On the use of reporter bacteria for measuring availability of organic contaminants

Natural environments are constantly challenged by the release of hydrophobic organic contaminants, which represent a threat for both the ecosystem and human health. Despite a substantial degradation by naturally occurring micro-organisms, a non negligible fraction of these pollutants tend to persist in soil and sediments due to their reduced accessibility to microbial degraders. This lack of 'bioavailability' is acknowledged as a key parameter for the natural and stimulated clean-up (bioremediation) of contaminated sites. We developed a bacterial bioreporter that responds to the presence of polyaromatic hydrocarbons (PAHs) by the production of the green fluorescent protein (GFP), based on the PAH-degrading bacterium Burkholderia sartisoli. We showed in this study that the bacterial biosensor B. sartisoli strain RP037 was faithfully reporting the degradation of naphthalene and phenanthrene (two PAHs of low molecular weight) via the production of GFP. What is more, the magnitude of GFP induction was influenced by change in the PAH flux triggered by a variety of physico-chemical parameters, such as the contact surface between the pollutant and the aqueous suspension. Further experiments permitted to test the influence of dissolved organic matter, which is an important component of natural habitats and can interact with organic pollutants. In addition, we tested the influence of two types of biosurfactants (tensio-active agents produced by living organisms) on phenanthrene's degradation by RP037. Interestingly, the surfactant's effects on the biodegradation rate appeared to depend on the type of biosurfactant and probably on the type of bacterial strain. Finally, we tagged B. sartisoli strain RP037 with a constitutively expressed mCherry fluorescent protein. The presence of mCherry allowed us to visualize the bacteria in complex samples even when GFP production was not induced. The new strain RP037-mChe embedded in a gel patch was used to detect PAH fluxes from a point source, such as a non-aqueous liquid or particles of contaminated soil. In parallel, we also developed and tested a so-called multiwell bacterial biosensor platform, which permitted the simultaneous use of four different reporter strains for the detection of major crude oil components (e.g., saturated hydrocarbons, mono- and polyaromatics) in aqueous samples. We specifically constructed the strain B. sartisoli RP007 (pPROBE-phn-luxAB) for the detection of naphthalene and phenanthrene. It was equipped with a reporter plasmid similar to the one in strain RP037, except that the gfp gene was replaced by the genes luxAB, which encoded the bacterial luciferase. The strain was implemented in the biosensor platform and detected an equivalent naphthalene concentration in oil spilled-sea water. We also cloned the gene for the transcriptional activator AlkS and the operator/promoter region of the operon alkSB1GHJ from the alkane-degrader bacterium Alcanivorax borkumensis strain SK2 in order to construct a new bacterial biosensor with higher sensitivity towards long-chain alkanes. However, the resulting strain showed no increased light emission in presence of tetradecane (C14), while it still efficiently reported low concentrations of octane (C8). RÉSUMÉ : Les écosystèmes naturels sont constamment exposés à nombre de contaminants organiques hydrophobes (COHs) d'origine industrielle, agricole ou même naturelle. Les COHs menacent à la fois l'environnement, le bien-être des espèces animales et végétales et la santé humaine, mais ils peuvent être dégradés par des micro-organismes tels que les bactéries et les champignons, qui peuvent être capables des les transformer en produits inoffensifs comme le gaz carbonique et l'eau. La biodégradation des COHs est cependant fréquemment limitée par leur pauvre disponibilité envers les organismes qui les dégradent. Ainsi, bien que la biodégradation opère partiellement, les COHs persistent dans l'environnement à de faibles concentrations qui potentiellement peuvent encore causer des effets toxiques chroniques. Puisque la plupart des COHs peuvent être métabolisés par l'activité microbienne, leur persistance a généralement pour origine des contraintes physico-chimiques plutôt que biologiques. Par exemple, leur solubilité dans l'eau très limitée réduit leur prise par des consommateurs potentiels. De plus, l'adsorption à la matière organique et la séquestration dans les micropores du sol participent à réduire leur disponibilité envers les microbes. Les processus de biodisponibilité, c'est-à-dire les processus qui gouvernent la dissolution et la prise de polluants par les organismes vivants, sont généralement perçus comme des paramètres clés pour la dépollution (bioremédiation) naturelle et stimulée des sites contaminés. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) sont un modèle de COH produits par les activités aussi bien humaines que naturelles, et listés comme des contaminants chroniques de l'air, des sols et des sédiments. Ils peuvent être dégradés par un vaste nombre d'espèces bactériennes mais leur taux de biodégradation est souvent limité par les contraintes mentionnées ci-dessus. Afin de comprendre les processus de biodisponibilité pour les cellules bactériennes, nous avons décidé d'utiliser les bactéries elles-mêmes pour détecter et rapporter les flux de COH. Ceci a été réalisé par l'application d'une stratégie de conception visant à produire des bactéries `biocapteurs-rapporteurs', qui littéralement s'allument lorsqu'elles détectent un composé cible pour lequel elles ont été conçues. En premier lieu, nous nous sommes concentrés sur Burkholderia sartisoli (souche RP007), une bactérie isolée du sol et consommatrice de HAP .Cette souche a servi de base à la construction d'un circuit génétique permettant la formation de la protéine autofluorescente GFP dès que les cellules détectent le naphtalène ou le phénanthrène, deux HAP de faible masse moléculaire. En effet, nous avons pu montrer que la bactérie obtenue, la souche RP037 de B. sartisoli, produit une fluorescence GFP grandissante lors d'une exposition en culture liquide à du phénanthrène sous forme cristalline (0.5 mg par ml de milieu de culture). Nous avons découvert que pour une induction optimale il était nécessaire de fournir aux cellules une source additionnelle de carbone sous la forme d'acétate, ou sinon seul un nombre limité de cellules deviennent induites. Malgré cela, le phénanthrène a induit une réponse très hétérogène au sein de la population de cellules, avec quelques cellules pauvrement induites tandis que d'autres l'étaient très fortement. La raison de cette hétérogénéité extrême, même dans des cultures liquides mélangées, reste pour le moment incertaine. Plus important, nous avons pu montrer que l'amplitude de l'induction de GFP dépendait de paramètres physiques affectant le flux de phénanthrène aux cellules, tels que : la surface de contact entre le phénanthrène solide et la phase aqueuse ; l'ajout de surfactant ; le scellement de phénanthrène à l'intérieur de billes de polymères (Model Polymer Release System) ; la dissolution du phénanthrène dans un fluide gras immiscible à l'eau. Nous en avons conclu que la souche RP037 détecte convenablement des flux de phénantrène et nous avons proposé une relation entre le transfert de masse de phénanthrène et la production de GFP. Nous avons par la suite utilisé la souche afin d'examiner l'effet de plusieurs paramètres chimiques connus dans la littérature pour influencer la biodisponibilité des HAP. Premièrement, les acides humiques. Quelques rapports font état que la disponibilité des HAP pourrait être augmentée par la présence de matière organique dissoute. Nous avons mesuré l'induction de GFP comme fonction de l'exposition des cellules RP037 au phénanthrène ou au naphtalène en présence ou absence d'acides humiques dans la culture. Nous avons testé des concentrations d'acides humiques de 0.1 et 10 mg/L, tandis que le phénanthrène était ajouté via l'heptamethylnonane (HMN), un liquide non aqueux, ce qui au préalable avait produit le plus haut flux constant de phénanthrène aux cellules. De plus, nous avons utilisé des tests en phase gazeuse avec des concentrations d'acides humiques de 0.1, 10 et 1000 mg/L mais avec du naphtalène. Contrairement à ce que décrit la littérature, nos résultats ont indiqué que dans ces conditions l'expression de GFP en fonction de l'exposition au phénanthrène dans des cultures en croissance de la souche RP037 n'était pas modifiée par la présence d'acides humiques. D'un autre côté, le test en phase gazeuse avec du naphtalène a montré que 1000 mg/L d'acides humiques abaissent légèrement mais significativement la production de GFP dans les cellules de RP037. Nous avons conclu qu'il n'y a pas d'effet général des acides humiques sur la disponibilité des HAP pour les bactéries. Par la suite, nous nous sommes demandé si des biosurfactants modifieraient la disponibilité du phénanthrène pour les bactéries. Les surfactants sont souvent décrits dans la littérature comme des moyens d'accroître la biodisponibilité des COHs. Les surfactants sont des agents tensio-actifs qui augmentent la solubilité apparente de COH en les dissolvant à l'intérieur de micelles. Nous avons ainsi testé si des biosurfactants (des surfactants produits par des organismes vivants) peuvent être utilisé pour augmenter la biodisponibilité du phénanthrène pour la souche B. sartisoli RP037. Premièrement, nous avons tenté d'obtenir des biosurfactants produits par une autre bactérie vivant en co-culture avec les biocapteurs bactériens. Deuxièmement, nous avons utilisé des biosurfactants purifiés. La co-cultivation en présence de la bactérie productrice de lipopeptide Pseudomonas putida souche PCL1445 a augmenté l'expression de GFP induite par le phénanthrène chez B. sartisoli en comparaison des cultures simples, mais cet effet n'était pas significativement différent lorsque la souche RP037 était co-cultivée avec un mutant de P. putida ne produisant pas de lipopeptides. L'ajout de lipopeptides partiellement purifiés dans la culture de RP037 a résulté en une réduction de la tension de surface, mais n'a pas provoqué de changement dans l'expression de GFP. D'un autre côté, l'ajout d'une solution commerciale de rhamnolipides (un autre type de biosurfactants produits par Pseudomonas spp.) a facilité la dégradation du phénanthrène par la souche RP037 et induit une expression de GFP élevée dans une plus grande proportion de cellules. Nous avons ainsi conclu que les effets des biosurfactants sont mesurables à l'aide de la souche biocapteur, mais que ceux-ci sont dépendants du type de surfactant utilisé conjointement avec le phénanthrène. La question suivante que nous avons abordée était si les tests utilisant des biocapteurs peuvent être améliorés de manière à ce que les flux de HAP provenant de matériel contaminé soient détectés. Les tests en milieu liquide avec des échantillons de sol ne fournissant pas de mesures, et sachant que les concentrations de HAP dans l'eau sont en général extrêmement basses, nous avons conçu des tests de diffusion dans lesquels nous pouvons étudier l'induction par les HAPs en fonction de la distance aux cellules. Le biocapteur bactérien B. sartisoli souche RP037 a été marqué avec une seconde protéine fluorescente (mCherry), qui est constitutivement exprimée dans les cellules et leur confère une fluorescence rouge/rose. La souche résultante RP037-mChe témoigne d'une fluorescence rouge constitutive mais n'induit la fluorescence verte qu'en présence de naphtalène ou de phénanthrène. La présence d'un marqueur fluorescent constitutif nous permet de visualiser les biocapteurs bactériens plus facilement parmi des particules de sol. Un test de diffusion a été conçu en préparant un gel fait d'une suspension de cellules mélangées à 0.5 % d'agarose. Des bandes de gel de dimensions 0.5 x 2 cm x 1 mm ont été montées dans des chambres d'incubation et exposées à des sources de HAP (soit dissouts dans du HMN ou en tant que matériel solide, puis appliqués à une extrémité de la bande). En utilisant ce montage expérimental, le naphtalène ou le phénanthrène (dissouts dans du HMN à une concentration de 2.5 µg/µl) ont induit un gradient d'intensité de fluorescence GFP après 24 heures d'incubation, tandis que la fluorescence mCherry demeurait comparable. Un sol contaminé par des HAPs (provenant d'un ancien site de production de gaz) a induit la production de GFP à un niveau comparable à celui du naphtalène. Des biocapteurs bactériens individuels ont également détecté un flux de phénanthrène dans un gel contenant des particules de sol amendées avec 1 et 10 mg/g de phénanthrène. Ceci a montré que le test de diffusion peut être utilisé pour mesurer des flux de HAP provenant de matériel contaminé. D'un autre côté, la sensibilité est encore très basse pour plusieurs sols contaminés, et l'autofluorescence de certains échantillons rend difficile l'identification de la réponse de la GFP chez les cellules. Pour terminer, un des points majeurs de ce travail a été la production et la validation d'une plateforme multi-puits de biocapteurs bactériens, qui a permis l'emploi simultané de plusieurs souches différentes de biocapteurs pour la détection des constituants principaux du pétrole. Pour cela nous avons choisi les alcanes linéaires, les composés mono-aromatiques, les biphényls et les composés poly-aromatiques. De plus, nous avons utilisé un capteur pour la génotoxicité afin de détecter la `toxicité globale' dans des échantillons aqueux. Plusieurs efforts d'ingénierie ont été investis de manière à compléter ce set. En premier lieu, chaque souche a été équipée avec soit gfp, soit luxAB en tant que signal rapporteur. Deuxièmement, puisqu'aucune souche de biocapteur n'était disponible pour les HAP ou pour les alcanes à longues chaînes, nous avons spécifiquement construit deux nouveaux biocapteurs. L'un d'eux est également basé sur B. sartisoli RP007, que nous avons équipé avec le plasmide pPROBE-phn-luxAB pour la détection du naphtalène et du phénanthrène mais avec production de luciférase bactérienne. Un autre est un nouveau biocapteur bactérien pour les alcanes. Bien que nous possédions une souche Escherichia coli DHS α (pGEc74, pJAMA7) détectant les alcanes courts de manière satisfaisante, la présence des alcanes à longues chaînes n'était pas rapportée efficacement. Nous avons cloné le gène de l'activateur transcriptionnel A1kS ainsi que la région opérateur/promoteur de l'opéron alkSB1GHJ chez la bactérie dégradant les alcanes Alcanivorax borkumensis souche SK2, afin de construire un nouveau biocapteur bactérien bénéficiant d'une sensibilité accrue envers les alcanes à longues chaînes. Cependant, la souche résultante E. coli DHSα (pAlk3} n'a pas montré d'émission de lumière augmentée en présence de tétradécane (C14), tandis qu'elle rapportait toujours efficacement de basses concentrations d'octane (C8). De manière surprenante, l'utilisation de A. borkumensis en tant que souche hôte pour le nouveau plasmide rapporteur basé sur la GFP a totalement supprimé la sensibilité pour l'octane, tandis que la détection de tétradécane n'était pas accrue. Cet aspect devra être résolu dans de futurs travaux. Pour calibrer la plateforme de biocapteurs, nous avons simulé une fuite de pétrole en mer dans une bouteille en verre ouverte de 5L contenant 2L d'eau de mer contaminée avec 20 ml (1%) de pétrole brut. La phase aqueuse a été échantillonée à intervalles réguliers après la fuite durant une période allant jusqu'à une semaine tandis que les principaux contaminants pétroliers étaient mesurés via les biocapteurs. L'émission de bioluminescence a été mesurée de manière à déterminer la réponse des biocapteurs et une calibration intégrée faite avec des inducteurs types a servi à calculer des concentrations d'équivalents inducteurs dans l'échantillon. E. coli a été utilisée en tant que souche hôte pour la plupart des spécificités des biocapteurs, à l'exception de la détection du naphtalène et du phénanthrène pour lesquels nous avons utilisé B. sartisoli. Cette souche, cependant, peut être employée plus ou moins selon la même procédure. Il est intéressant de noter que le pétrole répandu a produit une apparition séquentielle de composés dissouts dans la phase aqueuse, ceux-ci .étant détectables par les biocapteurs. Ce profil contenait d'abord les alcanes à courtes chaînes et les BTEX (c'est-à dire benzène, toluène, éthylbenzène et xylènes), apparaissant entre des minutes et des heures après que le pétrole a été versé. Leurs concentrations aqueuses ont par la suite fortement décru dans l'eau échantillonnée après 24 heures, à cause de la volatilisation ou de la biodégradation. Après quelques jours d'incubation, ces composés sont devenus indétectables. Les HAPs, en revanche, sont apparus plus tard que les alcanes et les BTEX, et leur concentration a augmenté de pair avec un temps d'incubation prolongé. Aucun signal significatif n'a été mis en évidence avec le biocapteur pour le biphényl ou pour la génotoxicité. Ceci démontre l'utilité de ces biocapteurs, spécifiquement pour la détection des composés pétroliers, comprenant les alcanes à courtes chaînes, les BTEX et les HAPs légers.

Quality of care after acute coronary syndromes in a prospective cohort with reasons for non-prescription of recommended medications.

BACKGROUND: Adherence to guidelines is associated with improved outcomes of patients with acute coronary syndrome (ACS). Clinical registries developed to assess quality of care at discharge often do not collect the reasons for non-prescription for proven efficacious preventive medication in Continental Europe. In a prospective cohort of patients hospitalized for an ACS, we aimed at measuring the rate of recommended treatment at discharge, using pre-specified quality indicators recommended in cardiologic guidelines and including systematic collection of reasons for non-prescription for preventive medications. METHODS: In a prospective cohort with 1260 patients hospitalized for ACS, we measured the rate of recommended treatment at discharge in 4 academic centers in Switzerland. Performance measures for medication at discharge were pre-specified according to guidelines, systematically collected for all patients and included in a centralized database. RESULTS: Six hundred and eighty eight patients(54.6%) were discharged with a main diagnosis of STEMI, 491(39%) of NSTEMI and 81(6.4%) of unstable angina. Mean age was 64 years and 21.3% were women. 94.6% were prescribed angiotensin converting enzyme inhibitors/angiotensin II receptor blockers at discharge when only considering raw prescription rates, but increased to 99.5% when including reasons non-prescription. For statins, rates increased from 98% to 98.6% when including reasons for non-prescription and for beta-blockers, from 82% to 93%. For aspirin, rates further increased from 99.4% to 100% and from to 99.8% to 100% for P2Y12 inhibitors. CONCLUSIONS: We found a very high adherence to ACS guidelines for drug prescriptions at discharge when including reasons for non-prescription to drug therapy. For beta-blockers, prescription rates were suboptimal, even after taking into account reason for non-prescription. In an era of improving quality of care to achieve 100% prescription rates at discharge unless contra-indicated, pre-specification of reasons for non-prescription for cardiovascular preventive medication permits to identify remaining gaps in quality of care at discharge. TRIAL REGISTRATION: ClinicalTrials.gov NCT01000701.

Neues aus Diagnostik und Therapie der spinalen Erkrankungen [Novel aspects of diagnostics and therapy of spinal cord diseases].

BACKGROUND: Both non-traumatic and traumatic spinal cord injuries have in common that a relatively minor structural lesion can cause profound sensorimotor and autonomous dysfunction. Besides treating the cause of the spinal cord injury the main goal is to restore lost function as far as possible. AIM: This article provides an overview of current innovative diagnostic (imaging) and therapeutic approaches (neurorehabilitation and neuroregeneration) aiming for recovery of function after non-traumatic and traumatic spinal cord injuries. MATERIAL AND METHODS: An analysis of the current scientific literature regarding imaging, rehabilitation and rehabilitation strategies in spinal cord disease was carried out. RESULTS: Novel magnetic resonance imaging (MRI) based techniques (e.g. diffusion-weighted MRI and functional MRI) allow visualization of structural reorganization and specific neural activity in the spinal cord. Robotics-driven rehabilitative measures provide training of sensorimotor function in a targeted fashion, which can even be continued in the homecare setting. From a preclinical point of view, defined stem cell transplantation approaches allow for the first time robust structural repair of the injured spinal cord. CONCLUSION: Besides well-established neurological and functional scores, MRI techniques offer the unique opportunity to provide robust and reliable "biomarkers" for restorative therapeutic interventions. Function-oriented robotics-based rehabilitative interventions alone or in combination with stem cell based therapies represent promising approaches to achieve substantial functional recovery, which go beyond current rehabilitative treatment efforts.

Nest-box design for the study of diurnal raptors and owls is still an overlooked point in ecological, evolutionary and conservation studies: a review

The use of artificial nest-boxes has led to significant progress in bird conservation and in our understanding of the functional and evolutionary ecology of free-ranging birds that exploit cavities for roosting and reproduction. Nest-boxes and their improved accessibility have made it easier to perform comparative and experimental field investigations. However, concerns about the generality and applicability of scientific studies involving birds breeding in nest-boxes have been raised because the occupants of boxes may differ from conspecifics occupying other nest sites. Here we review the existing evidence demonstrating the importance of nest-box design to individual life-history traits in three falcon (Falconiformes) and seven owl (Strigiformes) species, as well as the extent to which publications on these birds describe the characteristics of exploited artificial nest-boxes in their 'methods' sections. More than 60% of recent publications did not provide any details on nest-box design (e.g. size, shape, material), despite several calls >15 years ago to increase the reporting of such information. We exemplify and discuss how variation in nest-box characteristics can affect or confound conclusions from nest-box studies and conclude that it is of overall importance to present details of nest-box characteristics in scientific publications.

Avian erythrocytes have functional mitochondria, opening novel perspectives for birds as animal models in the study of ageing.

BACKGROUND: In contrast to mammalian erythrocytes, which have lost their nucleus and mitochondria during maturation, the erythrocytes of almost all other vertebrate species are nucleated throughout their lifespan. Little research has been done however to test for the presence and functionality of mitochondria in these cells, especially for birds. Here, we investigated those two points in erythrocytes of one common avian model: the zebra finch (Taeniopygia guttata). RESULTS: Transmission electron microscopy showed the presence of mitochondria in erythrocytes of this small passerine bird, especially after removal of haemoglobin interferences. High-resolution respirometry revealed increased or decreased rates of oxygen consumption by erythrocytes in response to the addition of respiratory chain substrates or inhibitors, respectively. Fluorometric assays confirmed the production of mitochondrial superoxide by avian erythrocytes. Interestingly, measurements of plasmatic oxidative markers indicated lower oxidative stress in blood of the zebra finch compared to a size-matched mammalian model, the mouse. CONCLUSIONS: Altogether, those findings demonstrate that avian erythrocytes possess functional mitochondria in terms of respiratory activities and reactive oxygen species (ROS) production. Interestingly, since blood oxidative stress was lower for our avian model compared to a size-matched mammalian, our results also challenge the idea that mitochondrial ROS production could have been one actor leading to this loss during the course of evolution. Opportunities to assess mitochondrial functioning in avian erythrocytes open new perspectives in the use of birds as models for longitudinal studies of ageing via lifelong blood sampling of the same subjects.

New insights into the long-term evolutionary history of the avian MHC

SummaryGene duplication and neofunctidnalization are important processes in the evolution of phenotypic complexity. They account for important evolutionary novelties that confer ecological adaptation, such as the major histocompatibility complex (MHC), a multigene family with a central role in vertebrates' adaptive immune system. Multigene families, which evolved in large part through duplication, represent promising systems to study the still strongly depbated relative roles of neutral and adaptive processes in the evolution of phenotypic complexity. Detailed knowledge on ecological function and a well-characterized evolutionary history place the mammals' MHC amongst ideal study systems. However mammalian MHCs usually encompass several million base pairs and hold a large number of functional and non-functional duplicate genes, which makes their study complex. Avian MHCs on the other hand are usually way more compact, but the reconstruction of. their evolutionary history has proven notoriously difficult. However, no focused attempt has been undertaken so far to study the avian MHC evolutionary history in a broad phylogenetic context and using adequate gene regions.In the present PhD, we were able to make important contributions to the understanding of the long-term evolution of the avian MHC class II Β (MHCI1B). First, we isolated and characterized MHCIIB genes in barn owl (Tyto alba?, Strigiformes, Tytonidae), a species from an avian lineage in which MHC has not been studied so far. Our results revealed that with only two functional MHCIIB genes the MHC organization of barn owl may be similar to the 'minimal essential' MHC of chicken (Gallus gallus), indicating that simple MHC organization may be ancestral to birds. Taking advantage of the sequence information from barn owl, we studied the evolution of MHCIIB genes in 13 additional species of 'typical' owls (Strigiformes, Strigidae). Phylogenetic analyses revealed that according to their function, in owls the peptide-binding region (PBR) encoding exon 2 and the non-PBR encoding exon 3 evolve by different patterns. Exon 2 exhibited an evolutionary history of positive selection and recombination, while exon 3 traced duplication history and revealed two paralogs evolving divergently from each other in owls, and in a shorebird, the great snipe {Gallinago media). The results from exon 3 were the first ever from birds to demonstrate gene orthology in species that diverged tens of millions of years ago, and strongly questioned whether the taxa studied before provided an adequate picture of avian MHC evolution. In a follow-up study, we aimed at explaining a striking pattern revealed by phylogenetic trees analyzing the owl sequences along with MHCIIB sequences from other birds: One owl paralog (termed DAB1) grouped with sequences of passerines and falcons, while the other (DAB2) grouped with wildfowl, penguins and birds of prey. This could be explained by either a duplication event preceding the evolution of these bird orders, or by convergent evolution of similar sequences in a number of orders. With extensive phylogenetic analyses we were able to show, that indeed a duplication event preceeded the major avian radiation -100 my ago, and that following this duplication, the paralogs evolved under positive selection. Furthermore, we showed that the divergently evolving amino acid residues in the MHCIIB-encoded β-chain potentially interact with the MHCI I α-chain, and that molecular coevolution of the interacting residues may have been involved in the divergent evolution of the MHCIIB paralogs.The findings of this PhD are of particular interest to the understanding of the evolutionary history of the avian MHC and, by providing essential information on long-term gene history in the avian MHC, open promising perspectives for advances in the understanding of the evolution of multigene families in general, and for avian MHC organization in particular. Amongst others I discuss the importance of including protein structure in the phylogenetic study of multigene families, and the roles of ecological versus molecular selection pressures. I conclude by providing a population genomic perspective on avian MHC, which may serve as a basis for future research to investigate the relative roles of neutral processes involving effective population size effects and of adaptation in the evolution of avian MHC diversity and organization.RésuméLa duplication de gènes et leur néo-fonctionnalisation sont des processus importants dans l'évolution de la complexité phénotypique. Ils sont impliqués dans l'apparition d'importantes nouveautés évolutives favorisant l'adaptation écologique, comme c'est le cas pour le complexe majeur d'histocompatibilité ofondies, nous avons pu montrer qu'un événement de duplication a effectivement précédé la radiation aviaire principale d'il y a environ 100 millions d'années, et qu'après cette duplication les paralogues ont évolué sous sélection positive. De plus, les résidus d'acides aminés évoluant de façon divergente dans la chaîne β codée par le CMHIIB interagissent potentiellement avec la chaîne α codée par le CMHII, et que la coévolution moléculaire de ces résidus pourrait être à la base de l'évolution divergente des paralogues CMHIIB.Dans cette thèse sont discutés entre autres l'importance d'inclure la structure des protéines dans l'étude phylogénétique des familles multigéniques, ainsi que les rôles respectifs des pressions sélectives écologique et moléculaire. La conclusion comporte une perspective sur la génomique des populations du CMH aviaire, qui pourrait servir de base pour de futures recherches sur les rôles relatifs joués par Îes processus neutres comprenant les effets de la taille efficace des populations et l'adaptation dans l'évolution de la diversité et l'organisation du MHC aviaire.

TFC - Accesibilidad web

Estudio de 10 webs del portal uoc.edu, basado en las pautas de accesibilidad web W3C

Characterization of tumor antigen specific CD8+ T cells and semi-invariant Vα24/Vβ11 NKT cells in tumor invaded liver

Summary: Detailed knowledge on tumor antigen expression and specific immune cells is required for a rational design of immunotherapy for patients with tumor invaded liver. In this study, we confirmed that Cancer/Testis (CT) tumor-associated antigens are frequently expressed in hepatocellular carcinoma (HCC) and searched for the presence of CD8+ T cells specific for these antigens. In 2/10 HLA-A2+ patients with HCC, we found that MAGE-A10 and/or SSX-2 specific CD8+ T cells naturally responded to the disease, since they were enriched in tumor lesions but not in non-tumoral liver. Isolated T cells specifically and strongly killed tumor cells in vitro, suggesting that these CTL were selected in vivo for high avidity antigen recognition, providing the rational for specific immunotherapy of HCC, based on immunization with CT antigens such as MAGE-Al 0 and SSX-2. Type 1 NKT cells express an invariant TCR α chain (Vα24.1α18, paired with Vβ11 in human) and share a specific reactivity to αGalactosylceramide (αGC) presented by CD1d. These cells can display paradoxical immuno-regulatory properties including strong anti-tumor effects upon αGC administration in murine models. To understand why NKT cells were not sufficiently protective against tumor development in patients with tumor invaded liver, we characterized the diversity of Vα24/Vβ11 NKT cells in healthy donors (HD) and cancer patients: NKT cells from HD and patients were generally diverse in terms of TCR β chain (Vβ11) variability and NKT cells from HD showed a variable recognition of αGC loaded CD 1 d multimers. Vα24/ Vβ11 NKT cells can be divided in 3 populations, the CD4, DN (CD4-/CD8-) and CD8 NKT cell subsets that show distinct ability of cytokine production. In addition, our functional analysis revealed that DN and CD8 subsets displayed a higher cytolytic potential and a weaker IFNγ release than the CD4 NKT cell subset. NKT cell subsets were variably represented in the blood of HD and cancer patients. However, HD with high NKT cell frequencies displayed an enrichment of the DN and CD8 subsets, and few of them were suggestive of an oligoclonal expansion in vivo. Comparable NKT cell frequencies were found between blood, non-tumoral liver and tumor of patients. In contrast, we identified a gradual enrichment of CD4 NKT cells from blood to the liver and to the tumor, together with a decrease of DN and CD8 NKT cell subsets. Most patient derived NKT cells were unresponsive upon αGalactosylceramide stimulation ex vivo; NKT cells from few patients displayed a weak responsiveness with different cytokine polarization. The NKT cell repertoire was thus different in tumor tissue, suggesting that CD4 NKT cells infiltrating tumors may be detrimental for protection against tumors and instead may favour the tumor growth/recurrence as recently reported in mice. Résumé en français scientifique : Afin de développer le traitement des patients porteurs d'une tumeur dans le foie par immunothérapie, de nouvelles connaissances sont requises concernant l'expression d'antigènes par les tumeurs et les cellules immunitaires spécifiques de ces antigènes. Nous avons vérifié que des antigènes associés aux tumeurs, tels que les antigènes « Cancer-Testis » (CT), sont fréquemment exprimés par le carcinome hepatocéllulaire (CHC). La recherche de lymphocytes T CD8+ spécifiques (CTL) de ces antigènes a révélé que des CTL spécifiques de MAGE-A10 et/ou SSX-2 ont répondu naturellement à la tumeur chez 2/10 patients étudiés. Ces cellules étaient présentes dans les lésions tumorales mais pas dans le foie adjacent. De plus, ces CTL ont démontré une activité cytolytique forte et spécifique contre les cellules tumorales in vitro, ce qui suggère que ces CTL ont été sélectionnés pour une haute avidité de reconnaissance de l'antigène in vivo. Ces données fournissent une base pour l'immunothérapie spécifique du CHC, en proposant de cibler les antigènes CT tels que MAGE-A10 ou SSX-2. Les cellules NKT de type 1 ont une chaîne α de TCR qui est invariante (chez l'homme, Vα24Jα18, apparié avec Vβ11) et reconnaissent spécifiquement l'αGalactosylceramide (αGC) présenté par CD1d. Ces cellules ont des propriétés immuno¬régulatrices qui peuvent être parfois contradictoires et leur activation par l'αGC induit une forte protection anti-tumorale chez la souris: Afin de comprendre pourquoi ces cellules ne sont pas assez protectrices contre le développement des tumeurs dans le foie chez l'homme, nous avons étudié la diversité des cellules NKT Vα24/Vβ11 d'individus sains (IS) et de patients cancéreux. Les cellules NKT peuvent être sous-divisées en 3 populations : Les CD4, DN (CD4- /CD8-) ou CDS, qui ont la capacité de produire des cytokines différentes. Nos analyses fonctionnelles ont aussi révélé que les sous-populations DN et CD8 ont un potentiel cytolytique plus élevé et une production d'IFNγ plus faible que la sous-population CD4. Ces sous-populations sont représentées de manière variable dans le sang des IS ou des patients. Cependant, les IS avec un taux élevé de cellules NKT ont un enrichissement des sous- populations DN ou CDS, et certains suggèrent qu'il s'agit d'une expansion oligo-clonale in vivo. Les patients avaient des fréquences comparables de cellules NKT entre le sang, le foie et la tumeur. Par contre, la sous-population CD4 était progressivement enrichie du sang vers le foie et la tumeur, tandis que les sous-populations DN ou CD8 était perdues. La plupart des cellules NKT des patients ne réagissaient pas lors de stimulation avec l'αGC ex vivo et les cellules NKT de quelques patients répondaient faiblement et avec des polarisations de cytokines différentes. Ces données suggèrent que les cellules NKT CD4, prédominantes dans les tumeurs, sont inefficaces pour la lutte anti-tumorale et pourraient même favoriser la croissance ou la récurrence tumorale. Donc, une mobilisation spécifique des cellules NKT CD4 négatives par immunothérapie pourrait favoriser l'immunité contre des tumeurs chez l'homme. Résumé en français pour un large public Au sein des globules blancs, les lymphocytes T expriment un récepteur (le TCR), qui est propre à chacun d'entre eux et leur permet d'accrocher de manière très spécifique une molécule appelée antigène. Ce TCR est employé par les lymphocytes pour inspecter les antigènes associés avec des molécules présentatrices à la surface des autres cellules. Les lymphocytes T CD8 reconnaissent un fragment de protéine (ou peptide), qui est présenté par une des molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité de classe I et tuent la cellule qui présente ce peptide. Ils sont ainsi bien adaptés pour éliminer les cellules qui présentent un peptide issu d'un virus quand la cellule est infectée. D'autres cellules T CD8 reconnaissent des peptides comme les antigènes CT, qui sont produits anormalement par les cellules cancéreuses. Nous avons confirmé que les antigènes CT sont fréquemment exprimés par le cancer du foie. Nous avons également identifié des cellules T CD8 spécifiques d'antigènes CT dans la tumeur, mais pas dans le foie normal de 2 patients sur 10. Cela signifie que ces lymphocytes peuvent être naturellement activés contre la tumeur et sont capables de la trouver. De plus les lymphocytes issus d'un patient ont démontré une forte sensibilité pour reconnaître l'antigène et tuent spécifiquement les cellules tumorales. Les antigènes CT représentent donc des cibles intéressantes qui pourront être intégrés dans des vaccins thérapeutiques du cancer du foie. De cette manière, les cellules T CD8 du patient lui-même pourront être induites à détruire de manière spécifique les cellules cancéreuses. Un nouveau type de lymphocytes T a été récemment découvert: les lymphocytes NKT. Quand ils reconnaissent un glycolipide présenté par la molécule CD1d, ils sont capables, de manière encore incomprise, d'initier, d'augmenter, ou à l'inverse d'inhiber la défense immunitaire. Ces cellules NKT ont démontré qu'elles jouent un rôle important dans la défense contre les tumeurs et particulièrement dans le foie des souris. Nous avons étudié les cellules NKT de patients atteints d'une tumeur dans le foie, afin de comprendre pourquoi elles ne sont pas assez protectrice chez l'homme. Les lymphocytes NKT peuvent être sous-divisés en 3 populations: Les CD4, les DN (CD4-/CD8-) et les CD8. Ces 3 classes de NKT peuvent produire différents signaux chimiques appelés cytokines. Contrairement aux cellules NKT DN ou CDS, seules les cellules NKT CD4 sont capables de produire des cytokines qui sont défavorables pour la défense anti-tumorale. Par ailleurs nous avons trouvé que les cellules NKT CD4 tuent moins bien les cellules cancéreuses que les cellules NKT DN ou CD8. L'analyse des cellules NKT, fraîchement extraites du sang, du foie et de la tumeur de patients a révélé que les cellules NKT CD4 sont progressivement enrichies du sang vers le foie et la tumeur. La large prédominance des NKT CD4 à l'intérieur des tumeurs suggère que, chez l'homme, ces cellules sont inappropriées pour la lutte anti-tumorale. Par ailleurs, la plupart des cellules NKT de patients n'étaient pas capables de produire des cytokines après stimulation avec un antigène. Cela explique également pourquoi ces cellules ne protègent pas contre les tumeurs dans le foie.

Evaluación de accesibilidad web en upc.edu

Evaluación de la accesibilidad Web de 10 páginas del sitio www.upc.edu siguiendo las pautas para niveles de conformidad en WCAG 1.0 y WCAG 2.0 de acuerdo a la Metodología Unificada de Evaluación Web (UWEM 1.0).

Accessibilitat web : cas d'anàlisi a partir de les WCAG 1.0 i WCAG 2.0

El document analitza, de forma manual i detallada, l'accessibilitat de 10 pàgines web del portal de la UOC en base a les 14 pautes i 65 punts de validació de les WCAG 1.0 i en base als quatre principis de les WCAG 2.0 que a la vegada s'organitzen en 12 directius i 61 criteris de conformitat.

Chronic delivery of antibody fragments using immunoisolated cell implants as a passive vaccination tool.

BACKGROUND: Monoclonal antibodies and antibody fragments are powerful biotherapeutics for various debilitating diseases. However, high production costs, functional limitations such as inadequate pharmacokinetics and tissue accessibility are the current principal disadvantages for broadening their use in clinic. METHODOLOGY AND PRINCIPAL FINDINGS: We report a novel method for the long-term delivery of antibody fragments. We designed an allogenous immunoisolated implant consisting of polymer encapsulated myoblasts engineered to chronically release scFv antibodies targeted against the N-terminus of the Aβ peptide. Following a 6-month intracerebral therapy we observed a significant reduction of the production and aggregation of the Aβ peptide in the APP23 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. In addition, functional assessment showed prevention of behavioral deficits related to anxiety and memory traits. CONCLUSIONS AND SIGNIFICANCE: The chronic local release of antibodies using immunoisolated polymer cell implants represents an alternative passive vaccination strategy in Alzheimer's disease. This novel technique could potentially benefit other diseases presently treated by local and systemic antibody administration.

L'usabilitat de llocs web per a persones amb discapacitat

Aquest treball mira de donar una visió global de la problemàtica de la facilitat d'accés web. El producte que provoca o pot provocar la problemàtica és una pàgina web i els afectats són les persones amb alguna discapacitat. Per això, en aquest treball s'estudia la facilitat d'ús d'una pàgina web orientada a uns usuaris especials i, per tant, es revisa la facilitat d'accés d'una pàgina.

Characterization of root apoplastic barriers in Arabidopsis thaliana

In vascular plants, the best-known feature of a differentiated endodermal cell is the "Casparian Strip" (CS). This structure refers to a highly localized cell wall impregnation in the transversal and anticlinal walls of the cell, which surrounds the cell like a belt/ring and is tightly coordinated with respect to neighboring cells. Analogous to tight junctions in animal epithelia, CS in plants act as a diffusion barrier that controls the movement of water and ions from soil into the stele. Since its first description by Robert Caspary in 1865 there have been many attempts to identify the chemical nature of the cell wall deposition in CS. Suberin, lignin, or both have been claimed to be the important components of CS in a series of different species. However, the exact chemical composition of CS has remained enigmatic. This controversy was due to the confusion and lack of knowledge regarding the precise measurement of three developmental stages of the endodermis. The CS represent only the primary stage of endodermal differentiation, which is followed by the deposition of suberin lamellae all around the cellular surface of endodermal cells (secondary developmental stage). Therefore, chemical analysis of whole roots, or even of isolated endodermal tissues, will always find both of the polymers present. It was crucial to clarify this point because this will guide our efforts to understand which cell wall biosynthetic component becomes localized in order to form the CS. The main aim of my work was to find out the major components of (early) CS, as well as their spatial and temporal development, physiological roles and relationship to barrier formation. Employing the knowledge and tools that have been accumulated over the last few years in the model plant Arabidopsis thaliana, various histological and chemical assays were used in this study. A particular feature of my work was to completely degrade, or inhibit formation of lignin and suberin biopolymers by biochemical, classical genetic and molecular approaches and to investigate its effect on CS formation and the establishment of a functional diffusion barrier. Strikingly, interference with monolignol biosynthesis abrogates CS formation and delays the formation of function diffusion barrier. In contrast, transgenic plants devoid of any detectable suberin still develop a functional CS. The combination of all these assays clearly demonstrates that the early CS polymer is made from monolignol (lignin monomers) and is composed of lignin. By contrast, suberin is formed much later as a secondary wall during development of endodermis. These early CS are functionally sufficient to block extracellular diffusion and suberin does not play important role in the establishment of early endodermal diffusion barrier. Moreover, suberin biosynthetic machinery is not present at the time of CS formation. Our study finally concludes the long-standing debate about the chemical nature of CS and opens the door to a new approach in lignin research, specifically for the identification of the components of the CS biosynthetic pathway that mediates the localized deposition of cell walls. I also made some efforts to understand the patterning and differentiation of endodermal passage cells in young roots. In the literature, passage cells are defined as a non- suberized xylem pole associated endodermal cells. Since these cells only contain the CS but not the suberin lamellae, it has been assumed that these cells may offer a continued low-resistance pathway for water and minerals into the stele. Thus far, no genes have been found to be expressed specifically in passage cells. In order to understand the patterning, differentiation, and physiological role of passage it would be crucial to identify some genes that are exclusively expressed in these cells. In order to identify such genes, I first generated fluorescent marker lines of stele-expressed transporters that have been reported to be expressed in the passage cells. My aim was to first highlight the passage cells in a non-specific way. In order to find passage cell specific genes I then adapted a two-component system based on previously published methods for gene expression profiling of individual cell types. This approach will allow us to target only the passage cells and then to study gene expression specifically in this cell type. Taken together, this preparatory work will provide an entry point to understand the formation and role of endodermal passage cells. - Chez les plantes vasculaires, la caractéristique la plus commune des cellules différentiées de l'endoderme est la présence de cadres de Caspary. Cette structure correspond à une imprégnation localisée des parties transversales et anticlinales de la paroi cellulaire. Cela donne naissance, autour de la cellule, à un anneau/cadre qui est coordonné par rapport aux cellules voisines. De manière analogue aux jonctions serrées des épithéliums chez les animaux, les cadres de Caspary agissent chez les plantes comme barrière de diffusion, contrôlant le mouvement de l'eau et des ions à travers la racine entre le sol et la stèle. Depuis leur première description par Robert Caspary en 1865, beaucoup de tentatives ont eu pour but de définir la nature chimique de ces cadres de Caspary. Après l'étude de différentes espèces végétales, à la fois la subérine, la lignine ou les deux ont été revendiquées comme étant des composants importants de ces cadres. Malgré tout, leur nature chimique exacte est restée longtemps énigmatique. Cette controverse provient de la confusion et du manque de connaissance concernant la détermination précise des trois stades de développement de l'endoderme. Les cadres de Caspary représentent uniquement le stade primaire de différentiation de l'endoderme. Celui-ci est suivi par le second stade de différentiation, la déposition de lamelles de subérine tout autour de la cellule endodermal. De ce fait, l'analyse chimique de racines entières ou de cellules d'endoderme isolées ne permet pas de séparer les stades de différentiation primaire et secondaire et aboutit donc à la présence des deux polymères. Il est également crucial de clarifier ce point dans le but de connaître quelle machinerie cellulaire localisée à la paroi cellulaire permet l'élaboration des cadres de Caspary. En utilisant les connaissances et les outils accumulés récemment grâce à la plante modèle Arabidopsis thaliana, divers techniques histologiques et chimiques ont été utilisées dans cette étude. Un point particulier de mon travail a été de dégrader ou d'inhiber complètement la formation de lignine ou de subérine en utilisant des approches de génétique classique ou moléculaire. Le but étant d'observer l'effet de l'absence d'un de ces deux polymères sur la formation des cadres de Caspary et l'établissement d'une barrière de diffusion fonctionnelle. De manière frappante, le fait d'interférer avec la voie de biosynthèse de monolignol (monomères de lignine) abolit la formation des cadres de Caspary et retarde l'élaboration d'une barrière de diffusion fonctionnelle. Par contre, des plantes transgéniques dépourvues d'une quantité détectable de subérine sont quant à elles toujours capables de développer des cadres de Caspary fonctionnels. Mises en commun, ces expériences démontrent que le polymère formant les cadres de Caspary dans la partie jeune de la racine est fait de monolignol, et que de ce fait il s'agit de lignine. La subérine, quant à elle, est formée bien plus tard durant le développement de l'endoderme, de plus il s'agit d'une modification de la paroi secondaire. Ces cadres de Caspary précoces faits de lignine suffisent donc à bloquer la diffusion extracellulaire, contrairement à la subérine. De plus, la machinerie de biosynthèse de la subérine n'est pas encore présente au moment de la formation des cadres de Caspary. Notre étude permet donc de mettre un terme au long débat concernant la nature chimique des cadres de Caspary. De plus, elle ouvre la porte à de nouvelles approches dans la recherche sur la lignine, plus particulièrement pour identifier des composants permettant la déposition localisée de ce polymère dans la paroi cellulaire. J'ai aussi fais des efforts pour mettre en évidence la formation ainsi que le rôle des cellules de passage dans les jeunes racines. Dans la littérature, les cellules de passage sont définies comme de la cellule endodermal faisant face aux pôles xylèmes et dont la paroi n'est pas subérisée. Du fait que ces cellules contiennent uniquement des cadres de Caspary et pas de lamelle de subérine, il a été supposé qu'elles ne devraient offrir que peu de résistance au passage de l'eau et des nutriments entre le sol et la stèle. Le rôle de ces cellules de passage est toujours loin d'être clair, de plus aucun gène s'exprimant spécifiquement dans ces cellules n'a été découvert à ce jour. De manière à identifier de tels gènes, j'ai tout d'abord généré des marqueurs fluorescents pour des transporteurs exprimés dans la stèle mais dont l'expression avait également été signalée dans l'endoderme, uniquement dans les cellules de passage. J'ai ensuite développé un système à deux composants basé sur des méthodes déjà publiées, visant principalement à étudier le profil d'expression génique dans un type cellulaire donné. En recoupant les gènes exprimés spécifiquement dans l'endoderme à ceux exprimés dans la stèle et les cellules de passage, il nous sera possible d'identifier le transriptome spécifique de ces cellules. Pris dans leur ensemble, ces résultats devraient donner un bon point d'entrée dans la définition et la compréhension des cellules de passage.

Open Educational Resources : Experiences of use in a Latin-American context

This paper presents practical experiences using Open educational Resources (OER) for basic and elementary education (K12), educational research and research training on two inter-institutional projects with the collaboration of thirteen higher education institutions and with the support of the Corporación de Universidades para el Desarrollo del Internet (CUDI) and by the Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) of Mexico and hosted by the Tecnológico de Monterrey. The first initiative is titled "Knowledge Hub for K-12 Education" with the main goal of enrich a catalog of Open Educational Resources for basic and elementary education (K-12) for Mexico and Spanish speaking countries in Latin-America. The main goal of the second initiative is to build a collection of Open Educational Resources for Mobile Learning to address the issue of educational research and research training.

Genetic variability in the 5' UTR and NS5A regions of hepatitis C virus RNA isolated from non-responding and responding patients with chronic HCV genotype 1 infection

Sequence variation among different hepatitis C virus (HCV) isolates has adaptive significance and reflects the modes and intensities of selection mechanisms operating on the virus. In this work, we sought to investigate using classical population genetics parameters, the genetic variability of HCV genotype 1 using the 5' UTR and NS5A regions from treatment non-responding and responding groups of patients. Both regions showed low genetic varia-bility and the 5' UTR showed neutral deviation. No differences were observed in the nonsynonymous/synonymous nucleotide substitution ratio among groups for NS5A. The analysis of molecular variance test of the 5' UTR region showed an 11.94% variation among groups. Phylogenetic analysis showed no correlation between sequence variations and therapeutic responses.