Population genetics of C. Maenas : oceanography and larval dispersal

Decifrar a complexa interacção entre os ciclos de vida de espécies marinhas e a oceanografia revela-se fundamental para a compreensão do fluxo genético e da conectividade no meio marinho. Nas espécies marinhas com desenvolvimento indirecto o fluxo de genes entre populações depende da distância que separa as populações, bem como da interacção entre a duração do desenvolvimento larvar, do comportamento das larvas e dos padrões de circulação oceânica. A conectividade larvar influencia uma variedade de processos como a dinâmica de stocks e de populações, a distribuição e limites geográficos das espécies, a estrutura genética das populações e a dispersão de espécies invasivas e reveste-se consequentemente de uma importância fundamental na identificação das unidades populacionais evolucionariamente relevantes e para a gestão e conservação marinhas. Os marcadores genéticos e os Modelos Individuais Acoplados a Modelos Físico-Biológicos (“ICPBMs”) são actualmente ferramentas fundamentais para o estudo dos padrões de dispersão larvar e para avaliar o nível de conectividade populacional. A presente tese respeita à avaliação das escalas espaciais de conectividade de populações de uma espécie costeira, o caranguejo Carcinus maenas, e utiliza conjuntamente informação de marcadores genéticos, análise de séries temporais de fornecimento de larvas e um modelo numérico de circulação oceânica. O primeiro capítulo introduz a temática da conectividade em espécies marinhas e inclui algumas referências aos métodos moleculares, analíticos e de modelação seguidos ao longo da tese. Através da utilização de múltiplas ferramentas – avaliação da estrutura genética geográfica de C. maenas na sua distribuição nativa com recurso a marcadores de DNA (microssatélites) (Capítulo 2), avaliação da estrutura genética temporal das larvas que formam os eventos de fornecimento larvar à Ria de Aveiro, NW Portugal (Capítulo 3), descrição da variabilidade inter-anual do fornecimento larvar à Ria de Aveiro, NW Portugal (Capítulo 4) e validação de um modelo ICPBM que descreve os padrões observados de fornecimento (Capítulo 5) – esta tese espera poder contribuir para uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam o fluxo de genes e a conectividade entre populações de organismos marinhos. No Capítulo 6 são apresentadas as principais conclusões da investigação. A análise genética com recurso a microssatélites indicou que as populações de C. maenas são geneticamente homogéneas ao longo de várias centenas de km, dentro da distribuição nativa da espécie. Paralelamente, não foram encontrados indícios da existência de reprodução por “sweepstakes” em C. maenas de populações da costa oeste da Península Ibérica, visto que não se obtiveram diferenças genéticas significativas entre os eventos larvares. Também não se encontrou qualquer estrutura familiar entre as larvas que formam cada episódio de fornecimento, e não houve nenhuma redução significativa da variabilidade genética das larvas quando comparada com a de caranguejos adultos. A análise de séries temporais de suprimento de larvas na Ria de Aveiro em cinco anos estudados indica que este é um fenómeno episódico e variável, sendo os maiores episódios de fornecimento coincidentes com as marés vivas e acentuados por fortes ventos de sul. O modelo ICPBM foi validado com sucesso e parece fornecer uma estimativa realística das escalas espaciais e temporais de dispersão larvar, de acordo com as observações da estrutura genética e da ausência de reprodução por “sweepstake” em C. maenas da costa oeste da Península Ibérica

ISCR and their association with antibiotic resistance genes

A prevalência de bactérias resistentes a antibióticos em ambiente hospitalar tem vindo a tornar-se dramática e preocupante a nível mundial. Contudo, com a utilização inadequada de antibióticos em áreas tão diversas como a veterinária, a aquacultura e a agricultura, esta deixou de estar confinada ao ambiente hospitalar, sendo o ambiente um reservatório natural de microganismos resistentes a estes compostos. O conhecimento detalhado dos determinantes de resistência a antibióticos presentes nestes ambientes, sejam estes genes de resistência ou estruturas envolvidas na sua mobilização, é fundamental, não só do ponto de vista do conhecimento como para a eventual implementação de medidas de contenção da sua disseminação. Neste contexto, são necessários estudos que permitam conhecer o panorama mais realista da distribuição destes determinantes de resistência a antibióticos, quer no meio ambiente quer no ambiente clínico. Assim, constituiu objectivo principal deste trabalho contribuir para o conhecimento do panorama actual da prevalência e distribuição dos elementos ISCR, bem como de outros determinantes de resistência a antibióticos em espécies de Gram-negativo clinicamente relevantes (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii e Citrobacter freundii) recolhidas a partir de amostras de pacientes do Hospital Infante D. Pedro, EPE, Aveiro, Portugal, entre 2006 e 2008. Adicionalmente, foram também recolhidas bactérias de Gram-negativo do meio ambiente, a partir de amostras de águas e de vísceras de peixes, nas quais foram igualmente pesquisados os elementos acima referidos. À excepção dos isolados de E. coli e de Gramnegativo ambientais, todas as estirpes estudadas foram seleccionadas com base no seu perfil de multirresistência a antibióticos. Os resultados mostraram que em todas as espécies recolhidas no ambiente hospitalar foi detectada a presença de elementos ISCR, do tipo ISCR1 ou ISCR2. O elemento ISCR1, foi encontrado em isolados de E. coli, K. pneumoniae e C. freundii e o elemento ISCR2 em isolados de A. baumannii. Não foi detectada a presença de ISCRs nos isolados de Gram-negativo ambientais, o que sugere que a ocorrência dos mesmos é fortemente influenciada pela pressão selectiva exercida pelo ambiente em que os microrganismos se encontram. Genes qnr e integrões de classe 1 foram os determinantes de resistência mais frequentemente encontrados associados aos elementos ISCR1. Os vários determinantes de resistência foram encontrados em diferentes contextos genéticos e localizados em estruturas móveis, nomeadamente em plasmídeos. O elemento ISCR2 presente em isolados de A. baumannii encontra-se associado ao gene sul2 em todos os isolados, dentro de um mesmo contexto genético e com uma localização cromossomal. Contudo, o contexto genético encontrado nestes isolados é novo não tendo sido descrito até à data em outros microrganismos. O presente estudo constitui a primeira descrição de elementos ISCR intrinsecamente ligados a genes de resistência a antibióticos, em Portugal. Uma vez que estes elementos parecem ser responsáveis pela mobilização de um grande número de genes de resistência a antibióticos, a sua elevada incidência entre estirpes resistentes e multirresistentes, bem como a sua associação com genes de resistência é preocupante e requer vigilância.

Tracing coastal organic enrichment: stable isotopes and biotic indices

Neste trabalho foi efectuada uma avaliação integrada usando descritores sedimentares e biológicos ao nível da espécie e da comunidade e índices bióticos de síntese para o traçamento do enriquecimento orgânico numa região, com características dispersivas, da costa Oeste de Portugal. Na área estudada existem gradientes ambientais e biológicos relacionados com a heterogeneidade da paisagem sedimentar, a qual inclui sedimentos desde areias finas limpas a vasas. Contudo, na área próxima do emissário, esta paisagem é mais homogénea e constituída por areia fina com baixo teor em finos. Nesta região, alguns dos descritores estudados deram uma indicação coerente de alterações ambientais associadas ao enriquecimento orgânico. O potencial de oxidação - redução mostrou valores negativos até 250 m do emissário, o que indicia que a degradação da matéria orgânica que entra no sistema cria condições reduzidas no sedimento. Os isótopos estáveis de carbono e azoto no sedimento diferenciam a área mais próxima do emissário, que apresenta uma depleção de acordo com uma origem terrestre da matéria orgânica naquela parte da plataforma. Uma imagem similar foi obtida pela análise dos isótopos estáveis na macrofauna que diagnosticou a origem terrestre da matéria orgânica consumida. A composição específica e a abundância das comunidades bentónicas também são significativamente diferentes junto ao emissário, onde são dominadas por espécies oportunistas, tolerantes ao enriquecimento orgânico. No entanto, os índices bióticos em validação no âmbito da implementação da Directiva Quadro da Água, não foram eficientes a mostrar as alterações bentónicas associadas ao enriquecimento orgânico apesar de alguns índices se basearem nos limiares de tolerância/sensibilidade a este tipo de perturbação. Apesar deste caso de estudo reflectir um enriquecimento orgânico moderado, uma vez que não foram detectadas alterações sedimentares ou acumulação de matéria orgânica, nem um significativo empobrecimento das comunidades biológicas junto ao emissário, a análise ao nível dos índices bióticos de síntese pode levar à perda de informação essencial e, portanto, prejudicar a nossa capacidade de diagnóstico devendo ser usados com cuidado. A análise do conjunto de dados da composição específica forneceu uma imagem mais precisa da perturbação ambiental e descritores específicos, tais como os isótopos estáveis, permitiram uma melhor compreensão da extensão espacial do enriquecimento orgânico.

Diversity of Aeromonas species from different environments in Portugal

Espécies de Aeromonas encontram-se distribuídas por diferentes habitats, estando especialmente relacionadas com ambientes aquáticos. O seu papel em complicações na saúde humana e animal é reconhecido. De facto, não só pelo seu potencial de virulência, mas também pelos determinantes genéticos de resistência a antibióticos que possam conter, estes organismos constituem uma preocupação na medicina humana e veterinária. Assim, é essencial o estudo da diversidade de espécies de Aeromonas bem como explorar as suas características fenotípicas e genéticas que podem conduzir a impactos negativos. A água constitui um importante veículo de transmissão de microrganismos e espécies de Aeromonas estão amplamente distribuídas em águas tratadas e não tratadas. Em Portugal é ainda comum o consumo de águas não tratadas cuja qualidade, na maioria das vezes, não é sujeita a monitorização, como acontece por exemplo, em explorações agrícolas de gestão familiar. Neste estudo, investigou-se a presença de Aeromonas em águas não tratadas para consumo. Estabeleceu-se também uma linha horizontal de colheitas de diferentes amostras de origem agrícola com o intuito de avaliar a possibilidade de a água ser uma das vias de contaminação de culturas agrícolas e animais por espécies de Aeromonas. Obtiveram-se 483 isolados que foram discriminados por RAPD-PCR. 169 estirpes distintas foram identificadas ao nível da espécie por análise filogenética baseada no gene gyrB. Verificou-se uma frequente ocorrência bem como uma diversidade considerável de espécies de Aeromonas. Em alguns casos, as relações genotípicas entre isolados de diferentes amostras eram muito próximas. Adicionalmente, a maioria das amostras continha diferentes espécies e estirpes distintas da mesma espécie. A. media e A. hydrophila foram as espécies mais ocorrentes. Um grupo de isolados apresentou variantes moleculares de gyrB diferente das conhecidas até agora, o que indica que poderão constituir espécies não descritas. O perfil de susceptibilidade da colecção de Aeromonas a diferentes antibióticos foi estabelecido, constituindo um perfil típico do género, com algumas excepções. Estirpes multirresistentes foram encontradas. A presença de genes tet e bla foi investigada por estudos de PCR, hibridação e, em alguns casos, de sequenciação. Como era esperado, cphA/imiS foi o mais detectado. A detecção de integrões fez-se por PCR e hibridação e a sua caracterização foi feita por sequenciação de DNA; a sua ocorrência foi reduzida. A maioria das estirpes sintetizou enzimas extracelulares com actividade lipolítica e proteolítica que potencialmente contribuem para virulência. A análise por PCR e hibridação permitiram a detecção de vários determinantes genéticos que codificam moléculas possivelmente envolvidas em processos patogénicos. Diversas espécies de Aeromonas apresentando características relacionadas com resistência a antibióticos e potencialmente de virulência estão frequentemente presentes em produtos para consumo humano e animal em Portugal. ABSTRACT: Aeromonas spp. are present in a wide range of ecological niches, being mainly related to aquatic environments. Their role in human and animal health complications is recognised. In fact, not only for their putative virulence but also for the antibiotic resistance genetic determinants Aeromonas may harbour, these organisms constitute an issue of concern in human and veterinary medicine. Thus, it is essential to get knowledge on Aeromonas sp. diversity and on their genotypic and phenotypic characteristics that may lead to negative impacts. Water constitutes a good contamination route for microorganisms and Aeromonas are widespread in untreated and treated waters from different sources. In Portugal there is still an extensive use of untreated water which is not regularly monitored for quality. This is often the case in family smallholding farms. In this study untreated drinking and mineral waters were assessed for their content in Aeromonas spp. Furthermore, a sampling scheme was designed to investigate the occurrence and diversity of Aeromonas sp. in different agricultural correlated sources and to assess the possibility of water being the transmission vehicle between those sources. 483 isolates were obtained and discriminated by RAPD-PCR. Identification at the species level for 169 distinct strains was done by gyrB based phylogenetic analysis. Results demonstrated the frequent occurrence and considerable diversity of Aeromonas spp. In some cases, genotypic close relations were found between isolates from different sources. Also, most samples contained different species and distinct strains of the same species. A. media and A. hydrophila were the most occurring. A group of isolates displayed gyrB gene sequences distinct from the previously known, indicating that they may constitute representatives of non-described species. The antibiotic susceptibility profile of the aeromonads collection was established and constituted a typical profile of the genus, although few exceptions. Multiresistance patterns were found. The presence of tet and bla genes was investigated by PCR, hybridisation and, in some cases, sequencing analysis. As expected, cphA/imiS was the most detected. Integrons were screened by PCR and hybridisation and characterised by DNA sequencing; low occurrence was recorded. The bulk of strains was able to produce extracellular enzymes with lipolytic and proteolytic activities, which may contribute to virulence. PCR and hybridisation surveys allowed the detection of distinct genetic determinants coding for molecules putatively involved in pathogenic processes. Diverse Aeromonas sp. presenting distinct antibiotic resistance features and putative virulence traits are frequently present in many sources for human and animal consumption in Portugal.

Influence of speciation in the bioavailability of cadmium to an isopod

Devido às actividades antropogénicas várias substâncias químicas têm sido introduzidas no meio ambiente em concentrações que de outro modo não ocorreriam de forma tão elevada naturalmente. Assim, o conhecimento acerca das características de um químico, tais como, o potencial para se acumular em diferentes níveis tróficos, a sua mobilidade dentro do ecossistema, a toxicidade específica e a bioacumulação, é fundamental para compreender os seus efeitos nos ecossistemas. Esta tese investiga a influência de especiação, na biodisponibilidade do cádmio (Cd) para o isópode Porcellio dilatatus, incluindo os efeitos de especiação do metal: (i) na assimilação do Cd, (ii) no modo como o Cd se distribui internamente no organismo, e (iii) como a sobrevivência e a reprodução são afectadas em isópodes terrestres. Num primeiro ensaio laboratorial avaliou-se a importância da transferência trófica na assimilação do Cd em P. dilatatus. Para tal analisou-se a eficiência de assimilação (EA) do Cd em isópodes, adicionado superficialmente ao alimento (alface) na forma de Cd(NO3)2 e contaminando o meio de crescimento da alface. A hipótese era de que a alface contaminada biologicamente através do cultivo em meio hidropónico contaminado teria uma maior proporção de complexos com proteína ou conjugado na forma de Cd (ex. Cd cisteína). A EA de Cd foi maior entre os isópodes que foram alimentados com o sal (71%, SE = 7%), do que entre os isópodes que se alimentaram de alface contaminada biologicamente (52%, SE = 5%), demonstrando-se assim num teste laboratorial que é provável que a especiação do Cd influencie a taxa de assimilação e acumulação do Cd. Na experiência alimentar que se seguiu, estudou-se em detalhe a especiação do metal comparando as EA do Cd conjugado com cisteína (Cd(Cys)2) e na forma de Cd(NO3)2, com os quais se contaminou gelatina com alface. A utilização de Cd-cisteína, proporcionou uma forma experimental para explorar a biodisponibilidade do Cd complexado dentro do tecido biológico. Como esperado, a EA de Cd em isópodes alimentados com nitrato de Cd (64%, SE = 5%) foi maior do que no caso de isópodes alimentados com o conjugado de cisteína (20%, SE = 3%). De seguida estudou-se a distribuição subcelular das espécies de Cd assimilado através de um processo de fraccionamento. Supunha-se que as diferenças de especiação de Cd reflectiria diferentes estratégias de compartimentalização, com consequências ao nível da detoxificação, armazenamento celular e distribuição subcelular do metal. O “sequestro” na forma de metal biologicamente detoxificado (BDM = proteínas estáveis ao calor - HSP e grânulos ricos em metal - RMG) foi maior nos isópodes alimentados com Cd(NO3)2, sugerindo que são mais eficientes na detoxificação de Cd (22%) do que quando alimentados com Cd(Cys)2 (15%). Foi também demonstrado que os isópodes alimentados com Cd(Cys)2 possuíam níveis de armazenamento de Cd superior nas fracções sensíveis ao metal (MSF = organelos e proteínas desnaturadas pelo calor - HDP) consideradas fracções potencialmente vulneráveis e afectando os isópodes em termos de toxicidade. As diferentes distribuições internas que se seguiram à assimilação e detoxificação das diferentes espécies de Cd foram finalmente avaliadas em termos da sobrevivência e reprodução dos isópodes. O tratamento com Cd(Cys)2 teve maior mortalidade, provavelmente devido à maior disponibilidade de Cd ingerido com implicações ao nível dos processos fisiológicos. Os isópodes alimentados com Cd(NO3)2 armazenaram o Cd nos MRG, como estratégia de detoxificação, sendo mais eficientes a detoxificar o Cd ainda que aumentando a concentração total do metal que se tornou menos tóxico para o isópode. Desta forma, o Cd nos grânulos não estava disponível para os processos fisiológicos e deixou de ser tóxico. Isso poderia estar relacionado com a resistência e tolerância aos metais devido à capacidade dos isópodes compartimentalizarem o Cd no hepatopâncreas, que actua como um mecanismo de detoxificação e contribui para a tolerância a altos níveis de cádmio. Em termos de parâmetros reprodutivos, observou-se uma redução de gestações e duração da gestação na presença de ambas as espécies de metal, mas no caso do Cd(Cys)2 as gravidezes não se concluíram. O número de jovens produzido por fêmeas alimentadas com Cd(NO3)2 foi menor do que no controlo, mas os pesos dos juvenis foram superiores. Finalmente sugere-se assim que esta abordagem seja considerada em estudos do movimento trófico de metais nas cadeias alimentares dado que se espera que a especiação de metais implique diferentes fluxos, dentro de uma dada cadeia trófica.

Levels and biological effects of selected EDC's in the portuguese coast

Os compostos orgânicos de estanho (OTs), de entre os quais se destaca o tributilestanho (TBT), encontram-se amplamente dispersos no meio aquático devido à sua intensa utilização como agente biocida em tintas antivegetativas. Estudos anteriores sobre a poluição por organoestanhos em Portugal demonstraram que estes compostos se encontram presentes não só na linha de costa mas também em zonas da plataforma, sendo as zonas portuárias (onde se incluem portos comerciais, portos de pesca, marinas e estaleiros navais) os principais focos de poluição. A presente tese tem como objectivo investigar o estado actual da poluição por organoestanhos na costa Portuguesa confirmando se os padrões espaciais acima descritos se mantêm, por meio da quantificação de diversos OTs, nomeadamente, butilestanhos, fenilestanhos e octilestanhos. Assim, os níveis destes compostos foram avaliados em populações de Mytilus galloprovincialis e Nassarius reticulatus ao longo da costa continental Portuguesa, com particular incidência na Ria de Aveiro onde se quantificaram os níveis de OTs em mexilhões, gastrópodes e sedimentos, recolhidos numa malha de amostragem mais densa. A distribuição espacial dos organoestanhos foi determinada utilizando o bivalve M. galloprovincialis como espécie bioindicadora. Os níveis totais de estanho (SnT) foram quantificados nos tecidos do mexilhão e relacionados com os níveis totais de OTs nos mesmos tecidos, incluindo monobutilestanho (MBT), dibutilestanho (DBT), tributilestanho (TBT), difenilestanho (DPhT), trifenilestanho (TPhT), monoctilestanho (MOcT) e dioctilestanho (DOct). A contribuição dos OTs para os valores de estanho total (SnT) foi superior nas estações de amostragem localizadas no interior de portos onde atingiram proporções próximas dos 50%. De entre estes, os butilestanhos (BuTs=MBT+DBT+TBT) contribuíram em média com 98.6% para o valor total de OTs, tendo sido detectados em todas as amostras analisadas. Os valores mais elevados foram registados no interior ou na proximidade de portos, corroborando a ideia anterior de que constituem importantes focos de poluição. A variação das concentrações de TBT no mexilhão situou-se entre os 0,9 e 720 ng Sn.g-1 de peso seco (ps). Estes valores são, em 69% das estações amostradas, superiores ao valor do proposto pela OSPAR (4,9 ng TBT-Sn.g-1 ps) para tecidos de mexilhão o que sugere a forte probabilidade de ocorrência de efeitos adversos sobre os ecossistemas. Os níveis de OTs foram também quantificados em tecidos de N. reticulatus recolhidos ao longo da costa em 2008 Os butilestanhos representaram a maioria dos compostos organoestânicos quantificados e os níveis mais elevados foram novamente detectados no interior ou nas imediações de portos. Os valores de TBT nos tecidos deste gastrópode variaram entre 3,5 e 380 ng Sn.g-1 ps, representando uma percentagem média de 50,4% do total de butilestanhos. Simultaneamente, os níveis de imposex foram também avaliados e relacionados com os valores deste composto nos tecidos. As distribuições espaciais de imposex e de TBT seguiram a mesma tendência, sendo que em todos os locais amostrados foram encontradas fêmeas afectadas. Os valores de VDSI (índice da sequência do vaso deferente) variaram entre 0,2 e 4,4. Em 91% dos locais os valores de VDSI foram superiores a 0,3 (definido pela OSPAR como o valor de VDSI em N. reticulatus acima do qual o objectivo de qualidade ecológica não é atingido), confirmando a suspeição da existência de efeitos adversos nos ecossistemas. Em todos os compartimentos analisados na Ria de Aveiro, os butilestanhos foram os principais contribuintes para estanho orgânico total. A utilização do imposex em N. reticulatus como biomarcador da poluição por TBT permitiu determinar um gradiente decrescente desde o interior da Ria (onde se situa a zona portuária) até zonas costeiras adjacentes. O mesmo gradiente foi observado relativamente às concentrações de TBT em tecidos de mexilhão. Para os sedimentos, as concentrações de TBT são bastante variáveis com valores entre 2,7 e 1780 ng Sn.g-1 ps encontrando-se significativamente correlacionadas com o conteúdo em matéria orgânica da amostra. Em todas as amostras analisadas os níveis de TBT são elevados e superiores ao valor inferior (provisório) de EAC (critério de avaliação ambiental) proposto pela OSPAR (0,004 ng TBT-Sn.g-1 ps). A análise da evolução temporal da poluição por TBT ao longo da costa foi concretizada por meio da comparação entre níveis de organoestanhos em N. reticulatus em amostras de 2008 e 2003 e também através da comparação dos níveis de imposex registados em campanhas realizadas naqueles dois anos. Os resultados obtidos indicam a ocorrência de reduções significativas nas concentrações de TBT, DBT e MBT, assim como uma diminuição significativa nos valores de VDSI entre 2003 e 2008. Os resultados obtidos sugerem que a redução verificada se deve à implementação do Regulamento 782/2003 da Comunidade Europeia, que tem por objectivo a erradicação das descargas e emissões de TBT para o ambiente a partir dos sistemas antivegetativos A diminuição da poluição por TBT ao longo dos últimos anos foi acompanhada por um aumento no número de fêmeas com um vaso deferente, mas sem pénis (imposex do tipo b): 3,5% em 2000, 11% em 2003 e 24% em 2008. Um aumento no número de locais onde se registou o fenómeno também é evidente: dois em 2000, sete em 2003 e treze em 2008. A proporção de fêmeas b no estádio 1 de VDS apresentou igual tendência com aumento de 38% em 2000 para 65% em 2008. O aumento no número de fêmeas com esta via parece estar associado à diminuição da poluição por TBT. Face à esperada diminuição da presença do composto no meio ambiente, devido à sua proibição, o aumento de fêmeas com imposex do tipo b é previsível. A ocorrência de compostos xenoestrogénicos no ambiente aquático foi também estudada e os níveis de estrona (E1), 17α-e 17β-estradiol (E2), 17α- etinilestradiol (EE2), bisfenol-A (BPA) e nonilfenol (NP) foram quantificados em efluentes de estações de tratamento de águas residuais (ETARs) localizadas na região de Aveiro, bem como no efluente final descarregado no Oceano Atlântico, através de um emissário submarino (S. Jacinto), sendo amostras recolhidas na entrada da Ria e ao largo usadas como referência. Os níveis de hormonas esteróides e compostos fenólicos registados nos locais de referência são baixos. De entre as hormonas esteróides os níveis mais elevados foram registados para a estrona, com valores máximos de 85.3 ng.L- 1 . Os níveis mais elevados de compostos fenólicos foram detectados em efluentes industriais (máximos de NP e BPA de 2410 ng.L-1 e 897 ng.L-1 , respectivamente). Os resultados obtidos sugerem que os níveis de compostos xenoestrogénicos em locais de referência são baixos e não parecerem acarretar risco ecológico, no entanto o mesmo não será verdadeiro para as imediações do emissário de S. Jacinto que liberta efluentes com concentrações muito elevadas de E1, NP e BPA. Foram realizadas experiências laboratoriais de forma a elucidar o papel do receptor retinóico X (RXR) no mecanismo de indução de imposex (presentemente o mecanismo que demonstra maior promessa na explicação do desencadear deste fenómeno). Fêmeas de Nucella lapillus e N. reticulatus foram injectadas com TBT em etanol ou com ácido 9-cis- retinóico em FBS (soro fetal bovino) tendo-se procedido à sua observação nos 30 dias subsequentes. Tanto o TBT como o 9CRA induziram o desenvolvimento de imposex em N. lapillus e N. reticulatus. Aumentos significativos nos valores de VDSI e FPL entre o controlo de etanol e o tratamento de TBT e o controlo de FBS e o tratamento de 9CRA foram registados. Os resultados obtidos fornecem novas provas do envolvimento da via de sinalização associada ao RXR no desenvolvimento de imposex em ambas as espécies.

Macrofaunal assemblages from mud volcanoes in the Gulf of Cadiz

Desde a descoberta em 1999 do primeiro vulcão de lama no Golfo de Cádis, cerca de 40 locais, de profundidade variável entre os 200 e os 3900 m, com diferentes graus de emissão de hidrocarbonetos foram localizados e amostrados dentro do programa IOC-UNESCO “Training Through Research (TTR) “ e mais recentemente dentro do projecto europeu HERMES. Neste estudo investigamos as comunidades da macrofauna dos vulcões de lama do Golfo de Cádis utilizando uma diversidade de equipamento de amostragem quantitativo e não quantitativo. Mais de 14550 espécimes foram examinados e incluídos nos diferentes grupos taxonómicos, sendo fornecida uma lista taxonómica detalhada com o menor nível taxonómico possível. A biodiversidade, distribuição dos principais taxa, as espécies quimiossintéticas e a biodiversidade regional e substituição de espécies são apresentados e discutidos. Dentro da macrofauna, os bivalves (nomeadamente super-familia Thyasiroidea, espécies quimisimbióticos e comunidade de bivalves) e os ofiurideos são estudados em pormenor. Os Thyasiroidea colhidos nos vulcões de lama do Golfo de Cádis são revistos. Das sete espécies identificadas, apenas uma Thyasira vulcolutre. sp. nov se encontra associada a um ambiente quimiossintético. Esta espécie é restrita a locais activos, mas não se verificam padrões de distribuição para as outras espécies. Os bivalves quimiosimbióticos amostrados são revistos. Das 10 espécies fortemente associadas a ambientes quimiossintéticos duas Solemyidae, Petrasma elarraichensis sp. nov. e Acharax gadirae sp. nov., uma Lucinidae, Lucinoma asapheus sp. nov., e uma Vesicomyidae, Isorropodon megadesmus sp. nov. são descritas e comparadas com similares das respectivas famílias. As comunidades de bivalves foram analisadas em detalhe e do estudo de 759 espécimes (49 espécies em 21 familias) descreve-se a diversidade e padrões de distribuição. Os Ophiuroidea amostrados nos vulcões de lama e ambientes batiais adjacentes são revistos. Treze espécies são incluídas em 4 famílias, Ophiacanthidae, Ophiactidae, Amphiuridae e Ophiuridae e são identificadas, tendo sido descrita uma nova espécie Ophiopristis cadiza sp. nov. Rácios isotópicos (δ13C, δ15N, δ34S) foram determinados em várias espécies no intuito de investigar a ecologia trófica das comunidades bênticas dos vulcões do Golfo de Cádis. Os valores de δ13C para os bivalves Solemyidae, Lucinidae e Thyasiridae estão de acordo com os valores para outros bivalves conhecidos por possuírem simbiontes tiotróficos. Por outro lado os valores de δ13C e δ34S para Bathymodiolus mauritanicus sugerem a ocorrência de metanotrofia. A análise da fauna heterotrófica indica igualmente que as espécies habitantes da cratera dos vulcões de lama derivam a sua nutrição de fontes quimiossintéticas. A indicação pela análise isotópica que as bactérias autotróficas contribuem substancialmente para a nutrição dos bivalves hospedeiros, levou-nos a investigar os endossimbiontes e as suas relações filogenéticas relativamente a outros bivalves através da análise comparativa de análises de sequências de 16S ribossomal RNS. Análises moleculares PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) e clonagem de genes de bacterias 16S rRNA confirmaram a presença de simbiontes oxidantes de enxofre e colocam a possibilidade de uma simbiose dupla para o B. mauritanicus. A diversidade microbiana dentro dos Frenulata foi igualmente estudada recorrendo a métodos moleculares e revelou a não existência de padrão entre espécies, vulcões, profundidade e idade do animal sugerindo assim a não procura de simbiontes específicos.

Avaliação do efeito de metais pesados na fertilidade do ratinho

A infertilidade é um problema actual que afecta cerca de 8 a 12% dos casais em idade fértil, sendo 50% dos casos atribuídos ao factor masculino. A exposição ocupacional e/ou ambiental a metais pesados representa uma das suas principais causas. O chumbo, o cádmio e o crómio são metais com elevada utilização industrial e muito persistentes no ambiente, sendo motivo de grande preocupação devido aos seus efeitos na saúde reprodutiva dos trabalhadores e da população em geral. Neste trabalho estudaram-se os efeitos do cloreto de chumbo (PbCl2), cloreto de cádmio (CdCl2) e cromato de potássio (K2CrO4) na fertilidade, usando como modelo ratinhos machos ICR-CD1. Os ratinhos foram injectados subcutaneamente com 74 e 100 mg de PbCl2/kg pc ou com 5 e 10 mg de K2CrO4/kg pc, respectivamente, durante 4 dias consecutivos ou com 1, 2 e 3 mg de CdCl2/kg pc numa única injecção. Nos ensaios com PbCl2 e K2CrO4 os animais foram sacrificados 5 e 35 dias após o início da exposição, enquanto que nos ensaios com CdCl2 os animais foram sacrificados após 24 horas e 35 dias. O cloreto de chumbo não alterou a histologia do testículo nem do epidídimo, mas induziu um aumento da percentagem de células em fase S no testículo. O cloreto de chumbo alterou também alguns parâmetros dos espermatozóides, tais como a motilidade, morfologia e integridade do acrossoma. Contudo, não foram observados efeitos na integridade do DNA ou na estrutura da cromatina. O cloreto de cádmio induziu lesões severas e não reversíveis nos testículos que, após 35 dias, reverteram em necrose testicular. O cloreto de cádmio alterou ainda as subpopulações de células testiculares após 24 horas e induziu IMS no testículo após 35 dias. Em consequência das lesões no testículo, a densidade espermática foi severamente afectada após 35 dias. A exposição ao cloreto de cádmio afectou também a morfologia, a motilidade e a integridade acrossómica nos espermatozóides. O cloreto de cádmio induziu ainda fragmentação do DNA nestas células após 35 dias. O cromato de potássio alterou a morfologia dos espermatozóides e a integridade do acrossoma, sobretudo nos animais sacrificados após 35 dias. Verificou-se ainda uma redução da motilidade dos espermatozóides. Não foram detectados efeitos genotóxicos nos espermatozóides, devido à acção do K2CrO4 nas doses testadas. Dos parâmetros avaliados neste trabalho, destacam-se duas novas abordagens, nomeadamente o programa informático Snakes e a análise do conteúdo em DNA de células de testículo, a partir de material incluído em parafina. O Snakes permitiu fazer medições rigorosas do diâmetro dos tubos seminíferos, enquanto que a fixação de amostras de testículo de ratinhos em formol tamponado e inclusão em parafina resultou numa boa preservação do DNA, possibilitando assim a quantificação das subpopulações de células testiculares por citometria de fluxo. Os resultados obtidos para os diferentes parâmetros testados indicam que a motilidade dos espermatozóides e a integridade do acrossoma sejam parâmetros sensíveis à toxicidade de metais. O acrossoma aparenta ser um dos principais alvos da toxicidade dos metais e cuja reacção acrossómica prematura pode reduzir a capacidade do espermatozóide para fertilizar o oócito. Assim, este trabalho representa uma contribuição para uma melhor compreensão dos efeitos do chumbo, cádmio e crómio na fertilidade masculina.

Networked tourism: from world destinations to inter-organizations

Na última década, a referência ao conceito de redes cresceu rapidamente entre a literatura sobre turismo, geralmente aplicado a tópicos como as interorganizações, estrutura de multi-destinos, espaços de Turismo online, entre outros. O conceito de rede difundiu-se na natureza e na sociedade, em áreas que vão desde a Biologia à Medicina, ou da Economia à Gestão, e o conhecimento sobre redes tem vindo a impulsionar uma teoria comum para facilitar a compreensão de diferentes sistemas complexos e a representação das ligações entre organizações, acções, bens, proteínas ou pessoas. A tese teve como propósito o encontro de um eixo comum entre dois campos férteis de investigação através de uma revisão teórica sistemática. A investigação sobre redes complexas é um campo recente na Física que tem vindo a desenvolver-se bastante na última década com fortes aplicações interdisciplinares. Por outro lado, a análise de redes sociais é uma área de investigação activa em Sociologia e Economia há bastante tempo. O estudo das implicações das redes complexas para a ciência das redes de turismo é uma área promissora já com resultados fascinantes. A tese tem três resultados principais. Primeiro, traz conhecimento das ricas áreas de conhecimento sobre redes complexas e redes sociais. Em segundo lugar, apresenta modelos evolutivos que melhor se adaptam às chegadas turísticas internacionais. Como se organizam as redes sociais? Como é que os indivíduos escolhem os seus destinos de viagem? Estes são exemplos de questões que serão abordadas na tese. Em terceiro lugar, discute resultados que fazem notar comportamentos comuns entre redes em turismo e outras redes reais. O que é comum a todas as redes na natureza? Adicionalmente, os padrões encontrados entre os destinos turísticos mostram um comportamento não social, com destinos mais característicos de redes económicas e sistemas tecnológicos que questionam a faceta social do sector do turismo. Por acréscimo, a rede de transportes aéreos e a rede de turismo mostram diferenças consideráveis que se podem dever a razões políticas ou outras que provavelmente explicam o aumento da utilização de voos charters.

Sistemas de informação para DNA microarrays

O projecto de sequenciação do genoma humano veio abrir caminho para o surgimento de novas áreas transdisciplinares de investigação, como a biologia computacional, a bioinformática e a bioestatística. Um dos resultados emergentes desde advento foi a tecnologia de DNA microarrays, que permite o estudo do perfil da expressão de milhares de genes, quando sujeitos a perturbações externas. Apesar de ser uma tecnologia relativamente consolidada, continua a apresentar um conjunto vasto de desafios, nomeadamente do ponto de vista computacional e dos sistemas de informação. São exemplos a optimização dos procedimentos de tratamento de dados bem como o desenvolvimento de metodologias de interpretação semi-automática dos resultados. O principal objectivo deste trabalho consistiu em explorar novas soluções técnicas para agilizar os procedimentos de armazenamento, partilha e análise de dados de experiências de microarrays. Com esta finalidade, realizou-se uma análise de requisitos associados às principais etapas da execução de uma experiência, tendo sido identificados os principais défices, propostas estratégias de melhoramento e apresentadas novas soluções. Ao nível da gestão de dados laboratoriais, é proposto um LIMS (Laboratory Information Management System) que possibilita a gestão de todos os dados gerados e dos procedimentos realizados. Este sistema integra ainda uma solução que permite a partilha de experiências, de forma a promover a participação colaborativa de vários investigadores num mesmo projecto, mesmo usando LIMS distintos. No contexto da análise de dados, é apresentado um modelo que facilita a integração de algoritmos de processamento e de análise de experiências no sistema desenvolvido. Por fim, é proposta uma solução para facilitar a interpretação biológica de um conjunto de genes diferencialmente expressos, através de ferramentas que integram informação existente em diversas bases de dados biomédicas.

Sistema computacional para o estudo da estrutura primária e redesenho de genes

Um dos maiores avanços científicos do século XX foi o desenvolvimento de tecnologia que permite a sequenciação de genomas em larga escala. Contudo, a informação produzida pela sequenciação não explica por si só a sua estrutura primária, evolução e seu funcionamento. Para esse fim novas áreas como a biologia molecular, a genética e a bioinformática são usadas para estudar as diversas propriedades e funcionamento dos genomas. Com este trabalho estamos particularmente interessados em perceber detalhadamente a descodificação do genoma efectuada no ribossoma e extrair as regras gerais através da análise da estrutura primária do genoma, nomeadamente o contexto de codões e a distribuição dos codões. Estas regras estão pouco estudadas e entendidas, não se sabendo se poderão ser obtidas através de estatística e ferramentas bioinfomáticas. Os métodos tradicionais para estudar a distribuição dos codões no genoma e seu contexto não providenciam as ferramentas necessárias para estudar estas propriedades à escala genómica. As tabelas de contagens com as distribuições de codões, assim como métricas absolutas, estão actualmente disponíveis em bases de dados. Diversas aplicações para caracterizar as sequências genéticas estão também disponíveis. No entanto, outros tipos de abordagens a nível estatístico e outros métodos de visualização de informação estavam claramente em falta. No presente trabalho foram desenvolvidos métodos matemáticos e computacionais para a análise do contexto de codões e também para identificar zonas onde as repetições de codões ocorrem. Novas formas de visualização de informação foram também desenvolvidas para permitir a interpretação da informação obtida. As ferramentas estatísticas inseridas no modelo, como o clustering, análise residual, índices de adaptação dos codões revelaram-se importantes para caracterizar as sequências codificantes de alguns genomas. O objectivo final é que a informação obtida permita identificar as regras gerais que governam o contexto de codões em qualquer genoma.

Evolução da população do fungo nematófago Pochonia chlamydosporia -isolado PcMR, após inoculação, no solo e na raiz do tomateiro cultivado em estufa

O fungo Pochonia chlamydospoia é um potencial agente de controlo biológico dos nemátodes-das-galhas-radiculares. Com este trabalho, pretendeu-se avaliar a eficácia de inoculações de clamidósporos no solo, no estabelecimento de uma população do fungo no solo e na raiz de tomateiro em estufa com níveis de densidade iguais ou superiores aos considerados como necessários para um eficaz controlo dos nematodes-das-galhas-radiculares. Ao longo de dois anos de ensaio, fórum efetuadas inoculações do isolado PcMR e avaliada a densidade de fungo no solo e na raiz, As inoculações efetuadas permitiram estabelecer uma população de P. chlamydosporia no solo e atingir os valores de densidade pretendidos. No entanto, os valores pretendidos para colonização da raiz pelo fungo foram atingidos apenas no primeiro ano. Foi igualmente demonstrada a capacidade do fungo em se manter no solo durante longos períodos de tempo mesmo na ausência de cultura e em condições adversas de humidade e temperatura. /ABSTRACT: Pochonia chlamydosporia is a potential root-knot nematode biological control agent. The aim of this work was to evaluate the effectiveness of chlamydospore inoculations at the soil, for the establishment at both soil and greenhouse tomato root, of a fungus population in density levels equal or superior to those considered as needed for an effective control of root-knot nematode. Along two years, several inoculations using the Portuguese isolate PcMR were made and the density of fungus at the soil and roots studied. These inoculations allowed the establishment of a population of P. chlamydosporia at the soil and achieve the desired density values. However, only in the first year of assay, the desired values of root colonization by fungus were achieved. lt was also demonstrated that P. chlamydosporia can survive for itself at the soil for a long period of time even in the absence of plant culture and in adverse moist and temperature conditions.

A influência dos factores humanos, ambientais e do pastoreio na ocorrência de geneta (Genetta genetta) no Sítio Monfurado

O presente estudo determina e analisa a importância relativa de diversos descritores ambientais, de pastoreio e de influência humana directa na distribuição da geneta (Genetta genetta L., 1758). O estudo decorreu em Monfurado, Sítio de Importância Comunitária, no Sul de Portugal. A área de estudo é predominantemente agrícola, maioritariamente ocupada por montado. A análise do padrão de distribuição deste carnívoro através de partição da variância e de ITMC (lnformation Theoretic Model Comparison) teve como objectivo orientar as prioridades na gestão das actividades humanas, compatíveis com a presença da espécie. Os resultados mostram que a distribuição da geneta é maioritariamente influenciada pelos descritores ambientais, apresentando uma relação positiva com densidade de montado com matos, conteúdo de matéria orgânica do solo e índice de Shannon de diversidade vertical da vegetação. A sua presença parece também ser promovida por níveis intermédios de pastoreio e fora das zonas de caça do regime cinegético especial. ABSTRACT; This study determines and analyses the relative importance of several environmental, livestock and human descriptors in the distribution of the common genet (Genetta genetta L., 1758). The study was conducted in Monfurado, a Site of Communitary lmportance, in South Portugal. The study area is Mediterranean farmland and is dominated by evergreen oak tree stands, named "montado". Modeling the distribution of this carnivore species was evaluated on the basis of ITMC (lnformation Theoretic Model Comparison) and variation partitioning techniques aiming to define human management activities compatible with the species conservation. The results show that the species distribution is mainly influenced by the environmental descriptors, and is positively related with montado and shrubs density, soil organic matter and Shannon's index of vertical vegetation diversity. Genet presence is favoured by intermediate levels of grazing and outside of game estates areas.

role of SLO in aGVHD : alterando o paradigma de allo-activação das células T, The

A indução da doença do transplante contra o hospedeiro (GVHD) depende da activação das células dadoras T pelas células do hospedeiro que apresentamantigenio (APCs). A teoria prevalecente descreve que estas interacções ocorrem nos órgãos linfáticos secundários (SLO), tais como os nóduloslinfáticos (LN), as placas de Peyer’s (PP) e o baço (SP). Esta hipótese foi testada usando ratinhos homozigóticos aly/aly (alinfoplasia) que não têm LN nem PP, usando como controlo os ratinhos heterozigóticos (aly/+) da mesma ninhada. Os dois grupos foram irradiados com dose letal após a remoção do baço aos ratinhos aly/aly (LN/PP/SP-/-), enquanto nos ratinhos aly/+ o baço foi deslocado e recolocado. Ambos receberam transplante de medula óssea (BMT) de ratinhos dadores singénicos (aly/aly, H-2b) ou de ratinhos alogénicos, com diferente complexo principal de histocompatibilidade (MHC) (BALB/c, H-2dou B10.BR, H-2k). A severidade de GVHD foi medida pela sobrevivência,e pelo sistema de pontuação, bem estabelecido, quer de doença clínica quer de doença dos órgãos alvo. Surpreendentemente, todos os ratinhos LN/PP/SP-/-sobreviveram, desenvolvendo GVHD clinicamente significativo, comparável,em severidade, com o observado nos ratinhos LN/PP/SP+/+. Além disso, asanálises histopatológicas demonstraram que os ratinhos LN/PP/SP-/-receptores de BMTdesenvolveram significativamente mais GVHD no fígado,no intestino, e na pele quando comparados com os animais singénicos decontrolo. Os ratinhos LN/PP/SP-/-desenvolveram também GVHD hepático mais severo quando comparados com os ratinhos de controlo LN/PP/SP+/+. Diferenças semelhantes foram ainda observadas, logo ao 7º dia, para o GVHDhepático entre os grupos alogénicos. Para identificar quais os órgãos extra-linfáticos do receptor que poderão servir como sítios iniciais de exposição a antigenios alogénicos, na ausência de SLO, foi examinada a expansão das células T (CD3+), a sua activação (CD69+), e a sua proliferação (CFSE) na medula óssea, 3 dias depois do BMT. Em cada caso, os ratinhos LN/PP/SP-/-transplantados com medula de dadores alogénicos apresentaram númerosabsolutos significativamente maiores quer de células, quer de divisõescelulares, se comparados com os LN/PP/SP+/+. Para garantir que as diferenças experimentais observadas nos animais aly/aly, no sistema díspar do MHC, não são apenas um fenómeno dependente da estirpe de ratinho, foramtransplantados ratinhos sem baço FucT dko (LN/PP/SP-/-), previamente tratados com o anticorpo monoclonal (mAb) anti-MadCAM-1. Após o BMT estes ratinhos apresentaram elevada pontuação clínica de GVHD, mostrando que os SLO não são necessários para a indução de GVHD. Em estudos de transplante-versus-leucemia usando hospedeiros homozigóticos (LN/PP/SP-/-) estes ratinhos morreram devido a expansão tumoral e não devido a GVHD.Estudos in vitro mostraram que a capacidade das APCs, quer das célulasdendríticas (DCs) esplénicas, quer das DCs derivadas da medula óssea, dosratinhos aly/aly e aly/+ eramcomparável. Colectivamente, estes resultados são consistentes com a noção de que os SLO não são necessários para a activação alogénica das celulas T, sugerindo que a medula óssea pode ser umlocal alternativo, embora menos eficiente, para o reconhecimento alogénico deantígenos e consequente activação das células dadoras T. Estas observações desafiam o paradigma de que os tecidos linfáticos secundários sãonecessários para a indução de GVHD.

Protein phosphatases acting on the replication checkpoint

A génese de um cancro está dependente da acumulação de mutações genéticas que dão origem a instabilidade genómica, que por sua vez resulta na proliferação descontrolada. Para prevenir a acumulação destas mutações, as células têm mecanismos de controlo (checkpoints) que suspendem o ciclo celular e accionam as vias de reparação do ADN. Estes eventos são muitas vezes regulados por dinâmicas de (des)fosforilação de proteínas. As proteínas fosfatases (PPs), enzimas responsáveis pela remoção do grupo fosfato de resíduos fosforilados, desempenham funções cruciais na regulação de muitos mecanismos celulares. Enquanto que no início do projecto as cinases envolvidas no checkpoint da replicação estavam bem estabelecidas, as PPs envolvidas não eram conhecidas. A Chk1, um componente da maquinaria do checkpoint da replicação, é exemplo dessa regulação por (des)fosforilação, como sejam nos resíduos Ser317 e Ser345. Assim, como primeira abordagem para determinar quais os grupos de PPs envolvidos na regulação do checkpoint da replicação, decidimos investigar o seu papel na regulação da fosforilação da Chk1. A primeira conclusão é que a desfosforilação da Chk1 ao longo do tempo, tanto in vivo como in vitro, ocorre com uma dinâmica bi-fásica. Em segundo, a abordagem in vitro sugere que as famílias PP1, PP2A e PP2C estão envolvidas na desfosforilação da Chk1. Uma vez que a família PP2A foi a que mostrou a maior acção nesta reacção, decidimos investigar outros membros da família in vivo, primeiro com uma abordagem geral (tratando com OA ou sobreexpressando a PME-1), e depois com o knockdown específico da PP4 e PP6 (através de siRNA). Os resultados mostram que a inibição das PPs afectam tanto a desfosforilação como o estado de activação da Chk1 em resposta a tratamento com Hidroxiureia (HU). Todas as PPs testadas in vivo pareceram ser capazes de regular, a níveis diferentes, tanto a fosforilação como a desfosforilação da Chk1. A função das PPs foi também investigada ao nível: da regulação do disparo das origens de replicação, e da recuperação da suspensão da replicação, induzida pela HU. No último caso, os dados indicam que na situação simultânea de knockdown da PP4 com tratamento de HU, há um atraso do ciclo celular na resolução da transição de G2/M. No ensaio de replicação por pulse-chase, os resultamos mostram que tanto o tratamento com OA, como a sobre-expressão de I-2 ou PME-1, atrasam a cronologia do disparo programado das origens de replicação. No entanto, nenhum dos tratamentos efectuados parece desregular o início do checkpoint da replicação. Um rastreio de 2-híbrido de levedura com uma biblioteca de cDNA de testículo humano foi realizado, usando a Chk1 como isco, no sentido de descobrir novos interactores e definir novas possíveis funções para a Chk1 no contexto da meiose. Com base nos resultados do rastreio, duas novas funções são sugeridas: a interacção com a GAGE12 sugere uma função na recombinação genómica/vigilância do genoma durante a meiose, e as interacções com a EEF1α1 e a RPS5 sugerem uma função na regulação da síntese proteíca. Estas experiências fornecem um visão geral para a compreensão da diversidade de funções das proteínas fosfatases envolvidas no checkpoint da replicação, bem como, abre novos caminhos para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento do cancro.