Competing demands for a complex system : photosystem II repair, photoprotection and quantum yield

Photosynthesis in general is a key biological process on Earth and Photo system II (PSII) is an important component of this process. PSII is the only enzyme capable of oxidizing water and is largely responsible for the primordial build-up and present maintenance of the oxygen in the atmosphere. This thesis endeavoured to understand the link between structure and function in PSII with special focus on primary photochemistry, repair/photodamage and spectral characteristics. The deletion of the PsbU subunit ofPSII in cyanobacteria caused a decoupling of the Phycobilisomes (PBS) from PSII, likely as a result of increased rates of PSII photodamage with the PBS decoupling acting as a measure to protect PSII from further damage. Isolated fractions of spinach thylakoid membranes were utilized to characterize the heterogeneity present in the various compartments of the thylakoid membrane. It was found that the pooled PSIILHCII pigment populations were connected in the grana stack and there was also a progressive decrease in the reaction rates of primary photochemistry and antennae size of PSII as the sample origin moved from grana to stroma. The results were consistent with PSII complexes becoming damaged in the grana and being sent to the stroma for repair. The dramatic quenching of variable fluorescence and overall fluorescent yield of PSII in desiccated lichens was also studied in order to investigate the mechanism by which the quenching operated. It was determined that the source of the quenching was a novel long wavelength emitting external quencher. Point mutations to amino acids acting as ligands to chromophores of interest in PSII were utilized in cyanobacteria to determine the role of specific chromophores in energy transfer and primary photochemistry. These results indicated that the Hl14 ligated chlorophyll acts as the 'trap' chlorophyll in CP47 at low temperature and that the Q130E mutation imparts considerable changes to PSII electron transfer kinetics, essentially protecting the complex via increased non-radiative charge Photosynthesis in general is a key biological process on Earth and Photo system II (PSII) is an important component of this process. PSII is the only enzyme capable of oxidizing water and is largely responsible for the primordial build-up and present maintenance of the oxygen in the atmosphere. This thesis endeavoured to understand the link between structure and function in PSII with special focus on primary photochemistry, repair/photodamage and spectral characteristics. The deletion of the PsbU subunit ofPSII in cyanobacteria caused a decoupling of the Phycobilisomes (PBS) from PSII, likely as a result of increased rates of PSII photodamage with the PBS decoupling acting as a measure to protect PSII from further damage. Isolated fractions of spinach thylakoid membranes were utilized to characterize the heterogeneity present in the various compartments of the thylakoid membrane. It was found that the pooled PSIILHCII pigment populations were connected in the grana stack and there was also a progressive decrease in the reaction rates of primary photochemistry and antennae size of PSII as the sample origin moved from grana to stroma. The results were consistent with PSII complexes becoming damaged in the grana and being sent to the stroma for repair. The dramatic quenching of variable fluorescence and overall fluorescent yield of PSII in desiccated lichens was also studied in order to investigate the mechanism by which the quenching operated. It was determined that the source of the quenching was a novel long wavelength emitting external quencher. Point mutations to amino acids acting as ligands to chromophores of interest in PSII were utilized in cyanobacteria to determine the role of specific chromophores in energy transfer and primary photochemistry. These results indicated that the Hl14 ligated chlorophyll acts as the 'trap' chlorophyll in CP47 at low temperature and that the Q130E mutation imparts considerable changes to PSII electron transfer kinetics, essentially protecting the complex via increased non-radiative charge.

Hyperosmotic Stress and the Impact on Metabolite Formation and Redox Balance in Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces bayanus strains

Wine produced using an appassimento-type process represents a new and exciting innovation for the Ontario wine industry. This process involves drying grapes that have already been picked from the vine, which increases the sugar content due to dehydration and induces a variety of changes both within and on the surface of the grapes. Increasing sugar contents in musts subject wine yeast to conditions of high osmolarity during alcoholic fermentations. Under these conditions, yeast growth can be inhibited, target alcohol levels may not be attained and metabolic by-products of the hyperosmotic stress response, including glycerol and acetic acid, may impact wine composition. The further metabolism of acetic acid to acetylCoA by yeast facilitates the synthesis of ethyl acetate, a volatile compound that can also impact wine quality if present in sufficiently high concentrations. The first objective of this project was to understand the effect of yeast strain and sugar concentration on fermentation kinetics and metabolite formation, notably acetic acid and ethyl acetate, during fermentation in appassimento-type must. Our working hypotheses were that (1) the natural isolate Saccharomyces bayanus would produce less acetic acid and ethyl acetate compared to Saccharomyces cerevisiae strain EC-1118 fermenting the high and low sugar juices; (2) the wine produced using the appassimento process would contain higher levels of acetic acid and lower levels of ethyl acetate compared to table wine; (3) and the strains would be similar in the kinetic behavior of their fermentation performances in the high sugar must. This study determined that the S. bayanus strain produced significantly less acetic acid and ethyl acetate in the appassimento wine and table wine fermentations. Differences in acetic acid and ethyl acetate production were also observed within strains fermenting the two sugar conditions. Acetic acid production was higher in table wine fermented by S. bayanus as no acetic acid was produced in appassimento-style wine, and 1.4-times higher in appassimento wine fermented by EC-1118 over that found in table wine. Ethyl acetate production was 27.6-times higher in table wine fermented by S. bayanus, and 5.2-times higher by EC-1118, compared to that in appassimento wine. Sugar utilization and ethanol production were comparable between strains as no significant differences were determined. The second objective of this project was to bring a method in-house for measuring the concentration of pyridine nucleotides, NAD+, NADP+, NADH and NADPH, in yeast cytosolic extract. Development of this method is of applicative interest for our lab group as it will enable the redox balance of the NAD+/ NADH and NADP+/ NADPH systems to be assessed during high sugar fermentations to determine their respective roles as metabolic triggers for acetic acid production. Two methods were evaluated in this study including a UV-endpoint method using a set of enzymatic assay protocols outlined in Bergmeyer (1974) and a colorimetric enzyme cycling method developed by Sigma-Aldrich® using commercial kits. The former was determined to be limited by its low sensitivity following application to yeast extract and subsequent coenzyme analyses, while the latter was shown to exhibit greater sensitivity. The results obtained from the kits indicated high linearity, accuracy and precision of the analytical method for measuring NADH and NADPH, and that it was sensitive enough to measure the low coenzyme concentrations present in yeast extract samples. NADtotal and NADPtotal concentrations were determined to be above the lower limit of quantification and within the range of the respective calibration curves, making this method suitable for our research purposes.

Structure d'une tagatose-1,6-bisphosphate aldolase de classe I : étude d'une apparente perte de stéréospécificité

La tagatose-1,6-biphosphate aldolase de Streptococcus pyogenes est une aldolase de classe I qui fait montre d'un remarquable manque de spécificité vis à vis de ses substrats. En effet, elle catalyse le clivage réversible du tagatose-1,6-biphosphate (TBP), mais également du fructose-1,6-biphosphate (FBP), du sorbose-1,6-biphosphate et du psicose-1,6-biphosphate, quatre stéréoisomères, en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et en glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Afin de mettre à jour les caractéristiques du mécanisme enzymatique, une étude structurale de la TBP aldolase de S. pyogenes, un pathogène humain extrêmement versatile, a été entreprise. Elle a permis la résolution de la structure native et en complexe avec le DHAP, a respectivement 1.87 et 1.92 Å de résolution. Ces mêmes structures ont permis de se représenter plus clairement le site actif de l'enzyme en général, et les résidus catalytiques en particulier. Le trempage des cristaux de TBP aldolase dans une solution saturante de DHAP a en outre permis de piéger un authentique intermédiaire iminium, ainsi que sa géométrie particulière en atteste. Des expériences d'échange de proton, entreprises afin d'évaluer le stéréoisomérisme du transfert de proton catalytique, ont également permis de faire une intéressante découverte : la TBP aldolase ne peut déprotoner le coté pro-R du C3 du DHAP, mais peut le protonner. Ce résultat, ainsi que la comparaison de la structure du complexe TBP aldolase-DHAP avec la structure du complexe FBP aldolase de muscle de lapin- DHAP, pointe vers un isomérisme cis-trans autour du lien C2-C3 de la base de Schiff formée avec le DHAP. De plus, la résolution de ces deux structures a permis de mettre en évidence trois régions très mobiles de la protéine, ce qui pourrait être relié au rôle postulé de son isozyme chez S. pyogenes dans la régulation de l’expression génétique et de la virulence de la bactérie. La cristallographie par rayons X et la cinétique enzymatique ont ainsi permis d'avancer dans l'élucidation du mécanisme et des propriétés structurales de cette enzyme aux caractéristiques particulières.

Rôle des kinines dans la physiopathologie des effets secondaires causés par les héparines contaminées d’origine chinoise : approche expérimentale

En janvier 2008, une éclosion de réactions anaphylactoïdes (RA) potentiellement mortelles associées à l’injection intraveineuse d’héparine manufacturées en Chine et contaminée par le chondroïtine sulfate hypersulfaté (CSHS) a forcé le rappel de ces dernières par la U.S. Food and Drug Administration. Ces RA ont rapidement été attribuées à la libération de la bradykinine (BK) suite à l’activation du système de contact par le CSHS. Cependant, aucune évidence expérimentale définitive n’est à ce jour venue appuyer directement cette hypothèse. En se basant sur le nombre de morts déclaré et associé à la contamination (>150 morts au niveau mondial) ainsi qu’aux données épidémiologiques, qui stipulent que 25% des patients ayant développés une RA aux États-Unis étaient essentiellement des insuffisant rénaux en dialyse traités au moyen d’un inhibiteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (iECA), nous avons émis l’hypothèse suivante : les RA causées par l’injection intraveineuse d’héparine contaminée au CSHS sont de nature multifactorielle et complexe. Le but de notre travail est donc, dans un premier temps, d’évaluer le pouvoir kininoformateur du CSHS en présence d’un iECA et de le comparer à celui du sulfate de dextran, un activateur de référence du système de contact. Comme les RA associées à l’injection intraveineuse d’héparine contaminée par le CSHS se produisent généralement dans les premières minutes des séances de dialyse, nous allons étudier l’effet de la dilution du plasma sur la quantité de BK libérée en présence ou en absence d’un iECA. Nous allons également mesurer les profils cinétiques de la libération de la BK sur un plasma stimulé par différents lots d’héparine contaminée, et associée à des RA, et nous comparerons cette cinétique avec celles d’une héparine de référence complémentée ou non avec différentes concentrations de CSHS synthétique. Enfin, nous allons caractériser le profil de libération de la BK et de son métabolite actif, la des-Arg9-BK, dans le plasma de patients dialysé ayant présenté une RA associée à une membrane de dialyse chargée négativement. L’application de méthodes expérimentales développées dans notre laboratoire nous a permis de montrer, pour la première fois, que l’héparine contaminée au CSHS a la capacité de libérer la BK à des concentrations susceptibles d’expliquer le rôle de ce peptide inflammatoire dans la physiopathologie des RA causées par l’injection intraveineuse d’héparine d’origine chinoise contaminée au CSHS.

The role of GAPDH in maintaining the functional state of the DNA repair enzyme APE1

Les sites apuriniques/apyrimidiniques (AP) sont des sites de l’ADN hautement mutagène. Les dommages au niveau de ces sites peuvent survenir spontanément ou être induits par une variété d’agents. Chez l’humain, les sites AP sont réparés principalement par APE1, une enzyme de réparation de l’ADN qui fait partie de la voie de réparation par excision de base (BER). APE1 est une enzyme multifonctionnelle; c’est une AP endonucléase, 3’-diestérase et un facteur redox impliqué dans l’activation des facteurs de transcription. Récemment, il a été démontré qu’APE1 interagit avec l’enzyme glycolytique GAPDH. Cette interaction induit l’activation d’APE1 par réduction. En outre, la délétion du gène GAPDH sensibilise les cellules aux agents endommageant l’ADN, induit une augmentation de formation spontanée des sites AP et réduit la prolifération cellulaire. A partir de toutes ces données, il était donc intéressant d’étudier l’effet de la délétion de GAPDH sur la progression du cycle cellulaire, sur la distribution cellulaire d’APE1 et d’identifier la cystéine(s) d’APE1 cible(s) de la réduction par GAPDH. Nos travaux de recherche ont montré que la déficience en GAPDH cause un arrêt du cycle cellulaire en phase G1. Cet arrêt est probablement dû à l’accumulation des dommages engendrant un retard au cours duquel la cellule pourra réparer son ADN. De plus, nous avons observé des foci nucléaires dans les cellules déficientes en GAPDH qui peuvent représenter des agrégats d’APE1 sous sa forme oxydée ou bien des focis de la protéine inactive au niveau des lésions d’ADN. Nous avons utilisé la mutagénèse dirigée pour créer des mutants (Cys en Ala) des sept cystéines d’APE1 qui ont été cloné dans un vecteur d’expression dans les cellules de mammifères. Nous émettons l’hypothèse qu’au moins un mutant ou plus va être résistant à l’inactivation par oxydation puisque l’alanine ne peut pas s’engager dans la formation des ponts disulfures. Par conséquent, on anticipe que l’expression de ce mutant dans les cellules déficientes en GAPDH pourrait restaurer une distribution cellulaire normale de APE1, libérerait les cellules de l’arrêt en phase G1 et diminuerait la sensibilité aux agents endommageant l’ADN. En conclusion, il semble que GAPDH, en préservant l’activité d’APE1, joue un nouveau rôle pour maintenir l’intégrité génomique des cellules aussi bien dans les conditions normales qu’en réponse au stress oxydatif.

Monocouches peptidiques auto-assemblées et applications dans le domaine des biocapteurs de résonance de plasmon de surfaces

Ces travaux visent à étendre les applications de la résonance de plasmons de surface (SPR) L’objectif est d’offrir des outils diagnostics plus rapides, efficaces et simple d’utilisation pour diagnostiquer ou effectuer le suivi de conditions cliniques. Pour se faire, un nouveau type d’instrumentation SPR basé sur l’utilisation d’un prisme d’inversion (dove) a permis d’atteindre une limite de détection (LOD) de 10-6 unité d’indice de réfraction (RIU), une valeur comparable aux instruments commerciaux complexes tout en demeurant peu dispendieux, robuste et simple d’utilisation. Les travaux présentés dans cet ouvrage visent, dans un second temps, à réduire les interactions nonspécifiques (NSB) entre la surface des biocapteurs SPR et les composants de la matrice biologique complexe telles que: l’urine, le lysat cellulaire, le sérum et le sang. Ces dernières induisent des réponses empêchant l’utilisation de biocapteurs SPR en milieux complexes. Les acides aminés (AA) offrent une grande variété de propriétés physico-chimiques permettant la mise au point de monocouches auto-assemblées (SAM) aux propriétés diverses. Initialement, 19 des 20 acides aminés naturels ont été attachés à l’acide 3-mercaptopropionique (3-MPA) formant des SAMs peptidomimétiques. La quantité d’interactions nonspécifiques engendrées par ces différentes surfaces a été mesurée en exposant ces surfaces au sérum sanguin bovin complet variant de 400 ng/cm² jusqu’à 800 ng/cm². La détection à l’aide de ces surfaces de la β-lactamase (une enzyme responsable de la résistance aux antibiotiques au niveau μM) a démontré la possibilité d’employer ces surfaces pour bâtir des biocapteurs SPR. Des peptides de longueur allant de 2 à 5 résidus attachés à 3-MPA ont été synthétisés sur support solide. Cette étude a démontré que l’augmentation de la longueur des peptides formés d’AA résistants aux NBS accroit leur résistance jusqu’à 5 résidus. Le composé le plus performant de ce type (3-MPA-(Ser)5-OH) a permis d’atteindre 180 ng/cm². Cette valeur est similaire à celle des meilleures surfaces disponibles commercialement, notamment les surfaces de polyethylène glycol (PEG) à 100 ng/cm². Des surfaces de 3-MPA-(Ser)5-OH ont permis l’étalonnage de la β-lactamase et sa quantification directe dans un lysat cellulaire. La LOD pour ces biocapteurs est de 10 nM. Une troisième génération de surfaces peptidiques binaires a permis la réduction de la NSB jusqu’à un niveau de 23±10 ng/cm² une valeur comparable aux meilleures surfaces disponibles. Ces surfaces ont permis l’étalonnage d’un indicateur potentiel du cancer la metalloprotéinase-3 de matrice (MMP-3). Les surfaces formées de peptides binaires (3-MPA-H3D2-OH) ont permis la quantification directe de la MMP-3 dans le sérum sanguin complet. Une quatrième génération de surfaces peptidiques a permis de réduire davantage le niveau de NSB jusqu’à une valeur de 12 ± 11 ng/cm². Ces surfaces ont été modifiées en y attachant une terminaison de type acide nitriloacétique (NTA) afin d’y attacher des biomolécules marquées par six résidus histidines terminaux. Ces surfaces ont permis le développement d’une méthode rapide de balayage des ligands ciblant le « cluster of differenciation-36 » (CD36). L’étude d’électroformation des monocouches de peptide a permis de déterminer les conditions de formation optimales d’une couche de 3-MPA-HHHDD-OH permettant ainsi la formation de monocouches résistantes au NSB en moins de 6 minutes en appliquant un potentiel de formation de 200mV vs Ag/AgCl.

Polymeric nanoparticles : from microporosity and drug release kinetics to cellular interactions

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Characterization of the AP endonuclease enzyme APN-1 from C. elegans

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Développement d'un microréacteur à base d'enzyme protéolytique réticulée avec le glutaraldéhyde pour la cartographie peptidique

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

New high through-put assays for detecting transglutaminase activity

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Cardiovascular and sensory abnormalities in a rat model of insulin resistance : beneficial effect of an antioxidant and an angiotensin-1 converting enzyme inhibitor

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Development of an enzyme immobilization platform based on microencapsulation for paper-based biosensors

Un papier bioactif est obtenu par la modification d’un papier en y immobilisant une ou plusieurs biomolécules. La recherche et le développement de papiers bioactifs est en plein essor car le papier est un substrat peu dispendieux qui est déjà d’usage très répandu à travers le monde. Bien que les papiers bioactifs n’aient pas connus de succès commercial depuis la mise en marche de bandelettes mesurant le taux de glucose dans les années cinquante, de nombreux groupes de recherche travaillent à immobiliser des biomolécules sur le papier pour obtenir un papier bioactif qui est abordable et possède une bonne durée de vie. Contrairement à la glucose oxidase, l’enzyme utilisée sur ces bandelettes, la majorité des biomolécules sont très fragiles et perdent leur activité très rapidement lorsqu’immobilisées sur des papiers. Le développement de nouveaux papiers bioactifs pouvant détecter des substances d’intérêt ou même désactiver des pathogènes dépend donc de découverte de nouvelles techniques d’immobilisation des biomolécules permettant de maintenir leur activité tout en étant applicable dans la chaîne de production actuelle des papiers fins. Le but de cette thèse est de développer une technique d’immobilisation efficace et versatile, permettant de protéger l’activité de biomolécules incorporées sur des papiers. La microencapsulation a été choisie comme technique d’immobilisation car elle permet d’enfermer de grandes quantités de biomolécules à l’intérieur d’une sphère poreuse permettant leur protection. Pour cette étude, le polymère poly(éthylènediimine) a été choisi afin de générer la paroi des microcapsules. Les enzymes laccase et glucose oxidase, dont les propriétés sont bien établies, seront utilisées comme biomolécules test. Dans un premier temps, deux procédures d’encapsulation ont été développées puis étudiées. La méthode par émulsion produit des microcapsules de plus petits diamètres que la méthode par encapsulation utilisant un encapsulateur, bien que cette dernière offre une meilleure efficacité d’encapsulation. Par la suite, l’effet de la procédure d’encapsulation sur l’activité enzymatique et la stabilité thermique des enzymes a été étudié à cause de l’importance du maintien de l’activité sur le développement d’une plateforme d’immobilisation. L’effet de la nature du polymère utilisé pour la fabrication des capsules sur la conformation de l’enzyme a été étudié pour la première fois. Finalement, l’applicabilité des microcapsules de poly(éthylèneimine) dans la confection de papiers bioactifs a été démontré par le biais de trois prototypes. Un papier réagissant au glucose a été obtenu en immobilisant des microcapsules contenant l’enzyme glucose oxidase. Un papier sensible à l’enzyme neuraminidase pour la détection de la vaginose bactérienne avec une plus grande stabilité durant l’entreposage a été fait en encapsulant les réactifs colorimétriques dans des capsules de poly(éthylèneimine). L’utilisation de microcapsules pour l’immobilisation d’anticorps a également été étudiée. Les avancées au niveau de la plateforme d’immobilisation de biomolécules par microencapsulation qui ont été réalisées lors de cette thèse permettront de mieux comprendre l’effet des réactifs impliqués dans la procédure de microencapsulation sur la stabilité, l’activité et la conformation des biomolécules. Les résultats obtenus démontrent que la plateforme d’immobilisation développée peut être appliquée pour la confection de nouveaux papiers bioactifs.

Identification et caractérisation des principaux fragments du collagène de type II du cartilage équin, produit in vitro par l'enzyme cathepsine K

La dégradation protéolytique du collagène de type II est considérée comme étant un facteur majeur dans le processus irréversible de dégradation de la matrice cartilagineuse lors d’ostéoarthrose. Outre les collagénases de la famille des métaloprotéinases de la matrice (MMP-1, -8, -13), la cathepsine K est parmi les seules enzymes susceptibles de dégrader la triple hélice intacte du collagène de type II, devenant ainsi un élément pertinent pour les recherches sur l’ostéoarthrose. L’objectif à court terme de notre étude consiste en l’identification et la caractérisation de sites de clivage spécifiques de la cathepsine K sur le collagène de type II équin. La technique d’électrophorèse SDS-PAGE 1D permet la visualisation des produits de digestion et la validation des résultats de la caractérisation moléculaire des fragments protéolytiques. La caractérisation est réalisée en combinant la digestion trypsique précédant l’analyse HPLC-ESI/MS. Les résultats ont permis d’établir les sites, présents sur la carte peptidique de la molécule de collagène de type II équin, des 48 résidus prolines (P) et 5 résidus lysines (K) supportant une modification post-traductionnelle. De plus, 6 fragments majeurs, différents de ceux produits par les MMPs, sont observés par SDS-PAGE 1D puis confirmés par HPLC-ESI/MS, correspondant aux sites suivants : F1 [G189-K190], F2 [G252-P253], F3 [P326-G327], F4 [P428-G429], F5 [P563-G564] et F6 [P824-G825]. Le fragment F1 nouvellement identifié suggère un site de clivage différent de l’étude antérieure sur le collagène de type II bovin et humain. L’objectif à long terme serait le développement d’anticorps spécifiques au site identifié, permettant de suivre l’activité protéolytique de la cathepsine K par immunohistochimie et ÉLISA, dans le cadre du diagnostic de l’ostéoarthrose.

Caractérisation du gène de l'enzyme de conversion de l'angiotensine-2 dans le rein diabétique et implication dans le développement de la néphropathie diabétique et de l'hypertension

De nombreuses études ont bien démontré que l’activation du système rénine-angiotensine (RAS) joue un rôle important dans le développement de l’hypertension et de la néphropathie diabétique (DN). La découverte de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 (ACE2) et l’identification du récepteur MAS, spécifique pour l’angiotensine 1-7 (Ang 1-7), ont permis d’identifier deux nouveaux membres du RAS. L’axe ACE2/Ang 1-7/MAS contrebalance les effets de l’axe ACE/Ang II/AT1. Plusieurs évidences impliquent la contribution du RAS intrarénal dans la DN. Des études réalisées dans notre laboratoire avec des souris transgéniques surexprimant l’angiotensinogène de rat dans les cellules de leurs tubules proximaux rénaux (RPTCs) ont permis de démontrer l’importance du RAS intrarénal dans l’induction de l’hypertension et les dommages rénaux. Nous avons également observé que l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’ANG 1-7 sont plus faibles chez les souris Akita (diabète de type 1) et qu’un traitement avec des bloqueurs du RAS permet de normaliser l’expression de l’ACE2 et de prévenir le développement de l’hypertension dans le modèle des souris Akita. Dans un milieu diabétique, à la fois la glycémie et l’angiotensine II (Ang II) peuvent induire la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS), contribuant ainsi aux dommages rénaux. Afin d’explorer la relation entre les ROS, ACE2 et la DN, nous avons créé des souris Akita transgéniques surexprimant la catalase (Cat) dans les RPTCs, en croisant des souris Akita diabétique de type 1 à notre modèle de souris transgéniques surexprimant la Cat de rat dans les RPTCs. Dans une seconde étude, des souris Akita ont été traitées avec l’Ang 1-7 ou une combinaison d’Ang 1-7 et de son antagoniste, A779, afin d’étudier la relation entre l’action de l’Ang 1-7, l’hypertension systolique (sHTN), le stress oxydatif, les dommages rénaux, ACE2 et l’expression du récepteur Mas. Nos résultats ont montré que la surexpression de Cat atténue le stress oxydatif rénal; prévient l’hypertension, améliore le taux de filtration glomérulaire, l’albuminurie, l’hypertrophie rénale, la fibrose tubulo-interstitielle et l’apoptose tubulaire; et supprime l’expression des gènes profibrotiques et proapoptotiques dans les RPTCs des souris Akita Cat-Tg lorsque comparées aux souris Akita. De plus, la surexpression de Cat dans les RPTC des souris Akita normalise l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’Ang 1-7. D’autre part, l’administration d’Ang 1-7 prévient l’hypertension systémique, normalise le ratio albumine/créatinine urinaire et atténue l’hyperfiltration glomérulaire des souris Akita, sans affecter la glycémie sanguine. De plus, le traitement avec l’Ang 1-7 atténue aussi le stress oxydatif et l’expression de la NADPH oxydase, Agt, ACE, TGF-β1 (transforming growth factor-β1) et collagène IV, tout en augmentant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas dans les reins des souris Akita. Ces effets sont renversés par la co-admininstration d’A779. Ces résultats démontrent que la surexpression de Cat prévient l’hypertension et la progression de la néphropathie, en plus de mettre en lumière l’importance du stress oxydatif intrarénal et l’expression de l’ACE2 comme facteurs contribuant à l’hypertension et les dommages rénaux observés dans le diabète. En outre, nos données suggèrent que l’Ang 1-7 joue un rôle protecteur dans l’hypertension et les dommages aux RPTC dans le diabète, principalement en réduisant les voies de signalisations du stress oxydatif dans les reins et en normalisant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas. Nos résultats indiquent aussi que l’Ang 1-7 pourrait agir comme un agent thérapeutique potentiel dans le traitement de l’hypertension systémique et les dommages rénaux observés dans le diabète. En conséquence, l’Ang 1-7 est responsable du rôle protecteur de l’ACE2 dans l’hypertension et la DN.

A single amino acid substitution in the mRNA capping enzyme λ2 of a mammalian orthoreovirus mutant increases interferon sensitivity.

In the last few years, the development of a plasmid-based reverse genetics system for mammalian reovirus has allowed the production and characterization of mutant viruses. This could be especially significant in the optimization of reovirus strains for virotherapeutic applications, either as gene vectors or oncolytic viruses. The genome of a mutant virus exhibiting increased sensitivity to interferon was completely sequenced and compared with its parental virus. Viruses corresponding to either the parental or mutant viruses were then rescued by reverse genetics and shown to exhibit the expected phenotypes. Systematic rescue of different viruses harboring either of the four parental genes in a mutant virus backbone, or reciprocally, indicated that a single amino acid substitution in one of λ2 methyltransferase domains is the major determinant of the difference in interferon sensitivity between these two viruses.