964 resultados para Mécanisme enzymatique
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La localisation des ARNm par transport dirig joue un rle dans le dveloppement, la motilit cellulaire, la plasticit synaptique et la division cellulaire asymtrique. Chez la levure Saccharomyces cerevisi, la localisation dARNm est un phnomne dont les mécanismes de rgulation sont conservs auprs de nombreux autres organismes. Lors de la division de la levure, plus dune trentaine de transcrits sont localiss par transport actif lextrmit du bourgeon de la cellule-fille. Parmi ceux-ci, lARNm ASH1 est le mieux caractris et constitue le modle utilis dans cette tude. Pour exercer sa fonction, la protine Ash1 doit tre produite uniquement aprs la localisation de lARNm ASH1. Pour ce faire, les mécanismes de rgulation de la traduction de lARNm ASH1 empchent son expression durant le transport. Ce projet de recherche vise tudier les mécanismes de rgulation de la traduction de lARNm ASH1 par les rpresseurs traductionnels connus, soit Khd1, Puf6 et Loc1. Les tudes antrieures se sont penches sur ces facteurs de manire individuelle. Cependant, dans cette tude, nous avons explor la prsence dune collaboration entre ceux-ci. Ainsi, nous avons voulu dterminer si les rpresseurs traductionnels peuvent tre intgrs en une seule voie de rgulation de la traduction de lARNm ASH1. De plus, nous avons cherch identifier le mécanisme de recrutement des rpresseurs traductionnels sur lARNm ASH1, qui correspond au point initial des voies de rgulations de lARNm ASH1. Nos rsultats montrent que les rpresseurs traductionnels de lARNm ASH1, soit Khd1 et Puf6, font partie dune mme voie de rgulation de la traduction. Le rle du facteur nuclaire Loc1 dans la voie de rgulation de la traduction, quant elle, a t examine partir dexpriences permettant ltude du mécanisme de recrutement des rpresseurs traductionnels dans le noyau. Ainsi, nos travaux montrent que Puf6 et Loc1 sont associs de manire ARN-dpendant avec la machinerie de transcription, notamment au facteur dlongation de la transcription Spt4-Spt5/DSIF. Par ailleurs, notre laboratoire a prcdemment montr que la localisation nuclaire de la protine de liaison lARN She2 est essentielle au recrutement des facteurs Loc1 et Puf6 sur lARNm ASH1. Des expriences dimmunoprcipitation de la chromatine (ChIP) supportent lhypothse que le recrutement de Loc1 est essentiel celui de Puf6, qui seffectue ultrieurement. Ainsi, partir des rsultats de cette tude et des rsultats publis prcdemment dans notre laboratoire, nous avons labor un modle de recrutement coordonn des facteurs She2, Loc1 et Puf6 sur lARNm ASH1 naissant. De manire gnrale, cette tude a permis dtablir la prsence dune seule voie de rgulation de la traduction de lARNm ASH1 et une meilleure connaissance du recrutement des facteurs de rpression traductionnelle sur celui-ci.
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Le rgulateur transcriptionnel BAP1 est une dubiquitinase nuclaire (DUB) dont le substrat est lhistone H2A modifie par monoubiquitination au niveau des residus lysines 118 et 119 (K118/K119). Depuis les dernires annes, BAP1 emerge comme un gene suppresseur de tumeur majeur. En effet, BAP1 est inactiv dans un plethore de maladies humaines hrditaires et sporadiques. Cependant, malgr laccumulation significative des connaissances concernant loccurrence, la pntrance et limpact des dfauts de BAP1 sur le dveloppement de cancers, ses mécanismes daction et de rgulation restent trs peu compris. Cette tude est ddie la caractrisation molculaire et fonctionnelle du complexe multi-protique de BAP1 et se prsente parmi les premiers travaux dcrivant sa rgulation par des modifications post-traductionnelles. Dabord, nous avons dfini la composition du corps du complexe BAP1 ainsi que ses principaux partenaires dinteraction. Ensuite, nous nous sommes spcifiquement intresss a investiguer davantage deux principaux aspects de la rgulation de BAP1. Nous avons dabord dcrit linter-rgulation entre deux composantes majeures du complexe BAP1, soit HCF-1 et OGT. Dune manire trs intressante, nous avons trouv que le cofacteur HCF-1 est un important rgulateur des niveaux protiques dOGT. En retour, OGT est requise pour la maturation protolytique de HCF-1 en promouvant sa protolyse par O-GlcNAcylation, un processus de rgulation trs important pour le bon fonctionnement de HCF-1. Dautre part, nous avons dcouvert un mécanisme unique de rgulation de BAP1 mdie par lubiquitine ligase atypique UBE2O. en effet, UBE2O se caractrise par le fait quil sagit aussi bien dune ubiquitine conjuratrice et dune ubiquitine ligase. UBE2O, multi-monoubiquitine BAP1 au niveau de son domaine NLS et promeut son exclusion du noyau, le squestrant ainsi dans le cytoplasme. De faon importante, nos travaux ont permis de mettre de lemphase sur le rle de lactivit auto-catalytique de chacune de ces enzymes, soit lactivit dauto-dubiquitination de BAP1 qui est requise pour la maintenance de sa localisation nuclaire ainsi que lactivit dauto-ubiquitination dUBE2O implique dans son transport nuclo-cytoplasmique. De manire significative, nous avons trouv que des dfauts au niveau de lauto-dubiquitination de BAP1 due des mutations associes certains cancers indiquent limportance dune propre regulation de cette dubiquitinase pour les processus associs la suppression de tumeurs.
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Lauto-incompatibilit (AI) est une barrire reproductive przygotique qui permet aux pistils dune fleur de rejeter leur propre pollen. Les systmes dAI peuvent prvenir lautofertilisation et ainsi limiter linbreeding. Dans lAI gamtophytique, le gnotype du pollen dtermine son propre phnotype dincompatibilit, et dans ce systme, les dterminants mles et femelles de lAI sont cods par un locus multignique et multi-alllique dsign le locus S. Chez les Solanaceae, le dterminant femelle de lAI est une glycoprotine stylaire extracellulaire fortement polymorphique possdant une activit ribonuclase et dsigne S-RNase. Les S-RNases montrent un patron caractristique de deux rgions hypervariables (HVa et HVb), responsables de leur dtermination alllique, et cinq rgions hautement conserves (C1 C5) impliques dans lactivit catalytique ou la stabilisation structurelle de ces protines. Dans ce travail, nous avons investigu plusieurs caractristiques des S-RNases et identifi un nouveau ligand potentiel aux S-RNases chez Solanum chacoense. Lobjectif de notre premire tude tait llucidation du rle de la rgion C4 des S-RNases. Afin de tester lhypothse selon laquelle la rgion C4 serait implique dans le repliement ou la stabilit des S-RNases, nous avons gnr un mutant dans lequel les quatre rsidus chargs prsents en rgion C4 furent remplacs par des rsidus glycine. Cette protine mutante ne saccumulant pas des niveaux dtectables, la rgion C4 semble bien avoir un rle structurel. Afin de vrifier si C4 est implique dans une liaison avec une autre protine, nous avons gnr le mutant R115G, dans lequel un acide amin charg ft limin afin de rduire les affinits de liaison dans cette rgion. Ce mutant naffectant pas le phnotype de rejet pollinique, il est peu probable que la rgion C4 soit implique dans la liaison des S-RNases avec un ligand ou leur pntration lintrieur des tubes polliniques. Enfin, le mutant K113R, dans lequel le seul rsidu lysine conserv parmi toutes les S-RNases ft remplac par un rsidu arginine, ft gnr afin de vrifier si cette lysine tait un site potentiel dubiquitination des S-RNases. Toutefois, la dgradation des S-RNases ne ft pas inhibe. Ces rsultats indiquent que C4 joue probablement un rle structurel de stabilisation des S-RNases. Dans une seconde tude, nous avons analys le rle de la glycosylation des S-RNases, dont un site, en rgion C2, est conserv parmi toutes les S-RNases. Afin dvaluer la possibilit que les sucres conjugus constituent une cible potentielle dubiquitination, nous avons gnr une S11-RNase dont lunique site de glycosylation en C2 ft limin. Ce mutant se comporte de manire semblable une S11-RNase de type sauvage, dmontrant que labsence de glycosylation ne confre pas un phnotype de rejet constitutif du pollen. Afin de dterminer si lintroduction dun sucre dans la rgion HVa de la S11-RNase pourrait affecter le rejet pollinique, nous avons gnr un second mutant comportant un site additionnel de glycosylation dans la rgion HVa et une troisime construction qui comporte elle aussi ce nouveau site mais dont le site en rgion C2 ft limin. Le mutant comportant deux sites de glycosylation se comporte de manire semblable une S11-RNase de type sauvage mais, de manire surprenante, le mutant uniquement glycosyl en rgion HVa peut aussi rejeter le pollen dhaplotype S13. Nous proposons que la forme non glycosyle de ce mutant constitue un allle double spcificit, semblable un autre allle double spcificit pralablement dcrit. Il est intressant de noter que puisque ce phnotype nest pas observ dans le mutant comportant deux sites de glycosylation, cela suggre que les S-RNases ne sont pas dglycosyles lintrieur du pollen. Dans la dernire tude, nous avons ralis plusieurs expriences dinteractions protine-protine afin didentifier de potentiels interactants polliniques avec les S-RNases. Nous avons dmontr que eEF1A, un composant de la machinerie de traduction chez les eucaryotes, peut lier une S11-RNase immobilise sur rsine concanavaline A. Des analyses de type pull-down utilisant la protine eEF1A de S. chacoense tiquete avec GST confirment cette interaction. Nous avons aussi montr que la liaison, pralablement constate, entre eEF1A et lactine est stimule en prsence de la S11-RNase, bien que cette dernire ne puisse directement lier lactine. Enfin, nous avons constat que dans les tubes polliniques incompatibles, lactine adopte une structure agrge qui co-localise avec les S-RNases. Ces rsultats suggrent que la liaison entre eEF1A et les S-RNases pourrait constituer un potentiel lien fonctionnel entre les S-RNases et laltration du cytosquelette dactine observe lors des ractions dAI. Par ailleurs, si cette liaison est en mesure de titrer les S-RNases disponibles lintrieur du tube pollinique, ce mécanisme pourrait expliquer pourquoi des quantits minimales ou seuils de S-RNases sont ncessaires au dclenchement des ractions dAI.
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Cette thse relie trois articles sur l'conomie politique. Ces articles analysent la fois thoriquement et empiriquement si, et dans quelle mesure, trois phnomnes politiques diffrents (les partis politiques, les guerres civiles et les menaces externes), et leur interaction, influent sur les rsultats conomiques. Le premier chapitre tudie l'impact de la prsence au pouvoir des politiciens de nouveaux partis politiques sur la taille du gouvernement. Le chapitre se concentre sur les municipalits colombiennes, o les nouveaux partis politiques ont t nombreux et fructueux au cours des dernires annes. Les estimations par rgressions sur discontinuit montrent que les dpenses publiques et les recettes fiscales sont significativement plus leves dans les municipalits gouvernes par un maire d'un nouveau parti politique. En utilisant des informations sur la politique locale et des caractristiques des nouveaux partis, je soutiens que ce rsultat peut tre expliqu par le fait qu'il y a moins d'information sur les politiciens de nouveaux partis que les politiciens des partis traditionnels. Le deuxime chapitre dveloppe une nouvelle explication de l'impact des guerres civiles et des conflits intertatiques sur le state-building qui repose sur l'ide que les protagonistes de ces deux types de conflits peuvent avoir un lien (ethnique ou idologique). Un premier rsultat montre que la force de ce lien dtermine si les conflits contre des adversaires internes (i.e. guerres civiles) ou des ennemis externes (i.e. conflits intertatiques) sont complmentaires ou se substituent, conduisant plus ou moins d'investissement en capacit fiscale. La thorie prdit galement un rle non trivial de la stabilit politique dans la relation entre les deux types de conflits et la capacit fiscale: un deuxime rsultat montre que, bien que la stabilit politique se traduit par moins de capacit fiscale, plus de stabilit n'implique pas plus de state-building. Leur quivalence dpend du niveau de cohsion des institutions. Un nouveau mécanisme par lequel plus de stabilit politique peut impliquer moins de state-building est propos. En outre, il est dmontr que des corrlations dans les donnes cross-country sont compatibles avec la thorie. Le troisime chapitre examine la relation entre la probabilit d'occurrence d'un conflit intrieur violent et le risque qu'un tel conflit "s'externalise" (c'est dire se propage dans un autre pays en devenant un conflit intertatique). Je considre une situation dans laquelle un conflit interne entre un gouvernement et un groupe rebelle peut s'externaliser. Je montre que le risque d'externalisation augmente la probabilit d'un accord de paix, mais seulement si le gouvernement est suffisamment puissant par rapport aux rebelles, et si le risque d'externalisation est suffisamment lev. Je montre comment ce modle aide comprendre les rcents pourparlers de paix entre le gouvernement colombien et le groupe le plus puissant des rebelles dans le pays, les FARC.
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Le fer est un oligo-lment ncessaire pour le fonctionnement normal de toutes les cellules de l'organisme et joue un rle essentiel dans de nombreuses fonctions biologiques. Cependant, le niveau de fer dans le corps doit tre bien rgl, sinon la carence en fer entraine des divers tats pathologiques tels que l'anmie et la diminution de limmunit. D'autre part, une surcharge en fer potentialise la multiplication des germes, aggrave linfection et la formation de radicaux libres ayant des effets toxiques sur les cellules et leurs composants, ce qui favorise les maladies cardio-vasculaires, l'inflammation et le cancer. L'hepcidine (HAMP), un rgulateur ngatif de l'absorption du fer, induit la dgradation de la ferroportine (FPN), le seul exportateur connu de fer ce qui rduit sa libration par les macrophages et inhibe son absorption gastro-intestinale. HAMP est synthtis principalement par les hpatocytes, mais aussi par les macrophages. Cependant, il y a trs peu de donnes sur la faon dont HAMP est rgul au niveau des macrophages. Plus rcemment, nous avons constat que linduction de lhepcidin dans le foie par le polysaccharide (LPS) est dpendante de la voie de signalisation mdie par Toll-like receptor 4 (TLR4). Grce au TLR4, le LPS induit l'activation des macrophages qui scrtent de nombreuses diffrentes cytokines inflammatoires, y compris Interleukine 6 (IL-6), responsable de l'expression de HAMP hpatique. Dans le premier chapitre de la prsente tude, nous avons tudi la rgulation de HAMP dans la ligne cellulaire macrophagique RAW264.7 et dans les macrophages pritonaux murins stimuls par diffrents ligands des TLRs. Nous avons constat que TLR2 et TLR4 par l'intermdiaire de la protine adaptatrice myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) activent l'expression de HAMP dans les cellules RAW264.7 et les macrophages pritonaux sauvages murins, tandis que cette expression a t supprime dans les macrophages isols des souris TLR2-/-, TLR4-dficiente ou MyD88-/-. En outre, nous avons constat que la production d'IL-6 par les cellules RAW264.7 stimules avec du LPS a t renforce par lajout des quantits leves de fer dans le milieu de culture. Au cours de linflammation, le niveau de HAMP est fortement augment. Ainsi, lorsque l'inflammation persiste, lexpression de HAMP continue tre active par des cytokines pro-inflammatoires conduisant une hyposidrmie. Malgr que cette dernire soit considre comme une dfense de l'hte pour priver les micro-organismes de fer, celle ci cause un dveloppement d'anmies nommes anmies des maladies chroniques. Ainsi, dans le deuxime chapitre de la prsente tude, nous avons tudi l'implication des TLRs et leurs protines adaptatrices MyD88 et TIR-domain-containing adapter-inducing interferon- (TRIF) dans le dveloppement des hyposidrmies. En utilisant des souris dficientes en MyD88 et TRIF, nous avons montr que les voies de signalisations MyD88 et TRIF sont essentielles pour linduction de HAMP par le LPS. Malgr l'absence de HAMP, les souris dficientes ont t capables de dvelopper une hyposidrmie, mais la rponse des souris dficientes en MyD88 a t trs lgre, ce qui indique l'exigence de cette protine pour assurer une rponse maximale au LPS. En outre, nous avons constat que la signalisation MyD88 est ncessaire pour le stockage du fer au niveau de la rate, ainsi que l'induction de lipocaline 2 (LCN2), qui est une protine implique dans la fixation du fer pour limiter la croissance bactrienne. Indpendamment de MyD88 ou TRIF, l'activation de TLR4 et TLR3 a conduit, au niveau de la rate, une diminution rapide de lexpression de FPN et du Human hemochromatosis protein (HFE) qui est une protine qui limite la squestration du fer cellulaire partir de la circulation. Cependant, malgr cette baisse dexpression, le manque de la signalisation MyD88 a altr de manire significative la rponse hyposidrmique. En tablissant le rle des TLRs et de la protine adaptatrice MyD88 dans la diminution du taux du fer srique au cours de la rponse inflammatoire, nous avons remarqu quen rponse au surcharge en fer les souris dficientes en MyD88 accumulent de manire significative plus de fer hpatique par rapport aux souris sauvages, et cela indpendamment des TLRs. Ainsi, dans le troisime chapitre de la prsente tude, nous avons tudi le phnotype observ chez les souris dficientes en MyD88. Nous avons trouv que l'expression de HAMP chez ces souris a t plus faible que celle des souris de type sauvage. Pour cela, nous avons explor la signalisation travers la voie du Bone Morphogenetic Proteins 6 (BMP6) qui est considre comme tant la voie fondamentale de la rgulation de HAMP en rponse aux concentrations du fer intracellulaires et extracellulaires et nous avons trouv que l'expression protique de Smad4, un rgulateur positif de l'expression de HAMP, est significativement plus faible chez les souris MyD88-/- par rapport aux souris sauvages. En outre, on a montr que MyD88 interagit avec mothers against decapentaplegic, Drosophila, homolog 4 (Smad4) et que cette interaction est essentielle pour linduction de HAMP travers la voie BMP6. En conclusion, notre tude montre que l'expression de HAMP dans les macrophages est rgule principalement par TLR2 et TLR4 travers la voie MyD88 et que l'accumulation du fer dans les macrophages peut affecter les niveaux des cytokines pro-inflammatoires. En outre, nos analyses dmontrent que le dveloppement dhyposidrmie en rponse au LPS se produit par l'intermdiaire dun mécanisme dpendant de MyD88 qui est dissocie de la production de cytokines et de HAMP. En plus, nos recherches montrent que MyD88 est ncessaire pour l'expression de Smad4 et cela pour garantir une rponse optimale travers la signalisation BMP6, conduisant ainsi une expression adquate de HAMP. Enfin, la protine MyD88 joue un rle crucial dans, la rgulation de HAMP au niveau des macrophages, la diminution du taux du fer srique en rponse au LPS et le maintien de l'homostasie du fer.
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Introduction: Au Canada, le cancer de la prostate est le cancer le plus frquemment diagnostiqu chez les hommes et le plus mortel aprs les cancers du poumon et du clon. Il y a place optimiser le traitement du cancer de la prostate de manire mettre en uvre une mdecine personnalise qui sadapte aux caractristiques de la maladie de chaque patient de faon individuelle. Dans ce mmoire, nous avons valu la rponse aux dommages de lADN (RDA) comme biomarqueur potentiel du cancer de la prostate. Les lsions potentiellement oncognes de l'ADN dclenche une cascade de signalisation favorisant la rparation de l'ADN et lactivation des points de contrle du cycle cellulaire pour prserver lintgrit du gnome. La RDA est un mécanisme central de suppression tumorale chez lhomme. La RDA joue un rle important dans larrt de la prolifration des cellules dont les gnomes sont compromis, et donc, prvient la progression du cancer en agissant comme une barrire. Cette rponse cellulaire dtermine galement comment les cellules normales et cancreuses ragissent aux agents utiliss pour endommager l'ADN lors du traitement du cancer comme la radiothrapie ou la chimiothrapie, en plus la prsence d,un certain niveau de RDA dans les cellules du cancer de la prostate peuvent galement influer sur l'issue de ces traitements. Lactivation des signaux de la RDA peut agir comme un frein au cancer dans plusieurs lsions pr-noplasiques de l'homme, y compris le cancer de la prostate. Il a t dmontr que la RDA est augmente dans les cellules de noplasie intra- pithliale (PIN) comparativement aux cellules prostatiques normales. Toutefois, le devient de la RDA entre le PIN et ladnocarcinome est encore mal document et aucune corrlation n'a t ralise avec les donnes cliniques des patients. Notre hypothse est que les niveaux dactivation de la RDA seront variables selon les diffrents grades et agressivit du cancer de la prostate. Ces niveaux pourront tre corrls et possiblement prdire les rponses cliniques aux traitements des patients et aider dfinir une stratgie plus efficace et de nouveaux biomarqueurs pour prdire les rsultats du traitement et personnaliser les traitements en consquence. Nos objectifs sont de caractriser l'activation de la RDA dans le carcinome de la prostate et corrler ses donnes avec les rsultats cliniques. Mthodes : Nous avons utilis des micro-talages de tissus (tissue microarrays- TMAs) de 300 patients ayant subi une prostatectomie radicale pour un cancer de la prostate et dtermin le niveau dexpression de protines de RDA dans le compartiment stromal et pithlial des tissus normaux et cancreux. Les niveaux dexpression de 53BP1, p-H2AX, p65 et p-CHK2 ont t quantifis par immunofluorescence (IF) et par un logiciel automatis. Ces marqueurs de RDA ont dabord t valids sur des TMAs-cellule constitus de cellules de fibroblastes normales ou irradies (pour induire une activation du RDA). Les donnes ont t quantifies l'aide de couches binaires couramment utilises pour classer les pixels d'une image pour que lanalyse se fasse de manire indpendante permettant la dtection de plusieurs rgions morphologiques tels que le noyau, l'pithlium et le stroma. Des oprations arithmtiques ont ensuite t ralises pour obtenir des valeurs correspondant l'activation de la RDA qui ont ensuite t corrles la rcidive biochimique et l'apparition de mtastases osseuses. Rsultats : De faibles niveaux d'expression de la protine p65 dans le compartiment nuclaire pithlial du tissu normal de la prostate sont associs un faible risque de rcidive biochimique. Par ailleurs, nous avons aussi observ que de faibles niveaux d'expression de la protine 53BP1 dans le compartiment nuclaire pithliale du tissu prostatique normal et cancreux ont t associs une plus faible incidence de mtastases osseuses. Conclusion: Ces rsultats confirment que p65 a une valeur pronostique chez les patients prsentant un adnocarcinome de la prostate. Ces rsultats suggrent galement que le marqueur 53BP1 peut aussi avoir une valeur pronostique chez les patients avec le cancer de la prostate. La validation d'autres marqueurs de RDA pourront galement tre corrls aux rsultats cliniques. De plus, avec un suivi des patients plus long, il se peut que ces rsultats se traduisent par une corrlation avec la survie. Les niveaux d'activit de la RDA pourront ventuellement tre utiliss en clinique dans le cadre du profil du patient comme le sont actuellement lantigne prostatique spcifique (APS) ou le Gleason afin de personnaliser le traitement.
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Les protines amylodes sont retrouves sous forme de fibres dans de nombreuses maladies neurodgnratives. En tentant dlucider le mécanisme de fibrillation, les chercheurs ont dcouvert que cette raction se fait par un phnomne de nuclation passant par des oligomres. Il semblerait que ces espces soient la principale cause de la toxicit observe dans les cellules des patients atteints damylodose. Cest pourquoi un intrt particulier est donc port aux premires tapes doligomrisation. Dans ce mmoire, nous nous intressons une squence dacide amin fortement hydrophobe de l-synucline appele composante non -amylode (Non-Amyloid Component ou NAC). Cette dernire est retrouve sous forme de fibres dans les corps et les neurites de Lewy des patients atteints de la maladie de Parkinson. De plus, elle constitue une composante minoritaire des fibres impliques dans la maladie dAlzheimer. Nous avons observ les changements structuraux qui ont lieu pour le monomre, le dimre et le trimre de la squence NAC de l-synucline. Nous nous sommes aussi intresss aux consquences structurelles observes dans des oligomres htrognes qui impliqueraient, A140. Pour cela nous utilisons des dynamiques molculaires, dchange de rpliques couples au potentiel gros-grain, OPEP. Nous constatons une disparition des hlices au profit des feuillets , ainsi que le polymorphisme caractristique des fibres amylodes. Certaines rgions se sont dmarques par leurs capacits former des feuillets . La disparition de ces rgions lorsque NAC est combine A laisse entrevoir limportance de lemplacement des rsidus hydrophobes dans des structures susceptibles de former des fibres amylodes.
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Le Costimulateur Inductible (ICOS) est un rcepteur exprim la surface des cellules T CD4 auxiliaires et T CD8 cytotoxiques. Il fut dmontr laide de modles murins de transplantation de moelle osseuse que ICOS joue un rle important dans linduction de la maladie du greffon contre lhte aigue (GVHD). ICOS potentialise deux signaux mdis par le rcepteur de cellules T (TCR) : lactivation de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K) ainsi que la mobilisation interne de calcium. En conditions in vitro, dans les cellules CD4 et CD8, ICOS russi potentialiser le flux de calcium mdi par le TCR indpendamment de PI3K. La voie de signalisation de ICOS implique dans la GVHD demeure inconnue. Cependant, en utilisant une ligne de souris knock-in nomme ICOS-Y181F, dans laquelle le cellules T ont slectivement perdu la capacit dactiver PI3K par lentremise dICOS, nous avons dmontr que les cellules T peuvent utiliser un mécanisme ICOS indpendant de PI3K afin dinduire la GVHD. La mobilisation interne du Ca2+ mne lactivation de NFAT, un facteur de transcription cl rgulant des gnes comme IFN-, qui exprime une des cytokines cls impliques dans la GVHD. Nous mettons comme hypothse que la capacit pathognique intacte des cellules T ICOSY181F induire la GVHD, repose sur la signalisation du Ca2+ indpendante de PI3K. Le but de mon projet est didentifier les rsidus responsables de cette signalisation de Ca2+ mdie par ICOS ainsi que le mécanisme par lequel ce rcepteur fonctionne. laide de la mutagnse dirige, jai gnr des mutants dICOS et jai analys par cytomtrie en flux leur capacit activer le flux de Ca2+. Jai ainsi identifi un groupe de lysine sur la queue cytoplasmique dICOS situ proximit de la membrane comme tant essentiel la fonction de potentialisation du flux de Ca2+. Je fournis galement des preuves de limplication de la kinase Lck, membre de la famille de kinases Src, dans la voie de signalisation de ICOS mdiant la potentialisation du flux de Ca2+. Ainsi, ICOS sassocie Lck et mne une augmentation de lactivation de PLC1, la protine effectrice cl causant la sortie de Ca2+ de la rserve intracellulaire. En conclusion, notre tude permet de comprendre davantage une des voies de signalisation dICOS. Linflux de Ca2+ dans les cellules T implique la voie ICOS-Lck-PLC1. Une comprhension plus approfondie de cette voie de signalisation pourrait savrer bnfique afin dlaborer de nouvelles stratgies menant la prvention de maladies relies ICOS, comme la GVHD.
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Le prsent mmoire dcrit le dveloppement dune mthode de synthse des hlicnes catalyse par la lumire visible. Les conditions pour la formation de [5]hlicne ont t tablies par une optimisation du photocatalyseur, du solvant, du systme doxydation et du temps ractionnel. Suite aux tudes mcanistiques prliminaires, un mécanisme oxydatif est propos. Les conditions optimises ont t appliques la synthse de [6]hlicnes pour laquelle la rgioslectivit a t amliore en ajoutant des substituants sur la colonne hlicale. La synthse de thiohlicnes a aussi t teste en utilisant les mmes conditions sous irradiation par la lumire visible. La mthode a t inefficace pour la formation de benzodithiophnes et de naphtothiophnes, par contre elle permet la formation du phenanthro[3,4-b]thiophne avec un rendement acceptable. En prolongeant la surface- de la colonne hlicale, le pyrne a t fusionn aux motifs de [4]- et [5]hlicne. Trois drivs de pyrne-hlicne ont t synthtiss en utilisant les conditions optimises pour la photocyclisation et leurs caractristiques physiques ont t tudies. La mthode de cyclisation sous laction de la lumire visible a aussi t tudie en flux continu. Une optimisation du montage exprimental ainsi que de la source lumineuse a t effectue et les meilleures conditions ont t appliques la formation de [5]hlicne et des trois drivs du pyrne-hlicne. Une amlioration ou conservation des rendements a t observe pour la plupart des produits forms en flux continu comparativement la synthse en batch. La concentration de la raction a aussi t conserve et le temps ractionnel a t rduit par un facteur de dix toujours en comparaison avec la synthse en batch.
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Ce travail examine les mécanismes de limmunit inne impliqus dans lhpatite aigu virale du modle murin dinfection par le virus de lhpatite virale murine de type 3 (MHV-3). Afin de dterminer le rle du TLR2 dans laggravation de lhpatite, des infections avec le virus MHV-3 ont t ralises in vivo chez des souris C57BL/6 et des souris dficientes pour le gne tlr2 et in vitro dans des macrophages et des hpatocytes infects avec le virus MHV-3 et le virus moins virulent MHV-A59. Les niveaux de transcription et de traduction des senseurs microbiens, des interfrons (IFN) de type I, des cytokines et/ou des chimiokines ont t valus par qRT-PCR et ELISA. Les cellules ont t traites avec des petits ARNs interfrants (siRNAs) pour le TLR2 et le CEACAM1a ou mises en prsence dinhibiteurs des voies dendocytose. Les rsultats rvlent le rle stimulateur du TLR2 pour la rplication virale, la production de cytokines pro-inflammatoires IL-6 et TNF- et des chimiokines CXCL1, CXCL10 et CCL2. Un nouveau mécanisme dchappement aux senseurs viraux dpendant du TLR2 a galement t mis en vidence dans les macrophages et les hpatocytes lors de linfection de ces cellules avec le virus MHV-3, et non pas avec le virus moins virulent MHV-A59. Ces diffrents travaux rvlent un nouveau rle du TLR2 lors dinfections virales dans l'aggravation de la rponse inflammatoire tout en protgeant le virus des autres senseurs de la rponse immune inne.
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Viral protein U (Vpu) is an accessory protein of HIV1 that efficiently targets BST2/Tetherin, a cellular restriction factor that acts as molecular anchor impeding the release of various enveloped viruses from the cell surface. The recently discovered natural receptor of BST2 is ILT7, a molecule exclusively expressed at the surface of the professional type 1 interferon (IFN1) producing cells, plasmacytoid dendritic cells (pDCs). The interaction between BST2 and ILT7 has been reported to efficiently induce a repression of IFN1 secretion by pDCs. Here, we investigated the impact of Vpu mediated antagonism of BST2, in regards to this newly described immune function of BST2. Using a system of CD4+ T cell lines infected with wild type or Vpudeficient HIV-1 cultured with peripheral blood mononuclear cells or purified pDCs, we report that the presence of Vpu efficiently reduces IFN-1 production from sensing pDCs. Furthermore, we observed that this Vpu effect is dependent on the availability of BST2 molecules at the surface of the infected cells, since the Vpu's immunoregulation is abrogated when blocking any potential BST2 trans interaction with antiBST2 antibodies. Similarly, depleting ILT7 from pDCs by means of small interfering RNA treatment equally negates the downregulation of pDC IFN-1 secretion by Vpu. Finally, the use of recombinant soluble ILT7 competes with pDCbound ILT7 for the free BST2 and similarly results in high IFN-1 production, causing an identical phenotype. Overall, our results demonstrate that Vpu heightens ILT7 activation and subsequent repression of IFN1 production by pDCs in response to HIV1 infected CD4+ T cells by promoting it's trans interaction with infected T cell bound BST2, through a yet uncharacterized mechanism. By allowing efficient particle release and restraining pDCs antiviral functions, Vpu exerts a double role on BST2 that seems crucial for the replication and dissemination of HIV1.
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La slection frquence-dpendante est un mécanisme dvolution selon lequel laptitude d'un type varie en fonction de sa frquence dans la population. Ce mécanisme joue un rle important dans de nombreuses interactions autant interspcifiques (parasitisme, prdation, comptition), qu'intra-spcifiques entre les diffrents phnotypes d'une mme espce. La slection frquence-dpendante peut tre positive ou ngative et favoriser alors les phnotypes communs ou rares, respectivement. Elle a t mise en vidence dans le contexte du choix de partenaire chez plusieurs espces, notamment chez certaines espces d'insectes (ex.: demoiselles, drosophiles, cantharide de Pennsylvanie) et de poissons (ex.: guppys, xiphos), mais elle a t aussi rcemment dcouverte chez lhumain. L'importance de la slection frquence-dpendante dans le choix de partenaire chez les espces monogames reste tout de mme peu explore et cette tude vise combler cette lacune en utilisant le diamant mandarin, un passereau monogame, comme modle biologique. Nous avons tudi l'importance de ce mécanisme lorsqu'un trait est neutre et lorsque celui-ci constitue un indicateur de qualit. De plus, nous avons tent de dterminer si la prsence de rivales peut modifier la prfrence initiale des femelles pour les phnotypes rares ou communs.
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Escherichia coli produit diverses entrotoxines thermolabiles et thermostables. STb est une toxine de faible poids molculaire rsistant la chaleur charge de la diarrhe chez les animaux de la ferme. Une tude antrieure a montr que les cellules ayant internalis la toxine STb provoquent un dysfonctionnement de la barrire pithliale par des changements dans les protines des jonctions serres (TJ). Ces modifications contribuent probablement la diarrhe observe. Pour mieux comprendre le mécanisme de l'augmentation de la permabilit intestinale, nous avons trait les cellules du clon humain (T84) avec la toxine purifie STb une fois que les cellules ont t rcoltes et les protines extraites. Aprs l'utilisation d'une solution contenant 1% de Nonidet P-40 (un dtergent non dnaturant, non ionique), nous avons tudi la distribution de la claudine -1, une protine majeure des TJs, responsable de l'impermabilit de l'pithlium, entre la membrane (NP40-insoluble) et le cytoplasme (NP40-soluble). En utilisant limmunoblot et la microscopie confocale, nous avons observ que le traitement des monocouches de cellules T84 avec STb induit la redistribution de la claudine-1. Aprs 24h, les cellules cultives en milieu faible en Ca+ (5 uM) et traites par STb, ont montr quenviron 40 % de plus de la claudine-1 se sont dloges dans le cytoplasme par comparaison au contrle. En passant dun milieu faible un milieu contenant des quantits physiologiques de Ca++ (1,8 mM) nous avons observ une augmentation du taux de claudine- 1 dlog, comme la dlocalisation comparable et ce, aprs 6h. Un milieu supplment avec la mme concentration de Mg++ ou Zn++ n'a pas affect le taux de dlogement compar au milieu contenant une faible teneur en Ca++. En utilisant des anticorps anti-phosphosrine et anti-phosphothronine, nous avons observ que la perte des claudines-1 de la membrane a t accompagne par une dphosphorylation de cette protine des TJs. Dans l'ensemble, nos rsultats ont montr une importante redistribution de la claudine-1 dans les cellules traites par la toxine STb. La perte de la claudine-1 phosphoryle de la membrane est susceptible d'tre implique dans la permabilit accrue observe. Les mécanismes par lesquels ces changements sont provoqus restent lucider.
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Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de mortalit dans les pays industrialiss. L'hypercholestrolmie constitue un facteur de risque majeur pour les MCV. Elle est caractrise par des niveaux levs de lipoprotines de faible densit (LDL, aussi appel mauvais cholestrol). La prsence prolonge de haut niveaux de LDL dans la circulation augmente le risque de formation de plaques athrosclrotiques, ce qui peut conduire l'obstruction des artres et l'infarctus du myocarde. Le LDL est normalement extrait du sang par sa liaison au rcepteur du LDL (LDLR) qui est responsable de son endocytose dans les hpatocytes. Des tudes gntiques humaines ont identifi PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) comme le troisime locus responsable de l'hypercholestrolmie autosomique dominante aprs le LDLR et son ligand lapolipoprotine B-100. PCSK9 interagit avec le LDLR et induit sa dgradation, augmentant ainsi les niveaux plasmatiques de LDL. Les mutations gain de fonction (GF) de PCSK9 sont associes des niveaux plasmatiques levs de LDL et l'apparition prcoce des MCV, alors que les mutations perte de fonction (PF) de PCSK9 diminuent le risque de MCV jusqu ~ 88% grce une rduction du LDL circulant. De ce fait, PCSK9 constitue une cible pharmacologique importante pour rduire le risque de MCV. PCSK9 lie le LDLR la surface cellulaire et/ou dans l'appareil de Golgi des hpatocytes et provoque sa dgradation dans les lysosomes par un mécanisme encore mal compris. Le but de cette tude est de dterminer pourquoi certaines mutations humaines de PCSK9 sont incapables de dgrader le LDLR tandis que d'autres augmentent sa dgradation dans les lysosomes. Plusieurs mutations GF et PF de PCSK9 ont t fusionnes la protine fluorecente mCherry dans le but d'tudier leur mobilit molculaire dans les cellules hpatiques vivantes. Nos analyses quantitatives de recouvrement de fluorescence aprs photoblanchiment (FRAP) ont montr que les mutations GF (S127R et D129G) avaient une mobilit protique plus leve (> 35% par rapport au WT) dans le rseau trans- Golgien. En outre, nos analyses quantitatives de recouvrement de fluorescence inverse aprs photoblanchiment (iFRAP) ont montr que les mutations PF de PCSK9 (R46L) avaient une mobilit protique plus lente (<22% par rapport au WT) et une fraction mobile beaucoup plus petite (<40% par rapport au WT). Par ailleurs, nos analyses de microscopie confocale et lectronique dmontrent pour la toute premire fois que PCSK9 est localise et concentre dans le TGN des hpatocytes humains via son domaine Cterminal (CHRD) qui est essentiel la dgradation du LDLR. De plus, nos analyses sur des cellules vivantes dmontrent pour la premire fois que le CHRD n'est pas ncessaire l'internalisation de PCSK9. Ces rsultats apportent de nouveaux lments importants sur le mécanisme d'action de PCSK9 et pourront contribuer ultimement au dveloppement d'inhibiteurs de la dgradation du LDLR induite par PCSK9.
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L'longation cellulaire de cellules cultivant bout comme hyphae fongueux, inculquez hairs, des tubes de pollen et des neurones, est limit au bout de la cellule, qui permet ces cellules d'envahir l'encerclement substrate et atteindre une cible. Les cellules cultivant bout d'quipement sont entoures par le mur polysaccharide rigide qui rgule la croissance et l'longation de ces cellules, un mécanisme qui est radicalement diffrent des cellules non-walled. La comprhension du rglement du mur de cellule les proprits mcaniques dans le contrle de la croissance et du fonctionnement cellulaire du tube de pollen, une cellule rapidement grandissante d'quipement, est le but de ce projet. Le tube de pollen porte des spermatozodes du grain de pollen l'ovule pour la fertilisation et sur sa voie du stigmate vers l'ovaire le tube de pollen envahit physiquement le stylar le tissu mettant de la fleur. Pour atteindre sa cible il doit aussi changer sa direction de croissance les temps multiples. Pour valuer la conduite de tubes de pollen grandissants, un dans le systme exprimental vitro bas sur la technologie de laboratoire-sur-fragment (LOC) et MEMS (les systmes micro-lectromcaniques) ont t conus. En utilisant ces artifices nous avons mesur une varit de proprits physiques caractrisant le tube de pollen de Camlia, comme la croissance la croissance acclre, envahissante et dilatant la force. Dans une des organisations exprimentales les tubes ont t exposs aux ouvertures en forme de fente faites de l'lastique PDMS (polydimethylsiloxane) la matire nous permettant de mesurer la force qu'un tube de pollen exerce pour dilater la croissance substrate. Cette capacit d'invasion est essentielle pour les tubes de pollen de leur permettre d'entrer dans les espaces intercellulaires troits dans les tissus pistillar. Dans d'autres essais nous avons utilis l'organisation microfluidic pour valuer si les tubes de pollen peuvent s'allonger dans l'air et s'ils ont une mmoire directionnelle. Une des applications auxquelles le laboratoire s'intresse est l'enqute de processus intracellulaires comme le mouvement d'organelles fluorescemment tiquet ou les macromolcules pendant que les tubes de pollen grandissent dans les artifices LOC. Pour prouver que les artifices sont compatibles avec la microscopie optique haute rsolution et la microscopie de fluorescence, j'ai utilis le colorant de styryl FM1-43 pour tiqueter le systme endomembrane de tubes de pollen de cognassier du Japon de Camlia. L'observation du cne de vsicule, une agrgation d'endocytic et les vsicules exocytic dans le cytoplasme apical du bout de tube de pollen, n'a pas pos de problmes des tubes de pollen trouvs dans le LOC. Pourtant, le colorant particulier en question a adhr au sidewalls du LOC microfluidic le rseau, en faisant l'observation de tubes de pollen prs du difficile sidewalls cause du signal extrmement fluorescent du mur. Cette proprit du colorant pourrait tre utile de reflter la gomtrie de rseau en faisant marcher dans le mode de fluorescence.
