Regulation of lipid metabolism in adipocytes and hepatocytes by hexarelin through scavenger receptor CD36

Les sécrétines de l’hormone de croissance (GHRPs) sont de petits peptides synthétiques capables de stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance à partir de l’hypophyse via leur liaison au récepteur de la ghréline GHS-R1a. Le GHRP hexaréline a été utilisé afin d’étudier la distribution tissulaire de GHS-R1a et son effet GH-indépendant. Ainsi, par cette approche, il a été déterminé que l’hexaréline était capable de se lier à un deuxième récepteur identifié comme étant le récepteur scavenger CD36. Ce récepteur possède une multitude de ligands dont les particules oxLDL et les acides gras à longue chaîne. CD36 est généralement reconnu pour son rôle dans l’athérogénèse et sa contribution à la formation de cellules spumeuses suite à l’internalisation des oxLDL dans les macrophages/monocytes. Auparavant, nous avions démontré que le traitement des macrophages avec l’hexaréline menait à l’activation de PPARƔ via sa liaison à GHS-R1a, mais aussi à CD36. De plus, une cascade d’activation impliquant LXRα et les transporteurs ABC provoquait également une augmentation de l’efflux du cholestérol. Une stimulation de la voie du transport inverse du cholestérol vers les particules HDL entraînait donc une diminution de l’engorgement des macrophages de lipides et la formation de cellules spumeuses. Puisque CD36 est exprimé dans de multiples tissus et qu’il est également responsable du captage des acides gras à longue chaîne, nous avons voulu étudier l’impact de l’hexaréline uniquement à travers sa liaison à CD36. Dans le but d’approfondir nos connaissances sur la régulation du métabolisme des lipides par CD36, nous avons choisi des types cellulaires jouant un rôle important dans l’homéostasie lipidique n’exprimant pas GHS-R1a, soient les adipocytes et les hépatocytes. L’ensemble de mes travaux démontre qu’en réponse à son interaction avec l’hexaréline, CD36 a le potentiel de réduire le contenu lipidique des adipocytes et des hépatocytes. Dans les cellules adipeuses, l'hexaréline augmente l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la mobilisation et l’oxydation des acides gras, et induit également l’expression des marqueurs thermogéniques PGC-1α et UCP-1. De même, hexaréline augmente l’expression des gènes impliqués dans la biogenèse mitochondriale, un effet accompagné de changements morphologiques des mitochondries; des caractéristiques observées dans les types cellulaires ayant une grande capacité oxydative. Ces résultats démontrent que les adipocytes blancs traités avec hexaréline ont la capacité de se transformer en un phénotype similaire aux adipocytes bruns ayant l’habileté de brûler les acides gras plutôt que de les emmagasiner. Cet effet est également observé dans les tissus adipeux de souris et est dépendant de la présence de CD36. Dans les hépatocytes, nous avons démontré le potentiel de CD36 à moduler le métabolisme du cholestérol. En réponse au traitement des cellules avec hexaréline, une phosphorylation rapide de LKB1 et de l’AMPK est suivie d’une phosphorylation inhibitrice de l’HMG-CoA réductase (HMGR), l’enzyme clé dans la synthèse du cholestérol. De plus, la liaison d'hexaréline à CD36 provoque le recrutement d’insig-2 à HMGR, l’étape d’engagement dans sa dégradation. La dégradation de HMGR par hexaréline semble être dépendante de l’activité de PPARƔ et de l’AMPK. Dans le but d’élucider le mécanisme d’activation par hexaréline, nous avons démontré d’une part que sa liaison à CD36 provoque une déphosphorylation de Erk soulevant ainsi l’inhibition que celui-ci exerce sur PPARƔ et d’autre part, un recrutement de l’AMPK à PGC-1α expliquant ainsi une partie du mécanisme d’activation de PPARƔ par hexaréline. Les résultats générés dans cette thèse ont permis d’élucider de nouveaux mécanismes d’action de CD36 et d'approfondir nos connaissances de son influence dans la régulation du métabolisme des lipides.

Rôle de l'estérification des acides gras dans la régulation de la sécrétion d'insuline et le stress métabolique induits par le glucose

Le diabète est une maladie chronique de l’homéostasie du glucose caractérisée par une hyperglycémie non contrôlée qui est le résultat d’une défaillance de la sécrétion d’insuline en combinaison ou non avec une altération de l’action de l’insuline. La surnutrition et le manque d’activité physique chez des individus qui ont des prédispositions génétiques donnent lieu à la résistance à l’insuline. Pendant cette période dite de compensation où la concentration d’acides gras plasmatiques est élevée, l’hyperinsulinémie compense pleinement pour la résistance à l’insuline des tissus cibles et la glycémie est normale. Le métabolisme du glucose par la cellule pancréatique bêta entraîne la sécrétion d’insuline. Selon le modèle classique de la sécrétion d’insuline induite par le glucose, l’augmentation du ratio ATP/ADP résultant de la glycolyse et de l’oxydation du glucose, induit la fermeture des canaux KATP-dépendant modifiant ainsi le potentiel membranaire suivi d’un influx de Ca2+. Cet influx de Ca2+ permet l’exocytose des granules de sécrétion contenant l’insuline. Plusieurs nutriments comme les acides gras sont capables de potentialiser la sécrétion d’insuline. Cependant, le modèle classique ne permet pas d’expliquer cette potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Pour expliquer l’effet potentialisateur des acides gras, notre laboratoire a proposé un modèle complémentaire où le malonyl-CoA dérivé du métabolisme anaplérotique du glucose inhibe la carnitine palmitoyltransférase-1, l’enzyme qui constitue l’étape limitante de l’oxydation des acides gras favorisant ainsi leur estérification et donc la formation de dérivés lipidiques signalétiques. Le modèle anaplérotique/lipidique de la sécrétion d'insuline induite par le glucose prédit que le malonyl-CoA dérivé du métabolisme du glucose inhibe la bêta-oxydation des acides gras et augmente la disponibilité des acyl-CoA ou des acides gras non-estérifiés. Les molécules lipidiques agissant comme facteurs de couplage du métabolisme des acides gras à l'exocytose d'insuline sont encore inconnus. Des travaux réalisés par notre laboratoire ont démontré qu’en augmentant la répartition des acides gras vers la bêta-oxydation, la sécrétion d’insuline induite par le glucose était réduite suggérant qu’un des dérivés de l’estérification des acides gras est important pour la potentialisation sur la sécrétion d’insuline. En effet, à des concentrations élevées de glucose, les acides gras peuvent être estérifiés d’abord en acide lysophosphatidique (LPA), en acide phosphatidique (PA) et en diacylglycérol (DAG) et subséquemment en triglycérides (TG). La présente étude a établi l’importance relative du processus d’estérification des acides gras dans la production de facteurs potentialisant la sécrétion d’insuline. Nous avions émis l’hypothèse que des molécules dérivées des processus d’estérification des acides gras (ex : l’acide lysophosphatidique (LPA) et le diacylglycerol (DAG)) agissent comme signaux métaboliques et sont responsables de la modulation de la sécrétion d’insuline en présence d’acides gras. Afin de vérifier celle-ci, nous avons modifié le niveau d’expression des enzymes clés contrôlant le processus d’estérification par des approches de biologie moléculaire afin de changer la répartition des acides gras dans la cellule bêta. L’expression des différents isoformes de la glycérol-3-phosphate acyltransférase (GPAT), qui catalyse la première étape d’estérification des acides gras a été augmenté et inhibé. Les effets de la modulation de l’expression des isoenzymes de GPAT sur les processus d’estérifications, sur la bêta-oxydation et sur la sécrétion d’insuline induite par le glucose ont été étudiés. Les différentes approches que nous avons utilisées ont changé les niveaux de DAG et de TG sans toutefois altérer la sécrétion d’insuline induite par le glucose. Ainsi, les résultats de cette étude n’ont pas associé de rôle pour l’estérification de novo des acides gras dans leur potentialisation de la sécrétion d’insuline. Cependant, l’estérification des acides gras fait partie intégrante d’un cycle de TG/acides gras avec sa contrepartie lipolytique. D’ailleurs, des études parallèles à la mienne menées par des collègues du laboratoire ont démontré un rôle pour la lipolyse et un cycle TG/acides gras dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Parallèlement à nos études des mécanismes de la sécrétion d’insuline impliquant les acides gras, notre laboratoire s’intéresse aussi aux effets négatifs des acides gras sur la cellule bêta. La glucolipotoxicité, résultant d’une exposition chronique aux acides gras saturés en présence d’une concentration élevée de glucose, est d’un intérêt particulier vu la prépondérance de l’obésité. L’isoforme microsomal de GPAT a aussi utilisé comme outil moléculaire dans le contexte de la glucolipotoxicité afin d’étudier le rôle de la synthèse de novo de lipides complexes dans le contexte de décompensation où la fonction des cellules bêta diminue. La surexpression de l’isoforme microsomal de la GPAT, menant à l’augmentation de l’estérification des acides gras et à une diminution de la bêta-oxydation, nous permet de conclure que cette modification métabolique est instrumentale dans la glucolipotoxicité.

Antiobesity and antidiabetic activity of P. balsamifera, its active Salicortin, and L. laricina, medicinal plants from the traditional pharmacopoeia of the James Bay Cree

La prévalence de l’obésité, du diabète de type 2, et du syndrome métabolique, sont à la hausse chez les Cris d’Eeyou Istchee (CEI-Nord du Québec). Ces problèmes sont aggravés par leur diète non traditionnelle, leur sédentarité, ainsi que par une résistance culturelle aux produits pharmaceutiques. Afin de développer des traitements antidiabétiques culturellement adaptés, notre équipe a effectué une enquête ethnobotanique qui a identifié 17 plantes provenant de la pharmacopée traditionnelle des CEI. À partir des études de criblage effectuées in vitro, deux plantes parmi les 17 ont attiré notre attention. Populus balsamifera L. (Salicaceae) pour ses propriétés anti-obésité et Larix laricina K. Koch (Pinaceae) pour ses propriétés antidiabétiques. P. balsamifera et son composé actif salicortin ont inhibé l’accumulation de triglycérides durant l’adipogénèse dans les adipocytes 3T3-L1. L. laricina a augmenté le transport de glucose et l’activation de l’AMPK dans les cellules musculaires C2C12, l’adipogénèse dans les 3T3-L1 et a démontré un fort potentiel découpleur (propriété anti-obésité). Les objectifs de cette thèse sont d'évaluer les potentiels anti-obésité et antidiabétique et d’élucider les mécanismes d'action de P. balsamifera, salicortin, et L. laricina chez la souris C57BL/6 rendue obèse par une diète riche en gras (HFD). Les souris ont été soumises pendant huit (étude préventive) ou seize semaines (étude traitement) à une HFD, ou à une HFD dans laquelle P. balsamifera, salicortin, ou L. laricina a été incorporé soit dès le départ (prévention), ou dans les 8 dernières des 16 semaines d'administration de HFD (traitement). iv Les résultats démontrent que P. balsamifera (dans les deux études) et salicortin (évalué dans l’étude traitement) diminuent: le poids corporel, le gras rétropéritonéal, la sévérité de la stéatose et l’accumulation de triglycérides hépatique (ERK impliqué), les niveaux de glycémie et d'insuline, et le ratio leptine/adiponectine. Dans les deux études, P. balsamifera a significativement réduit la consommation de nourriture mais cet effet coupe-faim nécessite d’être approfondi. Dans l'étude préventive, P. balsamifera a augmenté la dépense énergétique (hausse de la température à la surface de la peau et de l’activation de la protéine découplante-1; UCP-1). Les voies de signalisation activées par P. balsamifera et par salicortin (de façon plus modeste) sont impliquées dans: la production de glucose hépatique (Akt), l’expression de Glut4 dans le muscle squelettique, la captation du glucose et du métabolisme des lipides (Akt dans le tissu adipeux), la différenciation des adipocytes (ERK et PPARg), l’inflammation dans le foie (IKKαβ), et l'oxydation des acides gras dans le muscle, le foie, ou le tissu adipeux (PPARa et CPT-1). D’autre part, L. laricina a également diminué les niveaux de glycémie et d’insuline, le ratio leptine/adiponectine, le gras rétropéritonéal et le poids corporel. Ces effets ont été observés en conjonction avec une augmentation de la dépense énergétique: hausse de température à la surface de la peau (prévention) et amélioration de la fonction mitochondriale et de la synthèse d'ATP (traitement). En conclusion, l’utilisation de P. balsamifera, salicortin et L. laricina comme des traitements alternatifs et culturellement adaptés aux CEI représente une contribution importante dans la prévention et le traitement de l’obésité et du diabète.

Étude de l’implication de la protéine F du virus de l’hépatite C dans le développement de pathologie hépatique chez deux lignées de poissons zébrés transgéniques

La protéine core du virus de l’hépatite C (VHC) serait responsable des principaux effets pathogènes du VHC, dont le développement de fibrose, stéatose, cirrhose et carcinome hépatocellulaire. Un cadre de lecture alternatif existe dans le gène de core, permettant la synthèse d’une autre protéine appelée ARFP (pour alternatate reading frame protein) ou protéine F (pour frameshift), dont le rôle reste encore mal compris. La présence de la protéine F lors de l’étude des fonctions biologiques de core ne pouvant être exclue, il est possible que certains rôles attribués à core reflètent en réalité l’activité de la protéine F. Afin de déterminer les fonctions biologiques de la protéine F dans les hépatocytes et son influence dans la pathogenèse associée au VHC, nous avons généré des lignées transgéniques de poissons zébrés (Danio rerio) dans lesquelles l’expression de deux versions de la protéine F (AF11opti et AUG26opti) a été ciblée au foie par l’utilisation du promoteur de la liver fatty acid binding protein (L-FABP). Le phénotype des poissons transgéniques de génération F2 a été analysé au niveau morphologique, histologique et microscopique afin de rechercher des signes de pathologie hépatique. Nos résultats ont démontré l’implication de la protéine F dans le développement de stéatose hépatique chez les deux lignées transgéniques, mais aucun signe de fibrose ou d’oncogenèse n’a été détecté. L’identification des mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’accumulation lipidique induite par la protéine F pourrait permettre de mieux comprendre son rôle dans la pathogenèse du VHC, et mener au développement de nouvelles stratégies antivirales.

Intestin et défauts métaboliques dans la résistance à l'insuline

En lien avec l’augmentation constante de l’obésité, de plus en plus de personnes sont atteintes de résistance à l’insuline ou de diabète de type 2. Ce projet doctoral s’est surtout intéressé à l’une des conséquences majeures des pathologies cardiométaboliques, soit la dyslipidémie diabétique. À cet égard, les gens présentant une résistance à l’insuline ou un diabète de type 2 sont plus à risque de développer des perturbations lipidiques caractérisées essentiellement par des taux élevés de triglycérides et de LDL-cholestérol ainsi que de concentrations restreintes en HDL-cholestérol dans la circulation. Les risques de maladies cardiovasculaires sont ainsi plus élevés chez ces patients. Classiquement, trois organes sont connus pour développer l’insulino-résistance : le muscle, le tissu adipeux et le foie. Néanmoins, certaines évidences scientifiques commencent également à pointer du doigt l’intestin, un organe critique dans la régulation du métabolisme des lipides postprandiaux, et qui pourrait, conséquemment, avoir un impact important dans l’apparition de la dyslipidémie diabétique. De façon très intéressante, des peptides produits par l’intestin, notamment le GLP-1 (glucagon-like peptide-1), ont déjà démontré leur potentiel thérapeutique quant à l’amélioration du statut diabétique et leur rôle dans le métabolisme intestinal lipoprotéinique. Une autre évidence est apportée par la chirurgie bariatrique qui a un effet positif, durable et radical sur la perte pondérale, le contrôle métabolique et la réduction des comorbidités du diabète de type 2, suite à la dérivation bilio-intestinale. Les objectifs centraux du présent programme scientifique consistent donc à déterminer le rôle de l’intestin dans (i) l’homéostasie lipidique/lipoprotéinique en réponse à des concentrations élevées de glucose (à l’instar du diabète) et à des peptides gastro-intestinaux tels que le PYY (peptide YY); (ii) la coordination du métabolisme en disposant de l’AMPK (AMP-activated protein kinase) comme senseur incontournable permettant l’ajustement précis des besoins et disponibilités énergétiques cellulaires; et (iii) l’ajustement de sa capacité d’absorption des graisses alimentaires en fonction du gain ou de la perte de sa sensibilité à l’insuline démontrée dans les spécimens intestinaux humains prélevés durant la chirurgie bariatrique. Dans le but de confirmer le rôle de l’intestin dans la dyslipidémie diabétique, nous avons tout d’abord utilisé le modèle cellulaire intestinal Caco-2/15. Ces cellules ont permis de démontrer qu’en présence de hautes concentrations de glucose en basolatéral, telle qu’en condition diabétique, l’intestin absorbe davantage de cholestérol provenant de la lumière intestinale par l’intermédiaire du transporteur NPC1L1 (Niemann Pick C1-like 1). L’utilisation de l’ezetimibe, un inhibiteur du NPC1L1, a permis de contrecarrer cette augmentation de l’expression de NPC1L1 tout comme l’élévation de l’absorption du cholestérol, prouvant ainsi que le NPC1L1 est bel et bien responsable de cet effet. D’autre part, des travaux antérieurs avaient identifié certains indices quant à un rôle potentiel du peptide intestinal PYY au niveau du métabolisme des lipides intestinaux. Toutefois, aucune étude n’avait encore traité cet aspect systématiquement. Pour établir définitivement l’aptitude du PYY à moduler le transport et le métabolisme lipidique dans l’intestin, nous avons utilisé les cellules Caco-2/15. Notre étude a permis de constater que le PYY incubé du côté apical est capable de réduire significativement l’absorption du cholestérol et le transporteur NPC1L1. Puisque le rôle de l'AMPK dans l'intestin demeure inexploré, il est important non seulement de définir sa structure moléculaire, sa régulation et sa fonction dans le métabolisme des lipides, mais aussi d'examiner l'impact de l’insulino-résistance et du diabète de type 2 (DT2) sur son statut et son mode d’action gastro-intestinal. En employant les cellules Caco-2/15, nous avons été capables de montrer (i) la présence de toutes les sous-unités AMPK (α1/α2/β1/β2/γ1/γ2/γ3) avec une différence marquée dans leur abondance et une prédominance de l’AMPKα1 et la prévalence de l’hétérotrimère α1/β2/γ1; (ii) l’activation de l’AMPK par la metformine et l’AICAR, résultant ainsi en une phosphorylation accrue de l’enzyme acétylCoA carboxylase (ACC) et sans influence sur l'HMG-CoA réductase; (iii) la modulation négative de l’AMPK par le composé C et des concentrations de glucose élevées avec des répercussions sur la phosphorylation de l’ACC. D’autre part, l’administration de metformine au Psammomys obesus, un modèle animal de diabète et de syndrome métabolique, a conduit à (i) une régulation positive de l’AMPK intestinale (phosphorylation de l’AMPKα-Thr172); (ii) la réduction de l'activité ACC; (iii) l’augmentation de l’expression génique et protéique de CPT1, supportant une stimulation de la β-oxydation; (iv) une tendance à la hausse de la sensibilité à l'insuline représentée par l’induction de la phosphorylation d'Akt et l’inactivation de la phosphorylation de p38; et (v) l’abaissement de la formation des chylomicrons ce qui conduit à la diminution de la dyslipidémie diabétique. Ces données suggèrent que l'AMPK remplit des fonctions clés dans les processus métaboliques de l'intestin grêle. La preuve flagrante de l’implication de l’intestin dans les événements cardiométaboliques a été obtenue par l’examen des spécimens intestinaux obtenus de sujets obèses, suite à une chirurgie bariatrique. L’exploration intestinale nous a permis de constater chez ceux avec un indice HOMA élevé (marqueur d’insulinorésistance) (i) des défauts de signalisation de l'insuline comme en témoigne la phosphorylation réduite d'Akt et la phosphorylation élevée de p38 MAPK; (ii) la présence du stress oxydatif et de marqueurs de l'inflammation; (iii) la stimulation de la lipogenèse et de la production des lipoprotéines riches en triglycérides avec l’implication des protéines clés FABP, MTP et apo B-48. En conclusion, l'intestin grêle peut être classé comme un tissu insulino-sensible et répondant à plusieurs stimuli nutritionnels et hormonaux. Son dérèglement peut être déclenché par le stress oxydatif et l'inflammation, ce qui conduit à l'amplification de la lipogenèse et la synthèse des lipoprotéines, contribuant ainsi à la dyslipidémie athérogène chez les patients atteints du syndrome métabolique et de diabète de type 2.

ANALYSIS, MODIFICATION, AND EVALUATION OF THE COLD FLOW PROPERTIES OF VEGETABLE OILS AS BASE OIL FOR INDUSTRIAL LUBRICANTS

Poor cold flow properties of vegetable oils are a major problem preventing the usage of many abundantly available vegetable oils as base stocks for industrial lubricants. The major objective of this research is to improve the cold flow properties of vegetable oils by various techniques like additive addition and different chemical modification processes. Conventional procedure for determining pour point is ASTM D97 method. ASTM D97 method is time consuming and reproducibility of pour point temperatures is poor between laboratories. Differential Scanning Calorimetry (DSC) is a fast, accurate and reproducible method to analyze the thermal activities during cooling/heating of oil. In this work coconut oil has been chosen as representative vegetable oil for the analysis and improvement cold flow properties since it is abundantly available in the tropics and has a very high pour point of 24 °C. DSC is used for the analysis of unmodified and modified vegetable oil. The modified oils (with acceptable pour points) were then subjected to different tests for the valuation of important lubricant properties such as viscometric, tribological (friction and wear properties), oxidative and corrosion properties.A commercial polymethacrylate based PPD was added in different percentages and the pour points were determined in each case. Styrenated phenol(SP) was added in different concentration to coconut oil and each solution was subjected to ASTM D97 test and analysis by DSC. Refined coconut oil and other oils like castor oil, sunflower oil and keranja oil were mixed in different proportions and interesterification procedure was carried out. Interesterification of coconut oil with other vegetable oils was not found to be effective in lowering the pour point of coconut oil as the reduction attained was only to the extent of 2 to 3 °C.Chemical modification by acid catalysed condensation reaction with coconut oil castor oil mixture resulted in significant reduction of pour point (from 24 ºC to -3 ºC). Instead of using triacylglycerols, when their fatty acid derivatives (lauric acid- the major fatty acid content of coconut oil and oleic acid- the major fatty acid constituents of monoand poly- unsaturated vegetable oils like olive oil, sunflower oil etc.) were used for the synthesis , the pour point could be brought down to -42 ºC. FTIR and NMR spectroscopy confirmed the ester structure of the product which is fundamental to the biodegradability of vegetable oils. The tribological performance of the synthesised product with a suitable AW/EP additive was comparable to the commercial SAE20W30 oil. The viscometric properties (viscosity and viscosity index) were also (with out additives) comparable to commercial lubricants. The TGA experiment confirmed the better oxidative performance of the product compared to vegetable oils. The sample passed corrosion test as per ASTM D130 method.

Fatty acids as Biomarkers in the Mangrove sediments of Cochin

The biogeochemistry of mangroves are the least understood ecological properties because of their sediment complexicity due to the tidal influx of allochthonous organic matter and the autochthonous inputs.In order to understand the relative importance of biogeochemical processes,it is necessary not only to characterise and qualify the organic matter but also to identify its major sources .The present study is a preliminary investigation to identify the sources of organic matter in three mangrove systems of Cochin Estuary using fatty acid biomarkers,δ13 C of total organic matter,elemental composition and biochemical composition.

Ermittlung geeigneter Methoden zur Differenzierung und Qualitätsbeurteilung unterschiedlicher Milchqualitäten aus verschiedenen on-farm-Experimenten

Zusammenfassung: Ziel der Arbeit war ein Methodenvergleich zur Beurteilung der Milchqualität unterschiedlicher Herkünfte. Am Beispiel von Milchproben aus unterschiedlicher Fütterung sowie an Milchproben von enthornten bzw. horntragenden Kühen wurde geprüft, welche der angewendeten Methoden geeignet ist, die Vergleichsproben zu unterscheiden (Differenzierungsfähigkeit der Methoden) und inwieweit eine Qualitätsbeurteilung möglich ist (hinsichtlich Milchleistung, Fett-, Eiweiß-, Lactose- (=F,E,L), Harnstoff-gehalt und Zellzahl (=SCC), Säuerungseigenschaften (=SE), Fettsäuremuster (=FS-Muster), Protein- und Metabolit-Zusammensetzung (=Pr&M), Fluoreszenz-Anregungs-Spektroskopie-Eigenschaften (=FAS) und Steigbild-Merkmalen). Zusätzlich wurde vorab die Steigbildmethode (=SB-M) für das Produkt Rohmilch standardisiert und charakterisiert, um die Reproduzierbarkei der Ergebnisse sicherzustellen. Die Untersuchungen zur SB-M zeigten, dass es Faktoren gibt, die einen deutlichen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung aufweisen. Dazu gehören laborseitig die Klimabedingungen in der Kammer, die Verdünnungsstufe der Probe, die Standzeiten der Vorverdünnung (Reaktionen mit der Luft, Alterung usw.), und tagesspezifisch auftretende Effekte, deren Ursache unbekannt ist. Probenseitig sind sehr starke tierindividuelle Effekte auf die Bildmerkmals-Ausprägung festzustellen, die unabhängig von Fütterung, Alter, Laktationsstadium und Genetik auftreten, aber auch Fütterungsbedingungen der Kühe lassen sich in der Bildmerkmals-Ausprägung wiederfinden. Die Art der Bildauswertung und die dabei berücksichtigten Bildmerkmale ist von großer Bedeutung für das Ergebnis. Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten 46 Probenpaare (aus den Fütterungsvergleichen (=FV) und zur Thematik der Hörner) konnten in 91% der Fälle korrekt gruppiert werden. Die Unterschiede konnten benannt werden. Drei FV wurden auf drei biologisch-dynamischen Höfen unter Praxis-Bedingungen durchgeführt (on-farm-Experimente). Es wurden jeweils zwei vergleichbare Gruppen à mindestens 11 Kühen gebildet, die im Cross-Over-Design gefüttert wurden, mit Probennahme am 14. und 21. Tag je Periode. Es wurden folgende FV untersucht: A: Wiesenheu vs. Kleegrasheu (=KG-Heu), B: Futterrüben (=FuR) vs. Weizen (Ergänzung zu Luzernegrasheu ad lib.), C: Grassilage vs. Grasheu. Bei Versuch A sind die Futtereffekte am deutlichsten, Gruppeneffekte sind gering. Die Milch der Wiesenheu-Variante hat weniger CLA’s und n3- FS und mehr mittellangkettige FS (MCT-FS), das Pr&M-Muster weist auf „Gewebereifung und Ausdifferenzierung“ vs. bei KG-Heu „Nährstoff-fülle, Wachstum und Substanz-Einlagerung und die SB zeigen fein ausdifferenzierte Bildmerkmale. Bei Versuch B sind die Futtereffekte ähnlich groß wie die Gruppeneffekte. Bei vergleichbarer Milchleistung weist die Milch der FuR-Variante höhere F- und E-Gehalte auf, sie säuert schneller und mehr, das FS-Muster weist auf eine „intensive“ Fütterung mit vermehrt MCT- FS, und die Pr&M-Untersuchungen charakterisieren sie mit „Eisentransport und Fetttröpfchenbildung“ vs. bei Weizen „mehr Abwehr-, Regulations- und Transportfunktion“ /. „mehr Lipidsynthese“. Die SB charakterisieren mit „große, kräftige Formen, verwaschen“ vs. „kleine, ausdifferenzierte Bildmerkmal“ für FuR vs. Weizen. Die FAS charakterisiert sie mit „Saftfutter-typisch“ vs. „Samentypisch“. Versuch C weist die geringsten Futtereffekt auf, und deutliche Gruppen- und Zeiteffekte. Milchleistung und F,E,L-Gehalte zeigen keinen Futtereffekt. Die Milch der Heu-Variante säuert schneller, und sie weist mehr SCT und MCT- FS auf. Pr&M-Untersuchungen wurden nicht durchgeführt. Die SB charakterisieren bei Heumilch mit „fein, zart, durchgestaltet, hell“, bei Silagemilch mit „kräftig, wäßrig-verwaschen, dunkler“. Die FAS kann keine konsistenten Unterschiede ermitteln. Der Horn-Einfluß auf die Milchprobe wurde an 34 Probenpaaren untersucht. Von 11 Höfen wurden je zwei möglichst vergleichbare Gruppen zusammengestellt, die sich nur im Faktor „Horn“ unterscheiden, und im wöchentlichen Abstand drei mal beprobt. F,E,L, SCC und SE der Proben sowie die FAS-Messungen weisen keine konsistenten signifikanten Unterschiede zwischen den Horn-Varianten auf. Pr&M weisen bei den untersuchten Proben (von zwei Höfen) auf Horneffekte hin: bei Eh eine Erhöhung von Immun-Abwehr-Funktionen, sowie einer Abnahme phosphorylierter C3- und C6-Metabolite und Beta-Lactoglobulin. Mit den SB ließen sich für die gewählten Merkmale (S-Größe und g.B.-Intensität) keine Horneffekte feststellen. FS, Pr&M-Muster sowie Harnstoffgehalt und SB (und z.T. Milchleistung) zeigten je FV ähnliche Effekt-Intensitäten für Futter-, Gruppen- und Zeiteffekte, und konnten die Cross-Over-Effekte gut wiedergeben. F- und E-Gehalte konnten neben tierindividuellen Effekten nur in FV B auch Futtereffekte aufzeigen. In FV C zeigten die SE der Proben den deutlichsten Futtereffekt, die anderen Methoden zeigten hier vorrangig Gruppen-Effekte, gefolgt von Futter- und Zeiteffekten. Die FAS zeigte den SB vergleichbare Ergebnisse, jedoch weniger sensibel reagierend. Die Interpretation von Qualitätsaspekten war bei konsistent differenzierbaren Proben (FV A, B, C) am fundiertesten mit Hilfe der FS möglich, da über die Synthese von FS und beeinflussende Faktoren schon vielfältige Erkenntnisse vorliegen. Das Pr&M-Muster war nach einer weiteren Methodenentwicklung bei der Deutung von Stoffwechselprozessen sehr hilfreich. Die FAS konnte z.T. eine zu der Fütterungsvariante passende Charakterisierung liefern. Für die SB-M fehlt es noch an Referenzmaterial, um Angaben zu Qualitätsaspekten zu machen, wenngleich Probenunterschiede aufgezeigt und Proben-Eigenschaften charakterisiert werden konnten.

Les sHsps en surera: Estudis de funcionalitat

Aquesta tesi es centra en la caracterització funcional d'una proteïna de xoc de calor de baix pes molecular (Small Heat Shock Protein - sHSP) de classe I de surera pel que fa a la seva capacitat per protegir les cèl·lules de l'estrès i per estabilitzar les membranes. Les sHsps són proteïnes que s'expressen en condicions d'estrès cel·lular. Encara que certs aspectes funcionals de les sHsps són ben coneguts, el nostre treball aporta informacions noves sobre el paper de les diferents regions de la proteïna, especialment de la regió N-terminal. L'objectiu concret d'aquest treball és determinar la funció termoprotectora de QsHsp17.4-CI, una sHsp de classe I oobtinguda a partir de les cèl·lules de fel·lema d'alzina surera, en un model bacterià i analitzar la importància de les diferents regions de la proteïna en aquesta funció. Amb aquesta finalitat s'han dissenyat dues proteïnes parcials derivades de QsHsp17.4-CI: una a la que li falta la regió N-terminal (C105) i una altra amb pràcticament tot el domini -cristal·lí deleccionat (N61), i una tercera, derivada de QsHs10-CI, a la que li falta la meitat del domini -cristal·lí (Hsp10). També s'estudia la possible capacitat estabilitzadora de membranes i la capacitat de modificar l'expressió d'altres Hsps quan s'expressa de forma heteròloga. Els nostres resultats demostren que l'expressió de QsHsp17.4-CI protegeix a les cèl·lules d'E.coli de l'estrès tèrmic alhora que la regió N-terminal i la regió consens II del domini -cristal·lí són imprescindibles per aquesta funció de protecció. En relació a un possible paper en les membranes, els estudis de localització subcel·lular mostren que QsHsp17.4-CI colocalitza amb la fracció membranes i que la regió N-terminal de la proteïna és responsable d'aquesta colocalització. No s'ha pogut demostrar, però, que la localització amb la membrana estigui associada a un efecte protector d'aquesta: en cap cas la sobrexpressió de les proteïnes modifica la composició d'àcids grassos i només N61, que no té acció termoprotectora, altera l'estat fisico-químic de la membrana. En estudis d'expressió de novo en E.coli s'ha observat que, a diferència de les altres proteïnes heteròlogues, N61 activa l'expressió de la majoria de Hsps d'E.coli fent pensar en una possible relació entre l'estat físic de la membrana i l'activació de la resposta a l'estrès. En resum, en aquest treball hem provat la capacitat protectora de QsHsp17.4 i aportem noves dades sobre la importància de la regió N-terminal i la regió consens II del domini -cristal·lí en aquesta funció. Per altra banda, es suggereix que QsHsp17.4 podria interaccionar amb la membrana d'E.coli i que la regió N-terminal seria imprescindible per aquesta interacció. Finalment hem determinat que les proteïnes que provoquen variacions en l'estat de fluïdesa de la membrana poden activar la resposta al xoc de calor per part de la cèl·lula bacteriana.

Dietary supplements of whole linseed and vitamin E to increase levels of alpha-linolenic acid and vitamin E in bovine milk

The potential to increase the concentrations of n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) in milk fat was investigated by studying the effects of feeding a xylose-treated, whole cracked linseed supplement ( rich in alpha-linolenic acid) to dairy cows. Also the effect of increasing the dietary intake of vitamin E on the vitamin E status of milk was investigated. The effect of pasteurisation on milk fatty acid composition was also examined. Using a 3 x 2 factorial design, a total of 60 Holstein dairy cows were fed a total mixed ration based on grass silage supplemented with one of three levels of whole cracked linseed (78, 142 or 209 g . kg(-1) diet dry matter (DM); designated LL, ML or HL, respectively) in combination with one of two levels of additional dietary vitamin E intake ( 6 or 12 g vitamin E . animal(-1) . day(-1); designated LE or HE, respectively). Increasing lipid supplementation reduced (P < 0.01) diet DM intake and milk yield, and increased (P < 0.001) the overall content of oleic, vaccenic, alpha-linolenic and conjugated linoleic acids, and total PUFAs and monounsaturated fatty acids (MUFA). Myristic and palmitic acids in milk fat were reduced ( P < 0.001) through increased lipid supplementation. While α-linolenic acid concentrations were substantially increased this acid only accounted for 0.02 of total fatty acids in milk at the highest level of supplementation (630 g α-linolenic acid &BULL; animal(-1) &BULL; day(-1) for HL). Conjugated linoleic acid concentrations in milk fat were almost doubled by increasing the level of lipid supplementation (8.9, 10.4 and 16.1 g &BULL; kg(-1) fatty acids for LL, ML and HL, respectively). Although milk vitamin E contents were generally increased there was no benefit (P > 0.05) of increasing vitamin E intake from 6 to 12 g . animal(-1) . day(-1). The fatty acid composition of milk was generally not affected by pasteurisation.

Enhancement of oleic acid and vitamin E concentrations of bovine milk using dietary supplements of whole rapeseed and vitamin E

With the aim of reducing the degree of saturation and increasing the C18:1 cis fatty acid content of milk fat, the effects of feeding high levels of whole cracked rapeseed to dairy cows was investigated together with the effect of increasing dietary intake of vitamin E on the vitamin E content of milk. Using a 3 x 3 factorial design, 90 Holstein dairy cows were fed one of three levels of whole cracked rapeseed (0 (ZR), 134 (MR) and 270 g . kg(-1) diet dry matter (DM) (HR)) in combination with one of three intakes of supplementary vitamin E (0 (ZE), 2 (ME) and 4 g . cow(-1) . d(-1) (HE)). Supplementing with up to almost 2 kg . d(-1) of rapeseed oil (diet HR) significantly (P < 0.001) increased C18: 1cis in milk fat, from 181 (ZR) to over 400 g &BULL; kg(-1) (HR) of total milk fatty acids. Concentrations of C18: 0, C18: 2 and C18: 3 fatty acids were also increased ( P < 0.001) but by a much lesser degree, and the saturated fatty acids C4: 0 to C16: 0 decreased substantially. Vitamin E supplementation increased ( P < 0.01) milk vitamin E concentrations from 1.29 (ZE) to 1.68 mg &BULL; kg(-1) whole milk (HE). Thus substantial changes in milk fat composition with potentially beneficial effects on human health were achieved and without any adverse effects on milk taste. However, these improvements must be offset against the substantial reductions ( P < 0.001) observed in voluntary feed DM consumption (ZR, 20.6; HR, 15.2 kg DM . d(-1)), milk yield (ZR, 22.9; HR, 13.2 kg . d(-1)) and milk fat concentration (ZR, 42.1; HR, 33.4 g . kg(-1)) which would not be commercially sustainable unless a considerable premium was paid for this modified milk. It seems likely that the optimum dose of dietary rapeseed is lower than used in this study.

Effect of dietary vitamin A restriction on marbling and conjugated-linoleic acid (CLA) content in Holstein steers

To determine the effect of duration of dietary vitamin A restriction on site of fat deposition in growing cattle, 60 Holstein steers (BW = 218.4 ± 6.55 kg) were fed a diet based on high-moisture corn with 2,200 IU supplemental vitamin A/kg DM (C) or no supplemental vitamin A for a long (243 d; LR) or short (131 d; SR) restriction prior to harvest at 243 d. The SR steers were fed the C diet for the first 112 d. Steers were penned individually and fed for ad libitum intake. Jugular vein blood samples for serum retinol analysis were collected on d 1, 112, and 243. Carcass samples were collected for composition analysis. Subcutaneous fat samples were collected for fatty acid composition. Fat samples from the i.m. and s.c. depot were collected to measure adipocyte size and density. Feedlot performance (ADG, DMI, and G:F) was not affected (P > 0.05) by vitamin A restriction. On d 243, the i.m. fat content of the LM was 33% greater (P < 0.05) for LR than for SR and C steers (5.6 vs. 3.9 and 4.2% ether extract, respectively). Depth of back fat and KPH percentage were not affected (P = 0.44 and 0.80, respectively) by vitamin A restriction. Carcass weight, composition of edible carcass, and yield grade were similar among treatments (P > 0.10). Liver retinol (LR = 6.1, SR = 6.5, and C = 44.7 µg/g; P < 0.01) was reduced in LR and SR vs. C steers. On d 243, LR and SR steers had similar serum retinol concentrations, and these were lower (P < 0.01) than those of C steers (LR = 21.2, SR = 25.2, and C = 36.9 µg/dL). Intramuscular adipose cellularity (adipocyte/mm2 and mean adipocyte diameter) on d 112 and d 243 was not affected (P > 0.10) by vitamin A restriction. Restricting vitamin A intake for 243 d increased i.m fat percentage without affecting s.c. or visceral fat deposition, feedlot performance, or carcass weight. Restricting vitamin A intake for 131 d at the end of the finishing period appears to be insufficient to affect the site of fat deposition in Holstein steers.

Outlining eicosanoid biosynthesis in the crustacean Daphnia

Background: Eicosanoids are biologically active, oxygenated metabolites of three C20 polyunsaturated fatty acids. They act as signalling molecules within the autocrine or paracrine system in both vertebrates and invertebrates mainly functioning as important mediators in reproduction, the immune system and ion transport. The biosynthesis of eicosanoids has been intensively studied in mammals and it is known that they are synthesised from the fatty acid, arachidonic acid, through either the cyclooxygenase (COX) pathway; the lipoxygenase (LOX) pathway; or the cytochrome P450 epoxygenase pathway. However, little is still known about the synthesis and structure of the pathway in invertebrates. Results: Here, we show transcriptomic evidence from Daphnia magna (Crustacea: Branchiopoda) together with a bioinformatic analysis of the D. pulex genome providing insight on the role of eicosanoids in these crustaceans as well as outlining a putative pathway of eicosanoid biosynthesis. Daphnia appear only to have one copy of the gene encoding the key enzyme COX, and phylogenetic analysis reveals that the predicted protein sequence of Daphnia COX clusters with other invertebrates. There is no current evidence of an epoxygenase pathway in Daphnia; however, LOX products are most certainly synthesised in daphnids. Conclusion: We have outlined the structure of eicosanoid biosynthesis in Daphnia, a key genus in freshwater ecosystems. Improved knowledge of the function and synthesis of eicosanoids in Daphnia and other invertebrates could have important implications for several areas within ecology. This provisional overview of daphnid eicosanoid biosynthesis provides a guide on where to focus future research activities in this area.

Fatty acids and the immune system: from basic science to clinical applications

Over the last 25 years, the effects of fatty acids on the immune system have been characterized using in vitro, animal and human studies. Advances in fatty acid biochemistry and molecular techniques have recently suggested new mechanisms by which fatty acids could potentially modify immune responses, including modification of the organization of cellular lipids and interaction with nuclear receptors. Possibilities for the clinical applications of n-3 PUFA are now developing. The present review focuses on the hypothesis that the anti-inflammatory properties of n-3 PUFA in the arterial wall may contribute to the protective effects of n-3 PUFA in CVD, as suggested by epidemiological and secondary prevention studies. Studies are just beginning to show that dietary n-3 PUFA can be incorporated into plaque lipid in human subjects, where they may influence the morphology and stability of the atherosclerotic lesion.

Effects of dairy products naturally enriched with cis-9,trans-11 conjugated linoleic acid on the blood lipid profile in healthy middle-aged men

Background: Interest in the development of dairy products naturally enriched in conjugated linoleic acid (CLA) exists. However, feeding regimens that enhance the CLA content of milk also increase concentrations of trans-18:1 fatty acids. The implications for human health are not yet known. Objective: This study investigated the effects of consuming dairy products naturally enriched in cis-9,trans-11 CLA (and trans-11 18:1) on the blood lipid profile, the atherogenicity of LDL, and markers of inflammation and insulin resistance in healthy middle-aged men. Design: Healthy middle-aged men (n = 32) consumed ultra-heat-treated milk, butter, and cheese that provided 0.151 g/d (control) or 1.421 g/d (modified) cis-9,trans-11 CLA for 6 wk. This was followed by a 7-wk washout and a crossover to the other treatment. Results: Consumption of dairy products enriched with cis-9,trans-11 CLA and trans-11 18:1 did not significantly affect body weight, inflammatory markers, insulin, glucose, triacylglycerols, or total, LDL, and HDL cholesterol but resulted in a small increase in the ratio of LDL to HDL cholesterol. The modified dairy products changed LDL fatty acid composition but had no significant effect on LDL particle size or the susceptibility of LDL to oxidation. Overall, increased consumption of full-fat dairy products and naturally derived trans fatty acids did not cause significant changes in cardiovascular disease risk variables, as may be expected on the basis of current health recommendations. Conclusion: Dairy products naturally enriched with cis-9,trans-11 CLA and trans-11 18: 1 do not appear to have a significant effect on the blood lipid profile.