TGF-β dependent regulation of oxygen radicals during transdifferentiation of activated hepatic stellate cells to myofibroblastoid cells

Background: The activation of hepatic stellate cells (HSCs) plays a pivotal role during liver injury because the resulting myofibroblasts (MFBs) are mainly responsible for connective tissue re-assembly. MFBs represent therefore cellular targets for anti-fibrotic therapy. In this study, we employed activated HSCs, termed M1-4HSCs, whose transdifferentiation to myofibroblastoid cells (named M-HTs) depends on transforming growth factor (TGF)-β. We analyzed the oxidative stress induced by TGF-β and examined cellular defense mechanisms upon transdifferentiation of HSCs to M-HTs. Results: We found reactive oxygen species (ROS) significantly upregulated in M1-4HSCs within 72 hours of TGF-β administration. In contrast, M-HTs harbored lower intracellular ROS content than M1-4HSCs, despite of elevated NADPH oxidase activity. These observations indicated an upregulation of cellular defense mechanisms in order to protect cells from harmful consequences caused by oxidative stress. In line with this hypothesis, superoxide dismutase activation provided the resistance to augmented radical production in M-HTs, and glutathione rather than catalase was responsible for intracellular hydrogen peroxide removal. Finally, the TGF-β/NADPH oxidase mediated ROS production correlated with the upregulation of AP-1 as well as platelet-derived growth factor receptor subunits, which points to important contributions in establishing antioxidant defense. Conclusion: The data provide evidence that TGF-β induces NADPH oxidase activity which causes radical production upon the transdifferentiation of activated HSCs to M-HTs. Myofibroblastoid cells are equipped with high levels of superoxide dismutase activity as well as glutathione to counterbalance NADPH oxidase dependent oxidative stress and to avoid cellular damage.

Respiración y parámetros relacionados durante la maduración del Chicozapote cosechado en la Península de Yucatán

El chicozapote es un fruto nativo de América, considerado originario de la Península de Yucatán. Este fruto es clasificado como climatérico, dependiendo el momento del climaterio de factores externos que inducen la producción de etileno. En la ruta biosintética del etileno, la enzima Ácido 1-Aminocicloproano-1-Carboxílico Oxidasa (ACC Oxidasa) es responsable de la oxidación de Ácido 1-Aminocicloproano-1-Carboxílico (ACC) a etileno, lo que constituye la última etapa de su biosíntesis. Debido a que los procesos metabólicos relacionados con el proceso de respiración de este fruto durante su maduración poscosecha aún no son claros, el objetivo de este trabajo fue estudiar los principales cambios de la respiración y parámetros relacionados durante la maduración. Se cosecharon frutos de chicozapote (Manilkhara achras) sazones en el campo experimental de la Universidad Nacional Autónoma de Chapingo en Yucatán y se dejaron madurar a temperatura ambiente (28±2ºC), evaluando la velocidad de producción de CO2 y etileno en frutos enteros y destruyendo seis cada día, para realizar las determinaciones establecidas para la pulpa de este fruto. Los resultados indicaron que en el fruto chicozapote Selección Campeche, cultivado en Yucatán el pico climatérico se presenta alrededor del quinto día después de la cosecha y coincide con un pico de etileno y la máxima actividad de la enzima ACC Oxidasa. La enzima Polifenol Oxidasa (PPO) utiliza como sustrato a las antocianinas y los taninos. El etanol aparece como un producto de descomposición y no como sustrato durante la síntesis de etileno. Antocianinas y acetaldehído durante la madurez comestible y la senescencia en la pulpa de este fruto, contribuyen al color de la misma.

Fenólicos totais, polifenoloxidade e coloração em abacate 'Hass' submetido a radiação UV-C

Avaliou-se o efeito da radiação UV-C em abacates Hass, quanto ao conteúdo de fenólicos totais, atividade da enzima polifenoloxidase (PPO) e coloração. Os frutos selecionados foram submetidos à radiação em luz UV-C durante 5; 10; 15 e 20 minutos, sendo mantidos sob refrigeração (10 ± 1 ºC e 90±5% UR), e avaliados durante 15 dias. Para o teor fenólicos totais e PPO, não se observou diferença entre os tratamentos dos frutos nos diferentes tempos de exposição à luz UV-C. Os teores fenólicos totais e PPO diminuíram durante o período experimental. Os valores de luminosidade mantiveram-se elevados (85,4 a 88,5) no armazenamento. Os valores de cor a* e b* diminuíram com o armazenamento de forma mais intensa para os frutos submetidos à radiação UV-C. Não houve correlação significativa para a PPO, conteúdo de fenólicos totais e coloração.

Capacidade antioxidante e qualidade pós-colheita de abacate 'Fuerte'

A capacidade antioxidante e a qualidade pós-colheita do abacate 'Fuerte' foram avaliadas. Os frutos foram mantidos sob temperatura ambiente (24 ± 1 ºC) e sob refrigeração em 10 ± 1 ºC e 90±5% UR e avaliados durante 15 dias. Determinaram-se a perda de massa e a taxa respiratória. As características físico-químicas avaliadas foram acidez total titulável (AT), sólidos solúveis (SS), ratio, pH, firmeza, atividade da enzima polifenoloxidase (PPO), cor (L, a* e b*), fenólicos totais e atividade antioxidante (AA) por DPPH·. Nas duas condições de armazenamento, o pico respiratório ocorreu no 9º dia.Os frutos mantidos sob temperatura refrigerada apresentaram menor perda de massa e maior firmeza em relação àqueles em temperatura ambiente. O comportamento respiratório refletiu na redução dos valores de AT e no conteúdo de SS que diminuíram a partir do pico de respiração. Os valores de pH aumentaram como consequência da diminuição da AT. Os valores de luminosidade mantiveram-se elevados, observando-se diminuição do componente de cor verde na polpa com o armazenamento. A atividade da PPO diminuiu com o armazenamento. Os valores de AA variaram de 17,6 a 68,7%. O conteúdo de fenólicos totais diminuiu após o pico respiratório, e valores crescentes de AA foram observados mesmo após o 9º dia.

Atividade enzimática e paramêtros fisico-químicos de água de cocos colhidos em diferentes estádios de desenvolvimento e estação climática

Nos últimos anos, agricultores da região noroeste do Paraná vêm cultivando o coqueiro, visando à comercialização da água do fruto verde. Na literatura, ainda são poucos os relatos sobre as características da água de coco verde na região. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar os aspectos físico-químicos e a atividade das enzimas peroxidase (POD) e polifenoloxidase (PPO) da água de coco, cv. Anão-Verde, de frutos colhidos em diferentes estádios de desenvolvimento e estações climáticas. Os frutos foram colhidos no município de Umuarama, Paraná, nas quatro estações climáticas e em cinco estádios de desenvolvimento. Foram realizadas avaliações da atividade da POD e PPO, turbidez, pH, acidez titulável (AT), compostos fenólicos e teores de minerais da água de coco. As atividades da PPO e da POD apresentaram os maiores valores no inverno, variando de 1,87 a 3,69 U mL-1 para PPO e 15,42 a 22,56 U mL-1 para POD. A turbidez variou de 10,14 a 15,16 NTU, sendo valor referente à água de coco colhido com sete meses e nove meses na primavera. A AT resultou em valores entre 0,057 e 0,113 g de ácido cítrico 100 mL-1. No inverno e na primavera, a água de coco apresentou os maiores valores de compostos fenólicos em relação às outras estações. O potássio foi o mineral presente em maior concentração em todas as amostras. Os parâmetros avaliados indicam que a água de coco produzida em Umuarama, Paraná, apresenta características bioquímicas e físico-químicas adequadas e semelhantes aos cocos produzidos em regiões tropicais.

Genome sequence of the Drosophila melanogaster male-killing Spiroplasma strain MSRO endosymbiont.

Spiroplasmas are helical and motile members of a cell wall-less eubacterial group called Mollicutes. Although all spiroplasmas are associated with arthropods, they exhibit great diversity with respect to both their modes of transmission and their effects on their hosts; ranging from horizontally transmitted pathogens and commensals to endosymbionts that are transmitted transovarially (i.e., from mother to offspring). Here we provide the first genome sequence, along with proteomic validation, of an endosymbiotic inherited Spiroplasma bacterium, the Spiroplasma poulsonii MSRO strain harbored by Drosophila melanogaster. Comparison of the genome content of S. poulsonii with that of horizontally transmitted spiroplasmas indicates that S. poulsonii has lost many metabolic pathways and transporters, demonstrating a high level of interdependence with its insect host. Consistent with genome analysis, experimental studies showed that S. poulsonii metabolizes glucose but not trehalose. Notably, trehalose is more abundant than glucose in Drosophila hemolymph, and the inability to metabolize trehalose may prevent S. poulsonii from overproliferating. Our study identifies putative virulence genes, notably, those for a chitinase, the H2O2-producing glycerol-3-phosphate oxidase, and enzymes involved in the synthesis of the eukaryote-toxic lipid cardiolipin. S. poulsonii also expresses on the cell membrane one functional adhesion-related protein and two divergent spiralin proteins that have been implicated in insect cell invasion in other spiroplasmas. These lipoproteins may be involved in the colonization of the Drosophila germ line, ensuring S. poulsonii vertical transmission. The S. poulsonii genome is a valuable resource to explore the mechanisms of male killing and symbiont-mediated protection, two cardinal features of many facultative endosymbionts. IMPORTANCE: Most insect species, including important disease vectors and crop pests, harbor vertically transmitted endosymbiotic bacteria. These endosymbionts play key roles in their hosts' fitness, including protecting them against natural enemies and manipulating their reproduction in ways that increase the frequency of symbiont infection. Little is known about the molecular mechanisms that underlie these processes. Here, we provide the first genome draft of a vertically transmitted male-killing Spiroplasma bacterium, the S. poulsonii MSRO strain harbored by D. melanogaster. Analysis of the S. poulsonii genome was complemented by proteomics and ex vivo metabolic experiments. Our results indicate that S. poulsonii has reduced metabolic capabilities and expresses divergent membrane lipoproteins and potential virulence factors that likely participate in Spiroplasma-host interactions. This work fills a gap in our knowledge of insect endosymbionts and provides tools with which to decipher the interaction between Spiroplasma bacteria and their well-characterized host D. melanogaster, which is emerging as a model of endosymbiosis.

Armazenamento refrigerado de abacates 'Hass'

Este trabalho objetivou determinar a ocorrência de injúria pelo frio em abacates 'Hass'. Na primeira Etapa, os abacates foram armazenados a 5ºC (77% UR), 10ºC (79% UR) e 15ºC (79% UR) por até 21 dias. Aos 7; 14 e 21dias de armazenamento, um lote com 36 frutos foi levado ao ambiente (22°C e 77% UR) para amadurecimento. Testou-se também o armazenamento a 2°C (74% UR) e 4°C (77% UR) por até 45 dias, sendo que aos 15; 30 e 45 dias, um lote com a mesma quantidade de frutos foi levado ao ambiente, mantido a 22°C e 77% UR. Frutos armazenados ao ambiente, desde o início, foram considerados testemunha. Avalaram-se a aparência e a luminosidade da polpa. Os frutos armazenados a 10°C e 15°C não apresentaram sintomas de injúrias pelo frio, que foram observados nos frutos armazenados a 2°C, por períodos superiores a 15 dias, e nos mantidos a 4°C, por 30 dias. Quando levados ao ambiente, os frutos armazenados a 2°C conservaram aparência aceitável para o consumo (nota = 3) por até10 dias, e os armazenados a 4°C, por até 12 dias. Na segunda Etapa, analisaram-se a intensidade respiratória e a atividade das enzimas peroxidase (POD), polifenoloxidase (PPO), poligalacturonase (PG) e pectinametilesterase (PME) nos frutos armazenados a 2ºC, por 45 dias, em comparação com os testemunha. A atividade das enzimas associadas ao escurecimento, POD e PPO, assim como das associadas ao amaciamento da polpa, PME e PG, foi inibida pelo armazenamento a 2ºC, mas readquiriram atividade mais elevada que nos frutos-testemunha, quando foram transferidos ao ambiente, indicando estímulo devido aos danos pelo frio.

Controle da maturação de caqui 'Fuyu' com aplicação de aminoetoxivinilglicina e 1-metilciclopropeno

O armazenamento de caquis é uma ferramenta importante na manutenção da qualidade e no prolongamento da oferta do fruto após a colheita. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da aplicação de AVG em pré-colheita, e do 1-MCP, em pré e pós-armazenamento, sobre a manutenção da qualidade pós-colheita e seu efeito na incidência de distúrbios em caquis 'Fuyu' armazenados em atmosfera controlada a -0,5 ºC e transferidos a condição de ambiente (20 ºC) por 6 dias. Os tratamentos foram: [1] controle; [2] aplicação de AVG (123 g ha-1); [3] aplicação de 1-MCP (1,0 µL L-1) em pré-armazenamento; [4] aplicação de AVG e 1-MCP em pré-armazenamento; [5] aplicação de 1-MCP em pós-armazenamento; [6] aplicação de AVG e 1-MCP em pós-armazenamento. Os frutos foram avaliados quanto à qualidade na ocasião da colheita, visando à caracterização do lote e, após quatro meses de armazenamento a -0,5 ºC e mais seis dias a 20 ºC, quanto à firmeza da polpa, pH, coloração da casca, índices de amaciamento e de escurecimento, teores de sólidos solúveis e de acidez titulável, respiração, produção de etileno, além da atividade da enzima ACC oxidase. Os resultados indicaram que a aplicação de 1-MCP em pré ou em pós-armazenamento foi eficiente em conter o amaciamento da polpa de caquis 'Fuyu' previamente armazenados em atmosfera controlada a -0,5 ºC e mantidos a 20 ºC por seis dias. Todavia, o uso deste fitorregulador em pré-armazenamento ocasionou maior escurecimento da epiderme. O uso de AVG em pré-colheita não retardou a maturação de caquis 'Fuyu' armazenados na mesma condição.

Marjojen flavonoidien uuttaminen

Flavonoidit ovat kasvien polyfenolisia sekundäärimetaboliitteja, jotka koostuvat 15-hiilisestä C6-C3-C6-perusrungosta. Niillä on havaittu useita terveyden kannalta edullisia ominaisuuksia kuten antioksidatiivisia, antikarsinogeenisia, antiallergeenisia, anti-inflammatorisia, estrogeenisia sekä antimikrobiaalisia vaikutuksia. Kasvimateriaalia käyttävän elintarviketeollisuuden sivuvirrat ovat flavonoidi-pitoisten jakeiden arvokkaita raaka-aineita. Tässä työssä tarkoituksena oli tutkia marjojen puristusjäännöksen sisältämien flavonoidien uuttamista ja uuttautumiseen vaikuttavia tekijöitä kuten liuottimen koostumusta ja määrää, uuttolämpötilaa ja -aikaa sekä liuottimen lisäaineita. Uutteet analysointiin HPLC:lla käyttäen ODS-2-kolonnia ja gradienttieluointia. Komponentit detektoitiin niille tyypillisillä UV-VIS-aallonpituuksilla ja identifioitiin vertaamalla flavonoidiprofiililtaan tunnettujen marjojen kromatogrammeihin. Antosyaanien kvantitatiiviseen analysointiin käytettiin spektrofotometrista pH-eromenetelmää ja tulokset ilmoitettiin syanidiini-3-glukosidina. Uutteiden kestävyyttä tutkittiin säilyttämällä näytteitä eri olosuhteissa sekä lisäämällä niihin uuton saantoon ja komponenttien säilyvyyteen vaikuttavia aineita. Useimmat tutkituista hapoista paransivat flavonoidien saantoa ja uutteiden säilyvyyttä, mutta esim. askorbiinihapon lisääminen nopeutti tiettyjen uutteen sisältämien flavonoidien tuhoutumista.

Antioxidant compoundsand total antioxidant activity in fruits of acerola from cv. Flor Branca, Florida Sweet and BRS 366

Information on antioxidant properties at different ontological stages may help producers and food technologists to identify which cultivar and/or maturity stage are most adequate for their need, therefore this work aimed to study the changes in the antioxidant metabolism during acerola development. Fruit from cv. Flor Branca, BRS366 and Florida Sweet were harvested at different stages: immature green colored (I), physiologically mature with green color and maximum size (II), breaker (III) and full red ripe (IV). After harvest, fruits were selected, divided into four replications with 500 g each and evaluated regarding their titratable acidity, pH, soluble solids, total soluble sugar, vitamin C, polyphenol, anthocyanin, yellow flavonoid, total antioxidant activity and antioxidant enzyme activity. Anthocyanin and flavonoid were determined through LC-DAD-ESI/MS and all analysis followed a completely randomized factorial 3 x 4 design. Fruits of 'Florida Sweet' presented significantly higher soluble solids (9.46ºBrix). Vitamin C content decreased during ripening, but ripe 'BRS 366' fruits showed the greatest values (1363 mg.100 g-1) and highest TAA with 42.36 µM TEAC.g-1FW. Cyanidin 3-rhamnoside (520.76 mg.100 g-1 DM) and quercetin 3-rhamnoside (33.72 mg.100 g-1 DM) were the most abundant anthocyanin and yellow flavonoids found mainly in 'Flor Branca' fruit of acerola, whose antioxidant enzymes activities were also higher. Ripe 'Florida Sweet' fruit presents a great potential for fresh consumption, meanwhile physiologically mature 'BRS 366' fruit seems the best option for the bioactive compounds processing industry. As 'Flor Branca' fruit of acerola kept the highest activity levels, it could be an indicative of greater potential for postharvest conservation.

Ácido 2,3,5-tri-iodobenzoico (TIBA) na micropropagação de abacaxizeiro 'IAC Gomo-de-Mel'

O abacaxi 'IAC Gomo-de-Mel' é uma espécie economicamente importante devido a diversas características sensoriais. Uma das técnicas para obter maior número de plantas é a micropropagação. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a ação do TIBA (ácido 2,3,5-tri-iodobenzoico) na formação de brotos e raízes do abacaxizeiro 'IAC Gomo-de-Mel', assim como possíveis alterações na morfologia de tecidos foliares. Foram utilizados segmentos das gemas da coroa de abacaxi, com aproximadamente 1 cm, oriundos de cultivo em meio líquido, suplementadas com 1,0 mg L-1 BAP+ 0,5 mg L-1 NAA , sendo posteriormente inoculados em meio MS líquido contendo diversas concentrações de TIBA, em condição de luz e temperatura controladas, implantando 3 diferentes experimentos para as análises biométrica, bioquímica e anatômica. Os experimentos foram implantados em delineamento experimental inteiramente ao acaso, com 8 tratamentos, com 4 repetições para as análises biométricas e 5 repetições para a bioquímica e anatômica. Ao final de 60 dias, foram avaliados o número e o comprimento das brotações, o comprimento da planta-mãe e o número de raízes. A análise da atividade de AIA-oxidase foi realizada no dia da instalação do experimento e aos 15; 30; 45 e 60 dias de cultivo. Conclui-se que o TIBA isoladamente não induz brotações. A redução na atividade da AIA-oxidase foi relacionada com a emissão de novas raízes, e o aumento na espessura dos tecidos foliares ocorreu após aplicação exógena de TIBA, em abacaxizeiro in vitro.

ATIVIDADE RESPIRATÓRIA EM MITOCÔNDRIAS ISOLADAS DA POLPA DO MAMÃO UENF/CALIMAN 01 E TAINUNG 01 NA CONSERVAÇÃO DO FRUTO EM PÓS-COLHEITA

Este trabalho teve como objetivo comparar a atividade respiratória em mitocôndrias isoladas e os atributos físicos e químicos da polpade dois híbridos de mamão, UENF/Caliman01 (UC01) e Tainung01,durante o amadurecimento dos frutos. Oamadurecimento dos frutos não mostrou diferenças significativas entre os genótipos na luminosidade (L), no croma (C) e no ângulo hue da casca. A perda de massa (PM)e as firmezas do fruto (FF) e domesocarpo (FM) diferiram entre os genótipos, sendo que a FF e a FM diminuíram com o tempo após a colheita,ao contrário da PM, que aumentou no mesmo período. A atividade respiratória nas mitocôndrias isoladas mostrou diferenças entre os genótipos quanto à respiração total (RT), sendo maior e decrescente no Tainung01 e constante no UC01 durante o amadurecimento dos frutos. Durante esse período, verificou-se que a participação da via oxidase alternativa (AOX) foi crescente, contra uma participação decrescente da via citocromo oxidase (COX) em ambos os híbridos, indicando um crescente desacoplamento das mitocôndrias, o que pode estar associado às rápidas transformações bioquímicas que acarretam a senescência do órgão. A partir desses resultados, sugere-se investigar materiais genéticos com menor atividade AOX, ou formas de minimizar a atividade respiratória nos frutos em pós-colheita. A AOX apresentou alta correlação positiva com a PM e negativa com a FF e a FM. O inverso foi observado para COX. A RT apresentou correlação positiva apenas com a FM. As correlações apontam a viabilidade de estimar a atividade respiratória por meiode análises mais simples, como a PM, a FF e a FM, facilitando a pesquisa na área.

Dietary resveratrol prevents alzheimer's markers and increases life span in SAMP8

Resveratrol is a polyphenol that is mainly found in grapes and red wine and has been reported to be a caloric restriction (CR) mimetic driven by Sirtuin 1 (SIRT1) activation. Resveratrol increases metabolic rate, insulin sensitivity, mitochondrial biogenesis and physical endurance, and reduces fat accumulation in mice. In addition, resveratrol may be a powerful agent to prevent age-associated neurodegeneration and to improve cognitive deficits in Alzheimer's disease (AD). Moreover, different findings support the view that longevity in mice could be promoted by CR. In this study, we examined the role of dietary resveratrol in SAMP8 mice, a model of age-related AD. We found that resveratrol supplements increased mean life expectancy and maximal life span in SAMP8 and in their control, the related strain SAMR1. In addition, we examined the resveratrol-mediated neuroprotective effects on several specific hallmarks of AD. We found that long-term dietary resveratrol activates AMPK pathways and pro-survival routes such as SIRT1 in vivo. It also reduces cognitive impairment and has a neuroprotective role, decreasing the amyloid burden and reducing tau hyperphosphorylation.

Dietary resveratrol prevents alzheimer's markers and increases life span in SAMP8

Resveratrol is a polyphenol that is mainly found in grapes and red wine and has been reported to be a caloric restriction (CR) mimetic driven by Sirtuin 1 (SIRT1) activation. Resveratrol increases metabolic rate, insulin sensitivity, mitochondrial biogenesis and physical endurance, and reduces fat accumulation in mice. In addition, resveratrol may be a powerful agent to prevent age-associated neurodegeneration and to improve cognitive deficits in Alzheimer's disease (AD). Moreover, different findings support the view that longevity in mice could be promoted by CR. In this study, we examined the role of dietary resveratrol in SAMP8 mice, a model of age-related AD. We found that resveratrol supplements increased mean life expectancy and maximal life span in SAMP8 and in their control, the related strain SAMR1. In addition, we examined the resveratrol-mediated neuroprotective effects on several specific hallmarks of AD. We found that long-term dietary resveratrol activates AMPK pathways and pro-survival routes such as SIRT1 in vivo. It also reduces cognitive impairment and has a neuroprotective role, decreasing the amyloid burden and reducing tau hyperphosphorylation.

Effect of cocoa powder in the prevention of cardiovascular disease: biological, consumption and inflammatory biomarkers. A metabolomic approach

Numerous health benefits have been attributed to cocoa and its derived products in the last decade including antioxidant, anti-platelet and positive effects on lipid metabolism and vascular function. Inflammation plays a key role in the initiation and progression of atherosclerosis. However, cocoa feeding trials focused on inflammation are still rare and the results yielded are controversial. Health effects derived from cocoa consumption have been partly attributed to its polyphenol content, in particular of flavanols. Bioavailability is a key issue for cocoa polyphenols in order to be able to exert their biological activities. In the case of flavanols, bioavailability is strongly influenced by several factors, such as their degree of polymerization and the food matrix in which the polyphenols are delivered. Furthermore, gut has become an active site for the metabolism of procyanidins (oligomeric and polymeric flavanols). Estimation of polyphenol consumption or exposure is also a very challenging task in Food and Nutrition Science in order to correlate the intake of phytochemicals with in vivo health effects. In the area of nutrition, modern analytical techniques based on mass spectrometry are leading to considerable advances in targeted metabolite analysis and particularly in Metabolomics or global metabolite analysis. In this chapter we have summarized the most relevant results of our recent research on the bioavailability of cocoa polyphenols in humans and the effect of the matrix in which cocoa polyphenols are delivered considering both targeted analysis and a metabolomic approach. Furthermore, we have also summarized the effect of long-term consumption of cocoa powder in patients at high risk of cardiovascular disease (CVD) on the inflammatory biomarkers of atherosclerosis.