Alternative splicing by hnRNP L as a new modulator of hematopoietic cell differentiation, survival and migration

Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN messager (ARNm), comme l’épissage alternatif, jouent un rôle important dans la régulation du développement embryonnaire, de la fonction cellulaire et de l’immunité. De nouvelles évidences révèlent que l’épissage alternatif serait également impliqué dans la régulation de la maturation et de l’activation des cellules du système hématopoïétique. Le facteur hnRNP L a été identifié comme étant le principal régulateur de l’épissage alternatif du gène codant pour le récepteur CD45 in vitro. Le récepteur CD45 est une tyrosine phosphatase exprimée par toutes les cellules du système hématopoïétique qui contrôle le développement et l’activation des lymphocytes T. Dans un premier temps, nous avons étudié la fonction du facteur hnRNP L dans le développement des lymphocytes T et dans l’épissage de l’ARNm de CD45 in vivo en utilisant des souris dont le gène de hnRNP L a été supprimé spécifiquement dans les cellules T. La délétion de hnRNP L dans les thymocytes résulte en une expression aberrante des différents isoformes de CD45 avec une prédominance de l'isoforme CD45RA qui est généralement absent dans le thymus. Une conséquence de la délétion de hnRNP L est une diminution de la cellularité du thymus causée par un blocage partiel du développement des cellules pré-T au stade DN4. Cette réduction du nombre de cellules dans le thymus n’est pas liée à une hausse de la mort cellulaire. Les thymocytes déficients pour hnRNP L démontrent plutôt une prolifération augmentée comparée aux thymocytes sauvages due à une hyper-activation des kinases Lck, Erk1/2 et Akt. De plus, la délétion de hnRNP L dans le thymus cause une perte des cellules T en périphérie. Les résultats des expériences in vitro suggèrent que cette perte est principalement due à un défaut de migration des thymocytes déficients pour hnRNP L du thymus vers la périphérie en réponse aux chimiokines. L’épissage alternatif de CD45 ne peut expliquer ce phénotype mais l’identification de cibles par RNA-Seq a révélé un rôle de hnRNP L dans la régulation de l’épissage alternatif de facteurs impliqués dans la polymérisation de l’actine. Dans un second temps, nous avons étudié le rôle de hnRNP L dans l’hématopoïèse en utilisant des souris dont la délétion de hnRNP L était spécifique aux cellules hématopoïétiques dans les foies fœtaux et la moelle osseuse. L’ablation de hnRNP L réduit le nombre de cellules progénitrices incluant les cellules progénitrices lymphocytaires (CLPs), myéloïdes (CMPs, GMPs) et mégakaryocytes-érythrocytaires (MEPs) et une perte des cellules hématopoïétiques matures. À l’opposé des cellules progénitrices multipotentes (MPPs) qui sont affectées en absence de hnRNP L, la population de cellules souches hématopoïétiques (HSCs) n’est pas réduite et prolifère plus que les cellules contrôles. Cependant, les HSCs n’exprimant pas hnRNP L sont positives pour l'Annexin V et expriment CD95 ce qui suggère une mort cellulaire prononcée. Comme pour les thymocytes, une analyse par RNA-Seq des foies fœtaux a révélé différents gènes cibles de hnRNP L appartenant aux catégories reliées à la mort cellulaire, la réponse aux dommages à l’ADN et à l’adhésion cellulaire qui peuvent tous expliquer le phénotype des cellules n’exprimant pas le gène hnRNP L. Ces résultats suggèrent que hnRNP L et l’épissage alternatif sont essentiels pour maintenir le potentiel de différenciation des cellules souches hématopoïétiques et leur intégrité fonctionnelle. HnRNP L est aussi crucial pour le développement des cellules T par la régulation de l’épissage de CD45 ainsi que pour leur migration.

Remodelage du muscle lisse péribronchique dans l’inflammation respiratoire chronique

Le souffle chez les chevaux et l’asthme chez l’humain sont des maladies respiratoires qui partagent plusieurs caractéristiques, notamment des épisodes de bronchospasme et de détresse respiratoire dus à une inflammation pulmonaire inappropriée en réponse à une inhalation de substances antigéniques. Les manifestations cliniques incluent des efforts respiratoires augmentés, des sifflements et de la toux. Au niveau des voies respiratoires, on observe une augmentation du muscle lisse péribronchique, une fibrose sous épithéliale, une métaplasie/hyperplasie épithéliale et du mucus en quantité augmentée. L’augmentation du muscle lisse est particulièrement importante car elle n’affecte pas seulement le calibre basal des voies respiratoires, mais elle accentue l’obstruction respiratoire lors de bronchoconstriction. Ces changements sont regroupés sous le terme de « remodelage » et sont associés à un déclin accéléré de la fonction respiratoire chez les patients asthmatiques. Alors que les traitements actuels contrôlent efficacement le bronchospasme et relativement bien l’inflammation, leurs effets sur le remodelage sont mal connus. Dans le cadre de thèse, la réversibilité du remodelage musculaire péribronchique a été investiguée chez des chevaux atteints du souffle dans deux études longitudinales. Ces études, faites principalement sur du tissu pulmonaire prélevé par thoracoscopie, sont difficilement réalisables chez l’humain pour des raisons éthiques, ou chez d’autres animaux, car ceux-ci présentent rarement une inflammation de type asthmatique de façon spontanée. Les résultats démontrent que les chevaux atteints du souffle ont approximativement deux fois plus de muscle péribronchique que les chevaux sains d’âge similaire gardés dans les mêmes conditions, et que la prolifération des myocytes contribue à cette augmentation. Ils démontrent aussi qu’une stimulation antigénique relativement brève chez des chevaux atteints du souffle depuis plusieurs années n’accentue pas le remodelage, ce qui suggère que l’augmentation du muscle lisse atteint un plateau. Nous avons également montré que le remodelage du muscle lisse chez des chevaux adultes est partiellement réversible et que cette réversibilité peut être accélérée par l’administration de corticostéroïdes par inhalation. Il semble toutefois qu’une portion du remodelage chronique est irréversible puisque les corticostéroïdes ont accéléré la diminution du muscle mais sans toutefois mener à une amélioration plus marquée au terme de l’étude qu’avec une modification environnementale stricte. La diminution de trente pourcent observée sur un an paraît modeste mais elle démontre clairement, et pour une première fois, que le remodelage du muscle lisse présent chez des chevaux adultes malades depuis plusieurs années est au moins partiellement réversible.

Structure-fonction de MARCH1, une E3 ubiquitine ligase régulant la présentation antigénique par le CMH II

Les molécules classiques du CMH de classe II sont responsables de la présentation de peptides exogènes par les cellules présentatrices d’antigène aux lymphocytes T CD4+. Cette présentation antigénique est essentielle à l’établissement d’une réponse immunitaire adaptative. Cependant, la reconnaissance d’auto-antigènes ainsi que l’élimination des cellules du Soi sont des problèmes à l’origine de nombreuses maladies auto-immunes. Notamment, le diabète et la sclérose en plaque. D’éventuels traitements de ces maladies pourraient impliquer la manipulation de la présentation antigénique chez les cellules dont la reconnaissance et l’élimination engendrent ces maladies. Il est donc primordial d’approfondir nos connaissances en ce qui concerne les mécanismes de régulation de la présentation antigénique. La présentation antigénique est régulée tant au niveau transcriptionnel que post-traductionnel. Au niveau post-traductionnel, diverses cytokines affectent le processus. Parmi celles-ci, l’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, cause une rétention intracellulaire des molécules du CMH II. Son mécanisme d’action consiste en l’ubiquitination de la queue cytoplasmique de la chaîne bêta des molécules de CMH II. Cette modification protéique est effectuée par MARCH1, une E3 ubiquitine ligase dont l’expression est restreinte aux organes lymphoïdes secondaires. Jusqu’à tout récemment, il y avait très peu de connaissance concernant la structure et les cibles de MARCH1. Considérant son impact majeur sur la présentation antigénique, nous nous sommes intéressé à la structure-fonction de cette molécule afin de mieux caractériser sa régulation ainsi que les diverses conditions nécessaires à son fonctionnement. Dans un premier article, nous avons étudié la régulation de l’expression de MARCH1 au niveau protéique. Nos résultats ont révélé l’autorégulation de la molécule par formation de dimères et son autoubiquitination. Nous avons également démontré l’importance des domaines transmembranaires de MARCH1 dans la formation de dimères et l’interaction avec le CMH II. Dans un second article, nous avons investigué l’importance de la localisation de MARCH1 pour sa fonction. Les résultats obtenus montrent la fonctionnalité des motifs de localisation de la portion C-terminale de MARCH1 ainsi que la présence d’autres éléments de localisation dans la portion N-terminale de la protéine. Les nombreux mutants utilisés pour ce projet nous ont permis d’identifier un motif ‘‘VQNC’’, situé dans la portion cytoplasmique C-terminale de MARCH1, dont la valine est requise au fonctionnement optimal de la molécule. En effet, la mutation de la valine engendre une diminution de la fonction de la molécule et des expériences de BRET ont démontré une modification de l’orientation spatiale des queues cytoplasmiques. De plus, une recherche d’homologie de séquence a révélé la présence de ce même motif dans d’autres ubiquitines ligases, dont Parkin. Parkin est fortement exprimée dans le cerveau et agirait, entre autre, sur la dégradation des agrégats protéiques. La dysfonction de Parkin cause l’accumulation de ces agrégats, nommés corps de Lewy, qui entraînent des déficiences au niveau du fonctionnement neural observé chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. La valine comprise dans le motif ‘’VQNC’’ a d’ailleurs été identifiée comme étant mutée au sein d’une famille où cette maladie est génétiquement transmise. Nous croyons que l’importance de ce motif ne se restreint pas à MARCH1, mais serait généralisée à d’autres E3 ligases. Ce projet de recherche a permis de caractériser des mécanismes de régulation de MARCH1 ainsi que de découvrir divers éléments structuraux requis à sa fonction. Nos travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes de contrôle de la présentation antigénique par les molécules de CMH II.

Les cadres de lectures alternatifs : une approche non-conventionnelle pour le développement de vecteurs vaccinaux

Introduction: Les cadres de lectures alternatifs (CLA) sont utilisés par de multiples virus afin de générer plusieurs protéines à partir d'une seule séquence nucléotidique. Les épitopes dits « cryptiques », c’est-à-dire les épitopes dérivés de protéines codées dans des CLAs, ont étés dernièrement l’objet de différentes études portant sur la réponse immunitaire antivirale et les lymphocytes T cytotoxiques. Méthodologie: Afin de vérifier le potentiel immunogène d'épitopes encodés dans des CLAs programmés, trois cassettes ont été construites pour mener à l'expression de trois épitopes bien caractérisés (épitope GAG77–85 du virus de l'immunodéficience humaine de type 1; épitope NS31406-1415 du virus de l'hépatite C; épitope core18-27 du virus de l'hépatite B) à partir de trois cadres de lectures superposés. La première cassette permet une initiation alternative de la traduction, la deuxième comprend deux signaux bipartites en tandem permettant un frameshift ribosomique et la troisième est une cassette contrôle. Ces éléments ont été introduits dans des vecteurs adénoviraux. Les virions générés ont servi à immuniser des souris C57BL/6 transgéniques pour HLA-A*0201 et HLA-DR1. La réponse immunitaire induite une semaine post-immunisation a été mesurée par essai ELISpot IFN . Résultats: Dans le contexte de cassettes vaccinales, les peptides dérivés d'une initiation alternative de traduction et de changement de cadre de lecture ribosomique ribosomal peuvent être exprimés et détectés par le système immunitaire dans un modèle animal. Conclusion: Ces expériences suggèrent la possibilité de développer de nouvelles stratégies vaccinales dans le but de prévenir ou de guérir certaines maladies associées aux infections virales chroniques telles que celles causées par le virus de l’immunodéficience humaine et le virus de l’hépatite C.

Étude génétique et fonctionnelle des Interferon-producing Killer Dendritic Cells

L’idée qu’une cellule puisse effectuer la cytolyse de cellules transformées, comme une cellule Natural Killer (NK), tout en ayant la capacité de présenter des antigènes, comme une cellule dendritique (DC), peut sembler fantaisiste. Cependant, de telles cellules furent bel et bien identifiées chez la souris en 2006. Ces cellules, nommées Interferon-producing Killer Dendritic Cells (IKDC), furent l’objet d’une caractérisation extensive qui révéla leur énorme potentiel immunologique. La combinaison de fonctions associées à des cellules NK et à des DC a doté les IKDC d’un pouvoir antitumoral remarquable. D’ailleurs, il a été démontré que les IKDC sont plus efficaces que les cellules NK pour limiter la croissance tumorale. Ainsi, suite à leur découverte, les IKDC ont suscité beaucoup d’intérêt. Cependant, une controverse émergea sur la nature des IKDC. Plusieurs groupes indépendants tentèrent de reproduire les expériences attestant les fonctions de DC des IKDC, sans y parvenir. De plus, des études additionnelles révélèrent que les IKDC possèdent des similitudes très importantes avec les cellules NK. Ces observations ont mené la communauté scientifique à suggérer que les IKDC sont des cellules NK en état d’activation (aNK). Malgré cette controverse, les caractéristiques antitumorales des IKDC sont si uniques et considérables qu’il est primordial de poursuivre l’étude de ces cellules. Pour y arriver, il est essentiel de déterminer la nature des IKDC et de mettre fin à ce débat. Par la suite, il sera important d’identifier des façons de cibler spécifiquement les IKDC pour permettre leur usage dans le cadre de thérapies antitumorales. Ainsi, l’objectif de cette thèse est de définir l’identité des IKDC, puis de déterminer les facteurs génétiques responsables de la régulation de ces cellules. Nous avons démontré que les IKDC ne sont pas des cellules aNK, contrairement à ce qui avait été suggéré. Nous avons constaté que les IKDC prolifèrent activement et possèdent un phénotype unique, des caractéristiques associées à des cellules NK très immatures. Afin de déterminer si les IKDC peuvent acquérir un phénotype mature, nous avons effectué des expériences de transfert adoptif. Suite à leur injection in vivo, les IKDC acquièrent un phénotype de cellules matures, mais étonnamment, elles se différencient aussi en cellules NK. Ainsi, nous avons révélé que les IKDC sont un intermédiaire dans la différenciation des cellules NK. En parallèle, nous avons démontré que la proportion d’IKDC varie grandement entre des souris de fond génétique différent, indiquant que des facteurs génétiques sont impliqués dans la régulation de ces cellules. Nous avons alors effectué une analyse génétique qui a révélé que les IKDC sont régulées par des facteurs génétiques compris dans une région distale du chromosome 7. Les résultats présentés dans cette thèse constituent une avancée importante pour la recherche sur les IKDC. Ils ont permis de définir la nature des IKDC et d’identifier un intervalle génétique impliqué dans la régulation de ces cellules. Ces découvertes sont des connaissances précieuses pour l’identification des IKDC chez l’Homme et la création de nouvelles thérapies dans la lutte contre le cancer.

Antigen and superantigen presentation as defined by the MHCII-accessory proteins and associated-peptides

MHCII molecules expose a weave of antigens, which send survival or activation signals to T lymphocytes. The ongoing process of peptide binding to the MHC class II groove implicates three accessory molecules: the invariant chain, DM and DO. The invariant chain folds and directs the MHCII molecules to the endosomal pathway. Then, DM exchanges the CLIP peptide, which is a remnant of the degraded invariant chain, for peptides of better affinity. Expressed in highly specialized antigen presenting cells, DO competes with MHCII molecules for DM binding and favors the presentation of receptor-internalized antigens. Altogether, these molecules exhibit potential immunomodulatory properties that can be exploited to increase the potency of peptide vaccines. DO requires DM for maturation and to exit the ER. Interestingly, it is possible to monitor this interaction through a conformation change on DOβ that is recognized by the Mags.DO5 monoclonal antibody. Using Mags.DO5, we showed that DM stabilizes the interactions between the DO α1 and β1 chains and that DM influences DO folding in the ER. Thus, the Mags.DO5+ conformation correlates with DO egress from the ER. To further evaluate this conformation change, directed evolution was applied to DO. Of the 41 unique mutants obtained, 25% were localized at the DM-DO binding interface and 12% are at the solvent-exposed β1 domain, which is thought to be the Mags.DO5 epitope. In addition, I used the library to test the ability of HLA-DO to inhibit HLA-DM and sorted for the amount of CLIP. Interestingly, most of the mutants showed a decrease inhibitory effect, supporting the notion that the intrinsic instability of DO is a required for its function. Finally, these results support the model in which DO competes against classical MHCII molecules by sequestering DM chaperone’s function. MHCII molecules are also characterized by their ability to present superantigens, a group of bacterial or viral toxins that coerces MHCII-TCR binding in a less promiscuous fashion than what is observed in a canonical setting. While the mechanism of how bacterial superantigens form trimeric complexes with TCR and MHCII is well understood, the mouse mammary tumor virus superantigens (vSAG) are poorly defined. In the absence of a crystal structure, I chose a functional approach to examine the relation between vSAG, MHCII and TCR with the goal of uncovering the overall trimolecular architecture. I showed that TCR concomitantly binds both the MHCII α chain and the vSAG and that TCR-MHCII docking is almost canonical when coerced by vSAGs. Because many peptides may be tolerated in the MHCII groove, the pressure exerted by vSAG seems to tweak conventional TCR-MHCII interactions. Furthermore, my results demonstrate that vSAG binding to MHCII molecules is conformation-dependent and abrogated by the CLIP amino-terminal residues extending outside the peptide-binding groove. In addition, they also suggest that vSAGs cross-link adjacent MHCIIs and activate T cells via a TGXY motif.

Étude de l’impact de la grossesse sur l’hépatite auto-immune dans un modèle expérimental murin

L’hépatite auto-immune (HAI) est une maladie chronique caractérisée par une destruction progressive du parenchyme hépatique par le système immunitaire. La majorité des patients atteints d’HAI sont des femmes (75% à 90% des cas). L’amélioration des traitements au cours des dernières années a permis à un grand nombre de ces femmes de devenir enceintes. Pendant la grossesse, une rémission spontanée de la maladie a pu être observée chez les femmes atteintes d’HAI. Cette rémission est temporaire et elle est généralement suivie d’une rechute suite à l’accouchement (post-partum). Les causes exactes de cette rémission associée à la grossesse et de la rechute post-partum ne sont pas connues à ce jour. Nous avons donc tenté de reproduire ces phénomènes dans un modèle murin d’HAI développé dans notre laboratoire, afin de déterminer les mécanismes possiblement impliqués. Notre modèle d’HAI consiste en une xéno-immunisation de souris C57BL/6 avec les auto-antigènes impliqués dans l’HAI de type 2 chez l’humain. Nous avons ainsi accouplées des souris préalablement xéno-immunisées, puis nous les avons sacrifiées au début de la 3e semaine de gestation ou 2 à 3 semaines post-partum, afin d’évaluer les dommages hépatiques et afin d’étudier la réponse immunitaire. Comme chez les femmes atteintes d’HAI, les souris présentent une rémission de la maladie pendant la grossesse. Nous en sommes venus à cette conclusion par l’observation d’une diminution de l’inflammation hépatique, des niveaux de transaminases sériques et des titres d’auto-anticorps circulants. À l’inverse des humains, les souris xéno-immunisées ne présentent pas de rechute post-partum. Une analyse des cellules régulatrices (cellules T régulatrices et cellules B productrices d'IL-10) suggère une implication des Tregs hépatiques dans la rémission, car ceux-ci sont augmentés pendant la gestation. Ces Tregs hépatiques sont majoritairement d’origine thymique et ne semblent pas particulièrement attirés au foie en réponse à l’inflammation. La polarisation TH2 est un phénomène connu pendant la grossesse, par contre elle ne semble pas influencer la réponse auto-immune dans nos souris. Une meilleure compréhension des mécanismes d’immunosuppression observés lors de la grossesse pourrait mener au développement d’une thérapie mieux ciblée.

Systems biology of the human MHC class I immunopeptidome

Le système de différenciation entre le « soi » et le « non-soi » des vertébrés permet la détection et le rejet de pathogènes et de cellules allogéniques. Il requiert la surveillance de petits peptides présentés à la surface cellulaire par les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I). Les molécules du CMH I sont des hétérodimères composés par une chaîne lourde encodée par des gènes du CMH et une chaîne légère encodée par le gène β2-microglobuline. L’ensemble des peptides est appelé l’immunopeptidome du CMH I. Nous avons utilisé des approches en biologie de systèmes pour définir la composition et l’origine cellulaire de l’immunopeptidome du CMH I présenté par des cellules B lymphoblastoïdes dérivés de deux pairs de fratries avec un CMH I identique. Nous avons découvert que l’immunopeptidome du CMH I est spécifique à l’individu et au type cellulaire, qu’il dérive préférentiellement de transcrits abondants, est enrichi en transcrits possédant d’éléments de reconnaissance par les petits ARNs, mais qu’il ne montre aucun biais ni vers les régions génétiques invariables ni vers les régions polymorphiques. Nous avons également développé une nouvelle méthode qui combine la spectrométrie de masse, le séquençage de nouvelle génération et la bioinformatique pour l’identification à grand échelle de peptides du CMH I, dont ceux résultants de polymorphismes nucléotidiques simples non-synonymes (PNS-ns), appelés antigènes mineurs d’histocompatibilité (AMHs), qui sont les cibles de réponses allo-immunitaires. La comparaison de l’origine génomique de l’immunopeptidome de soeurs avec un CMH I identique a révélé que 0,5% des PNS-ns étaient représentés dans l’immunopeptidome et que 0,3% des peptides du CMH I seraient immunogéniques envers une des deux soeurs. En résumé, nous avons découvert des nouveaux facteurs qui modèlent l’immunopeptidome du CMH I et nous présentons une nouvelle stratégie pour l’indentification de ces peptides, laquelle pourrait accélérer énormément le développement d’immunothérapies ciblant les AMHs.

L'expression de la protéine de l'hémochromatose HFE est modulée par les lymphocytes T activés et inhibe la présentation antigénique par MHC I

La présentation antigénique par le complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) I est un processus ubiquitaire permettant la présentation de protéines endogènes qui reflètent l'état de la cellule à la surface cellulaire aux lymphocytes T CD8+ dans le contexte de la surveillance et la réponse immunitaires. Ainsi, l'expression des molécules du MHC I classiques est induite en réponse aux stimuli inflammatoires afin de favoriser la reconnaissance immunitaire et l'élimination des pathogènes. HFE est une molécule du MHC Ib non-classique qui sert de régulateur négatif de l'absorption du fer. HFE est associé au développement de l'hémochromatose héréditaire (HH), maladie associée au métabolisme du fer mais souvent accompagnée de défauts immunitaires. Ainsi, nous avons en premier lieu étudié l'impact de HFE sur la présentation antigénique par MHC I, afin d'expliquer en partie les défauts immunitaires liés à l'HH associée à HFEC282Y. Puis, compte tenu de l'impact de l'inflammation sur l'expression des molécules du MHC I classiques, nous avons étudié la régulation de l'expression de HFE en réponse aux stimuli inflammatoires induits par les cellules du sang périphérique mononucléées (PBMC). Nous avons mis au point un système d’expression antigénique dans lequel nous contrôlons l’expression de MHC I, de HFE et d’un antigène pour lequel nous avons généré des lymphocytes T CD8+ spécifiques. Nos résultats démontrent que la forme sauvage de HFE (HFEWT), contrairement à sa forme mutée (HFEC282Y), inhibe la reconnaissance de complexes MHC I/peptide (pMHC). Nous avons également démontré que l'inhibition de la reconnaissance est maintenue, indépendamment des niveaux d'expression de MHC I à la surface, d'une compétition pour la β2-microglobuline, de la capacité de HFE d'interagir avec le récepteur de la transferrine, de l'origine de l'antigène ou de l'affinité de celui-ci. Par ailleurs, nous avons identifié les domaines α1-2 de HFEWT comme étant responsables de l'inhibition de la reconnaissance antigénique. Par contre, la reconnaissance de peptides chargés de manière externe sur les molécules du MHC I présentes à la surface n'a démontré aucune inhibition en présence de HFEWT, suggérant que HFEWT pourrait affecter la reconnaissance en interférant avec le processus d'apprêtement antigénique intracellulaire. À l’inverse, nous avons souhaité déterminer si les lymphocytes T activés pouvaient influencer les niveaux d'expression de HFE. En termes de régulation de l'expression de HFE, nous avons établi que HFE est exprimé dans les tissus sains chez l'humain et induit chez les lignées de cancers du colon, du sein, du poumon, du rein et du mélanome. Par ailleurs, en co-cultivant des lymphocytes T activés avec ces lignées tumorales, nous avons démontré que l'expression de HFE est fortement inhibée dans toutes ces lignées tumorales lorsqu'exposées à des lymphocytes T activés. Finalement, la modulation de l'expression de HFE est indépendante du contact cellulaire et semble médiée en partie par le GM-CSF, l'IFN-γ et le TNF. En somme, ces résultats suggèrent que les lymphocytes T de l'hôte modulent l'expression de HFE dans le microenvironnement inflammatoire, ce qui pourrait promouvoir la reconnaissance des antigènes présentés sur les molécules du MHC I présentées aux lymphocytes T CD8+ antigène-spécifiques. De plus, ces études soulèvent la possibilité d'un nouveau rôle physiologique de HFEWT dans la voie de présentation antigénique par MHC I, qui pourrait moduler l'immunogénicité des antigènes et la réponse immunitaire cellulaire chez l'hôte.

Molecular characterization of the contribution of autophagy to antigen presentation using quantitative proteomics

L’autophagie est une voie hautement conservée de dégradation lysosomale des constituants cellulaires qui est essentiel à l’homéostasie cellulaire et contribue à l’apprêtement et à la présentation des antigènes. Les rôles relativement récents de l'autophagie dans l'immunité innée et acquise sous-tendent de nouveaux paradigmes immunologiques pouvant faciliter le développement de nouvelles thérapies où la dérégulation de l’autophagie est associée à des maladies auto-immunes. Cependant, l'étude in vivo de la réponse autophagique est difficile en raison du nombre limité de méthodes d'analyse pouvant fournir une définition dynamique des protéines clés impliquées dans cette voie. En conséquence, nous avons développé un programme de recherche en protéomique intégrée afin d’identifier et de quantifier les proteines associées à l'autophagie et de déterminer les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l’autophagosome dans la présentation antigénique en utilisant une approche de biologie des systèmes. Pour étudier comment l'autophagie et la présentation antigénique sont activement régulés dans les macrophages, nous avons d'abord procédé à une étude protéomique à grande échelle sous différentes conditions connues pour stimuler l'autophagie, tels l’activation par les cytokines et l’infection virale. La cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) est l'une des principales cytokines pro-inflammatoires qui intervient dans les réactions locales et systémiques afin de développer une réponse immune adaptative. La protéomique quantitative d'extraits membranaires de macrophages contrôles et stimulés avec le TNF-alpha a révélé que l'activation des macrophages a entrainé la dégradation de protéines mitochondriales et des changements d’abondance de plusieurs protéines impliquées dans le trafic vésiculaire et la réponse immunitaire. Nous avons constaté que la dégradation des protéines mitochondriales était sous le contrôle de la voie ATG5, et était spécifique au TNF-alpha. En outre, l’utilisation d’un nouveau système de présentation antigènique, nous a permi de constater que l'induction de la mitophagie par le TNF-alpha a entrainée l’apprêtement et la présentation d’antigènes mitochondriaux par des molécules du CMH de classe I, contribuant ainsi la variation du répertoire immunopeptidomique à la surface cellulaire. Ces résultats mettent en évidence un rôle insoupçonné du TNF-alpha dans la mitophagie et permet une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la présentation d’auto-antigènes par les molécules du CMH de classe I. Une interaction complexe existe également entre infection virale et l'autophagie. Récemment, notre laboratoire a fourni une première preuve suggérant que la macroautophagie peut contribuer à la présentation de protéines virales par les molécules du CMH de classe I lors de l’infection virale par l'herpès simplex virus de type 1 (HSV-1). Le virus HSV1 fait parti des virus humains les plus complexes et les plus répandues. Bien que la composition des particules virales a été étudiée précédemment, on connaît moins bien l'expression de l'ensemble du protéome viral lors de l’infection des cellules hôtes. Afin de caractériser les changements dynamiques de l’expression des protéines virales lors de l’infection, nous avons analysé par LC-MS/MS le protéome du HSV1 dans les macrophages infectés. Ces analyses nous ont permis d’identifier un total de 67 protéines virales structurales et non structurales (82% du protéome HSV1) en utilisant le spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Nous avons également identifié 90 nouveaux sites de phosphorylation et de dix nouveaux sites d’ubiquitylation sur différentes protéines virales. Suite à l’ubiquitylation, les protéines virales peuvent se localiser au noyau ou participer à des événements de fusion avec la membrane nucléaire, suggérant ainsi que cette modification pourrait influer le trafic vésiculaire des protéines virales. Le traitement avec des inhibiteurs de la réplication de l'ADN induit des changements sur l'abondance et la modification des protéines virales, mettant en évidence l'interdépendance des protéines virales au cours du cycle de vie du virus. Compte tenu de l'importance de la dynamique d'expression, de l’ubiquitylation et la phosphorylation sur la fonction des proteines virales, ces résultats ouvriront la voie vers de nouvelles études sur la biologie des virus de l'herpès. Fait intéressant, l'infection HSV1 dans les macrophages déclenche une nouvelle forme d'autophagie qui diffère remarquablement de la macroautophagie. Ce processus, appelé autophagie associée à l’enveloppe nucléaire (nuclear envelope derived autophagy, NEDA), conduit à la formation de vésicules membranaires contenant 4 couches lipidiques provenant de l'enveloppe nucléaire où on retrouve une grande proportion de certaines protéines virales, telle la glycoprotéine B. Les mécanismes régissant NEDA et leur importance lors de l’infection virale sont encore méconnus. En utilisant un essai de présentation antigénique, nous avons pu montrer que la voie NEDA est indépendante d’ATG5 et participe à l’apprêtement et la présentation d’antigènes viraux par le CMH de classe I. Pour comprendre l'implication de NEDA dans la présentation des antigènes, il est essentiel de caractériser le protéome des autophagosomes isolés à partir de macrophages infectés par HSV1. Aussi, nous avons développé une nouvelle approche de fractionnement basé sur l’isolation de lysosomes chargés de billes de latex, nous permettant ainsi d’obtenir des extraits cellulaires enrichis en autophagosomes. Le transfert des antigènes HSV1 dans les autophagosomes a été determine par protéomique quantitative. Les protéines provenant de l’enveloppe nucléaire ont été préférentiellement transférées dans les autophagosome lors de l'infection des macrophages par le HSV1. Les analyses protéomiques d’autophagosomes impliquant NEDA ou la macroautophagie ont permis de decouvrir des mécanismes jouant un rôle clé dans l’immunodominance de la glycoprotéine B lors de l'infection HSV1. Ces analyses ont également révélées que diverses voies autophagiques peuvent être induites pour favoriser la capture sélective de protéines virales, façonnant de façon dynamique la nature de la réponse immunitaire lors d'une infection. En conclusion, l'application des méthodes de protéomique quantitative a joué un rôle clé dans l'identification et la quantification des protéines ayant des rôles importants dans la régulation de l'autophagie chez les macrophages, et nous a permis d'identifier les changements qui se produisent lors de la formation des autophagosomes lors de maladies inflammatoires ou d’infection virale. En outre, notre approche de biologie des systèmes, qui combine la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse avec des essais fonctionnels tels la présentation antigénique, nous a permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l'autophagie lors de la présentation antigénique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra de réduire les effets nuisibles de l'immunodominance suite à l'infection virale ou lors du développement du cancer en mettant en place une réponse immunitaire appropriée.

Potential use of a recombinant replication-defective adenovirus vector carrying the C-terminal portion of the P97 adhesin protein as a vaccine against Mycoplasma hyopneumoniae in swine.

Mycoplasma hyopneumoniae causes severe economic losses to the swine industry worldwide and the prevention of its related disease, enzootic porcine pneumonia, remains a challenge. The P97 adhesin protein of M. hyopneumoniae should be a good candidate for the development of a subunit vaccine because antibodies produced against P97 could prevent the adhesion of the pathogen to the respiratory epithelial cells in vitro. In the present study, a P97 recombinant replication-defective adenovirus (rAdP97c) subunit vaccine efficiency was evaluated in pigs. The rAdP97c vaccine was found to induce both strong P97 specific humoral and cellular immune responses. The rAdP97c vaccinated pigs developed a lower amount of macroscopic lung lesions (18.5 ± 9.6%) compared to the unvaccinated and challenged animals (45.8 ± 11.5%). rAdP97c vaccine reduced significantly the severity of inflammatory response and the amount of M. hyopneumoniae in the respiratory tract. Furthermore, the average daily weight gain was slightly improved in the rAdP97c vaccinated pigs (0.672 ± 0.068 kg/day) compared to the unvaccinated and challenged animals (0.568 ± 0.104 kg/day). A bacterin-based commercial vaccine (Suvaxyn® MH-one) was more efficient to induce a protective immune response than rAdP97c even if it did not evoke a P97 specific immune response. These results suggest that immunodominant antigens other than P97 adhesin are also important in the induction of a protective immune response and should be taken into account in the future development of M. hyopneumoniae subunit vaccines.

Etude du développement de la réponse humorale dirigée contre la capsule polysaccharidique de Streptococcus suis et Streptococcus du groupe B

Streptococcus suis et Streptococcus du groupe B (GBS) sont deux bactéries encapsulées qui induisent des pathologies similaires chez l’homme et/ou l’animal, incluant septicémies et méningites. La capsule polysaccharidique (CPS) est un facteur de virulence clé de ces deux pathogènes et les anticorps (Ac) anti-CPS présentent un bon potentiel protecteur. Néanmoins, ces molécules sont faiblement immunogéniques et les mécanismes de la génération de la réponse humorale anti-CPS demeurent méconnus. L’objectif principal de cette thèse était d’évaluer les caractéristiques et les mécanismes du développement de la réponse Ac dirigée spécifiquement contre les CPS de S. suis et GBS, ainsi que l’effet de la biochimie de la CPS dans cette réponse. Nous avons étudié S. suis types 2 et 14 et GBS types III et V, dont les CPS présentent plusieurs similarités dans leurs compositions et leurs structures, incluant la présence d’acide sialique, un sucre potentiellement immunosuppresseur, tout en possédant une antigénicité propre. Nous avons tout d’abord analysé la nature de la réponse Ac anti-CPS sérique face à la bactérie entière. Les souris infectées par S. suis développent une réponse très faible (S. suis type 2) voire insignifiante (S. suis type 14) de profil isotypique restreint à l’IgM et sont incapables de monter une réponse mémoire efficace face à une seconde infection. Un profil similaire est obtenu chez le porc infecté par S. suis type 2. On détecte des titres d’IgM anti-CPS significatifs chez les souris infectées par GBS (type III ou V). Toutefois, la magnitude de la réponse reste globalement faible et aucune commutation de classe n’est observée. Nous avons ensuite examiné l’influence de la biochimie de la CPS sur ces profils de réponse en conduisant des expériences avec la CPS hautement purifiée de ces pathogènes. Tandis que la CPS de GBS type III administrée aux souris conserve des propriétés immunogéniques similaires à celles observées durant l’infection par la bactérie intacte, les CPS de S. suis type 2 et GBS type V perdent toute capacité à induire une réponse Ac spécifique. L’analyse de l’interaction in vitro des CPS avec les cellules dendritiques (DC) murines, des acteurs clés dans la détection des pathogènes et l’orchestration des réponses immunitaires subséquentes, révèle que ces molécules stimulent la production de niveaux conséquents de chémokines via différents récepteurs. Néanmoins, les CPS sont inaptes à induire la sécrétion de cytokines et elles interfèrent avec la capacité des DC à exprimer BAFF, une cytokine clé dans la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. L’utilisation de CPS chimiquement désialylées démontre que l’acide sialique ne joue aucun rôle immunosuppresseur majeur dans le développement de la réponse Ac dirigée contre les CPS purifiées de S. suis ou GBS, ni sur l’interaction des CPS avec les DC in vitro, ni sur profil de la réponse in vivo. D’autres propriétés biochimiques intrinsèques à ces CPS seraient responsables de l’inaptitude de l’hôte infecté à monter une réponse Ac adéquate et les identifier constituera un outil précieux pour une meilleure compréhension de l’immunopathogénèse de S. suis et GBS ainsi que pour développer des moyens de lutte efficaces contre ces bactéries.

Les immunoglobulines intraveineuses et la réponse spécifique des cellules T dans la prévention de la maladie lymphoproliférative post-greffe associée au virus Epstein-Barr chez les enfants greffés de cellules souches hématopoïétiques.

La maladie lymphoproliférative post-greffe (MLP) est une complication grave chez les greffés (d’organes solides ou de cellules souches hématopoïétiques) immunosupprimés suite à l'infection par le virus Epstein-Barr (VEB). En l’absence d'une réponse efficace des lymphocytes T cytotoxiques, les cellules B infectées par le VEB peuvent proliférer et donner lieu à la MLP. Dans le cas des receveurs de greffe immunosupprimés, les cellules B infectées par le VEB de façon lytique, produisent activement de nouveaux virions. Ces derniers infectent les cellules B voisines, entraînant leur expansion polyclonale. La gp350, une protéine du cycle lytique située dans l'enveloppe virale, joue un rôle important dans l'infection par le VEB. Elle interagit avec le récepteur CD21 exprimée à la surface des cellules B pour permettre l’entrée du virus. Ainsi, des anticorps neutralisants anti-gp350 sont considérés être des acteurs clés dans le blocage de l'infection, empêchant ainsi le développement de la MLP. L'effet protecteur des immunoglobulines intraveineuses (IgIV) à titre prophylactique contre le VEB et la MLP chez les greffés de cellules souches hématopoïétiques n’est pas clairement démontré. Par conséquent, le premier objectif de cette thèse a proposé d'évaluer l'efficacité des IgIV contre l'infection par le VEB et la MLP chez les receveurs de cellules souches hématopoïétiques. Le deuxième objectif a proposé de déterminer, en utilisant la technique ELISpot, si la présence d'une réponse forte des lymphocytes T contre l'antigène précoce BMLF1 du cycle lytique du VEB pourrait constituer un marqueur de protection contre la MLP chez les greffés de cellules souches hématopoïétiques. Les résultats ont montré d'une part que, si les IgIV peuvent neutraliser efficacement l'infection par le VEB in vitro, ils ne protègent pas efficacement les patients greffés contre l'infection par le VEB in vivo. D'autre part, l'étude de la réponse des lymphocytes T contre des antigènes du VEB a démontré que les cellules T de certains patients sont capables de reconnaître l'antigène lytique BMLF1. Cette réponse spécifique des lymphocytes T peut s’avérer un bon marqueur de la protection contre la MLP. Les résultats de cette thèse démontrent que l’infection lytique au VEB joue un rôle fondamental dans le développement de la MLP. Les données indiquent également que la présence d'une réponse spécifique des lymphocytes T contre un antigène du cycle lytique du VEB peut constituer un bon marqueur de la protection contre la MLP. Cependant, le traitement des patients recevant des greffes de cellules souches hématopoïétiques avec les IgIV n’apparaît pas efficace dans la prévention de la MLP.

Herpesviruses including novel gammaherpesviruses are widespread among phocid seal species in Canada.

Little is known about herpesviruses in Canadian pinnipeds. We measured prevalence of antibodies to herpesviruses in the sera from Canadian phocid seals by an indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Wild harbor seals (Phoca vitulina) and captive harbor seals were positive for antibodies to Phocid herpesvirus 1 (PhoHV-1) at prevalences of 91% and 100%, respectively. Sera from wild hooded seals (Cystophora cristata), harp seals (Pagophilus groenlandica), and grey seals (Halichoerus grypus) were positive for antibodies to PhoHV-1 antigenically related herpesvirus antigens at 73%, 79%, and 96%, respectively. We isolated new herpesviruses in cell culture from two hunter-harvested ringed seals (Pusa hispida) in poor body condition from Ulukhaktok, Northwest Territories, Canada; one lethargic hooded seal from the St. Lawrence Estuary, Québec, Canada; and one captive, asymptomatic harp seal from the Magdalen Islands, Québec. Partial sequencing of the herpesvirus DNA polymerase gene revealed that all four virus isolates were closely related to PhoHV-2, a member of the Gammaherpesvirinae subfamily, with nucleotide similarity ranging between 92.8% and 95.3%. The new seal herpesviruses were genetically related to other known pinniped herpesviruses, such as PhoHV-1, Otariid herpesvirus 3, Hawaiian monk (Monachus schauinslandi) seal herpesvirus, and Phocid herpesvirus 5 with 47–48%, 55%, 77%, and 70–77% nucleotide similarities, respectively. The harp seal herpesvirus and both ringed seal herpesviruses were almost identical to each other, whereas the hooded seal herpesvirus was genetically different from the three others (92.8% nucleotide similarity), indicating detection of at least two novel seal herpesviruses. These findings are the first isolation, partial genome sequencing, and identification of seal gammaherpesviruses in three species of Canadian phocid seals; two species of which were suspected of exposure to one or more antigenically related herpesviruses based on serologic analyses.

Establishing a Robust In Vitro Embryonic Stem Cell Differentiation Assay to Monitor the Hematopoietic Potential of DELES Clones

Afin d’effectuer des études fonctionnelles sur le génome de la souris, notre laboratoire a généré une bibliothèque de clones de cellules souches embryonnaires (ESC) présentant des suppressions chromosomiques chevauchantes aléatoires – la bibliothèque DELES. Cette bibliothèque contient des délétions couvrant environ 25% du génome murin. Dans le laboratoire, nous comptons identifier de nouveaux déterminants du destin des cellules hématopoïétiques en utilisant cet outil. Un crible primaire utilisant la benzidine pour démontrer la présence d'hémoglobine dans des corps embryoïdes (EBS) a permis d’identifier plusieurs clones délétés présentant un phénotype hématopoïétique anormal. Comme cet essai ne vérifie que la présence d'hémoglobine, le but de mon projet est d'établir un essai in vitro de différenciation des ESC permettant de mesurer le potentiel hématopoïétique de clones DELES. Mon hypothèse est que l’essai de différenciation hématopoïétique publié par le Dr Keller peut être importé dans notre laboratoire et utilisé pour étudier l'engagement hématopoïétique des clones DELES. À l’aide d’essais de RT-QPCR et de FACS, j’ai pu contrôler la cinétique de différenciation hématopoïétique en suivant l’expression des gènes hématopoïétiques et des marqueurs de surface comme CD41, c-kit, RUNX1, GATA2, CD45, β-globine 1 et TER-119. Cet essai sera utilisé pour valider le potentiel hématopoïétique des clones DELES candidats identifiés dans le crible principal. Mon projet secondaire vise à utiliser la même stratégie rétro-virale a base de Cre-loxP utilisée pour générer la bibliothèque DELES pour générer une bibliothèque de cellules KBM-7 contenant des suppressions chromosomiques chevauchantes. Mon but ici est de tester si la lignée cellulaire leuémique humaine presque haploïde KBM-7 peut être exploitée en utilisant l'approche DELES pour créer cette bibliothèque. La bibliothèque de clones KBM-7 servira à définir les activités moléculaires de drogues anti-leucémiques potentielless que nous avons identifiées dans le laboratoire parce qu’elles inhibent la croissance cellulaire dans plusieurs échantillons de leucémie myéloïde aiguë dérivés de patients. Elle me permettra également d'identifier les voies de signalisation moléculaires qui, lorsque génétiquement perturbées, peuvent conférer une résistance à ces drogues.