Impact de HOXB4 sur les cellules B

La greffe de cellules souches hématopoïétiques autologue est une thérapie de plus en plus utilisée. Cependant, les traitements de chimiothérapie ou de radiothérapie intensifs peuvent affecter les cellules souches et diminuer le nombre de ces cellules pouvant être mobilisées à des fins de transplantation. Il serait donc très utile de pouvoir expandre ces cellules souches afin de s’assurer qu’elles soient en quantité suffisante pour procéder à la greffe. Or, il a été démontré que la protéine HOXB4 a la capacité d’expandre les cellules souches hématopoïétiques humaines et murines. Lors d’une greffe autologue, la moelle osseuse est cependant colonisée par des cellules malignes. Notre objectif était donc de s’assurer que la protéine HOXB4 expand les cellules souches hématopoïétiques normales mais n’expand pas les cellules « souches » leucémiques. De plus, comme des expériences précédentes ont démontré que chez des souris transplantées avec des cellules souches surexprimant HOXB4, la reconstitution du système hématopoïétique pouvait favoriser les cellules myéloïdes aux dépends des cellules lymphoïdes, nous avons aussi voulu déterminer l’impact de HOXB4 sur la différenciation des cellules progénitrices lymphoïdes normales. Pour ce faire, nous avons exposé des cellules humaines et murines à la protéine HOXB4 afin de comparer la prolifération des cellules B malignes à celle des cellules B normales. De plus, nous avons évalué l’impact de HOXB4 sur les cellules B à leurs différents stades de différenciation. Nos résultats démontrent que HOXB4 ne favorise pas l’expansion des cellules leucémiques. De plus, nous avons observé que les cellules lymphoïdes surexprimant la protéine HOXB4 ont un ralentissement dans leur processus de différenciation. Aussi, la surexpression de HOXB4 entraîne une diminution de la fréquence et du nombre de progéniteurs lymphoïdes normaux. Ces résultats démontrent donc que la protéine HOXB4 ne produit pas d’expansion des cellules malignes. De plus, elle confère un désavantage prolifératif aux cellules lymphoïdes.

Étude d’un modèle murin de vieillissement sur la sténose valvulaire aortique

La sténose valvulaire aortique (SVA) est une pathologie associée au vieillissement et aux facteurs de risque cardiovasculaire. Afin d’étudier la SVA et d’explorer de nouvelles thérapies, plusieurs modèles animaux ont été récemment développés, mais la plupart de ces modèles ciblent les mécanismes de développement de la SVA reliés à l’hypercholestérolémie. Le syndrome de Werner (WS) est une maladie caractérisée par un vieillissement prématuré. Récemment, il a été découvert que des souris mutantes ayant une délétion du domaine hélicase du gène Werner, responsable du WS, démontraient un profile hémodynamique typique de la SVA. De ce fait, nous avons émis l’hypothèse que ces souris pourraient développer une SVA plus rapidement que des souris de type sauvage. Nous avons donc étudié les effets cette mutation chez des souris WrnΔhel/Δhel, en comparant le taux de progression d’une SVA entre des souris WrnΔhel/Δhel (WrnΔhel) et des souris de type sauvage comme groupe contrôle. À la suite d’une diète riche en sucre et en gras sur une période de 24 semaines, les souris WrnΔhel ont démontré une diminution plus prononcée de leur aire de valve aortique (mesures échocardiographiques) que les souris contrôles, supportée par les analyses histologiques concernant la fibrose des valves aortiques. Les souris n’ont toutefois développé aucun signe évident d’athérosclérose comme l’infiltration de lipides ou l’inflammation, bien que certaines caractéristiques liées à la dysfonction endothéliale semblent être augmentées chez les souris WrnΔhel. D’autres mesures échocardiographiques indiquant une SVA, comme une hypertrophie du ventricule gauche dans le groupe WrnΔhel, ont été obtenues. Nous avons aussi observé des indices de vieillissement plus marqués quant aux analyses sanguines et de la moelle osseuse des souris WrnΔhel en comparaison avec les souris contrôles. Par conséquent, ce modèle expérimental de vieillissement pourrait être utilisé pour les études futures sur la SVA sans les principaux effets athérogéniques des autres modèles expérimentaux.

Evaluation of oxytocin pharmacokinetic : pharmacodynamic profile and establishment of its cardiomyogenic potential in swine

La thérapie cellulaire est une avenue pleine de promesses pour la régénération myocardique, par le remplacement du tissu nécrosé, ou en prévenant l'apoptose du myocarde survivant, ou encore par l'amélioration de la néovascularisation. Les cellules souches de la moelle osseuse (CSMO) expriment des marqueurs cardiaques in vitro quand elles sont exposées à des inducteurs. Pour cette raison, elles ont été utilisées dans la thérapie cellulaire de l'infarctus au myocarde dans des études pre-cliniques et cliniques. Récemment, il a été soulevé de possibles effets bénéfiques de l'ocytocine (OT) lors d’infarctus. Ainsi, l’OT est un inducteur de différenciation cardiaque des cellules souches embryonnaires, et cette différenciation est véhiculée par la voie de signalisation du monoxyde d’azote (NO)-guanylyl cyclase soluble. Toutefois, des données pharmacocinétiques de l’OT lui attribue un profil non linéaire et celui-ci pourrait expliquer les effets pharmacodynamiques controversés, rapportés dans la lttérature. Les objectifs de ce programme doctoral étaient les suivants : 1) Caractériser le profil pharmacocinétique de différents schémas posologiques d'OT chez le porc, en développant une modélisation pharmacocinétique / pharmacodynamique plus adaptée à intégrer les effets biologiques (rénaux, cardiovasculaires) observés. 2) Isoler, différencier et trouver le temps optimal d’induction de la différenciation pour les CSMO porcines (CSMOp), sur la base de l'expression des facteurs de transcription et des protéines structurales cardiaques retrouvées aux différents passages. 3) Induire et quantifier la différenciation cardiaque par l’OT sur les CSMOp. 4) Vérifier le rôle du NO dans cette différenciation cardiaque sur les CSMOp. Nous avons constaté que le profil pharmacocinétique de l’OT est mieux expliqué par le modèle connu comme target-mediated drug disposition (TMDD), parce que la durée du séjour de l’OT dans l’organisme dépend de sa capacité de liaison à son récepteur, ainsi que de son élimination (métabolisme). D'ailleurs, nous avons constaté que la différenciation cardiomyogénique des CSMOp médiée par l’OT devrait être induite pendant les premiers passages, parce que le nombre de passages modifie le profile phénotypique des CSMOp, ainsi que leur potentiel de différenciation. Nous avons observé que l’OT est un inducteur de la différenciation cardiomyogénique des CSMOp, parce que les cellules induites par l’OT expriment des marqueurs cardiaques, et l'expression de protéines cardiaques spécifiques a été plus abondante dans les cellules traitées à l’OT en comparaison aux cellules traitées avec la 5-azacytidine, qui a été largement utilisée comme inducteur de différenciation cardiaque des cellules souches adultes. Aussi, l’OT a causé la prolifération des CMSOp. Finalement, nous avons observé que l'inhibition de la voie de signalisation du NO affecte de manière significative l'expression des protéines cardiaques spécifiques. En conclusion, ces études précisent un potentiel certain de l’OT dans le cadre de la thérapie cellulaire cardiomyogénique à base de cellules souches adultes, mais soulignent que son utilisation requerra de la prudence et un approfondissement des connaissances.

Mécanisme d’action du PBI-1402 impliqué dans l’expansion des progéniteurs érythroïdes humains et murins

Une des complications importantes d’un traitement intensif de chimio/radio-thérapie est l’aplasie de la moelle osseuse qui peut persister longtemps même après une greffe de cellules souches. Le PBI-1402 est un petit lipide qui a été associé à la diminution de l’apoptose des neutrophiles induite par des agents cytotoxiques. Nos travaux ont démontré que la culture in vitro de progéniteurs hématopoiétiques humains en présence de PBI-1402 induit une augmentation significative du nombre de progéniteurs érythroides (PEryth) (p<0,05). En évaluant la sensibilité des PEryth à l’érythropoietine (Epo), nous avons démontré que le PBI-1402 n’a pas d’effet sensibilisateur et que les cellules répondent de façon similaire aux cellules contrôles. De plus, la combinaison de l’Epo et du « stem cell factor » avec le PBI-1402 permet de prolonger et d’augmenter l’activation d’ERK1/2 (p<0,05), un important signal mitogène. Cet effet est associé à une inhibition de l’activation de la phosphatase MKP-1 dans les cellules exposées au PBI-1402. Nous démontrons aussi la capacité du PBI-1402 à amplifier la prolifération des PEryth et sa capacité à réduire la durée et l’intensité de l’anémie dans un modèle in vivo murin. Des souris ayant reçu une dose létale d’irradiation et subi une transplantation syngénique de moelle osseuse, ont été traitées oralement avec le PBI-1402 pendant 14 jours. Ces souris démontrent une réduction significative de l’anémie post-transplantation versus les souris contrôle (p<0,05). De plus, la moelle osseuse des souris traitées au PBI-1402 présente un nombre de BFU-E et CFU-E plus élevé comparativement au contrôle. Ces résultats démontrent donc le potentiel du PBI-1402 à réduire l’anémie post-transplantation et accélérer la reconstitution érythroïde.

Défaillance cardiaque et mécanismes de protection et réparation du myocarde

La cardiomyopathie ischémique et l’insuffisance cardiaque (IC) sont deux des principales causes de morbidité et de mortalité dans les pays industrialisés. L’IC représente la condition finale résultant de plusieurs pathologies affectant le myocarde. Au Canada, plus de 400 000 personnes souffrent d’IC. Malgré la grande variété de traitements disponibles pour prendre en charge ces patients à haut risque de mortalité, l’évolution et le pronostic clinique de cette population demeurent sombres. Les thérapies de régénération par transplantation cellulaire représentent de nouvelles approches pour traiter les patients souffrant d’IC. L’impact de cette approche cellulaire et les mécanismes qui sous-tendent l’application de ce nouveau mode de traitement demeurent obscurs. Les hypothèses proposées dans cette thèse sont les suivantes : 1) l’évolution à long terme des patients qui se présentent en IC grave est nettement défavorable malgré les techniques actuelles de revascularisation chirurgicale à cœur battant; 2) la thérapie cellulaire et, plus spécifiquement, l’injection intracoronaire précoce de milieu de culture cellulaire, permet d’améliorer la récupération fonctionnelle du ventricule gauche suite à un infarctus aigu du myocarde; et 3) la mobilisation de l’axe cœur-moelle osseuse constitue un mécanisme de réponse important lors de la survenue d’un événement ischémique chronique affectant le myocarde.

Les cellules dendritiques plasmacytoides dans le sang de cordon et après greffe de sang de cordon

La greffe de sang de cordon est de plus en plus utilisée et a permis de traiter avec succès chez l’enfant des déficits immunitaires ainsi que des hémopathies malignes comme les leucémies. Malgré d’importants avantages tels que l’absence de risque pour le donneur ou la plus faible incidence de maladie du greffon contre l’hôte (GvHD), utiliser le sang de cordon comporte certains inconvénients. En effet, une reconstitution immunitaire retardée, des infections opportunistes en plus grand nombre et un risque de rechute sont des complications qui peuvent survenir et engendrer un risque pour le pronostic vital du patient. Par conséquent, de nouvelles stratégies d’immunothérapies doivent être envisagées. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes particulièrement intéressés aux cellules dendritiques plasmacytoides (pDC) dont les fonctions sont importantes pour l’initiation des réponses immunitaires innée et adaptative et particulièrement pour leur capacité à activer les cellules NK. Afin d’élucider le rôle et l’impact de ces cellules dans les greffes de sang de cordon, le nombre et la fonction des pDC et des NK a été suivi longitudinalement chez des patients ayant subi une greffe de sang de cordon comparativement à des patients transplantés avec de la moelle osseuse. Nous avons ainsi démontré que les pDC et les NK apparaissent précocement suite à une greffe de sang de cordon et que ces cellules sont fonctionnelles. Ces résultats mettent donc en lumière que ces cellules pourraient être de bons outils pour l’établissement d’une immunothérapie après greffe de sang de cordon. De plus, la caractérisation fonctionnelle des pDC du greffon de sang de cordon a permis de révéler une plus faible production d’IFN-α par les pDC, comparativement aux pDC de sang d’adulte. Cette différence pourrait jouer un rôle dans la plus faible incidence de GvHD après les greffes de sang de cordon. Dans le but de préciser les mécanismes moléculaires de régulation négative de la production d’IFN-α par les pDC de sang de cordon, nous avons étudié les protéines de la voie de signalisation TLR9-IRF7. L’expression similaire de l’ARN du TLR9, MyD88, IRAK1 et IRF7 contraste avec la plus faible expression des protéines correspondantes. De plus, l’expression des MicroARNs miR-146a et miR-155 est plus élevé dans les pDC de sang de cordon comparativement aux pDC de sang d’adultes. Ensemble, ces données pointent une régulation négative post-transcriptionnelle de la voie TLR9-IRF7 qui pourrait expliquer la plus faible production d’IFN-α des pDC du sang de cordon. L’ensemble des ces travaux suggère que les pDC pourraient représenter une cible de choix dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques dans les greffes de sang de cordon.

Évaluation des effets de l'administration de fer intramusculaire sur l'anémie chez les oiseaux de proie

L’administration de fer dextran à 10 mg/kg intramusculaire (IM) est un traitement empirique couramment recommandé en médecine aviaire lors d’hémorragie ou d’anémie. L’objectif principal de cette étude était d’évaluer les effets de ce traitement sur l’anémie chez les oiseaux de proie. Deux types d’individus ont été utilisés : des crécerelles d’Amérique (Falco sparverius) où une anémie par perte de sang externe aiguë a été créée (deux phlébotomies de 20-40 % du volume sanguin total à un intervalle de 6 h) et des oiseaux de proie sauvages de différentes espèces souffrant d’anémies diverses. L’ensemble des oiseaux a été subdivisé aléatoirement en groupe traitement (fer dextran 10 mg/kg IM) et contrôle (NaCl 0,9% IM). Un suivi dans le temps a été réalisé afin d’étudier leur récupération de l’anémie, la présence d’effets secondaires au traitement et l’impact d’une administration de fer sur ces réserves. Aucune différence significative n’a été observée entre les deux groupes en ce qui concerne les signes cliniques, l’hématocrite, le pourcentage des polychromatophiles/réticulocytes, la densité cellulaire et le fer de la moelle osseuse, la créatine kinase et le fer plasmatique. La majorité des crécerelles ont présenté une myosite au site d’injection du fer. Nos résultats suggèrent qu’une administration de 10 mg/kg de fer dextran IM n’a pas d’effet sur l’érythropoïèse des rapaces souffrant d’anémie par perte de sang externe aiguë, qu’elle provoque une légère inflammation au site d’injection et qu’elle n’influence pas les réserves de fer. Le comptage des réticulocytes en anneau et des polychromatophiles semble être deux méthodes équivalentes.

Rôle de la CuZn superoxyde dismutase dans la néovascularisation en réponse à l'ischémie

L’athérosclérose est à l’origine d’importantes obstructions vasculaires. La sévérité de l’ischémie tissulaire provoquée par l’athérosclérose dépend en partie de la capacité de l’organisme à former de nouveaux vaisseaux (néovascularisation). Les mécanismes de néovascularisation sont modulés par la balance oxydo-réductive. Une exacerbation du stress oxydant est retrouvée dans tous les facteurs de risque cardiovasculaire, et en particulier lors du vieillissement. Au niveau vasculaire, la CuZnSOD est la principale enzyme antioxydante. Cependant, son rôle spécifique dans le vieillissement vasculaire et dans le développement de nouveaux vaisseaux en réponse à l’ischémie n’est pas connu. Nos hypothèses de recherche sont: 1) qu’une absence de CuZnSOD diminue la néovascularisation réparatrice en réponse à l’ischémie 2) que cette diminution de la néovascularisation est dûe au vieillissement de la vasculature affectant à la fois les cellules endothéliales matures et les cellules progénitrices endothéliales. Nous avons démontré qu’une déficience en CuZnSOD diminue significativement la néovascularisation en réponse à l’ischémie. Cette diminution de néovascularisation est associée à une augmentation du stress oxydant et une réduction de la biodisponibilité du NO. La déficience en CuZnSOD réduit significativement le nombre de EPCs (moelle, rate). De plus, ces EPCs présentent une augmentation significative des niveaux de stress oxydant, une diminution de la production de NO et une capacité réduite à migrer et à s’intégrer à un réseau tubulaire. Fait important, il iv est possible d’améliorer la néovascularisation des souris déficientes en CuZnSOD par une supplémentation en EPCs provenant de souris contrôles. Nous avons également démontré que la récupération du flot sanguin suivant l’ischémie est significativement réduite par l’âge. À la fois chez les jeunes et les vieilles souris, la déficience en CuZnSOD mène à une réduction additionnelle de la néovascularisation. Fait intéressant, le potentiel néovasculaire des jeunes souris déficiente en CuZnSOD est similaire à celui des vieilles souris contrôles. Les niveaux de stress oxydant sont également augmentés de façon similaire dans ces deux groupes de souris. L’âge et la déficience en CuZnSOD sont tous deux associés à une réduction du nombre d’EPCs isolées de la moelle et de la rate. L’effet de l’âge seul sur la fonction des EPCs est modeste. Par contre, la déficience en CuZnSOD en condition de vieillissement est associée à d’importants effets délétères sur l’activité fonctionnelle des EPCs. En résumé, nos résultats suggèrent que la protection contre le stress oxydant par la CuZnSOD est essentielle pour préserver la fonction des EPCs et la néovascularisation réparatrice en réponse à l’ischémie. Le défaut de néovascularisation observé en absence de CuZnSOD est associé à un vieillissement vasculaire accéléré. Nos résultats suggèrent que dans le contexte du vieillissement, la CuZnSOD a un rôle encore plus important pour limiter les niveaux de stress oxydant, préserver la fonction des EPCs et maintenir l’intégrité des tissus ischémiques.

Étude du rôle des lymphocytes T chez les receveurs pédiatriques de greffe de sang de cordon ombilical

La transplantation de sang de cordon ombilical (TSCO) est utilisée pour traiter les enfants atteints de maladies hématologiques en l’absence de donneurs apparentés compatibles. Elle est associée avec des risques plus élevés d’échec de greffe et d’infections opportunistes dans les premiers mois qui suivent la transplantation en comparaison avec une greffe de moelle osseuse. Par contre, la TSCO comporte un risque plus faible de maladie du greffon contre l’hôte et une incidence comparable de rechute de leucémie. Ces quatre complications impliquent directement les lymphocytes T. Dans le but de mieux comprendre le schéma particulier des évènements qui suivent la TSCO et d’améliorer le pronostic des patients, nous avons étudié le potentiel fonctionnel, la persistance et la reconstitution antivirale des lymphocytes T au sein d’un groupe d’enfants transplantés de sang de cordon ombilical (SCO). Étant donné que le SCO contient une majorité de lymphocytes T naïfs, nous avons étudié les lymphocytes T spécifiques au HLA-A2:Melan-A26-35 A27L; seul répertoire naïf et abondant caractérisé chez l’homme. Nous avons observé que les lymphocytes T du SCO se différencient en populations effectrices, s’oligoclonalisent, produisent de l’IFN-γ et lysent spécifiquement leur cible suite à la stimulation. Néanmoins, ces cellules produisent moins d’IFN-γ et sont moins bifonctionnelles que leurs homologues issus du sang périphérique d’adultes. Chez les patients, les lymphocytes T du SCO s’épuisent après la TSCO : ils s’oligoclonalisent dramatiquement, sont principalement en différenciation terminale, et une importante fréquence exprime PD-1 (« programmed death-1 ») dans les 3 à 6 premiers mois post-greffe. Très peu de patients sont capables de développer des réponses antivirales durant cette période et la fréquence de lymphocytes T qui expriment PD-1 semble aussi avoir un impact sur le risque subséquent de faire une rechute de leucémie. La deuxième vague de lymphocytes T émergeant à 6 mois post-TSCO mène à une population fonctionnelle et diversifiée. En conclusion, la fonctionnalité des lymphocytes T présents dans les 3 à 6 premiers mois post-TSCO doit être rétablie pour améliorer les risques d’infections opportunistes et de rechute de leucémie.

Contribution des protéines issues du liquide synovial dans la protection et la survie des PMN humains : chimioprotection : étude comparative des mécanismes d’action impliqués par rapport au GM-CSF

Les polymorphonucléaires neutrophiles (PMNs) représentent une arme primordiale dans la défense contre divers agents pathogènes; notamment les bactéries, les champignons, les cellules tumorales de même que les cellules infectées par des virus. Cependant, certaines pathologies reliées à l’inflammation chronique soulèvent l’implication des neutrophiles notamment dans l’arthrite rhumatoïde. La réponse inflammatoire persistante générée par l’activation et la survie des neutrophiles engendre une destruction des tissus environnants suite à la sécrétion non contrôlée de leurs produits cytotoxiques. Même si l’activation chronique des neutrophiles est néfaste dans plusieurs pathologies, elle pourrait s’avérer un bon outil en cas de neutropénie, comme c’est souvent le cas les patients ayant reçu des traitements de chimiothérapie. Ce projet fait suite aux travaux doctoraux de Lagraoui (1999). Il vise à identifier le(s) facteur(s) du liquide synovial qui augmente la survie des neutrophiles ainsi que le mécanisme d’action impliqué dans ce processus. Similairement au facteur semi-pur isolés par Lagraoui (1999), le milieu conditionné concentré (MCC) augmente la survie des PMNs de 75% (39% ± 9.5 vs 68% ± 2.5, p<0.01). Suivant le séquençage du MCC parallèlement au facteur semi-pur actif, deux protéines ont été identifiées à la fois dans le MCC et dans le facteur semi-pur soient : l’albumine et la fétuine. Notre projet vise donc à comparer les effets de l’albumine et de la fétuine à ceux du GM-CSF dans l’optique d’une thérapie alternative au GM-CSF en tant qu’adjuvant de chimiothérapie. La présence d’albumine, de fétuine ou de GM-CSF chez les PMNs incubés 24 heures avec la Mutamycin® induit une diminution du nombre de cellules en apoptose par rapport à la Mutamycin® (Ctrl : 43% ± 10; A : 74% ± 3; F : (82% ± 6 et GM : 74% ± 7; p<0.01). L’effet de l’albumine dépend de la voie de la kinase PI3 mais également celle la kinase ERK, alors que celle de la fétuine dépend de la kinase PI3. Similairement l’EPO, l’albumine et la fétuine supporte la différentiation des HSCs en précurseurs érythrocytaires de type BFU-E. Dans un modèle murin de chiomioprotection, l’albumine augmente la concentration cellulaire rapport au groupe contrôle des leukocytes de la rate (66 ±8 x106c/ml vs 81 ±16 x106c/ml) et du sang (3.6 ±0.4 x106c/ml vs 5.7 ±2.3 x106c/ml). Donc, in vitro, l’albumine et la fétuine sont comparables au GM-CSF au niveau fonctionalité et mécansimes d’action. Cependant, vu leur manque de spécificité, l’application thérapeutique en tant qu’adjuvant de chiomiothérapie de l’albumine et la fétuine est peu prometteuse. Par contre, les maladies dégénératives et les évènements ischémiques pourraient s’avérer de bonnes cibles thérapeutiques, principalement pour l’albumine.

Impact de la maladie du greffon contre l’hôte sur la reconstitution immunitaire suite à une greffe de moelle osseuse allogénique

La transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques est une technique très efficace pour traiter différents cancers du sang. Malheureusement la réaction du greffon contre l’hôte (GVHD) demeure la cause principale de morbidité et de mortalité post-greffe. La GVHD entraîne une diminution de la reconstitution immunitaire ce qui accentue considérablement l’immunosuppression associée à ce traitement et de ce fait augmente les risques d’infection et de rechute. Notre laboratoire a démontré précédemment que les niveaux élevés d’IL-7 dans des hôtes lymphopéniques interféraient avec la capacité des cellules dendritiques (DC) à soutenir la prolifération homéostatique (PH) des lymphocytes T CD4+. Puisque les niveaux d’IL-7 sont aussi élevés dans un contexte de GVHD, nous avons émis l’hypothèse que la signalisation de l’IL-7 sur les DC pouvait contribuer à diminuer la reconstitution immunitaire des lymphocytes T CD4+. Pour répondre à cette question, nous avons utilisé le modèle murin de GVHD C57BL/6 (B6) dans B6D2F1. Afin de régénérer une niche hématopoïétique permissive à la PH des lymphocytes T CD4+, nous avons transplanté des souris B6D2F1 avec de la moelle osseuse de souris B6 IL-7Rα-/-. La GVHD a été induite en transférant des lymphocytes T B6 réactifs aux cellules B6D2F1. Dans les souris contrôles, la PH des lymphocytes T CD4+ est maintenue. Par contre, la PH est absente dans les souris en GVHD malgré la présence d’une niche périphérique qui ne répond pas à l’IL-7. L’absence de PH des lymphocytes T CD4+ durant la GVHD est associée à une diminution du nombre de DC. En utilisant un test de cytotoxicité in vivo nous démontrons que les DC B6 générées dans une hôte B6D2F1 sont éliminées par les lymphocytes T B6 alloréactifs. En conclusion, nos résultats démontrent que l’immunosuppression associée à la GVHD est en partie causée par une élimination des DC par les lymphocytes T allogéniques. Nous postulons donc que la perte des DC, et non la signalisation de l’IL-7 sur les DC, est le facteur limitant la PH des lymphocytes T CD4+ durant la GVHD.

Amélioration de la prise de greffe hématopoïétique par une thérapie cellulaire à base de cellules souches mésenchymateuses

Le traitement du cancer à l’aide d’une exposition aux radiations ionisantes peut mener au développement de plusieurs effets secondaires importants, dont un retard de réparation et de régénération du tissu hématopoïétique. Les mécanismes responsables de ces effets demeurent encore inconnus, ce qui limite le développement de nouvelles approches thérapeutiques. À l’aide d’un modèle murin de prise de greffe, nos résultats démontrent que l’endommagement du microenvironnement par l’irradiation a un impact limitant sur le nichage hématopoïétique. Parce que le microenvironnement est composé principalement de cellules dérivées des cellules souches mésenchymateuses (CSM), nous avons évalué le potentiel des CSM à régénérer le tissu hématopoïétique par la reconstitution de la niche osseuse. Cette thérapie a mené à une augmentation remarquable du nichage hématopoïétique chez les souris irradiées. Les causes moléculaires impliquées dans le nichage hématopoïétiques sont encore inconnues, mais nous avons remarqué l’augmentation de la sécrétion de la cytokine « granulocyte-colony stimulating factor » (G-CSF) dans l’espace médullaire suite à l’irradiation. Le G-CSF est impliqué dans la mobilisation cellulaire et est fort possiblement nuisible à une prise de greffe. Nous avons évalué le potentiel d’une thérapie à base de CSM sécrétant le récepteur soluble du G-CSF afin de séquestrer le G-CSF transitoirement et les résultats obtenus démontrent que le blocage du G-CSF favorise le nichage hématopoïétique. Globalement, les données présentées dans ce mémoire démontrent que le microenvironnement osseux et le niveau de G-CSF dans la moelle sont importants dans le processus de nichage hématopoïétique et que la baisse du potentiel de régénération du tissu hématopoïétique suite à l’irradiation peut être renversée à l’aide d’une thérapie cellulaire de CSM génétiquement modifiées ou non.

Development of cellular and gene therapies for b[beta]-Thalassemia and sickle cell disease

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Investigating the role of the isomerase Rrd1/PTPA : from yeast to human

Chez Saccharomyces cerevisiae, les souches mutantes pour Rrd1, une protéine qui possède une activité de peptidyl prolyl cis/trans isomérase, montrent une résistance marquée à la rapamycine et sont sensibles au 4-nitroquinoline 1-oxide, un agent causant des dommages à l’ADN. PTPA, l’homologue de Rrd1 chez les mammifères, est reconnu en tant qu’activateur de protéine phosphatase 2A. Notre laboratoire a précédemment démontré que la surexpression de PTPA mène à l’apoptose de façon indépendante des protéines phosphatase 2A. La fonction moléculaire de Rrd1/PTPA était encore largement inconnue au départ de mon projet de doctorat. Mes recherches ont d’abord montré que Rrd1 est associé à la chromatine ainsi qu’à l’ARN polymérase II. L’analyse in vitro et in vivo par dichroïsme circulaire a révélé que Rrd1 est responsable de changements au niveau de la structure du domaine C-terminal de la grande sous-unité de l’ARN polymérase II, Rpb1, en réponse à la rapamycine et au 4-nitroquinoline 1-oxide. Nous avons également démontré que Rrd1 est requis pour modifier l’occupation de l’ARN polymérase II sur des gènes répondant à un traitement à la rapamycine. Finalement, nous avons montré que suite à un traitement avec la rapamycine, Rrd1 médie la dégradation de l’ARN polymérase II et que ce mécanisme est indépendant de l’ubiquitine. La dernière partie de mon projet était d’acquérir une meilleure connaissance de la fonction de PTPA, l’homologue de Rrd1 chez les mammifères. Nos résultats montrent que le «knockdown» de PTPA n’affecte pas la sensibilité des cellules à différentes drogues telles que la rapamycine, le 4-nitroquinoline 1-oxide ou le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Nous avons également tenté d’identifier des partenaires protéiques pour PTPA grâce à la méthode TAP, mais nous ne sommes pas parvenus à identifier de partenaires stables. Nous avons démontré que la surexpression de la protéine PTPA catalytiquement inactive n’induisait pas l’apoptose indiquant que l’activité de PTPA est requise pour produire cet effet. Finalement, nous avons tenté d’étudier PTPA dans un modèle de souris. Dans un premier lieu, nous avons déterminé que PTPA était exprimé surtout au niveau des tissus suivants : la moelle osseuse, le thymus et le cerveau. Nous avons également généré avec succès plusieurs souris chimères dans le but de créer une souris «knockout» pour PTPA, mais l’allèle mutante ne s’est pas transférée au niveau des cellules germinales. Mes résultats ainsi que ceux obtenus par mon laboratoire sur la levure suggèrent un rôle général pour Rrd1 au niveau de la régulation des gènes. La question demeure toujours toutefois à savoir si PTPA peut effectuer un rôle similaire chez les mammifères et une vision différente pour déterminer la fonction de cette protéine sera requise pour adresser adéquatement cette question dans le futur.

Identification et caractérisation des cibles transcriptionnelles de ETV6, un facteur de transcription impliqué dans la leucémie de l’enfant.

La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) est responsable d’environ 25% de l’ensemble des cancers pédiatriques. Chez 85% des enfants diagnostiqués, la LLA entraîne une prolifération massive et incontrôlée de lymphocytes immatures de type précurseurs B dans la moelle osseuse (LLA pré-B). Des avancées intéressantes ont été faites au cours des trente dernières années et ont mené à une augmentation de l’efficacité des traitements thérapeutiques. Plus de 80% des enfants atteints de LLA seront guéris de cette maladie. Malheureusement, ces traitements manquent de spécificité à cause du manque de connaissances sur les mécanismes moléculaires impliqués durant l’initiation et le développement de la LLA pré-B pédiatrique. En d’autres termes, nous connaissons peu de chose sur l’étiologie de cette maladie. Plus de 25% des enfants atteints de la LLA pré-B présentent la translocation chromosomique t(12;21)(p13;q22) qui implique les gènes ETV6 et AML1. Celle-ci est formée in utero et mène à l’expression de la protéine chimère transcriptionnelle ETV6-AML1, dont la présence seule ne suffit pas au développement de la LLA pré-B. Ainsi, d’autres événements génétiques sont nécessaires au développement de cette leucémie. La délétion de l’allèle résiduel de ETV6 est un événement génétique fréquemment rencontré au moment du diagnostic de la LLA pré-B t(12;21)+. Cette délétion entraîne l’inactivation complète de ETV6 dans les lymphocytes pré-B leucémiques. ETV6 est un répresseur transcriptionnel de la famille Ets. Mon hypothèse de recherche est que ETV6 agit comme gène suppresseur de tumeur dans la LLA pré-B pédiatrique. L’inactivation de ETV6 causerait une dérégulation de l’expression de ses cibles transcriptionnelles et, par le fait même, favoriserait l’initiation et le déroulement de la leucémogenèse pédiatrique. Dans le cadre de mon projet, comme peu de cibles transcriptionnelles de ETV6 sont connues, j’ai effectué des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine et des essais luciférases qui ont permis d’identifier six nouvelles cibles transcriptionnelles: TP53 (p53 et Δ133p53), SPHK1, IL-18, PTGER4 et LUM. J’ai démontré que la régulation transcriptionnelle médiée par ETV6 requiert la présence de ses deux domaines fonctionnels: PNT (interactions protéiques) et ETS (liaison à l’ADN). Ces domaines favorisent la reconnaissance d’un site EBS consensus dans une région située près du promoteur de base. Ce mécanisme peut dépendre du promoteur régulé par ETV6, mais également du contexte cellulaire. Des études fonctionnelles réalisées sur des lymphocytes pré-B leucémiques ont permis de mesurer l’impact de la dérégulation de l’expression des cibles transcriptionnelles de ETV6 sur trois voies biologiques: la prolifération cellulaire, l’apoptose induite par un stress génotoxique et la migration cellulaire dirigée par la voie de signalisation CXCL12/CXCR4. Ceci a permis de démontrer l’implication des gènes SPHK1, IL-18 et PTGER4 durant la leucémogenèse pédiatrique. Cette étude est une des premières à suggérer le rôle de ETV6 comme gène suppresseur de tumeur dans la LLA pré-B pédiatrique. Suite à l’inactivation du répresseur transcriptionnel ETV6, l’augmentation de l’expression de ses cibles transcriptionnelles favoriserait la prolifération et la survie des lymphocytes pré-B leucémiques dans la moelle osseuse. L’identification de nouveaux gènes impliqués dans le développement de la LLA pré-B pédiatrique ouvre la porte au développement de nouveaux traitements thérapeutiques qui pourront présenter une meilleure spécificité envers l’étiologie de la maladie.