Modular construction for function of a ribonucleoprotein enzyme: the catalytic domain of Bacillus subtilis RNase P complexed with B.subtilis RNase P protein

The bacterial RNase P holoenzyme catalyzes the formation of the mature 5′-end of tRNAs and is composed of an RNA and a protein subunit. Among the two folding domains of the RNase P RNA, the catalytic domain (C-domain) contains the active site of this ribozyme. We investigated specific binding of the Bacillus subtilis C-domain with the B.subtilis RNase P protein and examined the catalytic activity of this C-domain–P protein complex. The C-domain forms a specific complex with the P protein with a binding constant of ∼0.1 µM. The C-domain–P protein complex and the holoenzyme are equally efficient in cleaving single-stranded RNA (∼0.9 min–1 at pH 7.8) and substrates with a hairpin–loop 3′ to the cleavage site (∼40 min–1). The holoenzyme reaction is much more efficient with a pre-tRNA substrate, binding at least 100-fold better and cleaving 10–500 times more efficiently. These results demonstrate that the RNase P holoenzyme is functionally constructed in three parts. The catalytic domain alone contains the active site, but has little specificity and affinity for most substrates. The specificity and affinity for the substrate is generated by either the specificity domain of RNase P RNA binding to a T stem–loop-like hairpin or RNase P protein binding to a single-stranded RNA. This modular construction may be exploited to obtain RNase P-based ribonucleoprotein complexes with altered substrate specificity.

The fifth epidermal growth factor-like domain of thrombomodulin does not have an epidermal growth factor-like disulfide bonding pattern.

The disulfide bonding pattern of the fourth and fifth epidermal growth factor (EGF)-like domains within the smallest active fragment of thrombomodulin have been determined. In previous work, this fragment was expressed and purified to homogeneity, and its cofactor activity, as measured by Kcat for thrombin activation of protein C, was the same as that for full-length thrombomodulin. CNBr cleavage at the single methionine in the connecting region between the domains and subsequent deglycosylation yielded the individual EGF-like domains. The disulfide bonds were mapped by partial reduction with tris(2-carboxyethyl)phosphine according to the method of Gray [Gray, W. R. (1993) Protein Sci. 2, 1732-1748], which provides unambiguous results. The disulfide bonding pattern of the fourth EGF-like domain was (1-3, 2-4, 5-6), which is the same as that found previously in EGF and in a synthetic version of the fourth EGF-like domain. Surprisingly, the disulfide bonding pattern of the fifth domain was (1-2, 3-4, 5-6), which is unlike that found in EGF or in any other EGF-like domain analyzed so far. This result is in line with an earlier observation that the (1-2, 3-4, 5-6) isomer bound to thrombin more tightly than the EGF-like (1-3, 2-4, 5-6) isomer. The observation that not all EGF-like domains have an EGF-like disulfide bonding pattern reveals an additional element of diversity in the structure of EGF-like domains.

Genetic construction and properties of a diphtheria toxin-related substance P fusion protein: in vitro destruction of cells bearing substance P receptors.

We have genetically replaced the native receptor binding domain of diphtheria toxin with an extended form of substance P (SP): SP-glycine (SP-Gly). The resulting fusion protein, DAB389SP-Gly, is composed of the catalytic and transmembrane domains of diphtheria toxin genetically coupled to SP-Gly. Because native SP requires a C-terminal amide moiety to bind with high affinity to the SP receptor, the precursor form of the fusion toxin, DAB389SP-Gly, was converted to DAB389SP by treatment with peptidylglycine-alpha-amidating monooxygenase. We demonstrate that following conversion, DAB389SP is selectively cytotoxic for cell lines that express either the rat or the human SP receptor. We also demonstrate that the cytotoxic action of DAB389SP is mediated via the SP receptor and dependent upon passage through an acidic compartment. To our knowledge, this is the first reported use of a neuropeptide as the targeting ligand for a fusion toxin; and the first instance in which an inactive precursor form of a fusion toxin is converted to the active form by a posttranslational modification.

Culture as shared cognitive representations.

Culture consists of shared cognitive representations in the minds of individuals. This paper investigates the extent to which English speakers share the "same" semantic structure of English kinship terms. The semantic structure is defined as the arrangement of the terms relative to each other as represented in a metric space in which items judged more similar are placed closer to each other than items judged as less similar. The cognitive representation of the semantic structure, residing in the mind of an individual, is measured by judged similarity tasks involving comparisons among terms. Using six independent measurements, from each of 122 individuals, correspondence analysis represents the data in a common multidimensional spatial representation. Judged by a variety of statistical procedures, the individuals in our sample share virtually identical cognitive representations of the semantic structure of kinship terms. This model of culture accounts for 70-90% of the total variability in these data. We argue that our findings on kinship should generalize to all semantic domains--e.g., animals, emotions, etc. The investigation of semantic domains is important because they may reside in localized functional units in the brain, because they relate to a variety of cognitive processes, and because they have the potential to provide methods for diagnosing individual breakdowns in the structure of cognitive representations typical of such ailments as Alzheimer disease.

A variant of lambda repressor with an altered pattern of cooperative binding to DNA sites.

The bacteriophage lambda repressor binds cooperatively to pairs of adjacent sites in the lambda chromosome, one repressor dimer binding to each site. The repressor's amino domain (that which mediates DNA binding) is connected to its carboxyl domain (that which mediates dimerization and the interaction between dimers) by a protease-sensitive linker region. We have generated a variant lambda repressor that lacks this linker region. We show that dimers of the variant protein are deficient in cooperative binding to sites at certain, but not all, distances. The linker region thus extends the range over which carboxyl domains of DNA-bound dimers can interact. In particular, the linker is required for cooperative binding to a pair of sites as found in the lambda chromosome, and thus is essential for the repressor's physiological function.

kappa-Opioid receptor in humans: cDNA and genomic cloning, chromosomal assignment, functional expression, pharmacology, and expression pattern in the central nervous system.

Using the mouse delta-opioid receptor cDNA as a probe, we have isolated genomic clones encoding the human mu- and kappa-opioid receptor genes. Their organization appears similar to that of the human delta receptor gene, with exon-intron boundaries located after putative transmembrane domains 1 and 4. The kappa gene was mapped at position q11-12 in human chromosome 8. A full-length cDNA encoding the human kappa-opioid receptor has been isolated. The cloned receptor expressed in COS cells presents a typical kappa 1 pharmacological profile and is negatively coupled to adenylate cyclase. The expression of kappa-opioid receptor mRNA in human brain, as estimated by reverse transcription-polymerase chain reaction, is consistent with the involvement of kappa-opioid receptors in pain perception, neuroendocrine physiology, affective behavior, and cognition. In situ hybridization studies performed on human fetal spinal cord demonstrate the presence of the transcript specifically in lamina II of the dorsal horn. Some divergences in structural, pharmacological, and anatomical properties are noted between the cloned human and rodent receptors.

Construction of a 2.8-megabase yeast artificial chromosome contig and cloning of the human methylthioadenosine phosphorylase gene from the tumor suppressor region on 9p21.

Many human malignant cells lack methylthioadenosine phosphorylase (MTAP) enzyme activity. The gene (MTAP) encoding this enzyme was previously mapped to the short arm of chromosome 9, band p21-22, a region that is frequently deleted in multiple tumor types. To clone candidate tumor suppressor genes from the deleted region on 9p21-22, we have constructed a long-range physical map of 2.8 megabases for 9p21 by using overlapping yeast artificial chromosome and cosmid clones. This map includes the type IIFN gene cluster, the recently identified candidate tumor suppressor genes CDKN2 (p16INK4A) and CDKN2B (p15INK4B), and several CpG islands. In addition, we have identified other transcription units within the yeast artificial chromosome contig. Sequence analysis of a 2.5-kb cDNA clone isolated from a CpG island that maps between the IFN genes and CDKN2 reveals a predicted open reading frame of 283 amino acids followed by 1302 nucleotides of 3' untranslated sequence. This gene is evolutionarily conserved and shows significant amino acid homologies to mouse and human purine nucleoside phosphorylases and to a hypothetical 25.8-kDa protein in the pet gene (coding for cytochrome bc1 complex) region of Rhodospirillum rubrum. The location, expression pattern, and nucleotide sequence of this gene suggest that it codes for the MTAP enzyme.

Processos e significados da experiência de pais, mães ou cuidador primário de crianças abusadas sexualmente

Introdução - O abuso sexual de crianças constitui um problema de saúde pública, com aproximadamente 73 milhões de casos de meninos e 150 milhões de meninas registrados anualmente no mundo. O abuso sexual gera consequências negativas e condutas de risco que contribuem com algumas das principais causas de morte, doença e deficiência nas vítimas do abuso. Pais ou cuidadores primários são fundamentais no processo de orientação e de cuidado das crianças abusadas, no sentido de prevenir as consequências cognitivas, comportamentais e emocionais evidenciadas no futuro dessas crianças. Entretanto, as habilidades das famílias de cuidadores para lidar com a problemática ainda são insuficientes. Objetivo - Descrever os processos e significados da experiência vivida pelos pais ou cuidadores primários de crianças abusadas sexualmente. Método - Os dados empíricos foram tratados utilizando-se o Discurso do Sujeito Coletivo (DSC), fundamentado na Teoria das Representações Sociais, que viabiliza a emergência das representações sociais por meio da construção dos discursos coletivos obtidos de depoimentos de um grupo específico. Foram avaliados 60 pais ou cuidadores primários não estupradores, que responderam à cinco situações-problema, cada uma com questões correspondentes, residentes nos municípios de Cajicá e Tabio de Bogotá, Colômbia. O processamento e a análise dos dados foram realizados no sofware Qualiquantisoft, associado à metodologia do DSC. Resultados - Na primeira situação-problema, que aborda o porquê do silêncio do filho sobre o abuso, os entrevistados enfatizaram que é fundamental o relacionamento pais e filhos (45,7 por cento , n = 43), bem como melhorar o papel de pais por meio da escuta, do diálogo e do confiar, dedicando mais tempo às crianças; também acham que o silêncio se deve ao medo por parte das crianças e a ameaças e intimidação por parte do abusador, Na situação-problema 2, relativa à identificação do abuso sexual como problema real, o significado atribuído configura cadeias que se repetem por transmissão intergeracional (26,9 por cento , n = 21). Na situação-problema 3, o que fazer no futuro, 53,3 por cento dos entrevistados (n = 32) acham que a criança está comprometida comportamentalmente e enfatizam a homossexualidade com perda da identidade como consequência da violência sexual. Na situação-problema 4, que enfatiza o papel da rede social quanto ao cuidado da criança, os entrevistados acreditam que a solução é dar proteção (29,1 por cento ; n = 32), com ações que visem a afastar a criança do ambiente agressor, dar orientação, apoio e segurança à criança e à família. A quinta situação-problema que diz respeito ao cuidado das crianças abusadas; 34,26 por cento dos entrevistados (n = 37) enfatizam o apoio e a ajuda com a interveniência da rede de apoio social e afetivo. Conclusão - Para os pais ou cuidadores primários de crianças abusadas sexualmente, os significados se expressam como afetivo, coragem, superação, não ter medo e saber reconhecer as falhas dos pais. Em função dos resultados, que identificam posturas tradicionais dos respondentes, recomenda-se programas inovadores com um alto componente educativo, onde se contextualize o abuso sexual por meio de situações reais em escolas, delegacias, nas famílias e na comunidade, com interveniência das redes de apoio social; enfatiza-se igualmente a necessidade de formação mais humanizada dos profissionais de apoio social.

Do psicólogo no programa de residência multiprofissional em saúde: posição-sujeito, análise de discurso e psicanálise lacaniana

A residência multiprofissional em saúde é uma modalidade de ensino de pós graduação lato sensu, voltada para a educação em serviço. Emerge no contexto brasileiro como uma proposta complementar a fim de se atingir as metas e os princípios preconizados pelo sistema único de saúde (SUS), principalmente quanto à integralidade. Além de trazer implicações e lançar desafios ao exercício profissional do psicólogo, inserindo-o no entrelaçamento de campos densos e complexos (saúde, educação e políticas públicas), a modalidade propõe que profissionais com formações diferentes atuem num mesmo campo, com discussões e intervenções conjuntas. A questão que move a pesquisa é a posição-sujeito no programa de residência multiprofissional face ao modelo de educação-saúde vinculado. Assevera-se que a posição-sujeito é objeto discursivo deslizante (de tessitura simbólica) que toma em consideração o sujeito constituído no claudicar da linguagem e interpelado pelo inconsciente e que se manifesta como efeito de significantes em direção ao grande Outro. Para tal, vale-se da interface dos aportes teóricos da análise de discurso pêchetiana e da psicanálise lacaniana. A análise de discurso sustenta o discurso como efeito de sentidos mediados pela ideologia e ocupa-se, especialmente, da incursão da alteridade do discurso-outro sobre o mesmo. A psicanálise lacaniana, por sua vez, reitera a primazia do inconsciente estruturado como linguagem diante de um eu imaginário e versa para o sujeito marcado como falta que, dividido, faz do discurso o estatuto do significado. Assim, é proeminente na análise do objeto a metodologia indiciária dada ao caráter simbólico e cambiante da posição-sujeito no discurso. A análise se realizou mediante o dispositivo da interpretação como gesto analítico, que acompanha as elações próprias do objeto. O corpora é constituído por uma materialidade escrita e por uma oral. A escrita compõe-se de recortes de leis, portarias e resoluções que fundam a modalidade de residência multiprofissional e reforçam os ideias do sistema único de saúde; a materialidade oral compõe-se de recortes e fragmentos discursivos advindos da transcrição de supervisões realizadas mediante a prática clínica do psicólogo-residente na cena hospitalar. Da análise, conclui-se que a materialidade escrita se posta como campo-Outro que ordena a estrutura política da residência multiprofissional e direciona a manutenção da ordem e reprodução das relações hierárquicas mediante ideologia assujeitante. Essa materialidade, por sua vez, age como intradiscurso e reverbera-se na memória discursiva e na prática clínica. A posição-sujeito, no plano da articulação significante, faz deslizar e produzir sentidos que denotam ora a manutenção e reprodução de uma posição fusionada ao discurso médico, científico-positivista; ora a posição-sujeito é marcada pelo saber condicionado ao fetiche da mercadoria, deflagrando a ordem do capital nas insígnias da multiprofissionalidade e da educação permanente. O trabalho propiciou, enfim, acompanhar as transmutações da posição-sujeito, independentemente do indivíduo ou da naturalização de sentidos provenientes da função que exerce. O objeto posição-sujeito reiterou a construção da realidade a partir da condição faltante. É essa condição faltante e incompleta que outorga ao desejo o modo de o sujeito se posicionar desta e outra maneira - na formação, no trabalho, na vida.

Sentidos de família construídos por profissionais de saúde na estratégia de saúde da família

Na construção de políticas sociais atribuiu-se um papel central à família na proteção social e no cuidado com os seus membros. Na saúde, a família assume essa centralidade na Estratégia de Saúde da Família (ESF), sendo compreendida como objeto da atenção em saúde. Essa centralidade se deu a partir de uma pretensão de mudança no modelo assistencial que visasse a integralidade do cuidado e um olhar para as condições de vida como fundamentais no processo saúde-doença. Tais transformações nos sentidos e práticas de saúde têm sido desafiadoras. A partir da perspectiva Construcionista Social, que orienta esse estudo, compreendemos que os sentidos são construídos nas interações entre as pessoas e que esses configuram práticas sociais. Diante deste quadro de desafios na ESF e a partir da perspectiva adotada, temos como objetivo compreender os sentidos produzidos por profissionais de equipes de saúde sobre famílias em contextos de reuniões de discussão de família/caso na ESF, buscando analisar como esses configuram a produção de práticas de cuidado e também como se dá a dinâmica de construção desses sentidos a partir das negociações entre os participantes. A constituição do corpus foi feita a partir da observação e registros em áudio de 16 reuniões de duas equipes de saúde da família, contando com 26 participantes, dentre eles profissionais e estagiários de diferentes especialidades. A análise foi feita a partir da perspectiva das práticas discursivas, com os seguintes passos: 1) transcrição do material; 2) leitura intensiva e organização do material; 3) construção de sentidos sobre a família, e análise dos repertórios interpretativos, discursos usados, e implicações para ação; e 4) narrativa ilustrativa da dinâmica dos sentidos. Os sentidos construídos na análise foram: a) Família como pessoas que moram juntas: os repertórios usados descreviam os modos de ser família a partir do ambiente em que ela vive, entendendo a família como informante e cuidadora dos seus membros; b) Família como responsável pelo cuidado: repertórios de família como aquela que dá suporte aos seus membros e é responsável por eles; e, por vezes, está sobrecarregada com esses cuidados; c) Família como problema: repertórios que configuravam a família como aquela que é responsável pelo problema de saúde dos seus membros, como aquela que funciona como um estressor para eles ou como aquela que está em situação de risco; e d) Família como rede de relações, sentido que foi usado, mais comumente, em conversas sobre casos complexos, com discussões voltadas para configurações, estruturas e dinâmicas familiares. A partir da análise do processo de discussão da equipe em torno de um \"caso\", foi possível ilustrar o dinamismo desses sentidos nas conversas e como esses são negociados a todo momento. A análise nos permite considerar que há esforços dos profissionais em voltar a atenção do cuidado para a família, porém ainda são comuns práticas centradas no indivíduo e pouco pautadas no contexto e nas condições de vida das famílias. Compreendemos que dar visibilidade a esses diferentes sentidos e seu uso permite reflexões sobre como cada forma de descrever as famílias possibilita a construção de práticas distintas, o que pode contribuir para uma maior reflexão dos profissionais de saúde sobre sua prática cotidiana (Apoio Capes e Fapesp- 2014/08618-6).

Interpretação das imunidades do art. 150, VI, da Constituição Federal

O presente trabalho examina a interpretação das imunidades tributárias previstas no art. 150, VI, da Constituição Federal brasileira de 1988. Em primeiro lugar, são examinadas as teorias sobre a interpretação jurídica e conclui-se que a interpretação deve ser entendida como a construção do sentido do texto. No entanto, tal interpretação está limitada ao sentido literal possível do texto e, ademais, deve ser devidamente fundamentada, através do discurso argumentativo, de modo que a decisão possa ser intersubjetivamente controlada. Conclui-se que, no ordenamento jurídico brasileiro, têm primazia os argumentos de natureza linguística e sistemática, visto que se referem diretamente à ordem jurídica vigente. E, dentre os argumentos sistemáticos, deve-se prestigiar aquele sentido que seja mais consentâneo com o princípio constitucional subjacente ao dispositivo a ser interpretado. As mesmas conclusões aplicam-se às normas de Direito Tributário, já que estão sujeitas aos mesmos métodos de interpretação aplicáveis às demais normas jurídicas. Contudo, deve ser ressaltado que as normas que estabelecem a incidência dos tributos, bem como os preceitos que fixam a competência, incluindo as imunidades, têm sua interpretação limitada ao sentido literal possível, sendo vedado o recurso à analogia. Diante disso, afirma-se que, na aplicação desses preceitos, devem ser considerados principalmente os argumentos linguísticos, que limitam a interpretação ao sentido possível do texto, e os argumentos sistemáticos, que estudam a relação das imunidades com as outras normas inseridas no ordenamento pátrio, especialmente os princípios constitucionais. Nesse estudo, deve ser examinada a função exercida pelas imunidades, que não apenas bloqueiam a instituição de tributos, como podem resguardar certas condutas e promover um estado de coisas desejado pelo Estado. Estabelecidas tais premissas, são examinadas as imunidades do art. 150, VI, da Constituição, tendo em vista as principais questões hoje debatidas pela doutrina e pela jurisprudência acerca desses preceitos.

The Impact of Prefrontal Cortex "Warm Up" on Immediate Cognitive Reappraisal Ability in Older Adolescents with Elevated Symptoms of Depression

Cognitive Reappraisal (CR) is a central component of Cognitive Behavioral Therapy for adolescent depression. Yet, previous research indicates that a brain region highly associated with successful CR in adults, the Prefrontal Cortex (PFC), is not fully developed until early adulthood. Thus, there is growing concern that CBT interventions directed at building CR abilities in depressed teens might be constrained by PFC immaturity. However, CR is an effective strategy for regulating affect. The current study evaluated an intervention aimed at enhancing CR performance through PFC “warm up” with a working memory task. Additionally, the study examined moderators of intervention response, as well as cognitive correlates of self-reported CR use. Participants included 48 older adolescents (mean age=19.1, 89% female) with elevated symptoms of depression who were randomly assigned to a lab-based WM or control activity followed by a CR task. Overall, results failed to support the effectiveness of “warm up” to augment CR performance. However, current level of depression predicted negative bias and sadness ratings after CR instructions, and this effect was qualified by an interaction with condition. The moderator analysis showed that depressive symptoms interacted with condition such that in the control condition, participants with higher depressive symptoms had significantly lower negative bias scores than individuals with lower depressive symptoms, but this pattern was not found in the experimental condition. Contrary to hypotheses, history of depression did not moderate treatment response. Additional analyses explored alternative explanations for the lack of intervention effects. There was some evidence to suggest that the WM task was frustrating and cognitively taxing. However, irritation scores and overall WM task accuracy did not predict subsequent CR performance. Lastly, multiple cognitive variables emerged as correlates of self-reported CR use, with cognitive flexibility contributing unique variance to self-reported CR use. Results pointed to new directions for improving CR performance among youth with elevated symptoms of depression.

COMPENDIUM: a text summarisation tool for generating summaries of multiple purposes, domains, and genres

In this paper, we present a Text Summarisation tool, compendium, capable of generating the most common types of summaries. Regarding the input, single- and multi-document summaries can be produced; as the output, the summaries can be extractive or abstractive-oriented; and finally, concerning their purpose, the summaries can be generic, query-focused, or sentiment-based. The proposed architecture for compendium is divided in various stages, making a distinction between core and additional stages. The former constitute the backbone of the tool and are common for the generation of any type of summary, whereas the latter are used for enhancing the capabilities of the tool. The main contributions of compendium with respect to the state-of-the-art summarisation systems are that (i) it specifically deals with the problem of redundancy, by means of textual entailment; (ii) it combines statistical and cognitive-based techniques for determining relevant content; and (iii) it proposes an abstractive-oriented approach for facing the challenge of abstractive summarisation. The evaluation performed in different domains and textual genres, comprising traditional texts, as well as texts extracted from the Web 2.0, shows that compendium is very competitive and appropriate to be used as a tool for generating summaries.

Construction of 17-19th century domes in the province of Alicante (Spain): the case of San Juan Bautista in Cox

From the late seventeenth to early nineteenth centuries, many religious temples have been built in the province of Alicante (south east of Spain) with brick domes as their main characteristic feature. Often, the limited data available about these remarkable constructions make rehabilitation interventions become into real research projects, with a high value for their historic conservation over time. The aim of this paper is to show a detailed refurbishment analysis of a religious temple built in 1778, showing the need of preservation of historic buildings as a part of the architectural heritage by establishing a common pattern of materials, geometry and constructive systems, specifically in their domes. In most cases, there was not an architectural project for the construction, that is why the analysis of any documentary and archival sources available is essential to find different ways to proceed on the use and maintenance of these religious buildings.