Lignes ferroviaires régionales : ouvrir, fermer ou moderniser? : obstacles juridiques, techniques, géopolitiques ou absence de volonté politique? : études de quatre lignes ferroviaires franco-belges et franco-suisses

L'objectif de la présente étude est de cerner les facteurs de succès et d'échec des réouvertures et modernisations de lignes ferroviaires transfrontalières dans les zones limitrophes. L'enquête prend pour base deux lignes franco-belges (Mons-Valenciennes et Namur- Charleville-Mézières) et deux lignes franco-suisses (Delémont-Belfort et Neuchâtel- Besançon). Le problème public réside dans l'absence de moyens de transports publics exploitant le potentiel existant dans le bassin de vie concerné (sous-exploitation du marché des transports). Les obstacles à franchir dans le domaine des transports ferroviaires peuvent être de nature juridique. Ainsi, des prescriptions légales telles que certains standards d'interopérabilité, l'absence d'une définition de l'expression «train régional» au niveau européen, la sécurité (passages à niveau) ou des mesures en faveur des personnes à mobilité réduite, peuvent entraver, voire empêcher des réouvertures ou modernisations de lignes régionales, car ces standards ne sont pas adaptés à la réalité des lignes dont le potentiel est faible en termes de voyageurs et de fret. À un autre niveau, il est rare que les aspects techniques constituent des obstacles. C'est cependant le cas lorsque deux réseaux ferroviaires nourrissent des philosophies antagonistes (réseau cadencé et non cadencé). Pour la réouverture des lignes, on constate l'absence de définitions claires, au niveau politique, de la desserte de base et des seuils de fréquentation minimale. Il y a parfois un contraste marqué entre une infrastructure dégradée et un matériel roulant très moderne, signe d'absence de sensibilisation à l'entretien des infrastructures ferroviaires. Pourtant, ces infrastructures jouent un rôle important à l'échelon géopolitique. Correctement aménagées (offre, temps de parcours, correspondances), elles permettent le désenclavement de toute une région. La réouverture d'un chaînon manquant peut changer la position géopolitique d'une région, comme dans le cas de Mons-Valenciennes; mais en même temps, l'argument de l'impact géopolitique peut entraver une réouverture, même lorsqu'il n'est pas fondé, comme le montre le cas de Dinant-Givet qui semble concurrencer une autre ligne existante. L'impact des lignes à grande vitesse sur les régions limitrophes est souvent surestimé. En revanche, la praticabilité du concept des quatre capitaux (capital manufacturé, social, naturel et humain) est sous-estimée dans le domaine des transports publics. Les grilles d'analyse des quatre capitaux nous ont en effet permis de prouver l'applicabilité du concept aux lignes ferroviaires transfrontalières, en dépit du manque de me- surabilité de certains indicateurs. L'évaluation des lignes retenues à l'aide de notre grille d'analyse montre que les lignes régionales françaises accusent un lourd retard en termes de performance. Ce fait est confirmé dans les quatre capitaux. En appliquant notre méthode de planification à des lignes ferroviaires (transfrontalières), on observe que les lignes actuelles n'exploitent pas suffisamment leur potentiel. L'approche proposée se base sur le triangle «offre - infrastructure - matériel roulant» et s'articule autour des usagers. Avant toute planification, il faut développer une vision pour la région et la ligne concernée, dans laquelle la voie ferrée servira d'axe structurant. La vision se manifeste par un horaire qui traduit l'offre sou-haitée à long terme avec des temps de parcours idéaux, et des noeuds de correspondance avec d'autres moyens de transport. Alors, les lignes régionales peuvent contribuer à un changement de paradigme qui favorise un mode de vie axé davantage sur les services des transports publics que sur le transport individuel, également dans les régions limitrophes. - Het doel van deze Studie is het onderzocken von de redenen van het succès en van het falen van de heropening of modernisering van al of niet grensoverschrijdende spoorlijnen. Het on- derzoek is gebaseerd op twee Frans-Belgische lijnen (Bergen-Yalenciennes en Namen- Charleville-Mezières) en twee Frans-Zwitserse lijnen (Delémont-Belfort en Neuchâtel- Besançon). Het probleem is de afwezigheid van openbare transportmogelijkheden in de uitbating van de betrokken woongebieden (onderbenutting van de transportmarkt). De te overschrijden hindernissen op het gebied van spoorwegvervoer kunnen van juridische oorsprong zijn. Dat wil zeggen dat wettelijke vereisten zoals bepaalde standaarden voor inte- roperabiliteit, het ontbreken van een definitie van «regionale trein» op Europees niveau, de beveiliging (spoorwegovergangen) of maatregelen voor mensen met verminderde mobiliteit de heropening of modernisering van de regionale lijnen kunnen verhinderen, aangezien deze normen niet zijn aangepast aan de realiteit op aan de lijnen waarvan het potenti eel laag is, zowel voor reizigers als voor goederen. Op een ander niveau is het zeldzaam dat de technische as-pecten voor obstakels zorgen. Het is nochtans het geval wanneer twee spoorwegnetten zorgen voor tegenstrijdige ideeën (regelmatig of onregelmatig bezet net). Om de lijnen te he- ropenen, is er een gebrek aan duidelijke afspraken op politiek niveau, voor een minimale be- diening en een minimale opkomst. Soms is er een groot contrast tussen een verouderde infras- tructuur en een zeer modem rollend materieel, een teken van gebrek aan gezond verstand bij het onderhoud van de spoorweginfrastructuur. Deze infrastructuur speelt echter een belan- grijke roi in het geopolitieke niveau. Goed beheerd (aanbod, reistijd, verbindingen) zorgen ze voor een heropening van een hele regio. De heropening van een ontbrekende schakel kan de geopolitieke positie van een regio veranderen, zoals in het geval van Bergen-Valenciennes, maar terzelfder tijd kan het argument van de geopolitieke impact een heropening verhinderen, zelfs als het ongegrond is, zoals in het geval van Dinant-Givet dat blijkt te concurreren met een andere bestaande lijn. De impact van hogesnelheidslijnen op grensoverschrijdende regio's wordt vaak overschat. Daartegenover wordt de haalbaarheid van het concept van de vier kapi- taalvlakken (opbouwend, sociaal, natuurlijk en menselijk kapitaal) onderschat op het gebied van openbaar vervoer. De analyse van de vier kapitaalvlakken heeft ons toegelaten de toepas- baar-heid van het concept van de grensoverschrijdende spoorlijnen aan te tonen, ondanks het ge-brek aan meetbaarheid van bepaalde indicatoren. Evaluatie van de lijnen, geselecteerd met behulp van ons analysekader, heeft aangetoond dat Franse regionale lijnen achterblijven op het gebied van prestaties. Dit wordt bevestigd op de vier kapitaalvlakken. Door het toepassen van onze planningsmethode op spoorlijnen (in grenszones), zien we dat de huidige lijnen hun potentieel onvoldoende benutten. De voorgestelde aanpak is gebaseerd op de driehoek «aan- bieding - infrastructuur - rollend materieel» en rieht zieh op de gebruikers. Vooraleer een planning opgesteld kan worden, moeten we een visie ontwikkelen voor de betrokken lijn en de regio waarin de spoorweg zal dienen als structurele as. De visie baseert zieh op een diens- tregeling die uitgaat van een aanbod op lange termijn met ideale rijtijden en knooppunten met an-dere transportmiddelen. Zodoende kunnen regionale lijnen bijdragen aan een paradigma- vers-chuiving die een levensstijl promoot die meer gericht is op het openbaar vervoer dan op het individueel vervoer, ook in naburige regio's. - Das Ziel der Studie ist die Identifizierung von Erfolgs- und Misserfolgsfaktoren bei Wiedereröffnungen und Modernisierungen von (grenzüberschreitenden) Regionalverkehrslinien in Randregionen. Die Untersuchung stützt sich auf zwei belgisch-französische (Mons- Valenciennes und Namur-Charleville-Mézières) sowie zwei schweizerisch-französische Linien (Delémont-Belfort und Neuchâtel-Besançon). Das öffentliche Problem besteht im Fehlen eines öffentlichen Verkehrsmittels, welches das vorhandene Potential im Einzugsbereich der betrachteten Linien vollständig ausnützt (unvollständige Ausnützung des vorhandenen Transportmarktes). Die zu überwindenden Hindernisse auf dem Gebiet des Eisenbahnwesens können juristischer Natur sein. Es handelt sich dabei um gewisse juristische Vorschriften w. z. B. Interoperabili- tätsstandards, die Abwesenheit einer klaren Definition des Begriffes «Regionalverkehr» auf europäischer Ebene, Sicherheitsstandards (Bahnübergänge) oder Massnahmen zu Gunsten von Behinderten, die Wiedereröffnungen behindern können, weil diese Standards keine Rücksicht auf die Gegebenheiten von Regionallinien mit einem geringen Nachfragepotential nehmen. Technische Vorgaben stellen nur selten ein Hindernis bei Wiedereröffnungen dar. Dies kann dann der Fall sein, wenn zwei Eisenbahnnetze mit unterschiedlichen Betriebsphilosophien aufeinander treffen (Netz mit Taktverkehr und unvertaktete Netze). Bei Wiedereröffnung von Eisenbahnlinie ist festzustellen, dass auf politischer Ebene keine Definitionen in Bezug auf Basisangebot und der minimalen Nachfrage bestehen. Bisweilen ist ein starker Kontrast zwischen einem schlechten Infrastrukturzustand und einem darauf verkehrenden modernem Rollmaterial festzustellen. Gerade diese Infrastruktur spielt auf geopolitischer Ebene eine wichtige Rolle. Wird diese korrekt betrieben (attraktives Angebot, Fahrzeit, Umsteigeverbindungen), erlaubt sie einer ganzen Region eine Lösung aus der Isolation. Die Wiedereröffnung eines fehlenden Teilstücks kann die geopolitische Situation einer Region positiv verändern, wie das Beispiel der Linie Mons-Valenciennes zeigt. Gleichzeitig kann das Argument der geopolitischen Position eine Wiedereröffnung behindern, auch wenn die vorgebrachten Argumente nicht stichhaltig sind, wie das Beispiel der Linie Dinant-Givet beweist, die angeblich einen bestehenden Eisenbahgüterverkehrskorridor konkurrenzieren soll. Der Einfluss von Hochgeschwindigkeitsstrecken auf Randregionen wird oft überschätzt. Im Gegensatz dazu wird die Anwendbarkeit des Konzeptes der vier Kapitalien (konstruiertes, soziales, natürliches und Human-Kapital) bei der Anwendbarkeit im öffentlichen Verkehr unters-chätzt. Der verwendete Analyseraster der vier Kapitalien erlaubt die Anwendbarkeit dieses Ansatzes auf grenzüberschreitende Eisenbahnlinien, trotz des Fehlens von Daten für zahlreiche Indikatoren, zu untermauern. Die Evaluation der betrachteten Linien hat gezeigt, dass die französischen Schienenregionalverkehrslinien einen bedeutenden Rückstand in Bezug auf die Leistungsfähigkeit vorweisen. Dies wird durch die Anwendung des Analyseraster der vier Kapitalien bestätigt. Der Einsatz, der in dieser Arbeit entwickelten Planungsmethode auf die vier grenzüberschreitenden Regionalverkehrslinien hat gezeigt, dass die heutige Betriebsweise von Regionalverkehrslinien das vorhandene Potential nicht ausschöpft. Der vorgeschlagene Ansatz basiert auf dem Dreieck «Angebot - Infrastruktur - Rollmaterial» in dem die Benützerlnnen im Zentrum stehen. Jedoch steht die Entwicklung einer Vision für die betroffene Region und Linie vor dem Beginn jeder Planung im Zentrum, bei der die Eisenbahnlinie als strukturierende Achse benützt wird. Diese manifestiert sich in einer Fahrplanstruktur, die das langfristig gewünschte Angebot mit idealen Fahrzeiten und Umsteigeknoten mit anderen Verkehrsmitteln beinhaltet. In dieser Weise können die Regionalverkehrslinien einen Beitrag zu einem Paradigmawechsel beitragen, der auch in Randregionen einen Lebensstil fördert, der vermehrt auf den öffentlichen Verkehr als auf den motorisierten Individualverkehr setzt. - L'obiettivo di questo studio è quello di identificare i fattori di successo e di fallimento relativi alla riapertura e modernizzazione di linee ferroviarie transfrontaliere e non in aree limitrofe. L'indagine si basa su due linee franco-belghe (Mons-Valenciennes e Namur-Charleville- Mézières) e due linee franco-svizzere (Delémont-Belfort e Neuchâtel-Besançon). Il problema pubblico è la mancanza di mezzi di trasporto pubblico che sfruttino il potenziale esistente nel bacino d'utenza interessato (sottoutilizzazione del mercato dei trasporti). Gli ostacoli da superare nel settore del trasporto ferroviario possono essere di natura giuridica - vale a dire, requisiti legali come alcuni standard d'interoperabilità, l'assenza di una definizione del termine «treno regionale» a livello europeo, la sicurezza (passaggi a livello) o misure a favore di persone a mobilità ridotta, che possono ostacolare o impedire la riapertura o modernizzazione di linee regionali poiché queste norme non vengono adattate alla realtà delle linee il cui potenziale è basso in termini di viaggiatori e merci. A un altro livello è raro che aspetti tecnici costituiscano degli ostacoli. Tuttavia è il caso quando due reti ferroviarie perseguono filosofie antagoniste (rete cadenzata e non cadenzata). Per riaprire le linee si rileva una mancanza di definizioni chiare, a livello politico, del collegamento di base e delle soglie minime di frequentazione. A volte vi è un netto contrasto tra un'infrastruttura degradata e un modernissimo materiale rotabile, segno della mancanza di sensibilizzazione per la manutenzione delle infrastrutture ferroviarie. Eppure queste strutture svolgono un ruolo importante a livello geopolitico. Correttamente gestite (offerta, tempi di percorrenza, coincidenze), permettono l'apertura verso l'esterno di un'intera regione. La riapertura di un tassello mancante può cambiare la posizione geopolitica di una regione, come nel caso di Mons-Valenciennes. Allo stesso tempo, tuttavia, l'argomento dell'impatto geopolitico, anche se infondato, può ostacolare una riapertura - come nel caso di Dinant-Givet che sembra fare concorrenza a un'altra linea esistente. L'impatto delle linee ad alta velocità sulle regioni limitrofe è spesso sovrastimato. In compenso, l'attuabilità del concetto dei quattro capitali (capitale fabbricato, sociale, naturale e umano) è sottovalutata nel settore dei trasporti pubblici. Le griglie d'analisi dei quattro capitali ci hanno effettivamente permesso di dimostrare l'applicabilità del concetto alle linee ferroviarie transfrontaliere, nonostante la mancanza di misurabilità di alcuni indicatori. La valutazione delle linee selezionate in supporto alla nostra griglia d'analisi mostra che le linee regionali francesi accusano un pesante ritardo in termini di prestazioni. Questo dato di fatto è confermato nei quattro capitali. Applicando il nostro metodo di pianificazione alle linee ferroviarie (transfrontaliere), si osserva che le attuali linee non sfruttano a sufficienza il loro potenziale. L'approccio proposto è basato sul triangolo «offerta / infrastrutture / materiale rotabile» e si articola attorno agli utenti. Prima di qualsiasi pianificazione, è necessario sviluppare una visione per la regione e la linea coinvolta, in cui la ferrovia servirà come asse strutturale. La visione si manifesta attraverso un orario che rifletta l'offerta desiderata a lungo termine, con tempi di percorrenza ideali e nodi di coincidenza con altri mezzi di trasporto. In questo modo, le linee regionali possono contribuire a un cambiamento di paradigma che favorisca uno stile di vita più focalizzato sui servizi di trasporto pubblico che sul trasporto individuale - anche nelle regioni limitrofe.

Tolerogenic dendritic cells and their role in induction of immune tolerance

Les cellules dendritiques sont des cellules du système immunitaire qui permettent d'instruire les lymphocytes T, autres cellules de ce système, pour mettre en place une réponse immunitaire adaptée afin de combattre et vaincre une infection. Ces cellules dendritiques vont reconnaître des motifs spécifiquement exprimés par des pathogènes par l'intermédiaire de récepteurs exprimés à leur surface. En détectant ces molécules, elles vont s'activer et subir diverses modifications pour pouvoir activer les lymphocytes T. Elles vont alors interagir avec les lymphocytes Τ et transférer les informations nécessaires pour que ces cellules s'activent à leur tour et produisent différentes protéines de façon à éliminer le pathogène. En fonction du type de pathogène, les informations transférées entre les cellules dendritiques et les lymphocytes seront différentes de manière à produire la réponse immunitaire la mieux adaptée pour supprimer l'élément infectieux. Dans le corps, les cellules dendritiques circulent continuellement afin de détecter les éléments étrangers. Quand elles reconnaissent une protéine étrangère, elles la phagocytent, c'est-à-dire qu'elles la mangent afin de pouvoir la présenter aux lymphocytes T. Mais quand elles phagocytent un élément étranger, elles peuvent également prendre des éléments du soi, comme par exemple quand elles phagocytent une cellule infectée par un virus. Les cellules dendritiques doivent alors être capables de différentier les molécules du soi et du non-soi de façon à ne pas induire une réponse en présentant un antigène du soi aux lymphocytes T. D'autant plus que lors de leur développement, les lymphocytes Τ qui sont capables de reconnaître le soi sont éliminés mais ce système n'est pas parfait et donc certains lymphocytes Τ auto-reactifs peuvent se trouver dans le corps. Il existe ainsi d'autres mécanismes en périphérie du site de développement pour inhiber ces lymphocytes Τ auto-reactifs. Ce sont les mécanismes de tolérance. Quand les lymphocytes Τ induisent une réponse aux antigènes du soi, cela résulte à des maladies auto-immunes. Dans mon projet de recherche, nous avons travaillé avec des lignées de cellules dendritiques, c'est-à-dire des cellules dendritiques semblables à celles que l'on peut trouver in vivo mais qui sont immortalisées, elles peuvent donc être cultiver et manipuler in vitro. Nous avons génétiquement modifiées ces lignées cellulaires pour qu'elles expriment des molécules immunosuppressives afin d'étudier comment induire une tolérance immunitaire, c'est-à-dire si l'expression de ces molécules permet d'éviter de générer une réponse immunitaire. Pour cela, nous avons utilisé des modèles murins de tumeurs et de maladies auto-immunes. Nous avons démontré que ces lignées de cellules dendritiques peuvent être un grand outil de recherche pour étudier les bénéfices de différentes molécules immuno-modulatrices afin d'induire une tolérance immunitaire à différents antigènes. - Les cellules dendritiques sont responsables de l'induction des réponses immunitaires adaptatives. Suite à une infection microbienne, les cellules dendritiques s'activent, elles induisent l'expression de molécules de costimulation à leur surface, sécrètent des cytokines et induisent la différentiation des cellules Τ effectrices et mémoires. De plus, les cellules dendritiques ont un rôle important dans l'induction et la maintenance de la tolérance immunitaire au niveau du thymus et en périphérie, en induisant l'anergie, la délétion ou la conversion des cellules Τ naïves en cellules régulatrices. Dans notre groupe, une nouvelle lignée de cellules dendritiques appelée MuTu a été crée par la culture de cellules dendritiques tumorales isolées à partir d'une rate d'une souris transgénique, dans laquelle l'expression de l'oncogène SV40 et du GFP sont sous le contrôle du promoteur CD1 le, et sont ainsi spécifiquement exprimés dans les cellules dendritiques. Ces nouvelles lignées appartiennent au sous-type des cellules dendritiques conventionnelles exprimant CD8a. Elles ont conservé leur capacité d'augmenter l'expression des marqueurs de costimulation à leur surface ainsi que le production de cytokines en réponse à des ligands des récepteurs Toll, ainsi que leur capacité à présenter des antigènes associés aux molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I ou II pour activer la prolifération et la différentiation des lymphocytes T. En utilisant un système de transduction de lentivirus de seconde génération, ces nouvelles lignées de cellules dendritiques ont été génétiquement modifiées pour sur-exprimer des molécules immunosuppressives (IL-10, TGFP latent, TGFp actif, Activin A, Arginase 1, IDO, B7DC et CTLA4). Ces lignées permettent d'étudier de manière reproductible le rôle de ces molécules potentiellement tolérogènes sur les réponses immunitaires in vitro et in vivo. Ces lignées potentiellement tolérogènes ont été testées, tout d'abord, in vitro, pour leur capacité à inhiber l'activation des cellules dendritiques, à bloquer la prolifération des cellules Τ ou à modifier leur polarisation. Nos résultats démontrent qu'en réponse à une stimulation, la sur-expression des molécules costimulatrices et la sécrétion de molécules pro- inflammatoires est réduite quand les cellules dendritiques sur-expriment l'IL-10. La sur¬expression de TGFp sous sa forme active induit le développement de cellules régulatrices CD4+ CD25+ Foxp3+ et bloque la réponse CD8 cytotoxique tandis que la sur-expression de CTLA4 à la surface des cellules dendritiques inhibe une réponse Thl et induit des lymphocytes Τ anergiques. Ces lignées ont également été utilisées pour étudier l'induction de tolérance in vivo. Tout d'abord, nous avons étudié l'induction de tolérance dans un modèle de développement de tumeurs. En effet, quand les lignées tumorales sont transférées dans les lignées de souris C57BL/6, elles sont reconnues comme du non-soi du à l'expression de l'oncogène SV40 et du GFP et sont éliminées. Ce mécanisme d'élimination a été étudié en utilisant une lignée de cellules dendritiques modifiée pour exprimer la luciférase et qui a permis de suivre le développement des tumeurs par de l'imagerie in vivo dans des animaux vivants. Ces lignées de cellules dendritiques MuTu sont éliminées dans la souris C57BL/6 par les lymphocytes CD8 et l'action cytotoxique de la perforine. Après plusieurs injections, les cellules dendritiques sur-exprimant CTLA4 ou l'actif TGFp peuvent casser cette réponse immunitaire inhérente aux antigènes de la lignée et induire le développement de la tumeur dans la souris C57BL/6. Le développement tumoral a pu être suivi en mesurant la bioluminescence émise par des cellules dendritiques modifiées pour exprimer à la fois l'actif TGFp et la luciférase. Ces tumeurs ont pu se développer grâce à la mise en place d'un microenvironnement suppressif pour échapper à l'immunité en recrutant des cellules myéloïde suppressives, des lymphocytes CD4 régulateurs et en induisant l'expression d'une molécule inhibitrice PD-1 à la surface des lymphocytes CD8 infiltrant la tumeur. Dans un deuxième temps, ces lignées tolérogènes ont également été testées dans un modèle murin de maladies auto-immunes, appelé l'encéphalomyélite auto-immune expérimental (EAE), qui est un modèle pour la sclérose en plaques. L'EAE a été induite dans la souris par le transfert de cellules de ganglions prélevées d'une souris donneuse préalablement immunisée avec une protéine du système nerveux central, la glycoprotéine myéline oligodendrocyte (MOG) émulsifiée dans de l'adjuvant complet de Freund. La vaccination des souris donneuses et receveuses avec les cellules sur-exprimant l'actif TGFP préalablement chargées avec la protéine MOG bloque l'induction de l'EAE. Nous sommes actuellement en train de définir les mécanismes qui permettent de protéger la souris du développement de la maladie auto-immune. Dans cette étude, nous avons ainsi démontré la possibilité d'induire la tolérance in vivo et in vitro à différents antigènes en utilisant nos nouvelles lignées de cellules dendritiques et en les modifiant pour exprimer des molécules immunosuppressives. En conséquence, ces nouvelles lignées de cellules dendritiques représentent un outil pour explorer les bénéfices de différentes molécules ayant des propriétés immuno-modulatrices pour manipuler le système immunitaire vers un phénotype tolérogène. - Dendritic cells (DC) are widely recognized as potent inducers of the adaptive immune responses. Importantly, after microbial infections, DC become activated, induce co- stimulation, secrete cytokines and induce effector and memory Τ cells. DC furthermore play an important role in inducing and maintaining central and peripheral tolerance by inducing anergy, deletion or commitment of antigen-specific naïve Τ cells into regulatory Τ cells. In our group, stable MuTu DC lines were generated by culture of splenic DC tumors from transgenic mice expressing the SV40 large Τ oncogene and the GFP under DC-specific CDllc promoter. These transformed DC belong to the CD8a+ conventional DC subtype and have fully conserved their capacity to upregulate co-stimulatory markers and produce cytokines after activation with Toll Like Receptors-ligands, and to present Major Histocompatibility class-I or MHCII-restricted antigens to activate Τ cell expansion and differentiation. Using a second- generation lentiviral transduction system, these newly developed MuTu DC lines were genetically modified to overexpress immunosuppressive molecules (IL-10, latent TGFp, active TGFp, Activin A, Arginase 1, IDO, B7DC and CTLA4). This allows to reproducibly investigate the role of these potentially tolerogenic molecules on in vitro and in vivo immune responses. These potentially tolerogenic DC were tested in vitro for their ability to inhibit DC activation, to prevent Τ cell proliferation and to modify Τ cell polarization. Our results show that the upregulation of costimulatory molecules and the secretion of pro-inflammatory cytokines were reduced upon stimulation of DC overexpressing IL-10. The overexpression of active TGFP induced the development of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory Τ cells and inhibited the cytotoxic CD8 Τ cell response as shown by using the OT-II Τ cell system whereas the surface expression of CTLA-4 on DC prevented the Thl response and prompted an anergic antigen-specific Τ cell response. These MuTu DC lines were also used in vivo in order to study the induction of tolerance. First we addressed the induction of tolerance in a model of tumorogenesis. The adoptively transferred tumor cell lines were cleared in C57BL/6 mice due to the foreign expression of SV40 LargeT and GFP. The mechanism of clearance of MuTu DC line into C57BL/6 mice was investigated by using luciferase-expressing DC line. These DC line allowed to follow, by in vivo imaging, the tumor development in living animals and determined that MuTu DC lines were eliminated in a perforin-mediated CD8 Τ cell dependent and CD4 Τ cell independent response. After multiple injections, DC overexpressing CTLA4 or active TGFp could break the immune response to these inherent antigens and induced DC tumorogenesis in wild type mice. The tumor outgrowth in C57BL/6 mice was nicely observed by double-transduced DC lines to express both luciferase and active TGFp. actTGFp-DC tumor was shown to recruit myeloid-derived suppressor cells, induce CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory Τ cells and induce the expression of the inhibitory receptor PD-1 on tumor- infiltrating CD8+ Τ cells in order to escape tumor immunity. Tolerogenic DC lines were also tested for the induction of tolerance in a murine model of autoimmune disease, the experimental autoimmune encephalitis (EAE) model for human multiple sclerosis. EAE was induced in C57BL/6 mice by the adoptive transfer of lymph node cells isolated from donor mice previously immunized by a protein specific to the central nervous system, the myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) emulsified in the complete freund adjuvant. The vaccination of donor and recipient mice with MOG-pulsed actTGFP-DC line prevented EAE induction. We are still investigating how the active TGFP protect mice from EAE development. We generated tolerogenic DC lines inducing tolerance in vitro and in vivo. Thereby these MuTu DC lines represent a great tool to explore the benefits of various immuno-modulatory molecules to manipulate the immune system toward a tolerogenic phenotype.

Pharmacogenetic Study on Antidementia Drugs

Differences in efficacy and safety of drugs among patients are a recognized problem in pharmacotherapy. The reasons are multifactorial and, therefore, the choice of a drug and its dosage for a particular patient based on different clinical and genetic factors is suggested to improve the clinical outcome. Four drugs are currently used for the treatment of Alzheimer's disease: three acetylcholinesterase inhibitors (donepezil, galantamine, rivastigmine) and the N-methyl-D-aspartate-antagonist memantine. For these drugs, a high interindividual variability in plasma levels was observed, which might influence the response to treatment. The main objective of this thesis was to provide a better understanding of clinical and genetic factors affecting the plasma levels of antidementia drugs. Furthermore, the relationship between plasma levels, genetic variations and side effects was assessed. For this purpose, a pharmacogenetic study was conducted including 300 patients from a naturalistic clinical setting. Analytical methods for the simultaneous measurement of antidementia drugs in plasma have been developed and validated using liquid chromatography methods coupled with mass spectrometry detection. Presently, these methods are used in the therapeutic drug monitoring service of our laboratory. The routine use of therapeutic drug monitoring for antidementia drugs cannot yet be recommended with the available data, but it may be beneficial for some patients in special clinical cases such as insufficient treatment response, side effects or drug interactions. Donepezil and galantamine are extensively metabolized by the liver enzymes cytochromes P450 (CYP) 2D6 and 3A and are substrates of the drug transporter P-glycoprotein. The relationship of variations in genes affecting the activity of these metabolic enzymes and drug transporter (CYP2D6, CYP3A, POR, NR1I2, ABCB1) with donepezil and galantamine plasma levels was investigated. The CYP2D6 genotype appeared to be the major genetic factor involved in the pharmacokinetics of these two drugs. Thus, CYP2D6 poor metabolizers demonstrated significantly higher drug plasma levels than extensive metabolizers. Additionally, in the donepezil study population, the frequency of side effects was significantly increased in poor metabolizers. Lower donepezil plasma levels were observed in ultra rapid metabolizers, which might expose those patients to the risk of non-response. Memantine is mainly eliminated unchanged by the kidney, with implication of tubular secretion by renal transporters. A population pharmacokinetic model was developed to quantify the effects of clinical factors and genetic variations in renal cation transporters (SLC22A1/2/5, SLC47A1, ABCB1), and nuclear receptors (NR1I2, NR1I3, PPARG) involved in transporter expression, on memantine plasma levels. In addition to the renal function and gender, a genetic variation in the nuclear receptor Pregnane-X-Receptor (NR1I2) significantly affected memantine elimination. These findings suggest that an individualized therapy approach for antidementia drugs, taking into account clinical characteristics and genetic background of a patient, might increase efficacy and safety of the treatment. - Les différences interindividuelles dans l'efficacité et la tolérance des médicaments sont un problème connu en pharmacothérapie. Les raisons sont multiples, et le choix du médicament et de la dose, basé sur des facteurs cliniques et génétiques spécifiques au patient, peut contribuer à améliorer la réponse clinique. Quatre médicaments sont couramment utilisés dans le traitement de la maladie d'Alzheimer : trois inhibiteurs de l'acétylcholinestérase (donépézil, galantamine, rivastigmine) et un antagoniste du récepteur N-méthyl-D-aspartate, la mémantine. Une forte variabilité interindividuelle dans les taux plasmatiques de ces quatre composés a été observée, ce qui pourrait influencer la réponse au traitement. L'objectif principal de ce travail de thèse est de mieux comprendre les facteurs cliniques et génétiques influençant les taux des médicaments pro-cognitifs. En outre, des associations entre les taux, la variabilité génétique et les effets secondaires ont été recherchées. Dans ce but, 300 patients sous traitement avec un médicament pro-cognitif ont été recrutés pour une étude pharmacogénétique. Des méthodes de dosage simultané de médicaments pro-cognitifs par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse ont été développées et validées. Ces méthodes sont actuellement utilisées dans le service de suivi thérapeutique de notre unité. Malgré le fait qu'un suivi des taux sanguins des pro-cognitifs ne puisse pas encore être recommandé en routine, un dosage peut être utile dans des cas cliniques spécifiques, comme une réponse insuffisante, une intolérance ou une interaction médicamenteuse. Le donépézil et la galantamine sont fortement métabolisés par les cytochromes P450 (CYP) 2D6 et 3A, et sont également substrats du transporteur P-glycoprotéine. Les associations entre les polymorphismes génétiques de ces enzymes, cofacteur, récepteur nucléaire et transporteur (CYP2D6, CYP3A, POR, NR1I2, ABCB1) et les taux de donépézil et de galantamine ont été étudiées. Le génotype du CYP2D6 a été montré comme le facteur génétique majeur impliqué dans la pharmacocinétique de ces deux médicaments. Ainsi, les métaboliseurs déficients du CYP2D6 ont démontré des taux plasmatiques significativement plus élevés comparé aux bons métaboliseurs. De plus, dans la population traitée avec le donépézil, la fréquence des effets secondaires était plus élevée chez les métaboliseurs déficients. Des taux plasmatiques bas ont été mesurés chez les métaboliseurs ultra-rapides traités avec le donépézil, ce qui pourrait être un facteur de risque à une non-réponse au traitement. La mémantine est principalement éliminée sous forme inchangée par les reins, et partiellement par sécrétion tubulaire grâce à des transporteurs rénaux. Un modèle de cinétique de population a été développé pour quantifier les effets des différents facteurs cliniques et de la variabilité génétique des transporteurs rénaux (SLC22A1/2/5, SLC47A1, ABCB1) et des récepteurs nucléaires (NR1I2, NR1I3, PPARG, impliqués dans l'expression des transporteurs) sur les taux plasmatiques de mémantine. En plus de la fonction rénale et du genre, une variation génétique dans le récepteur nucléaire Pregnane-X-Receptor (NR1I2) a montré une influence significative sur l'élimination de la mémantine. Ces résultats suggèrent qu'une approche thérapeutique individualisée, prenant en compte des facteurs cliniques et génétiques du patient, pourrait améliorer l'efficacité et la sécurité du traitement pro-cognitif.

[Rome. Tomba di Cecilia Metella]

Référence bibliographique : Weigert, 609

[Rome. Sepolcro degli Scipioni]

Référence bibliographique : Weigert, 611

[Rome. Sepolcro degli Scipioni]

Référence bibliographique : Weigert, 612

[Rome. Roma vecchia]

Référence bibliographique : Weigert, 649

Regulation of the AKAP-LBC signaling complex : molecular characterization and functional implications

RÉSUMÉ Les protéines d'ancrage de la protéine kinase A (AKAPs) constituent une grande famille de protéines qui ciblent la protéine kinase A (PKA) à proximité de ses substrats physiologiques pour assurer leur régulation. Une nouvelle protéine de cette famille, appelée AKAP-Lbc, a été récemment caractérisée et fonctionne comme un facteur d'échange de nucléotides guanine (GEF) pour la petite GTPase Rho. AKAP-Lbc est régulée par différents signaux qui activent et désactivent son activité Rho-GEF. Son activation est assurée par la sous-unité alpha de la protéine G hétérotrimérique G12, tandis que son inhibition dépend de son interaction avec la PKA et 14-3-3. AKAP-Lbc est principalement exprimée dans le coeur et pourrait réguler des processus importants tels que l'hypertrophie et la différenciation des cardiomyocytes. Ainsi, il est crucial d'élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de son activité Rho-GEF. Le but général de ce travail de thèse est la caractérisation de deux nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation de l'activité de AKAP-Lbc. Le premier mécanisme consiste en la régulation de l'activité de AKAP-Lbc par son homo-oligomérisation. Mes travaux montrent que l'homo-oligomérisation maintient AKAP-Lbc inactive, dans une conformation permettant à la PKA ancrée et à 14-3-3 d'exercer leur effet inhibiteur sur l'activité de AKAP-Lbc. Le second mécanisme concerne la régulation de l'activité de AKAP-Lbc via une nouvelle interaction entre AKAP-Lbc et la protéine LC3. LC3 joue un rôle crucial dans l'autophagie, un processus cellulaire qui adresse les protéines cytoplasmiques au lysosome pour leur dégradation. Ce mécanisme est particulièrement important pour le survie des cardiomyocytes durant les périodes d'absence de nutriments. Mes travaux mettent en évidence que LC3 inhibe l'activité Rho-GEF de AKAP-Lbc, ce qui suggère que, au-delà son rôle bien établi dans l'autophagie, LC3 participerait à la régulation de la signalisation de Rho. Prises ensembles, ces études contribuent à comprendre comment le complexe de signalisation formé par AKAP-Lbc régule la signalisation de Rho dans les cellules. Au-delà de leur intérêt au niveau biochimique, ces travaux pourraient aussi contribuer à élucider les réseaux de signalisation qui régulent des phénomènes physiologiques dans le coeur. ABSTRACT A-kinase anchoring proteins (AKAPs) are a group of functionally related proteins, which target the cAMP dependent protein kinase A (PKA) in close proximity to its physiological substrates for ensuring their regulation. A novel PKA anchoring protein, termed AKAP-Lbc, has been recently characterized, which also functions as a guanine nucleotide exchange factor (GEF) for the small GTPase Rho. AKAP-Lbc is regulated in a bi-directional manner by signals which activate or deactivate its Rho-GEF activity. Activation is mediated by the alpha subunit of the heterotrimeric G protein G12, whereas inhibition occurs following its interaction with PKA and 14-3-3. AKAP-Lbc is predominantly expressed in the heart and might regulate important processes such as hypertrophy and differentiation of cardiomyocytes. Therefore ít is crucial to elucidate the molecular mechanisms involved in the regulation of the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. The general aim of the present thesis work is the characterization of two novel molecular mechanisms involved in the regulation of the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. The first mechanism consists of the. regulation of AKAP-Lbc activity through its homooligomerization. I report here that homo-oligomerization maintains AKAP-Lbc inactive, under a conformation suitable for ensuring the inhibitory effect of anchored PKA and 14-33 on AKAP-Lbc activity. The second mechanism concerns the regulation of AKAP-Lbc activity through a novel interaction between AKAP-Lbc and ubiquitin-like protein LC3. LC3 is a key mediator of autophagy, which is a cellular process that targets cytosolic proteins to the lysosome for degradation. This process is particularly important for cardiomyocyte survival during conditions of nutrient starvation. Here, I show that LC3 is a negative regulator of the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc, which suggests that, beyond its well established role in autophagy, LC3 can participate in the regulation of Rho signaling in cells. Overall, these findings contribute to understand how the AKAP-Lbc signaling complex can regulate the Rho signaling in cells. Beyond its interest at the biochemical level, this work might also contribute to elucidate the signaling network that regulate physiological events in the heart.

Molar substitution and C2/C6 ratio of hydroxyethyl starch: influence of blood coagulation

Résumé Cette étude a démontré l'effet individuel sur la coagulation sanguine humaine des deux principales caractéristiques de la molécule d'hydroxyéthylamidon (HES) : la substitution molaire et le rapport C2/C6. L'analyse par thrombélastographe (TEG®) indique que la molécule de HES dont la substitution molaire est de 0.42 et le rapport C2/C6 de 2.7 a le moins d'effet sur la coagulation sanguine chez l'être humain. Objectifs de l'étude Le développement d'hydroxyéthylamidons (HES) qui ont à la fois peu d'impact sur la coagulation sanguine et une longue persistance intravasculaire est d'un grand intérêt clinique. Une précédente étude in vitro a démontré qu'une solution de HES de haut poids moléculaire et de bas degré de substitution molaire ne compromettait pas plus la coagulation sanguine qu'une solution HES de poids moléculaire moyen (1). La présente étude examine l'effet individuel de la substitution molaire et du rapport C2/C6 d'une solution de HES de haut poids moléculaire (700 kDa) sur la coagulation sanguine. Matériel et méthode Nous avons prélevé du sang chez 30 adultes en bonne santé; le sang a été mélangé avec 6 solutions de HES qui diffèrent par leur degré de substitution molaire (0.42 et 0.51) et leur rapport C2/C6 (2.7, 7 et 14) à trois degrés de dilution : 20%, 40% et 60%. Les échantillons ont ensuite été analysés par thrombélastographe. Les données ont été étudiées par analyse de variance à trois voies pour mesures répétées sur une voie (dilution). Résultats Plus la substitution molaire est élevée, plus la coagulation sanguine est compromise et ce concernant tous les paramètres du TEG® (tous les p sont < à 0.05). La solution HES avec le rapport C2/C6 le plus bas a l'effet le moins prononcé sur le temps r (p<0.001), l'angle α (p=0.003) et l'Index de Coagulation CI (p<0.001) ; on n'a pas observé d'effet sur le temps k (p=0.513) et l'amplitude maximale (p=0.699) concernant ce paramètre. Conclusion L'analyse par thrombélastographe révèle qu'une molécule de HES avec une substitution molaire de 0.42 et un rapport C2/C6 de 2.7 a un effet minimal sur la coagulation sanguine humaine in vitro.

Characterising the role of T-cell subsets in experimental allograft rejection and transplantation tolerance

SUMMARY : The recognition by recipient T cells of the allograft major histocompatibility complex (MHC)mismatched antigens is the primary event that ultimately leads to rejection. In the transplantation setting, circulating alloreactive CD4+ T cells play a central role in the initiation and the coordination of the immune response and can initiate the rejection of an allograft via three distinct pathways: the direct, indirect and the recently described semi-direct pathway. However, the exact role of individual CD4+ T-cell subsets in the development of allograft rejection is not clearly defined. Furthermore, besides pathogenic effector T cells, a new subset of T cells with regulatory properties, the CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) cells, has come under increased scrutiny over the last decade. The experiments presented in this thesis were designed to better define the phenotype and functional characteristics of CD4+ T-cell subsets and Treg cells in vitro and in vivo in a marine adoptive transfer and skin transplantation model. As Treg cells play a key role in the induction and maintenance of peripheral transplantation tolerance, we have explored whether donor-antigen specific Treg cells could be expanded in vitro. Here we describe a robust protocol for the ex-vivo generation and expansion of antigen-specific Treg cells, without loss of their characteristic phenotype and suppressive function. In our in vivo transplantation model, antigen-specific Treg cells induced donor-specific tolerance to skin allografts in lymphopenic recipients and significantly delayed skin graft rejection in wild-type mice in the absence of any other immunosuppression. Naïve and memory CD4+ T cells have distinct phenotypes, effector functions and in vivo homeostatsis, and thus may play different roles in anti-donor immunity after transplantation. We have analyzed in vitro and in vivo primary alloresponses of naïve and cross-reactive memory CD4+ T cells. We found that the CD4+CD45RBlo memory T-cell pool was heterogeneous and contained cells with regulatory potentials, both in the CD4+CD25+ and CD4+CD25- populations. CD4+ T cells capable of inducing strong primary alloreactive responses in vitro and rejection of a first allograft in vivo were mainly contained within the CD45RBhi naïve CD4+ T-cell compartment. Taken together, the work described in this thesis provides new insights into the mechanisms that drive allograft rejection or donor-specific transplantation tolerance. These results will help to optimise current clinical immunosuppressive regimens used after solid organ transplantation and design new immunotherapeutic strategies to prevent transplant rejection. RÉSUMÉ : ROLE DES SOUS-POPULATIONS DE CELLULES T DANS LE REJET DE GREFFE ET L'INDUCTION DE TOLERANCE EN TRANSPLANTATION La reconnaissance par les cellules T du receveur des alloantigènes du complexe majeur d'histocompatibilité (CMIT) présentés par une greffe allogénique, est le premier événement qui aboutira au rejet de l'organe greffé. Dans le contexte d'une transplantation, les cellules alloréactives T CD4+ circulantes jouent un rôle central dans l'initiation et la coordination de 1a réponse immune, et peuvent initier le rejet par 3 voies distinctes : la voie directe, indirecte et la voie servi-directe, plus récemment décrite. Toutefois, le rôle exact des sous-populations de cellules T CD4+ dans les différentes étapes menant au rejet d'une allogreffe n'est pas clairement établi. Par ailleurs, hormis les cellules T effectrices pathogéniques, une sous-population de cellules T ayant des propriétés régulatrices, les cellules T CD4+CD25+Foxp3+ (Treg), a été nouvellement décrite et est intensément étudiée depuis environ dix ans. Les expériences présentées dans cette thèse ont été planifiées afin de mieux définir le phénotype et les caractéristiques fonctionnels des sous-populations de cellules T CD4+ et des Treg in vitro et in vivo dans un modèle marin de transfert adoptif de cellules et de transplantation de peau. Comme les cellules Treg jouent un rôle clé dans l'induction et le maintien de la tolérance périphérique en transplantation, nous avons investigué la possibilité de multiplier in vitro des cellules Treg avec spécificité antigénique pour le donneur. Nous décrivons ici un protocole reproductible pour la génération et l'expansion ex-vivo de cellules Treg avec spécificité antigénique, sans perte de leur phénotype caractéristique et de leur fonction suppressive. Dans notre modèle in vivo de transplantation de peau, ces cellules Treg pouvaient induire une tolérance spécifique vis-à-vis du donneur chez des souris lymphopéniques, et, chez des souris normales non-lymphopéniques ces Treg ont permis de retarder significativement le rejet en l'absence de tout traitement immunosuppresseur. Les cellules T CD4+ naïves et mémoires se distinguent par leur phénotype, fonction effectrice et leur homéostasie in vivo, et peuvent donc moduler différemment la réponse immune contre le donneur après transplantation. Nous avons analysé in vitro et in vivo les réponses allogéniques primaires de cellules T CD4+ naïves et mémoires non-spécifiques (cross-réactives). Nos résultats ont montré que le pool de cellules T CD4+CD45RB'° mémoires était hétérogène et contenait des cellules avec un potentiel régulateur, aussi bien parmi la sous-population de cellules CD4+CD25+ que CD4+CD25+. Les cellules T CD4+ capables d'induire une alloréponse primaire intense in vitro et le rejet d'une première allogreffe in vivo étaient essentiellement contenues dans le pool de cellules T CD4+CD45RBhi naïves. En conclusion, le travail décrit dans cette thèse amène un nouvel éclairage sur les mécanismes responsables du rejet d'une allogreffe ou de l'induction de tolérance en transplantation. Ces résultats permettront d'optimaliser les traitements immunosuppresseurs utilisés en transplantation clinique et de concevoir des nouvelles stratégies irnmuno-thérapeutiques pour prévenir le rejet de greffe allogénique.

El turismo como estrategia de desarrollo en Cuba

El turismo se ha convertido en una actividad económica que, cada vez tiene mayor importancia en el desarrollo económico, social y medio ambiental. Este hecho adquiere una especial relevancia en el caso de Cuba. La actividad turística es vista como una forma de equilibrar la balanza de pagos, una fuente de divisas y de empleo. Sin embargo, en momentos de incertidumbre económica y política como son los actuales, los peligros de sustituir un monocultivo (del azúcar) por otro (el turismo) son muy grandes y se hace necesario revisar su utilización como vía para el desarrollo

Immunotherapies for uro-genital cancers

Les cancers du col utérin et de la vessie prennent tous deux leur origine dans les sites muqueux et peuvent évoluer lentement de lésions superficielles (lésions squameuses intra-épithéliales de bas à haut grade (HSIL) et carcinomes in situ du col utérin (CIS); ou tumeurs non musculo-invasives de la vessie (NMIBC)) à des cancers invasifs plus avancés. L'éthiologie de ces deux cancers est néanmoins très différente. Le cancer du col utérin est, à l'échelle mondiale, le deuxième cancer le plus mortel chez la femme. Ce cancer résulte de l'infection des cellules basales de l'épithélium stratifié du col utérin par le papillomavirus humain à haut risque (HPV). Les vaccins prophylactiques récemment développés contre le HPV (Gardasil® et Cervarix®) sont des moyens de prévention efficaces lorsqu'ils sont administrés chez les jeunes filles qui ne sont pas encore sexuellement actives; cependant ces vaccins ne permettent pas la régression des lésions déjà existantes. Malgré un développement actif, les vaccins thérapeutiques ciblant les oncogènes viraux E6/E7 n'ont montré qu'une faible efficacité clinique jusqu'à présent. Nous avons récemment démontré qu'une immunisation sous-cutanée (s.c.) était capable de faire régresser les petites tumeurs génitales chez 90% des souris, mais chez seulement 20% des souris présentant de plus grandes tumeurs. Dans cette étude, nous avons développé une nouvelle stratégie où la vaccination est associée à une application locale (intra-vaginale (IVAG)) d'agonistes de TLR. Celle-ci induit une augmentation des cellules T CD8 totales ainsi que T CD8 spécifiques au vaccin, mais pas des cellules T CD4. L'attraction sélective des cellules T CD8 est permise par leur expression des récepteurs de chemokines CCR5 et CXCR3 ainsi que par les ligants E-selectin. La vaccination, suivie de l'application IVAG de CpG, a conduit, chez 75% des souris, à la régression de grandes tumeurs établies. Le cancer de la vessie est le deuxième cancer urologique le plus fréquente. La plupart des tumeurs sont diagnostiquées comme NMIBC et sont restreintes à la muqueuse de la vessie, avec une forte propension à la récurrence et/ou progression après une résection locale. Afin de développer des vaccins contre les antigènes associés à la tumeur (TAA), il est nécessaire de trouver un moyen d'induire une réponse immunitaire CD8 spécifique dans la vessie. Pour ce faire, nous avons comparé différentes voies d'immunisation, en utilisant un vaccin composé d'adjuvants et de l'oncogène de HPV (E7) comme modèle. Les vaccinations s.c. et IVAG ont toutes deux induit un nombre similaire de cellules T CD8 spécifiques du vaccin dans la vessie, alors que l'immunisation intra-nasale fut inefficace. Les voies s.c. et IVAG ont induit des cellules T CD8 spécifiques du vaccin exprimant principalement aL-, a4- et le ligand d'E-selectin, suggérant que ces intégrines/sélectines sont responsables de la relocalisation des cellules T dans la vessie. Une unique immunisation avec E7 a permis une protection tumorale complète lors d'une étude prophylactique, indépendemment de la voie d'immunisation. Dans une étude thérapeutique, seules les vaccinations s.c. et IVAG ont efficacement conduit, chez environ 50% des souris, à la régression de tumeurs de la vessie établies, alors que l'immunisation intra-nasale n'a eu aucun effet. La régression de la tumeur est correlée avec l'infiltration dans la tumeur des cellules T CD8 spécifiques au vaccin et la diminution des cellules T régulatrices (Tregs). Afin d'augmenter l'efficacité de l'immunisation avec le TAA, nous avons testé une vaccination suivie de l'instillation d'agonistes de TLR3 et TLR9, ou d'un vaccin Salmonella Typhi (Ty21a). Cette stratégie a entraîné une augmentation des cellules T CD8 effectrices spécifiques du vaccin dans la vessie, bien qu'à différentes échelles. Ty21a étant l'immunostimulant le plus efficace, il mérite d'être étudié de manière plus approfondie dans le contexte du NMIBC. - Both cervical and bladder cancer originates in mucosal sites and can slowly progress from superficial lesions (low to high-grade squamous intra-epithelial lesions (HSIL) and carcinoma in situ (CIS) in the cervix; or non-muscle invasive tumors in the bladder (NMIBC)), to more advanced invasive cancers. The etiology of these two cancers is however very different. Cervical cancer is the second most common cause of cancer death in women worldwide. This cancer results from the infection of the basal cells of the stratified epithelium of the cervix by high-risk human papillomavirus (HPV). The recent availability of prophylactic vaccines (Gardasil® and Cervarix®) against HPV is an effective strategy to prevent this cancer when administered to young girls before sexual activity; however, these vaccines do not induce regression of established lesions. Despite active development, therapeutic vaccines targeting viral oncogenes E6/E7 had limited clinical efficacy to date. We recently reported that subcutaneous (s.c.) immunization was able to regress small genital tumors in 90% of the mice, but only 20% of mice had regression of larger tumors. Here, we developed a new strategy where vaccination is combined with the local (intravaginal (IVAG)) application of TLR agonists. This new strategy induced an increase of both total and vaccine-specific CD8 T cells in cervix-vagina, but not CD4 T cells. The selective attraction of CD8 T cells is mediated by the expression of CCR5 and CXCR3 chemokine receptors and E-selectin ligands in these cells. Vaccination followed by IVAG application of CpG resulted in tumor regression of large established tumors in 75% of the mice. Bladder cancer is the second most common urological malignancy. Most tumors are diagnosed as NMIBC, and are restricted to the mucosal bladder with a high propensity to recur and/or progress after local resection. Aiming to develop vaccines against tumor associated antigens (TAA) it is necessary to investigate how to target vaccine-specific T-cell immune responses to the bladder. Here we thus compared using an adjuvanted HPV oncogene (E7) vaccine, as a model, different routes of immunization. Both s.c. and IVAG vaccination induced similar number of vaccine-specific CD8 T-cells in the bladder, whereas intranasal (i.n.) immunization was ineffective. S.c. and IVAG routes induced predominantly aL-, a4- and E-selectin ligand-expressing vaccine-specific CD8 T-cells suggesting that these integrin/selectin are responsible for T-cell homing to the bladder. A single E7 immunization conferred full tumor protection in a prophylactic setting, irrespective of the immunization route. In a therapeutic setting, only ivag and s.c. vaccination efficiently regressed established bladder-tumors in ca. 50 % of mice, whereas i.n. immunization had no effect. Tumor regression correlated with vaccine- specific CD8 T cell tumor-infiltration and decrease of regulatory T cells (Tregs). To increase efficacy of TAA immunization, we tested vaccination followed by the local instillation of TLR3 or TLR9 agonist or of a Salmonella Typhi vaccine (Ty21a). This strategy resulted in an increase of vaccine-specific effector CD8 T cells in the bladder, although at different magnitudes. Ty21a being the most efficient, it deserves further investigation in the context of NMIBC. We further tested another strategy to improve therapies of NMIBC. In the murine MB49 bladder tumor model, we replaced the intravesical (ives) BCG therapy by another vaccine strain the Salmonella Ty21a. Ives Ty21a induced bladder tumor regression at least as efficiently as BCG. Ty21a bacteria did not infect nor survive neither in healthy nor in tumor-bearing bladders, suggesting its safety. Moreover, Ty21a induced a transient inflammatory response in healthy bladders, mainly through infiltration of neutrophils and macrophages that rapidly returned to basal levels, confirming its potential safety. The tumor regression was associated to a robust infiltration of immune cells, and secretion of cytokines in urines. Infection of murine tumor cell lines by Ty21a resulted in cell apoptosis. The infection of both murine and human urothelial cell lines induced secretion of in vitro inflammatory cytokines. Ty21a may be an attractive alternative for the ives treatment of NMIBC after transurethral resection and thus deserves more investigation.

Good outcomes of Lyme arthritis in 24 patients in an endemic area of Switzerland

RESUME : But : Décrire l'évolution après traitement de l'arthrite de Lyme dans une zone d'endémie de l'Ouest de la Suisse, région où certains parmi les premiers cas d'arthrite de Lyme en dehors des Etats-Unis (USA) ont été rapportés. Patients et méthodes : Une évaluation rétrospective a été faite à partir d'un groupe de 24 patients (15 H, 9 F; âge moyen :38,7 ans) qui ont présenté une arthrite monoarticulaire (20 cas) ou oligoarticulaire (4 cas) causée par une infection à Borrelia burgdorferi (Bb). Ces patients ont été recrutés par l'intermédiaire de rhumatologues entre 1994 et 1999. Le genou était touché dans 85 % des cas. Une histoire de piqûre de tique était décrite dans 9 cas et un érythème chronique migrant dans 4 cas. Tous les patients avaient un titre d'anticorps pour Bb élevé, dosé par ELISA.Dans 20 cas, un immunoblot était positif pour Bb, la majorité étant positif pour les 3 sous-types de Bb présents en Suisse ; un seul cas était positif pour Bb sensu stricto. Neuf liquides synoviaux ont été examinés par PCR afin de détecter la présence de BbDNA (6 cas positifs). Résultats : Tous les patients ont reçu des antibiotiques soit oralement (10 cas), soit par voie parentérale (14 cas). Une deuxième cure d'antibiotiques a été administrée à 4 patients en raison de persistance de l'arthrite. On a observé une évolution rapidement favorable chez 13 patients et dans 9 cas, il a fallu, pour obtenir la guérison, réaliser une injection intraarticulaire de glucocorticoïdes ou une synoviorthèse. Après une période d'observation de 40 mois en moyenne (de 6 à 84 mois), aucun patient n'a présenté de signe d'arthrite chronique, mais 2 patients se plaignaient encore de myalgies ou d'arthralgies. Conclusion : Nous n'avons pas trouvé dans notre étude d'arthrite récidivante ou chronique après traitement comme on l'a décrit aux USA. Ceci est peut-être lié au fait que les types de Bb observés en Europe sont différents des USA où on trouve seulement Bb sensu stricto. ABSTRACT: Objective: To describe outcomes of treated Lyme arthritis in an endemic area of western Switzerland, where some of the first cases of Lyme disease outside the United States were reported. Patients and methods: We retrospectively studied 24 patients (15 males and nine females, mean age 38.7 years) managed by rheumatologists between 1994 and 1999 for Borrelia burgdotferi arthritis manifesting as monoarthritis (a = 20), oligoarthritis (a = 3), or polyarthritis (a = 1). The knee was affected in 20 (85%) patients. Nine patients reported a history of tick bite and four of erythema chronicum migrans. All the patients but one had a high titer of antibodies to B. burgdoiferi by ELISA and all but two had a positive immunoblot test (22 positive for all three types of B. burgdorferi found in Switzerland and one positive only for B. burgdoiferi sensu stricto). Joint fluid PCR for B. burgdorferi was done in nine patients and was positive in six. Results: All 24 patients received antibiotic therapy, orally (a= 10) or parenterally (n= 14). A second course of antibiotic therapy was used in four patients with persistent arthritis. A rapid response was noted in 13 patients. IntraarticUlar glucocorticoid therapy or a synoviorthesis was required in nine patients. After a mean follow-up of 40 months (range, 6-84 months), none of the patients had chronic arthritis but two reported persistent muscle or joint pain. Conclusion: Recurrent or chronic arthritis, which has been reported in treated patients in the United States, did not occur in our series. This may be ascribable to differences in B. burgdolferi subtypes, as in the United States only B. burgdoiferi sensu stricto is found.

Differential miRNA and IncRNA expression in embryonic stem cells lacking the Notch1 receptor

Embryonic stem (ES) cells-derived cardiomyocytes represent an attractive source of cells in cell replacement therapies for heart disease. However, controlled cardiogenic differentiation of ES cells requires a complete understanding of the complex molecular mechanisms regulating the differentiation process. We have previously shown that differentiation of ES cells into cardiomyocytes is favored by inactivation of the Notch 1 receptor pathway. In the present study, we therefore compared two ES cell lines, one with normal Notchl expression and one carrying deleted Notchl receptor alleles (Notchl-deleted ES cells) in order to identify genes responsible for the increased propensity of Notchl-deleted ES cells to produce cardiomyocytes. Using RNA-sequencing, we found approximately 300 coding and noncoding transcripts, which are differently expressed in undifferentiated Notchl-deleted ES cells. Since accumulating evidences indicate that long noncoding RNAs (IncRNAs) play important roles in ES cell pluripotency and differentiation, we focused our analysis on modulated IncRNAs. In particular, two IncRNAs, named here lnc 1230 and lnc 1335, are highly induced in the absence of Notchl receptor expression. These represent therefore prime candidates that could favor cardiogenic commitment in undifferentiated ES cells. Indeed, we demonstrate that forced expression of these two IncRNAs in wild-type ES cells result in a significant increase of the number of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in the differentiated progeny of these ES cells. Furthermore, we also identify several microRNAs that are differentially modulated in absence of Notchl expression. Among these are miR-142-5p and miR- 381-3p. Interestingly, both lncl230 and lncl335 are targets of these two microRNAs. Altogether, these data suggest that Notchl-dependent noncoding gene networks, implicating microRNAs and IncRNAs, control embryonic stem cell commitment into the mesodermal and cardiac lineages already at the undifferentiated state. - Les cardiomyocytes issus cellules souches embryonnaires sont une source très prometteuse pour les thérapies cellulaire de remplacement dans le cadre des maladies cardiaques. Cependant, l'utilisation de telles cellules requiert une compréhension poussée des mécanismes moléculaire régulant la différenciation. Nous avons par le passé démontré que la différenciation des cellules souches embryonnaires en cardiomyocytes est favorisée par l'inactivation de la voie d'activation intracellulaire dépendante du récepteur Notch 1. Nous avons donc comparé deux lignées de cellules souches embryonnaires, une présentant une voie d'activation Notchl normale et une chez laquelle les allèles codant pour le récepteur Notchl avaient été invalidés, de façon à identifier les gènes impliqués dans la capacité augmentée des cellules déficientes à produire des cardiomyocytes. En utilisant du séquençage d'ARN à haut débit, nous avons trouvé environ 300 gènes différemment exprimés dans les cellules déficientes pour Notchl. Par ailleurs, des évidences de plus en plus nombreuses suggèrent qu'une nouvelle classe de molécules appelée « long noncoding RNAs » joue un rôle prépondérant dans la maintenance de l'état non différencié et de la capacité de différenciation des cellules souches embryonnaires. Nous avons trouvé que plusieurs « long noncoding RNAs » étaient modulés en l'absence de Notchl, et en particulier deux molécules que nous avons appelées lncl230 et lncl335. Ces derniers représentent des candidats potentiels devant permettre de favoriser la production de cardiomyocytes. Nous avons en effet démontré que la surexpression de ces deux candidats dans des cellules souches embryonnaires résultait en une surproduction de cardiomyocytes. De plus, nous avons également identifié plusieurs microRNAs dont l'expression était modulée dans les cellules souches embryonnaires déficientes dans la voie Notchl. De façon intéressante, parmi ces microRNAs, le miR-142-5p et le miR-381-3p sont capables de cibler lncl230 and lncl335. Dans l'ensemble, ces résultats indiquent donc que des réseaux d'interaction dépendant de la voie d'activation Notch 1 et impliquant des ARNs non codant existent dans les cellules souches embryonnaires pour réguler leur différenciation en différent types cellulaires spécifiques.

EZ-IO intraosseous device implementation in a pre-hospital emergency service : a prospective study and review of the literature

Introduction : La prise en charge des patients critiques nécessite dans la majorité des situations l'obtention rapide d'un accès vasculaire, afin d'administrer des médicaments, des solutés de remplissage, ou des produits sanguins. La mise en place d'un accès vasculaire peut s'avérer difficile chez ces patients. En cas d'échec de pose d'une voie veineuse périphérique, des abords vasculaires alternatifs existent. Il s'agit essentiellement de la pose d'une voie veineuse centrale, la réalisation d'une dénudation veineuse, ou la pose d'une voie intra-osseuse. Depuis le développement de dispositifs d'insertion « semi-automatique » à la fin des années 90, la voie intra-osseuse, traditionnellement réservée aux cas pédiatriques, est de plus en plus fréquemment utilisée chez les patients adultes. Le Service des Urgences du CHUV a introduit en 2009 les dispositifs d'insertion d'aiguilles intra-osseuses de type EZ-IO® (perceuse électrique), en salle de réanimation des urgences vitales (déchoquage), ainsi qu'au sein du secteur préhospitalier pour les interventions du SMUR de Lausanne et de l'hélicoptère REGA de la base de Lausanne. Par cette étude, nous voulions mettre en évidence les aspects épidémiologiques des patients ayant dû être perfusés par cet abord dans un contexte préhospitalier, ainsi que les circonstances cliniques ayant justifié un tel usage, le taux de succès, les éventuelles complications, les médicaments perfusés et la mortalité des patients ayant bénéficié de ce dispositif. Méthode: Chaque patient ayant bénéficié de la mise en place d'une voie intra-osseuse par EZ-IO® du 1er janvier 2009 au 31 décembre 2011 a été inclus. Les données récoltées étaient l'âge, le sexe, l'indication à la mise en place de l'intra-osseuse, la localisation, le taux de succès, les médicaments et fluides administrés, les complications, la mortalité à 48 heures et à la sortie de l'hôpital. Tous les articles mentionnant l'utilisation de ΙΈΖ-ΙΟ® dans des situations cliniques ont également été analysés par une revue de littérature structurée exhaustive, afin de comparer nos résultats avec les données de la littérature. Résultats : Cinquante-huit patients, représentant 60 intra-osseuses EZ-IO®, ont été inclus. Leur âge moyen (47 ans), le taux de succès (90%), les indications, la localisation de l'aiguille (98% au niveau du tibia proximal) et le taux de complications (0%) correspondent aux valeurs trouvées dans la littérature. Le taux de survie de nos patients est de 38% à 48 heures et de 29% à la sortie de l'hôpital. De nombreux médicaments ou solutés de perfusion ont été administrés; l'adrénaline restant le médicament le plus fréquemment administré par cette voie. Dans 7 cas, les patients ont bénéficié d'une induction d'anesthésie par voie intra-osseuse. La revue de littérature a permis de compiler 30 études distinctes, représentant un total de 1603 accès vasculaires de type EZ-IO®. Conclusion : La voie intra-osseuse s'avère fiable et rapide pour obtenir un accès vasculaire, avec un taux de complications très faible et permet l'administration d'un grand nombre de substances. D'autres études sont nécessaires pour évaluer l'impact de la voie intra osseuse, notamment en termes de mortalité, de complications tardives, ainsi que d'analyse coût/bénéfice de ce matériel.