Système de recombinaison Xer chez Staphylococcus aureus

Le système de recombinaison Xer est impliqué dans la monomerisation des réplicons bactériens, comme les plasmides et les chromosomes, dans une grande variété de bactéries. Ce système est un système de recombinaison site-spécifique composé de deux tyrosine recombinases, soit XerC et XerD. Ils agissent ensemble afin de convertir les chromosomes dimériques en monomères en agissant à un site spécifique près du terminus de la réplication, appelé le site dif. Les gènes Xer et leur site d’action sont identifiés dans plusieurs bactéries gram positives et gram négatives. Staphylococcus aureus représente une bactérie gram positive qui contient un système XerCD/dif. Elle est impliqué dans plusieurs maladies humaines, tels que des infections cutanées, des gastroentérites, et le syndrome de choc toxique, pour en nommer quelques unes. Bien que les gènes codant les protéines XerC et XerD ont été identifiés, il y a beaucoup d’inconnu sur leur mode d’action au site dif. Des mutations dans XerC ont été obtenues, mais aucune dans XerD, suggérant que ce gène pourrait être essentiel pour cet organisme. Les études présentées dans ce mémoire ont permis de commencer à mieux caractériser XerD de S. aureus, en séquençant le gène et en faisant des tests de liaison à l’ADN. Elles ont montré que la recombinase XerD se lie au site dif d’Eschericia coli seul et de façon coopérative avec la recombinase XerC d’E. coli. XerD de S. aureus est, aussi, efficace dans la complémentation de XerD muté d’E. coli dans la réaction de recombinaison chromosomique. Cependant, elle ne démontre pas cette même capacité de complémentation lors de la recombinaison plasmidique aux sites cer.

Supercomplexes multifonctionnels chez les mitochondries, et chez E. coli

Les processus mitochondriaux tels que la réplication et la traduction sont effectués par des complexes multiprotéiques. Par contre, le métabolisme et la voie de maturation des ARN mitochondriaux (p. ex précurseurs des ARNt et des ARNr) sont habituellement traités comme une suite de réactions catalysées par des protéines séparées. L’exécution fidèle et optimale de ces processus mitochondriaux, exige un couplage étroit nécessaire pour la canalisation des intermédiaires métaboliques. Or, les évidences en faveur de l'interconnexion postulée de ces processus cellulaires sont peu nombreuses et proviennent en grande partie des interactions protéine-protéine. Contrairement à la perception classique, nos résultats révèlent l’organisation des fonctions cellulaires telles que la transcription, la traduction, le métabolisme et la régulation en supercomplexes multifonctionnels stables, dans les mitochondries des champignons (ex Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans et Neurospora crassa), des animaux (ex Bos taurus), des plantes (B. oleracea et Arabidopsis thaliana) et chez les bactéries (ex E. coli) à partir desquelles les mitochondries descendent. La composition de ces supercomplexes chez les champignons et les animaux est comparable à celle de levure, toutefois, chez les plantes et E. coli ils comportent des différences notables (ex, présence des enzymes spécifiques à la voie de biosynthèse des sucres et les léctines chez B. oleracea). Chez la levure, en accord avec les changements dûs à la répression catabolique du glucose, nos résultats révèlent que les supercomplexes sont dynamiques et que leur composition en protéines dépend des stimulis et de la régulation cellulaire. De plus, nous montrons que l’inactivation de la voie de biosynthèse des lipides de type II (FASII) perturbe l’assemblage et/ou la biogenèse du supercomplexe de la RNase P (responsable de la maturation en 5’ des précurseurs des ARNt), ce qui suggère que de multiples effets pléiotropiques peuvent être de nature structurale entre les protéines. Chez la levure et chez E. coli, nos études de la maturation in vitro des précurseurs des ARNt et de la protéomique révèlent l’association de la RNase P avec les enzymes de la maturation d’ARNt en 3’. En effet, la voie de maturation des pré-ARNt et des ARNr, et la dégradation des ARN mitochondriaux semblent êtres associées avec la machinerie de la traduction au sein d’un même supercomplexe multifonctionnel dans la mitochondrie de la levure. Chez E. coli, nous avons caractérisé un supercomplexe similaire qui inclut en plus de la RNase P: la PNPase, le complexe du RNA degradosome, l’ARN polymérase, quatre facteurs de transcription, neuf aminoacyl-tRNA synthétases, onze protéines ribosomiques, des chaperons et certaines protéines métaboliques. Ces résultats supposent l’association physique de la transcription, la voie de maturation et d’aminoacylation des ARNt, la dégradation des ARN. Le nombre de cas où les activités cellulaires sont fonctionnellement et structurellement associées est certainement à la hausse (ex, l’éditosome et le complexe de la glycolyse). En effet, l’organisation en supercomplexe multifonctionnel représente probablement l’unité fonctionnelle dans les cellules et les analyses de ces super-structures peuvent devenir la prochaine cible de la biologie structurale.

Contribution de la déficience en lipoprotéine lipase (LPL) au profil cardiométabolique lié à l'adiponectine chez les femmes

La déficience partielle en lipoprotéine lipase (LPLD) est associée à une augmentation du risque cardiométabolique chez les hommes et les femmes. L’adiponectine, le syndrome métabolique et la ménopause sont des modulateurs importants de ce risque. L’objectif de cette étude était d’évaluer la contribution de l’adiponectine au profil de risque cardiométabolique de femmes porteuses de variants dans le gène LPL connus pour être associés avec la LPLD. L'échantillon étudié comprenait 568 femmes d'origine canadienne-française, dont 127 avec une LPLD et 441 non LPLD (contrôles). L'influence de l'adiponectine sur le risque associé à la LPLD a été évaluée en utilisant des analyses de régression multiples prenant en compte l’influence du statut ménopausique, des variables anthropométriques, du bilan lipidique, de la glycémie à jeun et du tabagisme. Les résultats montrent que les niveaux d'adiponectine étaient significativement plus faibles dans les groupes LPLD. La contribution des valeurs faibles d’adiponectine au profil de risque cardiométabolique des sujets LPLD était indépendante du statut ménopausique et de toutes les autres covariables étudiées. Cela suggère que l'adiponectine contribue au profil de risque cardiométabolique chez les femmes porteuses d’une mutation connue pour être associée avec la LPLD.

MAST3 : facteur de risque génétique aux maladies inflammatoires de l’intestin et modulateur d’inflammation

La maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU) sont des maladies inflammatoires chroniques du tube digestif qu’on regroupe sous le terme maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Les mécanismes moléculaires menant au développement des MII ne sont pas entièrement connus, mais des études génétiques et fonctionnelles ont permis de mettre en évidence des interactions entre des prédispositions génétiques et des facteurs environnementaux - notamment la flore intestinale – qui contribuent au développement d’une dérégulation de la réponse immunitaire menant à l’inflammation de la muqueuse intestinale. Des études d’association pangénomiques et ciblées ont permis d’identifier plusieurs gènes de susceptibilité aux MII mais les estimations de la contribution de ces gènes à l’héritabilité suggèrent que plusieurs gènes restent à découvrir. Certains d’entre eux peuvent se trouver dans les régions identifiées par des études de liaison génétique. L’objectif de mon projet de doctorat était d’identifier un ou des facteurs de risque génétique dans la région chromosomale 19p (identifiée comme région de liaison IBD6) et de le/les caractériser au niveau fonctionnel. Nous avons d’abord entrepris une cartographie d’association de la région 19p. À la suite du génotypage successif de deux cohortes indépendantes, nous avons identifié un SNP intronique et quatre SNP codants dont un non-synonyme, rs8108738, tous localisés dans le gène microtubule associated serine threonine kinase gene-3 (MAST3) et associés aux MII. Peu d’information fonctionnelle sur MAST3 était disponible. Par contre MAST2, une protéine encodée par un gène de la même famille, régule l’activité du facteur de transcription inflammatoire NF-kappaB. Nous avons confirmé l’implication de MAST3 dans l’activité de NF-kappaB via un knockdown de MAST3 et des essais gène-rapporteur. Pour poursuivre la caractérisation fonctionnelle de MAST3, nous avons choisi une approche non ciblée pour étudier les effets de la variation des niveaux d’expression de MAST3 sur la cellule. C’est-à-dire que nous avons créé un 1er modèle cellulaire de surexpression du gène MAST3 dans les cellules HEK293 et analysé l’expression pangénomique endogène. La validation de l’expression génique dans un 2e modèle cellulaire de knockdown et de type cellulaire différent (THP1), nous a permis d’identifier et de contrer les effets non-spécifiques dus aux niveaux non-physiologiques. Notre étude d’expression a mené à l’identification d’un groupe de gènes dont l’expression est régulée par MAST3. Ces gènes sont majoritairement impliqués dans des fonctions immunitaires (cytokines pro-inflammatoires, régulateurs de NF-kappaB, migration cellulaire, etc.) et une forte proportion est régulée par NF-kappaB. Nous avons évalué l’importance du groupe de gènes régulés par MAST3 dans la présentation clinique des MII à travers des études d’expression dans des biopsies intestinales de patients atteints de CU. Nous avons constaté que l’expression de ces gènes est significativement supérieure dans les régions enflammées par rapport aux régions saines de la muqueuse intestinale des patients atteints de CU. Globalement, les résultats de nos études suggèrent que le facteur de risque aux MII MAST3 agit via la voie du facteur de transcription NF-kappaB pour influencer l’expression d’un groupe de gènes impliqués dans l’inflammation intestinale typique des MII. Chaque étude génétique sur les MII a le potentiel d’orienter les recherches fonctionnelles vers de nouvelles voies biologiques causales. Le dévoilement des mécanismes moléculaires sous-jacents à ces voies permet d’augmenter les connaissances sur le développement de ces maladies vers une compréhension plus complète de la pathogenèse qui permettra d’optimiser le diagnostic et le traitement de ces maladies.

Patrons de distribution des crustacés planctoniques dans le fleuve Saint-Laurent

La recherche porte sur les patrons de distribution longitudinale (amont-aval) et transversale (rive nord - rive sud) des communautés de crustacés planctoniques qui ont été analysés le long du fleuve Saint-Laurent entre le lac Saint-François et la zone de transition estuarienne, à deux hydropériodes en mai (crue) et en août (étiage). Les données zooplanctoniques et environnementales ont été récoltées à 52 stations réparties sur 16 transects transversaux en 2006. Au chapitre 1, nous présentons les principaux modèles écosystémiques en rivière, une synthèse des facteurs influençant le zooplancton en rivières et les objectifs et hypothèses de recherche. Au chapitre 2, nous décrivons la structure des communautés de zooplancton dans trois zones biogéographiques du fleuve et 6 habitats longitudinaux, ainsi que les relations entre la structure du zooplancton et la distribution spatiale des masses d’eau et les variables environnementales. Au chapitre 3, nous réalisons une partition de la variation des variables spatiales AEM (basées sur la distribution des masses d’eau) et des variables environnementales pour évaluer quelle part de la variation du zooplancton est expliquée par les processus hydrologiques (variables AEM) et les conditions locales (facteurs environnementaux). Le gradient salinité-conductivité relié à la discontinuité fleuve-estuaire a déterminé la distribution à grande échelle du zooplancton. Dans les zones fluviales, la distribution du zooplancton est davantage influencée par la distribution des masses d’eau que par les facteurs environnementaux locaux. La distribution des masses d’eau explique une plus grande partie de la variation dans la distribution du zooplancton en août qu’en mai.

Étude de la collaboration entre les facteurs de transcription hématopoïétiques lors du développement et de la différenciation des cellules érythroïdes

La régulation transcriptionnelle des gènes est cruciale pour permettre le bon fonctionnement des cellules. Afin que les cellules puissent accomplir leurs fonctions, les gènes doivent être exprimés adéquatement dans le bon type cellulaire et au stade de développement et de différenciation approprié. Un dérèglement dans l’expression de un ou plusieurs gènes peut entraîner de graves conséquences sur le destin de la cellule. Divers éléments en cis (ex : promoteurs et enhancers) et en trans (machinerie transcriptionnelle et facteurs de transcription) sont impliqués dans la régulation de la transcription. Les gènes du locus humain beta-globine (hub) sont exprimés dans les cellules érythroïdes et sont finenement régulés lors du développement et de la différenciation. Des mutations dans différentes régions du locus causent entre autres les beta-thalassémies. Nous avons utilisé ce modèle bien caractérisé afin d’étudier différents mécanismes de régulation favorisés par les facteurs de transcription qui sont exprimés dans les cellules érythroïdes. Nous nous sommes intéressés à l’importance de l’élément en cis HS2 du Locus control region. Cet élément possède plusieurs sites de liaison pour des facteurs de transcription impliqués dans la régulation des gènes du locus hub. Nos résultats montrent que HS2 possède un rôle dans l’organisation de la chromatine du locus qui peut être dissocié de son rôle d’enhancer. De plus, HS2 n’est pas essentiel pour l’expression à haut niveau du gène beta alors qu’il est important pour l’expression des gènes gamma. Ceci suggère que le recrutement des différents facteurs au site HS2 lors du développement influence différement les gènes du locus. Dans un deuxième temps, nous avons investigué l’importance de HS2 lors de la différenciation des cellules érythroïdes. Il avait été rapporté que l’absence de HS2 influence grandement la potentialisation de la chromatine du gène beta. La potentialisation dans les cellules progénitrices favorise l’activation transcriptionnelle du gène dans les cellules matures. Nous avons caractérisé le recrutement de différents facteurs de transcription au site HS2 et au promoteur beta dans les cellules progénitrices hématopoïétiques (CPH) ainsi que dans les cellules érythroïdes matures. Nos résultats montrent que le facteur EKLF est impliqué dans la potentialisation de la chromatine et favorise le recrutement des facteurs BRG1, p45 et CBP dans les CPH. L’expression de GATA-1 dans les cellules érythroïdes matures permet le recrutement de GATA-1 au locus hub dans ces cellules. Ces données suggèrent que la combinaison de EKLF et GATA-1 est requise pour permettre une activation maximale du gène beta dans les cellules érythroïdes matures. Un autre facteur impliqué dans la régulation du locus hub est Ikaros. Nous avons étudié son recrutement au locus hub et avons observé que Ikaros est impliqué dans la répression des gènes gamma. Nos résultats montrent aussi que GATA-1 est impliqué dans la répression de ces gènes et qu’il interagit avec Ikaros. Ensemble, Ikaros et GATA-1 favorisent la formation d’un complexe de répression aux promoteurs gamma. Cette étude nous a aussi permis d’observer que Ikaros et GATA-1 sont impliqués dans la répression du gène Gata2. De façon intéressante, nous avons caractérisé le mécanisme de répression du gène Hes1 (un gène cible de la voie Notch) lors de la différenciation érythroïde. Similairement à ce qui a été observé pour les gènes gamma, Hes1 est aussi réprimé par Ikaros et GATA-1. Ces résultats suggèrent donc que la combinaison de Ikaros et GATA-1 est associée à la répression de plusieurs de gènes dans les cellules érythroïdes. Globalement cette thèse rapporte de nouveaux mécanismes d’action de différents facteurs de transcription dans les cellules érythroïdes. Particulièrement, nos travaux ont permis de proposer un modèle pour la régulation des gènes du locus hub lors du développement et de la différenciation. De plus, nous rapportons pour la première fois l’importance de la collaboration entre les facteurs Ikaros et GATA-1 dans la régulation transcriptionnelle de gènes dans les cellules érythroïdes. Des mutations associées à certains des facteurs étudiés ont été rapportées dans des cas de beta-thalassémies ainsi que de leucémies. Nos travaux serviront donc à avoir une meilleure compréhension des mécanismes d’action de ces facteurs afin de potentiellement pouvoir les utiliser comme cibles thérapeutiques.

La cartographie des sites de régulation génétique à partir de données de débalancement allélique

En 1975, Wilson et King ont proposé que l'évolution opère non seulement via des changements affectant la structure des protéines, mais aussi via des mutations qui modifient la régulation génétique. L'étude des éléments régulateurs de l'expression génétique a un rôle important dans la compréhension de l'expression de différentes maladies et de la réponse thérapeutique. Nous avons développé un algorithme bio- informatique qui nous permet rapidement de trouver des sites de régulation génétique à travers tout le génome et pour une grande quantité de gènes. Notre approche consiste à trouver des sites polymorphes (SNPs) qui sont en déséquilibre de liaison avec le débalancement allélique (AI) afin de cartographier la région régulatrice et le site responsable. Notre méthode est avantageuse par rapport à d'autres méthodes, car elle n'a pas besoin des données « phasées». De plus, les données de débalancement allélique ne sont pas affectées par des facteurs externes étant donné qu'ils sont mesurés dans la même cellule. Nous avons démontré que notre approche est fiable et qu'elle peut détecter des sites loin du gène. De plus, il peut être appliqué à des données de génotypage sans avoir besoin de les « phaser » .

Évaluation du potentiel des parasitoïdes Binodoxys communis, Aphidius colemani et Aphelinus certus pour la lutte biologique au puceron du soya

Le puceron du soya (Aphis glycines) est le ravageur le plus important de la culture du soya en Amérique du Nord. Quoi qu’efficaces, les pesticides permettent le contrôle des ravageurs que pour une courte période et nécessitent plusieurs applications au cours de la saison. De plus, ils sont dommageables pour l’environnement et la santé humaine. La lutte biologique se présente comme une alternative crédible pour le contrôle des populations d’A. glycines en Amérique du Nord. Trois parasitoïdes (Binodoxys communis, Aphidius colemani, Aphelinus certus) du puceron semblent être des candidats prometteurs. L’objectif de cette étude était d’examiner certains attributs biologiques de ces parasitoïdes au Québec. Dans le cas de B. communis et A. certus nous avons estimé leur synchronisme saisonnier ainsi que leur résistance au froid en laboratoire et en conditions naturelles. Dans le cas, d’A. colemani, nous avons évalué sa capacité à parasiter le puceron du soya et à se disperser dans un champ de soya. Nos résultats démontrent que la souche utilisée de B. communis a perdu sa capacité à entrer en diapause, probablement à cause de la longue période d’élevage en laboratoire qui a suivi son échantillonnage en Asie. Aphelinus certus démontre un potentiel intéressant puisqu’il possède un synchronisme saisonnier tant en automne qu’au printemps avec son hôte ainsi qu’un bon potentiel de survie hivernale au Québec. Quant à A. colemani, les essais suggèrent qu’il se disperse rapidement hors des champs sans attaquer de manière significative A. glycines.

Rôles et régulation des enzymes antioxydantes paraoxonases au niveau intestinal et implication dans les maladies inflammatoires de l'intestin

Le stress oxydant joue un rôle majeur dans le développement et l’évolution des maladies inflammatoires de l’intestin. Le corps humain est doté d’une panoplie d’enzymes antioxydantes ayant pour fonction de protéger l’intégrité cellulaire. De nouvelles enzymes au fort potentiel antioxydant, les paraoxonases (PON) 1, 2 et 3, ont récemment été identifiées tout au long du tube digestif, mais leurs rôles y restent inconnus. Les cellules intestinales Caco-2/15, qui ont la capacité de se différencier et d’acquérir les caractéristiques physiologiques de l'intestin grêle, ont été utilisées dans le présent travail pour étudier la régulation des PON. Les cellules ont été traitées avec différents effecteurs physiologiques (cytokines, LPS, stress oxydant) et pharmacologiques (fibrates, thiazolidinédiones) et l’expression des leurs gènes et protéines a été évaluée. Les résultats ont mis en lumière la modulation distincte de l’expression des PON par le stress oxydant et l’inflammation. Ceci suggère que chaque PON peut jouer un rôle différent au niveau intestinal et être impliquée dans le maintien de l’homéostasie. La régulation de l’expression des PON a également été largement explorée dans un article de revue. Pour définir le rôle de PON2, celle-ci étant potentiellement la plus importante pour l’homéostasie intestinale, les cellules Caco-2/15 ont été infectées à l’aide de lentivirus contenant des ARN d’interférence, ce qui a fortement réduit l’expression de PON2. En l’absence de PON2, les cellules Caco-2/15 étaient plus susceptibles face à un stress oxydant, la réponse inflammatoire était exacerbée et la perméabilité cellulaire paraissait altérée. Toutes ces composantes sont majeures dans le développement des maladies inflammatoires de l’intestin chez l’humain. De plus, des cellules Caco-2/15 de la PON2, ce qui a renforcé la force de la défense antioxydante cellulaire. Les résultats suggèrent que les PON jouent un rôle dans le maintien de l’homéostasie intestinale et pourraient être impliquées dans l’étiologie et la pathogenèse des maladies inflammatoires de l’intestin.

Analyse génétique moléculaire du gène de la voie non-canonique Frizzled/Dishevelled PRICKLE1 dans les anomalies du tube neural chez l’humain

La voie de la polarité planaire cellulaire (PCP), aussi connue sous le nom de la voie non-canonique du Frizzled/Dishevelled, contrôle le processus morphogénétique de l'extension convergente (CE) qui est essentiel pour la gastrulation et la formation du tube neural pendant l'embryogenèse. La signalisation du PCP a été récemment associée avec des anomalies du tube neural (ATN) dans des modèles animaux et chez l'humain. Prickle1 est une protéine centrale de la voie PCP, exprimée dans la ligne primitive et le mésoderme pendant l'embryogenèse de la souris. La perte ou le gain de fonction de Prickle1 mène à des mouvements de CE fautifs chez le poisson zèbre et la grenouille. PRICKLE1 interagit directement avec deux autres membres de la voie PCP, Dishevelled et Strabismus/Vang. Dans notre étude, nous avons investigué le rôle de PRICKLE1 dans l'étiologie des ATN dans une cohorte de 810 patients par le re-séquençage de son cadre de lecture et des jonctions exon-intron. Le potentiel pathogénique des mutations ainsi identifiées a été évalué par des méthodes bioinformatiques, suivi par une validation fonctionnelle in vivo dans un système poisson zèbre. Nous avons identifié dans notre cohorte un total de 9 nouvelles mutations dont sept: p.Ile69Thr, p.Asn81His, p.Thr275Met, p.Arg682Cys et p.Ser739Phe, p.Val550Met et p.Asp771Asn qui affectent des acides aminés conservés. Ces mutations ont été prédites in silico d’affecter la fonction de la protéine et sont absentes dans une large cohorte de contrôles de même origine ethnique. La co-injection de ces variantes avec le gène prickle1a de type sauvage chez l’embryon de poisson zèbre a démontré qu’une mutation, p.Arg682Cys, modifie dans un sens négatif le phénotype du défaut de la CE produit par pk1 de type sauvage. Notre étude démontre que PK1 peut agir comme facteur prédisposant pour les ATN chez l’humain et élargit encore plus nos connaissances sur le rôle des gènes de la PCP dans la pathogenèse de ces malformations.

Impacts fonctionnels des variants génétiques dans les promoteurs des gènes associés à la survie et à la mort cellulaire

La régulation de l’apoptose est importante dans le maintient de l’homéostasie cellulaire et l’intégrité du matériel génétique. L’apoptose est un mécanisme cellulaire qui élimine les cellules endommagées. Le bon fonctionnement de cette voie biologique est crucial pour contrer la propagation des cellules avec leurs anomalies génétiques. La dérégulation des gènes codants pour des composantes de la voie intrinsèque de l’apoptose est fréquemment observée chez divers types de cancers, incluant la leucémie. Nous proposons que des polymor¬phis¬mes fonctionnels localisés dans la région régulatrice (rSNP) des gènes impliqués dans la voie d’apoptose intrinsèque auraient un impact significatif dans l’oncogenèse en modifiant le taux d’expression de ces gènes. Dans cette étude, nous avons validé, à l’aide d’une combinaison d’approches in silico et in vitro, l’impact fonctionnel de la variabilité génétique sous la forme d’haplotypes (rHAPs), au niveau du promoteur proximal, de 11 gènes codant pour des composantes de la voie intrinsèque de l’apoptose. Pour ce faire, nous avons sous-cloné les rHAPs majeurs dans un vecteur contenant le gène rapporteur luciférase (pGL3b). Ces constructions furent utilisées dans des essais de transfections transitoires dans 3 lignées cellulaires (Hela, Jeg3 et Jurkat). Nous avons observé qu’au moins 2 rHAPs influencent significativement l’activité transcriptionelle de façon allèle spécifique. Ces rHAPs sont associés aux gènes YWHAB et YWHAQ. Les analyses de retard sur gel d’électrophorèse (EMSA) ont permis d’identifier 2 sites de liaison ADN-protéine différentielles dans les rHAPs du gène YWHAB. La variabilité du niveau d’expression des gènes étudiés pourrait contribuer à la susceptibilité interindividuelle de développer un cancer, tel que la leucémie de l’enfant.

Contribution de l’hypoxie et du facteur hif1a à la guérison cutanée chez le cheval

Le cheval est souvent victime de plaies traumatiques, dont la guérison est fréquemment problématique, et ce, principalement quand la plaie survient sur le membre. Il est courant de voir chez le cheval le développement d’un tissu de granulation exubérant ou « bouton de chair », qui mène à une cicatrisation excessive due à la surproduction de tissu fibreux. Ce tissu cicatriciel, non épithélialisé, est caractérisé par une occlusion au niveau de la microcirculation due à l’hypertrophie des cellules endothéliales, qui laisse supposer la présence d’hypoxie tissulaire. Une hypoxie relative a effectivement été mesurée par spectroscopie dans le proche infrarouge au niveau des plaies appendiculaires prédisposées au développement de tissu de granulation exubérant, par rapport aux plaies corporelles. De plus, une étude thermographique a révélé un patron spatial similaire de la perfusion. Au niveau moléculaire, la littérature rapporte que le facteur de transcription «hypoxia inducible factor» (HIF) est à l’origine de plusieurs changements dans les niveaux d’expression de divers gènes régulés par l’hypoxie. L’objectif du présent projet de recherche était de définir la contribution de l’hypoxie à la guérison cutanée chez le cheval. Le premier volet (in vivo) du projet visait à mesurer l’expression protéique temporelle du HIF1A dans des échantillons tissulaires en provenance de plaies cutanées guérissant normalement et d’autres développant une cicatrisation excessive, selon divers sites anatomiques (tronc, membre). Les résultats obtenus suggèrent que la mesure de HIF1A, dans les échantillons pluricellulaires de cette étude, reflète l’épithélialisation de la plaie plutôt que les niveaux d’oxygène tissulaire. En effet, le HIF1A semble réguler l’homéostasie et la prolifération des kératinocytes. Le second volet (in vitro), consistait en la mise en culture de fibroblastes dermiques équins provenant du tronc ou du membre, en condition de normoxie ou d’hypoxie (à 1% d’O2 ou à l’aide d’un mimétique, le CoCl2) afin d’en étudier le comportement (capacités de prolifération et de synthèse protéique). Les résultats obtenus soutiennent une contribution de l’hypoxie à la cicatrisation extensive chez le cheval puisque l’hypoxie favorise la prolifération des fibroblastes en plus d’encourager la synthèse de collagène de type 1 et de diminuer la synthèse de la métalloprotéinase de type 2. Les changements observés semblent dépendre de facteurs extrinsèques (environnementaux) car les fibroblastes dermiques se comportent de façon similaire indépendamment de la provenance anatomique. En somme, les deux volets de l’étude ont permis d’élucider une part des mécanismes sous-jacents à la formation du tissu de granulation exubérant lors de guérison cutanée chez le cheval. La poursuite des recherches dans ce domaine mènera à une meilleure compréhension de la pathologie et ainsi, permettra de développer des méthodes de traitement spécifiques à la condition.

Rôles et régulation du PI(4,5)P2 dans le remodelage cortical et la morphogénèse cellulaire en mitose

Doctorat réalisé en cotutelle avec le laboratoire de François Payre au Centre de Biologie du Développement à Toulouse, France (Université de Toulouse III - Paul Sabatier)

Rôle du cortex pariétal postérieur dans le processus d'intégration visuomotrice - connexions anatomiques avec le cortex moteur et activité cellulaire lors de la locomotion chez le chat

La progression d’un individu au travers d’un environnement diversifié dépend des informations visuelles qui lui permettent d’évaluer la taille, la forme ou même la distance et le temps de contact avec les obstacles dans son chemin. Il peut ainsi planifier en avance les modifications nécessaires de son patron locomoteur afin d’éviter ou enjamber ces entraves. Ce concept est aussi applicable lorsque le sujet doit atteindre une cible, comme un prédateur tentant d’attraper sa proie en pleine course. Les structures neurales impliquées dans la genèse des modifications volontaires de mouvements locomoteurs ont été largement étudiées, mais relativement peu d’information est présentement disponible sur les processus intégrant l’information visuelle afin de planifier ces mouvements. De nombreux travaux chez le primate suggèrent que le cortex pariétal postérieur (CPP) semble jouer un rôle important dans la préparation et l’exécution de mouvements d’atteinte visuellement guidés. Dans cette thèse, nous avons investigué la proposition que le CPP participe similairement dans la planification et le contrôle de la locomotion sous guidage visuel chez le chat. Dans notre première étude, nous avons examiné l’étendue des connexions cortico-corticales entre le CPP et les aires motrices plus frontales, particulièrement le cortex moteur, à l’aide d’injections de traceurs fluorescents rétrogrades. Nous avons cartographié la surface du cortex moteur de chats anesthésiés afin d’identifier les représentations somatotopiques distales et proximales du membre antérieur dans la partie rostrale du cortex moteur, la représentation du membre antérieur située dans la partie caudale de l’aire motrice, et enfin la représentation du membre postérieur. L’injection de différents traceurs rétrogrades dans deux régions motrices sélectionnées par chat nous a permis de visualiser la densité des projections divergentes et convergentes pariétales, dirigées vers ces sites moteurs. Notre analyse a révélé une organisation topographique distincte de connexions du CPP avec toutes les régions motrices identifiées. En particulier, nous avons noté que la représentation caudale du membre antérieur reçoit majoritairement des projections du côté rostral du sillon pariétal, tandis que la partie caudale du CPP projette fortement vers la représentation rostrale du membre antérieur. Cette dernière observation est particulièrement intéressante, parce que le côté caudal du sillon pariétal reçoit de nombreux inputs visuels et sa cible principale, la région motrice rostrale, est bien connue pour être impliquée dans les fonctions motrices volontaires. Ainsi, cette étude anatomique suggère que le CPP, au travers de connexions étendues avec les différentes régions somatotopiques du cortex moteur, pourrait participer à l’élaboration d’un substrat neural idéal pour des processus tels que la coordination inter-membre, intra-membre et aussi la modulation de mouvements volontaires sous guidage visuel. Notre deuxième étude a testé l’hypothèse que le CPP participe dans la modulation et la planification de la locomotion visuellement guidée chez le chat. En nous référant à la cartographie corticale obtenue dans nos travaux anatomiques, nous avons enregistré l’activité de neurones pariétaux, situés dans les portions des aires 5a et 5b qui ont de fortes connexions avec les régions motrices impliquées dans les mouvements de la patte antérieure. Ces enregistrements ont été effectués pendant une tâche de locomotion qui requiert l’enjambement d’obstacles de différentes tailles. En dissociant la vitesse des obstacles de celle du tapis sur lequel le chat marche, notre protocole expérimental nous a aussi permit de mettre plus d’emphase sur l’importance de l’information visuelle et de la séparer de l’influx proprioceptif généré pendant la locomotion. Nos enregistrements ont révélé deux groupes de cellules pariétales activées en relation avec l’enjambement de l’obstacle: une population, principalement située dans l’aire 5a, qui décharge seulement pendant le passage du membre au dessus del’entrave (cellules spécifiques au mouvement) et une autre, surtout localisée dans l’aire 5b, qui est activée au moins un cycle de marche avant l’enjambement (cellules anticipatrices). De plus, nous avons observé que l’activité de ces groupes neuronaux, particulièrement les cellules anticipatrices, était amplifiée lorsque la vitesse des obstacles était dissociée de celle du tapis roulant, démontrant l’importance grandissante de la vision lorsque la tâche devient plus difficile. Enfin, un grand nombre des cellules activées spécifiquement pendant l’enjambement démontraient une corrélation soutenue de leur activité avec le membre controlatéral, même s’il ne menait pas dans le mouvement (cellules unilatérales). Inversement, nous avons noté que la majorité des cellules anticipatrices avaient plutôt tendance à maintenir leur décharge en phase avec l’activité musculaire du premier membre à enjamber l’obstacle, indépendamment de sa position par rapport au site d’enregistrement (cellules bilatérales). Nous suggérons que cette disparité additionnelle démontre une fonction diversifiée de l’activité du CPP. Par exemple, les cellules unilatérales pourraient moduler le mouvement du membre controlatéral au-dessus de l’obstacle, qu’il mène ou suive dans l’ordre d’enjambement, tandis que les neurones bilatéraux sembleraient plutôt spécifier le type de mouvement volontaire requis pour éviter l’entrave. Ensembles, nos observations indiquent que le CPP a le potentiel de moduler l’activité des centres moteurs au travers de réseaux corticaux étendus et contribue à différents aspects de la locomotion sous guidage visuel, notamment l’initiation et l’ajustement de mouvements volontaires des membres antérieurs, mais aussi la planification de ces actions afin d’adapter la progression de l’individu au travers d’un environnement complexe.

Génomique fonctionnelle des cellules corticotropes hypophysaires : contrôle génétique de la gestion systémique des stress

L'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) permet de maintenir l'homéostasie de l'organisme face à divers stress. Qu'ils soient de nature psychologique, physique ou inflammatoire/infectieux, les stress provoquent la synthèse et la libération de CRH par l'hypothalamus. Les cellules corticotropes hypophysaires perçoivent ce signal et en réaction, produisent et sécrètent l'ACTH. Ceci induit la synthèse des glucocorticoïdes (Gc) par le cortex surrénalien; ces stéroïdes mettent le système métabolique en état d’alerte pour la réponse au stress et à l’agression. Les Gc ont le rôle essentiel de contrôler les défenses de l'organisme, en plus d'exercer une rétro-inhibition sur l'axe HPA. L'ACTH est une petite hormone peptidique produite par le clivage d'un précurseur: la pro-opiomélanocortine (POMC). À cause de sa position critique dans la normalisation de l'homéostasie, le contrôle transcriptionnel du gène Pomc a fait l'objet d'études approfondies au cours des dernières décennies. Nous savons maintenant que la région promotrice du gène Pomc permet une expression ciblée dans les cellules POMC hypophysaires. L'étude du locus Pomc par des technologies génomiques m'a permis de découvrir un nouvel élément de régulation qui est conservé à travers l'évolution des mammifères. La caractérisation de cet enhancer a démontré qu'il dirige une expression restreinte à l'hypophyse, et plus particulièrement dans les cellules corticotropes. De façon intéressante, l'activité de cet élément dépend d'un nouveau site de liaison recrutant un homodimère du facteur de transcription Tpit, dont l'expression est également limitée aux cellules POMC de l'hypophyse. La découverte de cet enhancer ajoute une toute nouvelle dimension à la régulation de l'expression de POMC. Les cytokines pro-inflammatoires IL6/LIF et les Gc sont connus pour leur antagonisme sur la réaction inflammatoire et sur le promoteur Pomc via l'action des facteurs de transcription Stat3 et GR respectivement. L'analyse génomique des sites liés ii par ces deux facteurs nous a révélé une interrelation complexe et a permis de définir un code transcriptionnel entre ces voies de signalisation. En plus de leur action par interaction directe avec l’ADN au niveau des séquences régulatrices, ces facteurs interagissent directement entre eux avec des résultats transcriptionnels différents. Ainsi, le recrutement de GR par contact protéine:protéine (tethering) sur Stat3 étant lié à l'ADN provoque un antagonisme transcriptionnel. Inversement, le tethering de Stat3 sur GR supporte une action synergique, tout comme leur co-recrutement à l'ADN sur des sites contigus ou composites. Lors d'une activation soutenue, ce synergisme entre les voies IL6/LIF et Gc induit une réponse innée de défense cellulaire. Ainsi lors d'un stress majeur, ce mécanisme de défense est mis en branle dans toutes les cellules et tissus. En somme, les travaux présentés dans cette thèse définissent les mécanismes transcriptionnels engagés dans le combat de l'organisme contre les stress. Plus particulièrement, ces mécanismes ont été décrits au niveau de la réponse globale des corticotropes et du gène Pomc. Il est essentiel pour l'organisme d'induire adéquatement ces mécanismes afin de faire face aux stress et d'éviter des dérèglements comme les maladies inflammatoires et métaboliques.