre du transcriptome par puce ADN (microarray). Par ailleurs, nous avons étudié les courants électriques et les propriétés biophysiques des canaux sodiques (Na,,ls) dans les neurones lésés et non-lésés des DRG. Aussi bien dans le système nerveux périphérique, entre les neurones lésés et non-lésés, qu'au niveau central avec les aires recevant les projections des nocicepteurs lésés ou non-lésés, l'analyse du transcriptome montre des différences de profil d'expression. En effet, nous avons constaté des changements transcriptionnels importants dans les nocicepteurs lésés (1561 gènes, > 1.5x et pairwise comparaison > 77%) ainsi que dans les laminae correspondantes (618 gènes), alors que ces modifications transcriptionelles sont mineures au niveau des nocicepteurs non-lésés (60 gènes), mais important dans leurs laminae de projection (459 gènes). Au niveau des nocicepteurs, en utilisant la classification par groupes fonctionnels (Gene Ontology), nous avons observé que plusieurs processus biologiques sont modifiés. Ainsi des fonctions telles que la traduction des signaux cellulaires, l'organisation du cytosquelette ainsi que les mécanismes de réponse au stress sont affectés. Par contre dans les neurones non-lésés seuls les processus biologiques liés au métabolisme et au développement sont modifiés. Au niveau de la corne dorsale de la moelle, nous avons observé des modifications importantes des processus immuno-inflammatoires dans l'aire affectée par les nerfs lésés et des changements associés à l'organisation et la transmission synaptique au niveau de l'aire des nerfs non-lésés. L'analyse approfondie des canaux sodiques a démontré plusieurs changements d'expression, principalement dans les neurones lésés. Les analyses fonctionnelles n'indiquent aucune différence entre les densités de courant tétrodotoxine-sensible (TTX-S) dans les neurones lésés et non-lésés même si les niveaux d'expression des ARNm des sous-unités TTX-S sont modifiés dans les neurones lésés. L'inactivation basale dépendante du voltage des canaux tétrodotoxine-insensible (TTX-R) est déplacée vers des potentiels positifs dans les cellules lésées et non-lésées. En revanche la vitesse de récupération des courants TTX-S et TTX-R après inactivation est accélérée dans les neurones lésés. Ces changements pourraient être à l'origine de l'altération de l'activité électrique des neurones sensoriels dans le contexte des douleurs neuropathiques. En résumé, ces résultats suggèrent l'existence de mécanismes différenciés affectant les neurones lésés et les neurones adjacents non-lésés lors de la mise en place la douleur neuropathique. De plus, les changements centraux au niveau de la moelle épinière qui surviennent après lésion sont probablement intégrés différemment selon la perception de signaux des neurones périphériques lésés ou non-lésés. En conclusion, ces modulations complexes et distinctes sont probablement des acteurs essentiels impliqués dans la genèse et la persistance des douleurs neuropathiques. ABSTRACT : Neuropathic pain (NP) results from damage or dysfunction of the peripheral or central nervous system. Symptoms associated with NP are severe and difficult to treat. Targeting NP mechanisms and their translation into symptoms may offer a better therapeutic approach.Hyperexcitability of the peripheral and central nervous system occurs in the dorsal root ganglia (DRG) and the dorsal horn (DH) of the spinal cord. We aimed to identify transcriptional variations in injured and in adjacent non-injured nociceptors as well as in corresponding laminae I and II of DH receiving their inputs.We investigated changes one week after the injury induced by the spared nerve injury model of NP. We employed the laser capture microdissection (LCM) for the procurement of specific cell-types (enrichment in nociceptors of injured/non-injured neurons) and laminae in combination with transcriptional analysis by microarray. In addition, we studied functionál properties and currents of sodium channels (Nav1s) in injured and neighboring non-injured DRG neurons.Microarray analysis at the periphery between injured and non-injured DRG neurons and centrally between the area of central projections from injured and non-injured neurons show significant and differential expression patterns. We reported changes in injured nociceptors (1561 genes, > 1.5 fold, >77% pairwise comparison) and in corresponding DH laminae (618 genes), while less modifications occurred in non-injured nociceptors (60 genes) and in corresponding DH laminae (459 genes). At the periphery, we observed by Gene Ontology the involvement of multiple biological processes in injured neurons such as signal transduction, cytoskeleton organization or stress responses. On contrast, functional overrepresentations in non-injured neurons were noted only in metabolic or developmentally related mechanisms. At the level of superficial laminae of the dorsal horn, we reported changes of immune and inflammatory processes in injured-related DH and changes associated with synaptic organization and transmission in DH corresponding to non-injured neurons. Further transcriptional analysis of Nav1s indicated several changes in injured neurons. Functional analyses of Nav1s have established no difference in tetrodotoxin-sensitive (TTX-S) current densities in both injured and non-injured neurons, despite changes in TTX-S Nav1s subunit mRNA levels. The tetrodotoxin-resistant (TTX-R) voltage dependence of steady state inactivation was shifted to more positive potentials in both injured and non-injured neurons, and the rate of recovery from inactivation of TTX-S and TTX-R currents was accelerated in injured neurons. These changes may lead to alterations in neuronal electrogenesis. Taken together, these findings suggest different mechanisms occurring in the injured neurons and the adjacent non-injured ones. Moreover, central changes after injury are probably driven in a different manner if they receive inputs from injured or non-injured neurons. Together, these distinct and complex modulations may contribute to NP.

Molecular screening of ADAMTSL2 gene in 33 patients reveals the genetic heterogeneity of geleophysic dysplasia.

Background Geleophysic dysplasia (GD, OMIM 231050) is an autosomal recessive disorder characterised by short stature, small hands and feet, stiff joints, and thick skin. Patients often present with a progressive cardiac valvular disease which can lead to an early death. In a previous study including six GD families, we have mapped the disease gene on chromosome 9q34.2 and identified mutations in the A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin repeats-like 2 gene (ADAMTSL2). Methods Following this study, we have collected the samples of 30 additional GD families, including 33 patients and identified ADAMTSL2 mutations in 14/33 patients, comprising 13 novel mutations. The absence of mutation in 19 patients prompted us to compare the two groups of GD patients, namely group 1, patients with ADAMTSL2 mutations (n=20, also including the 6 patients from our previous study), and group 2, patients without ADAMTSL2 mutations (n=19). Results The main discriminating features were facial dysmorphism and tip-toe walking, which were almost constantly observed in group 1. No differences were found concerning heart involvement, skin thickness, recurrent respiratory and ear infections, bronchopulmonary insufficiency, laryngo-tracheal stenosis, deafness, and radiographic features. Conclusions It is concluded that GD is a genetically heterogeneous condition. Ongoing studies will hopefully lead to the identification of another disease gene.

Predicting adverse events in children with fever and chemotherapy-induced neutropenia: the prospective multicenter SPOG 2003 FN study.

PURPOSE To develop a score predicting the risk of adverse events (AEs) in pediatric patients with cancer who experience fever and neutropenia (FN) and to evaluate its performance. PATIENTS AND METHODS Pediatric patients with cancer presenting with FN induced by nonmyeloablative chemotherapy were observed in a prospective multicenter study. A score predicting the risk of future AEs (ie, serious medical complication, microbiologically defined infection, radiologically confirmed pneumonia) was developed from a multivariate mixed logistic regression model. Its cross-validated predictive performance was compared with that of published risk prediction rules. Results An AE was reported in 122 (29%) of 423 FN episodes. In 57 episodes (13%), the first AE was known only after reassessment after 8 to 24 hours of inpatient management. Predicting AE at reassessment was better than prediction at presentation with FN. A differential leukocyte count did not increase the predictive performance. The score predicting future AE in 358 episodes without known AE at reassessment used the following four variables: preceding chemotherapy more intensive than acute lymphoblastic leukemia maintenance (weight = 4), hemoglobin > or = 90 g/L (weight = 5), leukocyte count less than 0.3 G/L (weight = 3), and platelet count less than 50 G/L (weight = 3). A score (sum of weights) > or = 9 predicted future AEs. The cross-validated performance of this score exceeded the performance of published risk prediction rules. At an overall sensitivity of 92%, 35% of the episodes were classified as low risk, with a specificity of 45% and a negative predictive value of 93%. CONCLUSION This score, based on four routinely accessible characteristics, accurately identifies pediatric patients with cancer with FN at risk for AEs after reassessment.

Subgroup-specific structural variation across 1,000 medulloblastoma genomes.

Medulloblastoma, the most common malignant paediatric brain tumour, is currently treated with nonspecific cytotoxic therapies including surgery, whole-brain radiation, and aggressive chemotherapy. As medulloblastoma exhibits marked intertumoural heterogeneity, with at least four distinct molecular variants, previous attempts to identify targets for therapy have been underpowered because of small samples sizes. Here we report somatic copy number aberrations (SCNAs) in 1,087 unique medulloblastomas. SCNAs are common in medulloblastoma, and are predominantly subgroup-enriched. The most common region of focal copy number gain is a tandem duplication of SNCAIP, a gene associated with Parkinson's disease, which is exquisitely restricted to Group 4α. Recurrent translocations of PVT1, including PVT1-MYC and PVT1-NDRG1, that arise through chromothripsis are restricted to Group 3. Numerous targetable SCNAs, including recurrent events targeting TGF-β signalling in Group 3, and NF-κB signalling in Group 4, suggest future avenues for rational, targeted therapy.

Could concomitant radio-chemotherapy improve the outcomes of early-stage node negative anal canal cancer patients? A retrospective analysis of 122 patients.

One hundred twenty-two early-stage anal canal cancer patients (median age: 69 years) were treated with curative radiotherapy with (70 patients) or without (52 patients) concomitant chemotherapy. Median follow-up was 65 months (range: 4-238). At multivariate analysis, concomitant chemotherapy significantly improved local control (p = .007). Local control significantly influenced all considered endpoints, except the metastases free survival. The global rates of G3-G4 acute and late toxicity were 13.1% and 8.2%, respectively, and they were not increased by concomitant chemotherapy. Finally, concomitant chemotherapy is efficacious and safe in the treatment of T1-2N0 anal canal cancer patients and should be prospectively studied.

Développement et caractérisation de nouveaux modèles du cancer épithélial de l’ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire (EOC) est le plus mortel des cancers gynécologiques. Cette maladie complexe progresse rapidement de façon difficilement décelable aux stades précoces. De plus, malgré une chirurgie cytoréductive et des traitements de chimiothérapie le taux de survie des patientes diagnostiquées aux stades avancées demeurt faible. Dans le but d’étudier l’EOC dans un contexte ex vivo, l’utilisation de modèles cellulaires est indispensable. Les lignées cellulaires d’EOC sont un outil pratique pour la recherche cependant, la façon dont l'expression des gènes est affectée en culture par comparaison à la tumeur d'origine n'est pas encore bien élucidée. Notre objectif était donc de développer et de caractériser de nouveaux modèles de culture in vitro qui réflèteront plus fidèlement la maladie in vivo. Nous avons tout d’abord utiliser des lignées cellulaires disponibles au laboratoire afin de mettre au point un modèle 3D de culture in vitro d’EOC. Des sphéroïdes ont été générés à l’aide de la méthode des gouttelettes inversées, une méthode pionnière pour la culture des cellules tumorales. Nous avons ensuite procédé à une analyse des profils d’expression afin de comparer le modèle sphéroïde au modèle de culture en monocouche et le modèle xénogreffe in vivo. Ainsi, nous avons identifié des gènes stratifiant les modèles tridimensionnels, tant in vivo qu’in vitro, du modèle 2D monocouche. Parmi les meilleurs candidats, nous avons sélectionné S100A6 pour une caractérisation ultérieure. L’expression de ce gène fût modulée afin d’étudier l’impact de son inhibition sur les paramètres de croissance des sphéroïdes. L’inhibition de ce gène a comme effet de réduire la motilité cellulaire mais seulement au niveau du modèle sphéroïde. Finalement, toujours dans l’optique de développer des modèles d’EOC les plus représentatifs de la maladie in vivo, nous avons réussi à développer des lignées cellulaires uniques dérivées de patientes atteintes d’EOC du type séreux, soit le plus commun des EOC. Jusque là, très peu de lignées cellulaires provenant de ce type de cancer et de patientes n’ayant pas reçu de chimiothérapie ont été produites. De plus, nous avons pour la première fois caractérise des lignées d’EOC de type séreux provenant à la fois de l’ascite et de la tumeur solide de la même patiente.

Mutations impliquées dans la progression du cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) est le cancer gynécologique le plus létal. Plus de 70% des patientes diagnostiquées avec une tumeur de stade avancé rechutent suite aux traitements chimiothérapeutiques de première ligne, la survie à cinq ans étant ainsi très faible. Afin de mieux comprendre l’évolution de la maladie, nous avons recherché de nouveaux gènes, responsables de l’initiation et de la progression du CEO. Précédemment, des lignées cellulaires ont été dérivées à partir de la tumeur primaire et récurrente et/ou d’ascites de trois patientes. Le séquençage de l’ARN de ces lignées par la technologie de séquençage de nouvelle génération (TSNG) nous a permis d’identifier des mutations ponctuelles qui pourraient nous indiquer des gènes dérégulés dans le CEO. La TSNG est un bon outil qui permet d’identifier et de cribler à grande échelle des mutations. Nous avons sélectionné PLEC1, SCRIB, NCOR2, SEMA6C, IKBKB, GLCE et ITGAE comme gènes candidats présentant des mutations dans nos lignées et ayant une relation fonctionnelle avérée avec le cancer. Étant donné que la TSNG est une technique à taux de fiabilité limité, nous avons validé ces mutations par séquençage Sanger. Ensuite, nous avons étudié l’effet de ces mutations sur la structure protéique et l’expression de PLEC1, de SCRIB et de SEMA6C. Seules certaines mutations dans les gènes PLEC1, SCRIB et SEMA6C ont pu être confirmées. PLEC1 et SCRIB sont deux protéines d’échafaudage dont la mutation, rapportée dans plusieurs cancers, pourrait induire des changements de leurs conformations et affecter leurs interactions et leurs fonctions. Les conséquences de ces mutations sur la tumorigenèse de l’ovaire devront être étudiées.

Searching for novel gene functions in yeast : identification of thousands of novel molecular interactions by protein-fragment complementation assay followed by automated gene function prediction and high-throughput lipidomics

La compréhension de processus biologiques complexes requiert des approches expérimentales et informatiques sophistiquées. Les récents progrès dans le domaine des stratégies génomiques fonctionnelles mettent dorénavant à notre disposition de puissants outils de collecte de données sur l’interconnectivité des gènes, des protéines et des petites molécules, dans le but d’étudier les principes organisationnels de leurs réseaux cellulaires. L’intégration de ces connaissances au sein d’un cadre de référence en biologie systémique permettrait la prédiction de nouvelles fonctions de gènes qui demeurent non caractérisées à ce jour. Afin de réaliser de telles prédictions à l’échelle génomique chez la levure Saccharomyces cerevisiae, nous avons développé une stratégie innovatrice qui combine le criblage interactomique à haut débit des interactions protéines-protéines, la prédiction de la fonction des gènes in silico ainsi que la validation de ces prédictions avec la lipidomique à haut débit. D’abord, nous avons exécuté un dépistage à grande échelle des interactions protéines-protéines à l’aide de la complémentation de fragments protéiques. Cette méthode a permis de déceler des interactions in vivo entre les protéines exprimées par leurs promoteurs naturels. De plus, aucun biais lié aux interactions des membranes n’a pu être mis en évidence avec cette méthode, comparativement aux autres techniques existantes qui décèlent les interactions protéines-protéines. Conséquemment, nous avons découvert plusieurs nouvelles interactions et nous avons augmenté la couverture d’un interactome d’homéostasie lipidique dont la compréhension demeure encore incomplète à ce jour. Par la suite, nous avons appliqué un algorithme d’apprentissage afin d’identifier huit gènes non caractérisés ayant un rôle potentiel dans le métabolisme des lipides. Finalement, nous avons étudié si ces gènes et un groupe de régulateurs transcriptionnels distincts, non préalablement impliqués avec les lipides, avaient un rôle dans l’homéostasie des lipides. Dans ce but, nous avons analysé les lipidomes des délétions mutantes de gènes sélectionnés. Afin d’examiner une grande quantité de souches, nous avons développé une plateforme à haut débit pour le criblage lipidomique à contenu élevé des bibliothèques de levures mutantes. Cette plateforme consiste en la spectrométrie de masse à haute resolution Orbitrap et en un cadre de traitement des données dédié et supportant le phénotypage des lipides de centaines de mutations de Saccharomyces cerevisiae. Les méthodes expérimentales en lipidomiques ont confirmé les prédictions fonctionnelles en démontrant certaines différences au sein des phénotypes métaboliques lipidiques des délétions mutantes ayant une absence des gènes YBR141C et YJR015W, connus pour leur implication dans le métabolisme des lipides. Une altération du phénotype lipidique a également été observé pour une délétion mutante du facteur de transcription KAR4 qui n’avait pas été auparavant lié au métabolisme lipidique. Tous ces résultats démontrent qu’un processus qui intègre l’acquisition de nouvelles interactions moléculaires, la prédiction informatique des fonctions des gènes et une plateforme lipidomique innovatrice à haut débit , constitue un ajout important aux méthodologies existantes en biologie systémique. Les développements en méthodologies génomiques fonctionnelles et en technologies lipidomiques fournissent donc de nouveaux moyens pour étudier les réseaux biologiques des eucaryotes supérieurs, incluant les mammifères. Par conséquent, le stratégie présenté ici détient un potentiel d’application au sein d’organismes plus complexes.