Lokalisation und Verteilung von Synapsen auf identifizierten Zellen im Zentralen Nervensystem von Drosophila melanogaster

Wir präsentieren zwei Techniken, mit deren Hilfe es erstmals möglich ist, zentralnervöse Synapsen im Zentralen Nervensystem (ZNS) von Drosophila melanogaster reproduzierbar darzustellen und experimentellen Methoden zugänglich zu machen. Die erste Technik beruht auf dem UAS/Gal4-System und ermöglicht die Expression markierter synaptischer Proteine in bekannten reproduzierbaren Neuronen. Die zweite Technik beruht auf der Einzel-Zelltransplantation und erlaubt die reproduzierbare Visualisierung von Synapsen in allen neuralen Zell-Linien des Drosophila Bauchmark.Mit Hilfe dieser Techniken konnte gezeigt werden, dass Neuriten im Bauchmark von Drosophila mindestens drei unterschiedliche Kompartimente aufweisen: 1. Primäre, häufig transversal verlaufende Neurite ohne Output-Synapsen, 2. Seitenneurite von vermutlich rein postsynaptischer Natur und 3. Seitenneurite, die präsynaptisch spezialisierte Regionen aufweisen. Des Weiteren konnten wir nachweisen, dass die Seitenneurite von Motroneuronen im ZNS vermutlich rein postsynaptisch sind. Weitere Beobachtungen veranlassen uns zu der Hypothese, dass motorneuronale Seitenneurite in Drosophila homolog oder analog zu Dendriten in Vertebraten sein könnten.Mit Hilfe der Transplantationstechnik untersuchten wir weiterhin die Funktion des Gens kakapo im ZNS. Obwohl kakapo für die Entwicklung von Synapsen an der Neuromuskulären Verbindung wichtig ist, konnten wir im ZNS keinen Phänotyp feststellen. Dies legt nahe, dass zwischen der Entwicklung von periphären und zentralnervösen Synapsen klare Unterschiede bestehen.

Synaptic connectivity in micropatterned networks of neuronal cells

The presented thesis describes the formation of functional neuronal networks on an underlying micropattern. Small circuits of interconnected neurons defined by the geometry of the patterned substrate could be observed and were utilised as a model system of reduced complexity for the behaviour of neuronal network formation and activity. The first set of experiments was conducted to investigate aspects of the substrate preparation. Micropatterned substrates were created by microcontact printing of physiological proteins onto polystyrene culture dishes. The substrates displayed a high contrast between the repellant background and the cell attracting pattern, such that neurons seeded onto these surfaces aligned with the stamped structure. Both the patterning process and the cell culture were optimised, yielding highly compliant low-density networks of living neuronal cells. In the second step, cellular physiology of the cells grown on these substrates was investigated by patch-clamp measurements and compared to cells cultivated under control conditions. It could be shown that the growth on a patterned substrate did not result in an impairment of cellular integrity nor that it had an impact on synapse formation or synaptic efficacy. Due to the extremely low-density cell culture that was applied, cellular connectivity through chemical synapses could be observed at the single cell level. Having established that single cells were not negatively affected by the growth on patterned substrates, aspects of network formation were investigated. The formation of physical contact between two cells was analysed through microinjection studies and related to the rate at which functional synaptic contacts formed between two neighbouring cells. Surprisingly, the rate of synapse formation between physically contacting cells was shown to be unaltered in spite of the drastic reduction of potential interaction partners on the micropattern. Additional features of network formation were investigated and found consistent with results reported by other groups: A different rate of synapse formation by excitatory and inhibitory neurons could be reproduced as well as a different rate of frequency-dependent depression at excitatory and inhibitory synapses. Furthermore, regarding simple feedback loops, a significant enrichment of reciprocal connectivity between mixed pairs of excitatory and inhibitory neurons relative to uniform pairs could be demonstrated. This phenomenon has also been described by others in unpatterned cultures [Muller, 1997] and may therefore be a feature underlying neuronal network formation in general. Based on these findings, it can be assumed that inherent features of neuronal behaviour and cellular recognition mechanisms were found in the cultured networks and appear to be undisturbed by patterned growth. At the same time, it was possible to reduce the complexity of the forming networks dramatically in a cell culture on a patterned surface. Thus, features of network architecture and synaptic connectivity could be investigated on the single cell level under highly defined conditions.

Einfluss des Aktin-Zytoskeletts und intrazellulärer Signalkaskaden auf die postsynaptische Lokalisation von Gephyrin

Neuronen haben für die Informationsübertragung untereinander spezielle Strukturen entwickelt, welche als Synapsen bezeichnet werden. Um eine schnelle und präzise synaptische Signalübertragung zu gewährleisten, ist eine hohe Konzentration von Neurotransmitter-regulierten Ionenkanälen in der postsynaptischen Plasmamembran notwendig. Die spezifische Verankerung der Rezeptoren wird durch intrazelluläre Proteine der Postsynapse vermittelt. Das periphere Membranprotein Gephyrin spielt eine essentielle Rolle in der synaptischen Lokalisation von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren an inhibitorischen Synapsen. Um das postsynaptische Netzwerk zu stabilisieren, ist eine Interaktion von Gephyrin mit Proteinen der Mikrofilamente und der Mikrotubuli nötig. In der vorliegenden Arbeit sollte analysiert werden, wie Gephyrin mit dem Aktin-Zytoskelett interagiert, und ob die Größe und Stabilität neuronaler Gephyrincluster durch das Aktin-Zytoskelett reguliert wird. Dies wurde mittels Expression von GFP-Gephyrin-Konstrukten in HEK293T-Zellen und Aktin-depolymerisierende Alkaloidbehandlung von hippokampalen Primärkulturzellen untersucht. Der Einfluss unterschiedlicher Signalkaskaden auf die Lokalisation und Funktionalität von GABAA- oder Glyzin-Rezeptoren wurde bereits intensiv untersucht, jedoch für Rezeptor-assoziierte Proteine wie Gephyrin existierten nur wenig relevante Daten. Ein weiteres Ziel war daher, durch pharmakologische Beeinflussung von Schlüsselenzymen in hippokampalen Primärkulturen jene Signalwege zu identifizieren, die am Transport von Gephyrin, seiner Stabilisierung im postsynaptischen Netzwerk und seinem Abbau beteiligt sind. Im Verlauf der Arbeit konnte belegt werden, dass das Aktin-regulierende Phosphoprotein ena/VASP als Adapter die Interaktion von Gephyrin mit F-Aktin vermittelt, und dass diese Bindung ausreicht, um Gephyrin an das Aktin-Zytoskelett zu rekrutieren. Entgegen früheren Veröffentlichungen konnte die Bindung von ena/VASP im Bereich der sog. Linkerregion von Gephyrin nachgewiesen werden. Aktin-depolymerisierende Alkaloidbehandlungen von hippokampalen Neuronen bestätigten, das die Lokalisation von Gephyrin an sich entwickelnden inhibitorischen Kontakten von einem intakten Mikrofilamentsystem abhängig zu sein scheint. Das Aktin-Zytoskelett könnte somit eine transiente Rolle in der Ausbildung und Stabilisierung des Gephyrin-Netzwerkes in der frühen Entwicklung von inhibitorischen GABAergen Synapsen haben, während die Abhängigkeit der synaptisch-lokalisierten Gephyrincluster vom Aktin-Zytoskelett mit steigender neuronaler Differenzierung abnimmt. Zusätzlich konnte erstmals der Einfluss einzelner Signaltransduktionskaskaden auf die synaptische Lokalisation von Gephyrin nachgewiesen werden. Dabei hatte die Inhibition der Protein- Phosphatasen 1 und 2A eine Destabilisierung synaptisch-lokalisierter Gephyrincluster bei gleichzeitigem Anstieg der zytoplasmatischen Immunreaktivität zur Folge. Dies ist möglicherweise auf eine Hyperphosphorylierung wichtiger Sequenzabschnitten von Gephyrin zurückzuführen, wobei Änderungen im Phosphorylierungsstatus der Linkerregion von Gephyrin unter anderem die Assoziation mit dem Zytoskelett beeinträchtigen oder lösen könnten. Umgekehrt könnte eine Dephosphorylierung möglicherweise die Stabilität der Vernetzung erhöht. Kopräzipitationsstudien konnten zusätzlich nachweisen, dass Gephyrin, PP1 und PP2A nicht nur gemeinsam an inhibitorischen Synapsen vorliegen, sondern dass eine direkte Interaktion besteht. Dabei handelt es sich um den ersten Nachweis einer direkten Bindung von Gephyrin an Ser/Thr-Phosphatasen. Die Komplexbildung von PP1 und PP2A mit Gephyrin könnten der Regulation des Phosphorylierungsgrades dienen. Der genaue Mechanismus wird jedoch in weiteren Experimenten zu untersuchen sein.

Generation of a NG2-EYFP mouse for studying the properties of NG2-expressing cells

A range of vectors were made in which the EYFP gene or the Cre gene were inserted in the start codon of the NG2 gene. The NG2-EYFP vectors were used to generate NG2-EYFP “knockin” mice by homologous recombination. The F1 generation showed lack of EYFP expression, due to NeoR cassette interference. Excision of the NeoR, by breeding the F1 generation to ELLA-Cre mice allowed proper expression of EYFP. NG2-EYFP heterozygous mice were characterized in detail for astrocytic, neurogenic and oligodendrocytic properties through antibody labeling. NG2-EYFP+ cells did not label for the astrocyte marker GFAP, but some cells did express S100 Beta. The cells did not label with any neuronal markers like Beta III tubulin, Neun, and double cortin, but many of the NG2-EYFP+ cells made intimate contacts to the neurons. These contacts are widespread throughout the grey and white matter of the brain. The NG2-EYFP+ cells did label for oligodendrocyte markers like PDGFα-R, NG2, Olig2, O4, and Sox 10. There were a few cells termed phantom cells that did label for NG2, but had no EYFP expression. This could have been caused by improper excision of the NeoR cassette in the F2 generation. The heterozygous mouse is a tool to allow the characterization of the in vivo properties of the NG2+ cells. Breeding of these mice to homozygosity yielded an NG2-knockout mouse, which was also subjected to initial characterization. The NG2-EYFP homozygous showed equivalent cell labeling results to the NG2-EYFP heterozygous mouse, but the phantom cells disappeared in the knockout. The results show that the NG2 cells are a heterogenous population that does not express astrocytic or neuronal markers. The homozygous mouse is an ideal tool to further dissect the properties of the cells, lacking NG2 in vivo.

Neuronal differentiation and epithelial integrity: the role of Drosophila Short stop

The nervous system is the most complex organ in animals and the ordered interconnection of neurons is an essential prerequisite for normal behaviour. Neuronal connectivity requires controlled neuronal growth and differentiation. Neuronal growth essentially depends on the actin and microtubule cytoskeleton, and it has become increasingly clear, that crosslinking of these cytoskeletal fractions is a crucial regulatory process. The Drosophila Spectraplakin family member Short stop (Shot) is such a crosslinker and is crucial for several aspects of neuronal growth. Shot comprises various domains: An actin binding domain, a plakin-like domain, a rod domain, calcium responsive EF-hand motifs, a microtubule binding Gas2 domain, a GSR motif and a C-terminal EB1aff domain. Amongst other phenotypes, shot mutant animals exhibit severely reduced dendrites and neuromuscular junctions, the subcellular compartmentalisation of the transmembrane protein Fasciclin2 is affected, but it is also crucially required in other tissues, for example for the integrity of tendon cells, specialised epidermal cells which anchor muscles to the body wall. Despite these striking phenotypes, Shot function is little understood, and especially we do not understand how it can carry out functions as diverse as those described above. To bridge this gap, I capitalised on the genetic possibilities of the model system Drosophila melanogaster and carried out a structure-function analysis in different neurodevelopmental contexts and in tendon cells. To this end, I used targeted gene expression of existing and newly generated Shot deletion constructs in Drosophila embryos and larvae, analyses of different shot mutant alleles, and transfection of Shot constructs into S2 cells or cultured fibroblasts. My analyses reveal that a part of the Shot C-terminus is not essential in the nervous system but in tendon cells where it stabilises microtubules. The precise molecular mechanism underlying this activity is not yet elucidated but, based on the findings presented here, I have developed three alternative testable hypothesis. Thus, either binding of the microtubule plus-end tracking molecule EB1 through an EB1aff domain, microtubulebundling through a GSR rich motif or a combination of both may explain a context-specific requirement of the Shot C-terminus for tendon cell integrity. Furthermore, I find that the calcium binding EF-hand motif in Shot is exclusively required for a subset of neuronal functions of Shot but not in the epidermal tendon cells. These findings pave the way for complementary studies studying the impact of [Ca2+] on Shot function. Besides these differential requirements of Shot domains I find, that most Shot domains are required in the nervous system and tendon cells alike. Thus the microtubule Gas2 domain shows no context specific requirements and is equally essential in all analysed cellular contexts. Furthermore, I could demonstrate a partial requirement of the large spectrin-repeat rod domain of Shot in neuronal and epidermal contexts. I demonstrate that this domain is partially required in processes involving growth and/or tissue stability but dispensable for cellular processes where no mechanical stress resistance is required. In addition, I demonstrate that the CH1 domain a part of the N-terminal actin binding domain of Shot is only partially required for all analysed contexts. Thus, I conclude that Shot domains are functioning different in various cellular environments. In addition my study lays the base for future projects, such as the elucidation of Shot function in growth cones. Given the high degree of conservation between Shot and its mammalian orthologues MACF1/ACF7 and BPAG1, I believe that the findings presented in this study will contribute to the general understanding of spectraplakins across species borders.

Funktionelle Analyse der beiden Zinkfinger-Homöodomänentranskriptionsfaktoren Zfh-1 und Zfh-2 während der Entwicklung des Nervensystems von Drosophila melanogaster

Diese Arbeit charakterisiert die Funktion und das Expressionmuster der beiden Zinkfinger-Homöodomänentranskriptionsfaktoren zfh1 und zfh2 von Drosophila melanogaster. Das zfh2 Gen wurde hierbei vor allem molekular charakterisiert. Es wurden eine Vielzahl möglicher Spleißformen identifiziert, welche das regulatorische Potential von Zfh2 enorm erweitern. Für Überexpressionsexperimente wurde zudem erstmalig die cDNA des längsten zfh2-Transkriptes kloniert. Durch Analysen an zfh1 Mutanten konnte gezeigt werden, dass zfh1 sowohl notwendig ist für die embryonale Entwicklung von Motoneuronen, als auch das larvale Wachstum motoneuronaler Endplatten reguliert. Wegen weit reichender pleiotroper Effekte, die zfh1 Funktionsverlustmutanten haben, war es notwendig, neben dem Einsatz hypomorpher Allele auf die Analyse genetischer Mosaike auszuweichen. Die als MARCM-Technik (Lee und Luo, 1999) bezeichnete Methode zur Erzeugung genetischer Mosaike wurde modifiziert um in dieser Arbeit erstmals für die Analyse mutanter larvaler Motoneurone eingesetzt werden zu können. Weitergehend konnte gezeigt werden, dass Zfh1 notwendig ist für die larvale Expression des Neuropeptides FMRFamid. Anhand von Sequenzvergleichen und durch Verwendung eines fmrfamid-Promoterkonstruktes (Benveniste et al., 1998) konnten Hinweise dafür gesammelt werden, dass die Zfh1-abhängige Regulation sehr wahrscheinlich direkter Natur ist. Bei fmrfamid handelt es sich somit um das erste identifizierte neurale Zielgen von Zfh1, an dem sich zudem modellhaft der molekulare Wirkmechanismus von Zfh1 erforschen lässt.

Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des synaptischen Vesikelproteins Synaptophysin

Die neuronale Signalübertragung beruht auf dem synaptischen Vesikelzyklus, der durch das koordinierte Zusammenspiel von circa 400 verschiedenen Proteinen reguliert wird. Eines der Hauptproteine des synaptischen Vesikels ist Synaptophysin (SYP), das zu den tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) gehört. Es wird vermutet, dass es zahlreiche Funktionen der Exo- und Endozytose moduliert, wenngleich die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bisher größtenteils unverstanden sind. Ziel der Arbeit war daher die Identifizierung von Interaktionspartnern von SYP, um zum Verständnis der vielen ungeklärten Prozesse im synaptischen Vesikelzyklus beizutragen. Mit dem Split-Ubiquitin Yeast Two-Hybrid System, das eine direkte in vivo Interaktion von Membranproteinen erlaubt, konnten in der vorliegenden Arbeit bekannte, aber auch neue SYP-Bindungspartner identifiziert werden. Ein bekannter Interaktionspartner war Synaptobrevin2 (SYB2), das zu den stärksten im Split-Ubiquitin Y2H System identifizierten Bindeproteinen zählt. Zu den neuen starken SYP-Interaktionspartnern gehören die TVPs Synaptogyrin3 (SYNGR3) und SCAMP1. Somit konnten erstmals heterophile Interaktionen zwischen den verschiedenen TVP-Genfamilien nachgewiesen werden, die für eine universelle Funktion der TVPs sprechen. Die Validierung der im Split-Ubiquitin Y2H System ermittelten Interaktionspartner wurde auf eine Auswahl von Proteinen beschränkt, die vermutlich am synaptischen Vesikelzyklus beteiligt sind. Dabei konnte eine immunhistologische Kolokalisierung von SYP mit SYB2, SYNGR3, SCAMP1, Stathmin-like3 (STMN3), Rho family GTPase2 (RND2), Phospholipid transfer protein, Vesicle transport through interaction with t-SNAREs 1B homolog, Arfaptin2 und Profilin1 in den Synapsen-reichen Schichten der Retina beobachtet werden. Die SYP/SYB2- und SYP/SYNGR3-Komplexe konnten zudem sowohl aus Synaptosomen-Lysat als auch aus cDNA-transfizierten Epithelzellen koimmunpräzipitiert werden, wohingegen dies für die anderen Interaktionspartner nicht gelang. Da Koimmunpräzipitation die Struktur der Proteine durch Solubilisierung mit Detergenzien beeinflusst, wurden die in der Hefe beobachteten Interaktionen noch mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer überprüft, mit dem Proteinwechselwirkungen in der nativen Umgebung nachgewiesen werden können. Ein positives FRET-Signal konnte für SYP mit SYB2, SYP, SYNGR3, SCAMP1, STMN3, RND2 und Arfaptin2 detektiert werden, lediglich für SYP mit Phospholipase D4 (PLD4) gelang dieser Nachweis nicht. Ferner zeigten FRET-Analysen von Synaptophysin-Mutanten, dass der zytoplasmatische C-Terminus für die Interaktion mit zytoplasmatischen und membranassoziierten Proteinen benötigt wird. Durch in vivo FRET-Studien mit der SH2-Domäne der Src-Kinase, die an phosphorylierte Tyrosine bindet, konnte eine Tyrosin-Phosphorylierung des zytoplasmatischen C-Terminus von Synaptophysin und von Synaptogyrin3 detektiert werden. Viele der neu identifizierten Synaptophysin-Interaktionspartner sind im Lipid-Metabolismus involviert. Vermutlich rekrutiert der zytoplasmatische und durch Phosphorylierung modifizierbare C-Terminus diese Partner in spezifische Lipoproteindomänen, die an der Feinabstimmung der synaptischen Vesikelendo- und -exozytose beteiligt sind.

Morphologische und quantitative Untersuchungen synaptischer Körperchen in Retina und Zirbeldrüse von Säugetieren und Mensch

Um mit sehr hoher Geschwindigkeit Sinnesreize zur Weiterverarbeitung übertragen zu können, besitzen im Ruhezustand Dauerimpulse liefernde Rezeptorzellen in Sinnesorganen, wie z.B. der Netzhaut (Retina), spezialisierte glutamaterge Synapsen, die durch präsynapti-sche Körperchen (SK) charakterisiert sind, die außerdem nur in Parenchymzellen der Zirbel-drüse vorkommen. SK binden mit hoher Affinität Neurotransmittervesikel und zeigen licht- bzw. reizabhängige morphologische Veränderungen. Sie dienen der Speicherung, eventuell auch dem Transport dieser Vesikel zum Ort der Reizübertragung, der nahen aktiven Zone der Ribbonsynapse. Um Dynamik und Funktion der Zellorganellen zu verstehen, ist es wichtig, ihre genaue Topo-graphie und dreidimensionale (3D) Struktur unter verschiedenen Bedingungen zu kennen. So wurden aus Serienschnitten der Retina und Zirbeldrüse mit Hilfe geeigneter, teils selbst programmierter Software 3D-Rekonstruktionen der SK durchgeführt. Untersucht wurden die ersten und zweiten Synapsen der Sehbahn in Retinae von Mensch, Maus und Ratte, Zapfen-terminale des Hühnchens und SK in Zirbeldrüsen von Ratte, Meerschweinchen und Kaninchen. Analysiert wurde zu verschiedenen Zeitpunkten der Photoperiode oder unter experimentellen Bedingungen entnommenes Frischgewebe sowie Material aus Organkultu-ren. Außerdem wurden SK unter diversen Bedingungen quantifiziert, wobei eine neue Zähl-methode entwickelt wurde, die auf einer Modifikation des Disektors basiert und die Quantifi-zierung auch anderer seltener Ultrastrukturen am Elektronenmikroskop ermöglicht. Im Gegensatz zur etablierten Zählmethode, die die Profilzahl von SK in einer definierten Fläche (PZ) angibt, liefert die vorgestellte Methode die aussagekräftigere Zahl der SK in definierten Volumina und hängt weder von deren Form noch Größe ab. Diverse Kalkulationen zeigten, daß eine Umrechnung von am selben Material gewonnenen PZ in validere Disektor Werte nicht präzise genug möglich ist. Um sinnvolle Aussagen zur Quantität von SK machen zu können, ist es daher erforderlich, die Methode für jedes Tier einer identisch behandelten Gruppe anzuwenden. Es konnte gezeigt werden, daß SK eine konstante Dicke von 35 nm haben. In der Retina sind sie meist nur in einer Ebene C-förmig gebogene Bänder, weshalb sie auch als "synaptic ribbons" bezeichnet werden, oder Platten mit Breite zu Höhe Verhältnissen zwischen 6:1 bis 3:1. Die elektronendichten, unter Normalbedingungen durch regelmäßig polymerisierte Dimere des Hauptproteins RIBEYE pentalamellären SK binden über dünne Proteinbrücken glutamathaltige Neurotransmittervesikel. Ihre untere lange schmale Kante ist über feines elektronendichtes Material an einem, als arciform density (ad) bezeichneten Plaque der Zell-membran verankert, der die Form einer gebogenen Rinne hat. Die zumeist senkrecht darauf stehenden SK zeigen an ihrer membranfernen langen Kante zu Beginn der Lichtphase, ins-besondere aber unter Dauerlicht partiell verdickte Ränder, die auf An- bzw. Abbauvorgänge hinweisen. Diese Veränderungen waren nur in Stäbchenterminalen und Pinealozyten in Ver-bindung mit dem Auftreten kleinerer klumpiger bis kugelförmiger SK nachweisbar und zeig-ten sich in den Schnitten als runde oder irreguläre Profile, die dann neben den "üblichen" stabförmigen SK-Anschnitten vorlagen. Die 3D-Rekonstruktion von Stäbchenterminalen der menschlichen Retina zeigte, daß diese entsprechend der Zahl ihrer SK 1-3 Ribbonsynapsen aufweisen. Letztere bestehen aus einem an der Zellmembran senkrecht über eine ad verankerten SK und der aktiven Zone, die einem ca. 200 nm breiten Bereich der Zellmembran in Fortsetzung der ad nach seitlich oben entspricht. Die boomerang- bis hufeisenförmigen SK haben 2 parallele flache Hauptflächen. Postsynaptisch liegen zwei Horizontalzellfortsätze, welche mit variabeln Aufspaltungen von einem engen Hilus aus tief in Stäbchenendkolben invaginiert sind. Sie verbreitern sich termi-nal und zeigen große breite oft aufgefächerte bzw. verzweigte Auftreibungen. Die Ribbon-synapsen sind in die zwischen solchen Endauftreibungen entstehenden Rinnen eingesenkt. Unterhalb ihrer ad berühren sich die Horizontalzellterminale. Etwas darunter enden 1-2 ca. 100 nm breite Bipolarzelldendriten, die vom Zentrum der Invagination des Stäbchenterminals zum Hilus hin dünner werden, um zum Soma invaginierender ON-Bipolarzellen weiterzulau-fen. Da die Zahl der in den Stäbchenendkolben eintretenden Fortsätze variabel ist, fanden sich Konstellationen von 1-3 SK, 1-3 Horizontal- und 1-4 Bipolarzellterminalen, wie sie auch in der Literatur beschrieben sind. Drei zentrale Ausschnitte menschlicher Zapfenpedikel wurden aus lückenlosen Serienschnit-ten mit ihren Mitochondrien, SK und den in Form von Triaden hier invaginierenden postrib-bonsynaptischen Fortsätzen rekonstruiert. Der Grundbauplan der Ribbonsynapsen ist hier dem der Stäbchen ähnlich, jedoch sind die SK kürzer, die Invaginationen deutlich kleiner und nie verzweigt, die Bipolarzelldendriten breiter und die Horizontalzellfortsätze terminal weniger stark und nur rundlich aufgetrieben. Zapfen-SK sind nur in einer Ebene schwach gebogene Bänder. Die gefundene Zahl von Zapfen SK paßt zu Literaturdaten, deren Zusammenfas-sung für Primaten foveanah 10-20 und peripher 30-40 SK zeigt. In Bipolarzellaxonen des Menschen waren SK nicht immer über leistenartige Membranplaques am Plasmalemm ver-ankert. Die hier flachen Ribbonsynapsen zeigten kleinere bandförmige oder nur ca. 250 x 150 x 35 nm große plattenförmige SK mit etwas größerem Abstand zu den aktiven Zonen als in Photorezeptoren. Bei BALB/c Mäusen, deren SK besonders deutlich auf Veränderungen der Photoperiode oder experimentelle Bedingungen reagieren, zeigten Rekonstruktionen von Stäbchenribbon-synapsen am Ende der Dunkelphase band- bis boomerangförmige SK und weder Klumpen noch Kugeln. Im ersten Drittel und gegen Ende der Lichtphase fanden sich jedoch ca. 20 Prozent solch veränderter SK. Gleichzeitig waren die mittleren Abschnitte vieler SK unter beiden Lichtbedingungen dünner als am Ende der Dunkelphase. Die langen, oft mehrfach gebogenen und verdrehten Zapfen-SK dieser Mäuse waren unabhängig von den Lichtbedin-gungen oft deutlich größer als die der Stäbchen, wohingegen beim Menschen Zapfen-SK re-lativ gerade, bandförmige Zellorganellen geringerer Größe als in Stäbchen darstellten. Während in Stäbchenterminalen nur ausnahmsweise mehr als ein größeres bandförmiges SK (neben eventuellen kugelförmigen) vorlag, zeigten sich in den Zapfen orts- und spezies-abhängig 15 bis über 25 meist bandförmige Organellen, die in wenigen Fällen mit zwei ge-legentlich sogar 3 verschiedenen Triaden aus 2 Horizontal- und einem Bipolarzellfortsatz ver-bunden waren. Dies ist bei BALB/c Mäusen, die weniger, aber größere Zapfen-SK zeigten, häufiger als beim Menschen. Die SK der Bipolarzellen in der inneren plexiformen Schicht waren speziesübergreifend meist lange Bänder oder kleine Platten mit ca. 250 x 150 nm großen Hauptflächen und nur ge-ringen Verdrehungen. Verschiedene Bipolarzelltypen haben unterschiedlich viele SK. Im Rahmen der Arbeit erstmals erstellte 3D-Rekonstruktion ektopischer synaptischer Körper-chen (eSK) konnten belegen, daß diese in Bipolarzelldendriten lokalisiert sind. Die kleinen, leicht gebogenen, 35 nm dicken Platten, deren große Oberflächen Dimensionen von meist nur ca. 100 x 200 nm hatten, sind praktisch nie an der Zellmembran verankert, sondern ste-hen in einigen Fällen über zu langen Tubuli fusionierte Vesikel mit dem Interzellularspalt in Verbindung. Dies könnte ein Hinweis auf eine "compound" Endo- oder Exozytose sein. Sel-ten finden sich zwei, ausnahmsweise auch drei parallel zueinander angeordnete SK im Inne-ren der Bipolarzelldendriten, meistens nahe deren Eintritt in Stäbchenendkolben. Im Gegen-satz zur Ratte fanden sich eSK bei seit Geburt unter Dauerdunkelheit gehaltenen BALB/c Mäusen sogar im in Stäbchen- bzw. Zapfenterminal invaginierten Abschnitt von Bipolarzell-dendriten. Neben plattenförmigen SK lagen bei diesen Mäusen auch innen hohle klumpen-förmige Organellen in Stäbchenbipolarzelldendriten vor. Unter Organkultur und Ca++-Entzug fanden sich in Stäbchen die massivsten Veränderungen von SK, die entweder als Klumpen oder Kugeln vorlagen oder massive Protrusionen an ei-nem kleinen plattenförmigen Abschnitt zeigten, der noch an der ad befestigt blieb. Die Be-funde deuten darauf hin, daß Licht über Kalziumentzug zu Verklumpungen an SK und zur Abschnürung von klumpen- bis kugelförmigen SK Fragmenten führt. Bei der Rekonstruktion mit anti-β-Dystroglykan Immunogold-markierter Zapfenterminalen der Hühnchenretina konnte erstmals gezeigt werden, daß sich dieses zum Dystrophin-assozierten Glykoproteinkomplex gehörende Protein in perisynaptischen Fortsätzen der Pho-torezeptoren seitlich und an ihren Spitzen fand, während Horizontal- und Bipolarzellfortsätze nicht markiert waren. Dies deutet auf eine neue strukturelle oder funktionelle Domäne in Pho-torezeptorterminalen hin, die eine noch im Detail zu klärende Rolle bei der synaptischen Transmission spielt, da bei Mutationen im Dystrophin-assoziierten Proteinkomplex eine Ver-änderung der synaptischen Kommunikation in der äußeren plexiformen Schicht zu beobach-ten ist. In der Zirbeldrüse sind die meisten SK wenig gebogene, flache, plattenförmige Strukturen, die bei der Ratte meist ca. 300x150x35 nm groß sind. Daneben gibt es deutlich längere bandförmige Organellen und unter Normalbedingungen bei Ratte und Hühnchen praktisch keine, bei Meerschweinchen nur wenige klumpige oder kugelförmige SK. Pinealozyten der Meerschweinchenzirbeldrüse weisen üblicherweise Felder parallel gruppierter plattenförmi-ger synaptischer Körperchen auf. Unter Dauerlicht zeigten sich an der Membran benachbar-ter Zellen einander gegenüberliegende Felder stark verbogener, partiell verdickter SK, die vermutlich aus verschmolzenen Einzelplatten entstanden waren sowie deutlich mehr kugeli-ge bzw. klumpige SK. Die Organellen nehmen nachts an Größe zu, wodurch sich ihre Ober-fläche vergrößert, bei Ratten nimmt sie um 19,3 Prozent von 0,041 auf 0,0501 µm² zu. Da die plattenförmigen SK eine konstante Dicke von 35 nm hatten, läßt sich so ein durchschnitt-liches Volumen von 1,47x10-3 µm³ für 12.00 und von 1,75x10-3 µm³ für Mitternacht mit einer Zunahme von 0,28x10-3 µm³ (entspricht 19,3 %) errechnen. Der Vergleich von Pinealocyten-SK von unter LD 4:20 zu LD 20:4 gehaltenen Ratten zeigte unter LD 20:4 insignifikant mehr SK, die signifikant längere Profile hatten, was auf eine Größenzunahme der Organellen hin-deutet. Überlegungen und mathematische Berechnungen, was Profillängenmessungen bedeuten und wieviele Profile für sinnvolle Vergleiche ausgewertet werden müßten, werden kritisch diskutiert. Die selbst erhobenen Befunde werden im Kontext mit allen verfügbaren Literaturdaten de origine, dem Auftreten von SK in der Ontogenese sowie SK betreffenden pathologischen und Altersveränderungen betrachtet. Hierbei deutet die Analyse der Chronobiologie von SK in quantitativer und morphologischer Hinsicht auf eine Abhängigkeit von der Photoperiode bzw. Licht und Dunkelheit und nicht auf eine endogene zirkadiane Rhythmik hin. Die oberhalb funktionell wichtiger Ca++-Känale lokalisierten SK setzen in Photorezeptoren die Lichtinformation in exozytierte Glutamatquanten um, wobei das Glutamat an verschiedenen postsynaptischen Orten wirkt. Die zuvor nie so anschaulich durch 3D-Stereoanimationen visualisierten Befunde zeigen, daß die Morphologie von SK hier für eine maximal schnelle Freisetzung der gebundenen Transmittervesikel an in unmittelbarer Nähe gelegenen aktiven Zonen der Ribbonsynapsen optimiert ist. Der molekulare Aufbau von SK wird ultrastrukturell nachvollzogen und die Funktion der Organellen diskutiert. Diesbezüglich ist die Vesikelspei-cherung erwiesen, das "Priming" für die Exozytose beinahe bewiesen, eine Koordinations-funktion für multivesikuläre Transmitterfreisetzung ist denkbar, während eine Förderband-funktion eher unwahrscheinlich ist. In breve haben die im Rahmen dieser Habilitation ge-wonnenen Erkenntnisse und entwickelten Methoden einige Beiträge zur Klärung des mor-phologisch funktionellen Gesamtverständnisses der Ribbonsynapsen geleistet.

Behavioural analysis of mouse mutants with altered neuronal and glial genes

Im ersten Teil dieser Doktorarbeit beabsichtigte meine Arbeit, die funktionelle Beteiligung des CB1 Rezeptors, einer Hauptkomponente des neuronalen Endocannabinoid-Systems (ECS), an der Ausbildung von verschiedenen Verhaltensphänotypen mit Hilfe von konditionalen Mausmutanten, denen der CB1 Rezeptor auf verschiedenen neuronalen Unterpopulationen fehlt, aufzuschlüsseln und zu untersuchen. Verschiedene Verhaltensmodelle wurden hierzu getestet. Dabei lag der Fokus dieser Arbeit auf der CB1f/f;D1-Cre Mauslinie, welche der CB1 Rezeptor auf den D1 Rezeptor exprimierenden Neuronen des Striatums fehlt. Ich konnte zeigen, dass der Verlust des CB1 Rezeptors auf diesen Neuronen keinen Einfluss auf basale neurologische Funktionen, Gewicht, Bewegung, Exploration, Sozialverhalten, Angst und Stressbewältigung der Tiere hat, jedoch eine Beteiligung an der Entwicklung von Suchtverhalten gegeben ist. Bei Betrachtung des Kokain-induzierten Suchtverhaltens zeigten die konditionalen Mausmutanten eine reduzierte Suchtanfälligkeit sowohl im Vergleich zu Tieren mit einem totalen CB1 Rezeptor Verlust in allen Körperzellen, als auch zu genetisch unveränderten Kontrollmäusen beider Linien.rnDes Weiteren zeigen die Ergebnisse dieser Studie eine große, aber gegensätzliche Beteiligung des ECS bei der Regulation von Exploration in Abhängigkeit des Verlustes des CB1 Rezeptors auf GABAergen Neuronen des Vorderhirns und kortikalen glutamatergen Neuronen, jedoch nicht auf striatalen Neuronen alleine. Zusätzlich war ich in der Lage, die Wichtigkeit des genetischen Hintergrunds von Mauslinien nicht nur auf die Ausbildung von spezifischen Verhaltensphänotypen, sondern auch auf die Genexpression zu zeigen.rnIn dem zweiten Teil dieser Arbeit, in dem ich mich auf die Funktion von Gliazellen konzentrierte, wurden ebenfalls Mausmutanten in verschiedenen Verhaltensmodellen getestet. Ein genetisches Auslöschen des NG2 Glykoproteins in Gliazellen sorgt in den Knock-out Mäusen für ein schlechteres Hörvermögen und ein reduziertes Depressionsverhalten im Vergleich zu ihren Wildtyp-Kontrollmäusen. Interessanterweise zeigten diese Tiere auch eine reduzierte Empfänglichkeit bei chemisch induzierten epileptischen Krämpfen, was eine Rolle des NG2 Glykoproteins bei der Kontrolle der glutamatergen Homöostase vorschlägt, die wahrscheinlich durch Strukturänderungen der Neuron-Glia-Synapse verursacht wird. rn

Comparative functional analysis of factors controlling glial differentiation in Drosophila and mouse

The present study is a comparative functional analysis of three factors controlling glial differentiation in mouse (Fyn Src kinase, hnRNPF/H and NG2) and their homologues in Drosophila (Src42A and 64B, Glorund and Kon-tiki (Kon)). In Drosophila, mutations in any of these genes were not associated with major embryonic neurodevelopmental phenotypes. Src kinases and Glorund were shown to be ubiquitously expressed, whereas kon mRNA showed selective expression in muscles as well as in central and peripheral glia. Kon was also shown to be expressed in L3 larvae with high levels of protein accumulation at the neuromuscular junction (NMJ) and in muscles in the form of speckles. Knockdown of kon in glia resulted in NMJ phenotypes, mainly characterized by a significant increase in bouton number and a reduction in α-Konecto staining intensity at the NMJ. From the three glial layers ensheathing the peripheral nervous system, subperineurial glial showed to be the one contributing the most to kon knockdown dependent NMJ phenotypes, while perineurial glia only had a minor role. The knockdown of kon in glia also showed to affect Glutamate receptor subunit (α-GluRIIA) clustering in the postsynapse, same as microtubule arrangement in the presynapse, as seen by α-Futsch pattern interruptions and alterations. kon knockdown in glia also resulted in impaired axonal transport, as seen by the accumulation of Bruchpilot-positive vesicles along the nerves, abnormal formation of neuronal derived protrusions and swellings, filled with vacuole-like structures. Glia number along the peripheral nerves is also reduced as consequence of kon knockdown. Muscle derived Kon was shown to accumulate at the NMJ and play a role in bouton consolidation and to interfere with phagocytosis of ghost boutons. NMJ bouton and branch number was also significantly increased in Kon overexpression in glia. The overexpression of Kon in glia also resulted in a massive elongation of the ventral nerve cord, which served in a suppressor screen to identify intracellular interaction partners of Kon in glia. It was shown that Kon is processed in glia and preliminary results indicate that the metalloendopeptidase Kuzbanian (the fly homologue of ADAM10) may play a role in the shedding of Konecto. In the present work, Kon is shown as a multifunctional gene with various roles in glia-neuron and glia-neuron-muscle interaction.

Die Rolle der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen im Zentralen Nervensystem

Im Fokus dieser Studie stehen die zu den Gliazellen zählenden OPC, sowie das von diesen exprimierte Typ-1 Membranprotein NG2. Dieses wird auf eine Prozessierung durch α- und γ-Sekretase, in Analogie zu Proteinen wie Notch oder APP, untersucht.rnEine solche Prozessierung ginge mit zusätzlichen intrazellulären Spaltprodukten neben der bekannten Ektodomäne einher. Da OPC mit dem Neuronalen Netzwerk durch synaptische Innervierungen in Verbindung stehen, stellt sich die Frage, ob diese mit der Spaltung von NG2 in Verbindung gebracht werden können. Dazu käme mechanistisch beispielsweise eine aktivitätsabhängige Regulierung der Proteolyse, wie sie jüngst für das neuronale synaptische cell adhesion molecule Neuroligin gezeigt werden konnte, in Frage. Zudem werden eine physiologische Rolle der NG2 Ektodomäne bzw. der möglichen intrazellulären Fragmente untersuchen. Insbesondere potentielle neuromodulatorische Funktionen sind hier von Interesse, da diese die OPC tiefer in das Neuronale Netzwerk integrieren würden. Die Existenz eines NG2 Homologes in D. melanogaster, wirft weiterhin die Frage auf, in wie weit diese Mechanismen in diesem Modellsystem konserviert sind.rnIn Analogie zur Lokalisierung von Markerproteinen an Neuron-Neuron Synapsen in vivo, ergibt sich die Frage ob sich die synaptischen Verbindungen zwischen Neuronen und OPC in ähnlicher Weise darstellen lassen.rnEin Charakteristikum von OPC ist die Teilungsaktivität in sich entwickelnden und adulten Säugern. Zudem gibt es Evidenzen für direkte funktionelle Verknüpfungen zwischen dem NG2 Protein und dem Teilungsmodus der OPC. Deshalb war ein weiteres Ziel mögliche Änderungen in der Zellteilung der OPC, die mit dem NG2 Protein in Verbindung stehen könnten, in NG2 -/- Mäusen zu untersuchen.rn

Effects of acute temperature increase on performance and survival of Caribbean echinoids

Climate change is occurring at a faster rate than in the past, with an expected increase of mean sea surface temperatures up to 4.8°C by the end of this century. The actual capabilities of marine invertebrates to adapt to these rapid changes has still to be understood. Adult echinoids play a crucial role in the tropical ecosystems where they live. Despite their role, few studies about the effect of temperature increase on their viability have been reported in literature. This thesis work reports a first systematic study on several Caribbean echinoids about their tolerance to temperature rise in the context of global warming. The research - carried out at the Bocas del Toro Station of the Smithsonian Tropical Research Institute, in Panama - focalized on the 6 sea urchins Lytechinus variegatus, L. williamsi, Echinometra lucunter, E. viridis, Tripneustes ventricosus and Eucidaris tribuloides, and the 2 sand dollars Clypeaster rosaceus and C. subdepressus. Mortality and neuromuscular well-being indicators - such as righting response, covering behaviour, adhesion to the substrate, spine and tube feet movements - have been analysed in the temperature range 28-38°C. The righting time RT (i.e., the time necessary for the animal to right itself completely after inversion) measured in the 6 sea urchin species, demonstrated a clearly dependence on the water temperature. The experiments allowed to determine the “thermal safety margin” (TSM) of each species. Echinometra lucunter and E. viridis resulted the most tolerant species to high temperatures with a TSM of 5.5°C, while T. ventricosus was the most vulnerable with a TSM of only 3°C. The study assessed that all the species already live at temperatures close to their upper thermal limit. Their TSMs are comparable to the predicted temperature increase by 2100. In absence of acclimatization to such temperature change, these species could experience severe die-offs, with important consequences for tropical marine ecosystems.

Usefulness of a clinical diagnosis of ICU-acquired paresis to predict outcome in patients with SIRS and acute respiratory failure

Neuromuscular abnormalities are common in ICU patients. We aimed to assess the incidence of clinically diagnosed ICU-acquired paresis (ICUAP) and its impact on outcome.

Spatio-temporal credit assignment in population learning

Learning by reinforcement is important in shaping animal behavior, and in particular in behavioral decision making. Such decision making is likely to involve the integration of many synaptic events in space and time. However, using a single reinforcement signal to modulate synaptic plasticity, as suggested in classical reinforcement learning algorithms, a twofold problem arises. Different synapses will have contributed differently to the behavioral decision, and even for one and the same synapse, releases at different times may have had different effects. Here we present a plasticity rule which solves this spatio-temporal credit assignment problem in a population of spiking neurons. The learning rule is spike-time dependent and maximizes the expected reward by following its stochastic gradient. Synaptic plasticity is modulated not only by the reward, but also by a population feedback signal. While this additional signal solves the spatial component of the problem, the temporal one is solved by means of synaptic eligibility traces. In contrast to temporal difference (TD) based approaches to reinforcement learning, our rule is explicit with regard to the assumed biophysical mechanisms. Neurotransmitter concentrations determine plasticity and learning occurs fully online. Further, it works even if the task to be learned is non-Markovian, i.e. when reinforcement is not determined by the current state of the system but may also depend on past events. The performance of the model is assessed by studying three non-Markovian tasks. In the first task, the reward is delayed beyond the last action with non-related stimuli and actions appearing in between. The second task involves an action sequence which is itself extended in time and reward is only delivered at the last action, as it is the case in any type of board-game. The third task is the inspection game that has been studied in neuroeconomics, where an inspector tries to prevent a worker from shirking. Applying our algorithm to this game yields a learning behavior which is consistent with behavioral data from humans and monkeys, revealing themselves properties of a mixed Nash equilibrium. The examples show that our neuronal implementation of reward based learning copes with delayed and stochastic reward delivery, and also with the learning of mixed strategies in two-opponent games.

Spatio-temporal credit assignment in population learning

Learning by reinforcement is important in shaping animal behavior. But behavioral decision making is likely to involve the integration of many synaptic events in space and time. So in using a single reinforcement signal to modulate synaptic plasticity a twofold problem arises. Different synapses will have contributed differently to the behavioral decision and, even for one and the same synapse, releases at different times may have had different effects. Here we present a plasticity rule which solves this spatio-temporal credit assignment problem in a population of spiking neurons. The learning rule is spike time dependent and maximizes the expected reward by following its stochastic gradient. Synaptic plasticity is modulated not only by the reward but by a population feedback signal as well. While this additional signal solves the spatial component of the problem, the temporal one is solved by means of synaptic eligibility traces. In contrast to temporal difference based approaches to reinforcement learning, our rule is explicit with regard to the assumed biophysical mechanisms. Neurotransmitter concentrations determine plasticity and learning occurs fully online. Further, it works even if the task to be learned is non-Markovian, i.e. when reinforcement is not determined by the current state of the system but may also depend on past events. The performance of the model is assessed by studying three non-Markovian tasks. In the first task the reward is delayed beyond the last action with non-related stimuli and actions appearing in between. The second one involves an action sequence which is itself extended in time and reward is only delivered at the last action, as is the case in any type of board-game. The third is the inspection game that has been studied in neuroeconomics. It only has a mixed Nash equilibrium and exemplifies that the model also copes with stochastic reward delivery and the learning of mixed strategies.