Pattern and clinical significance of cancer-testis gene expression in head and neck squamous cell carcinoma

Les cancer-testis antigènes appartiennent à la famille des antigènes tumoraux spécifiques. Ils ont montré un pouvoir immunogène chez les patients porteurs de différents cancers. En effet, ils stimulent sélectivement les lymphocytes cytotoxiques, et leur expression spécifique dans les tissus tumoraux en fait une cible idéale pour une vaccination antitumorale. Le but de cette étude est d'identifier l'expression de certains de ces antigènes, d'analyser leur valeur pronostique et de déterminer la meilleure cible antigénique pour permettre une immunothérapie spécifique dans les carcinomes épidermoïdes des voies aérodigestives supérieures. Le profil et le taux d'expression de 12 cancer-testis antigènes (MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGEA10, MAGE-C2, NY-ESO-1, LAGE-1, SSX-2, SSX-4, BAGE, GAGE-1/2, GAGE-3/4) et de 3 autres antigènes tumoraux spécifiques (PRAME, HERV-K-MEL, NA-17A) ont été évalués par RT-PCR sur 57 échantillons de cancers ORL primaires. Les paramètres tumoraux et cliniques ont été prospectivement collectés afin de corréler ces données avec le résultat de nos investigations immunobiologiques. Quatre-vingt-huit pour cent des tumeurs expriment au moins 1 antigène. Une co-expression de 3 gènes ou plus est détectée chez 59% des patients. MAGE-A4 (60%), MAGE-A3 (51%), PRAME (49%) et HERV-K-MEL (42%) sont les gènes le plus fréquemment exprimés. Ils sont totalement absents des muqueuses saines avoisinantes. La présence de MAGE-A et NY-ESO-1 à la surface des cellules a été vérifiée par immunohistochimie. Nos analyses statistiques ont permis d'identifier une diminution de la survie liée au cancer chez les patients porteurs d'une tumeur exprimant de multiples cancer-testis antigènes et notamment MAGE-A4 dont l'expression indépendante d'autres éléments cliniques s'associe statistiquement à un taux de survie diminué. Nos résultats ont permis d'identifier un rôle pronostique de l'expression des gènes associés aux tumeurs dont l'expression est apparemment liée à un phénotype de malignité plus élevé. Cette constatation, corroborée par l'identification parallèle d'un infiltrat lymphocytaire spécifique confirme l'utilité potentielle de certains cancer-testis antigènes comme cible pour une immunothérapie ciblée dans les carcinomes des voies aérodigestives supérieures

Interactions between cells and functionalized nanoparticles

In this present thesis Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles (SPIONs) with 9 nm in diameter were selected as nanocarriers in order to study their potential application as drug delivery systems. Therefore the aim of the study was to demonstrate the proof of concept by establishing an efficient system of drug delivery, which would be a valuable tool in biomedical applications, such as the treatement of cancer, by reducing the side effects due to administration of a high concentration of therapeutic agents. As demonstrated in a previous study, the uptake of SPIONs by tumoral human cells was enhanced by the presence of amino groups on their surface. The stabilization of SPIONs were then performed and optimized by the coating of poly(vinylalcohol) and poly(vinylalcohol/vinylamine). Such nanoparticles were known as aminoPVA-SPIONs. The toxicity and the inflammatory reaction of aminoPVA-SPIONs were evaluated in order to establish their potentiel use in the human body. The results demonstrated that the human cells were able to invaginate aminoPVA-SPIONS without revealing any toxicity and inflammatory reaction. The analysis by transmission electron microscopy (TEM), scanning electron microscopy (SEM), cryo-TEM, confocal microscopy and histological staining (i.e. Prussian Blue) showed that the iron oxide core of SPIONs were located in the cytoplasm of cells and concentrated in vesicles. The evaluation of the mechanism of uptake of aminoPVA-SPIONs revealed that their uptake by monolayer cell culture was performed via an active mechanism, which was achieved by a clathrin-mediated endocytosis. Consequently, it was suggested that aminoPVA-SPIONs were good candidates as nanocarriers in drug delivery systems, which were able to reach the cytoplasm of cells. Their incubation with three-dimensional models mimicing tissues, such as differentiated rat brain cell-derived aggregates and spheroids, revealed that aminoPVA-SPIONs were able to invade into deep cell layers according to the stage of growth of these models. In the view of these promising results, drug-SPIONs were prepared by the functionalization of aminoPVA-SPIONs via a biological labile chemical bond by one of these three antineoplastic agents, which are widely used in clinical practice: 5-fluorourdine (Fur) (an antimetabolite), or camptothecin (CPT) (a topoisomerase inhibitor) or doxorubicin (DOX) (an anthracycline which interfere with DNA). The results shown that drug-SPIONs were internalized by human melanoma cells, as it was expected due the previous results with aminoPVA-SPIONs, and in addition they were active as anticancer agents, suggesting the efficient release of the drug from the drug-SPIONs. The results with CPT-SPIONs were the most promising, whereas DOX- SPIONs did not demonstrate a prononced activity of DOX. In conclusion, the results demonstrated that functionalized iron oxide nanoparticles are a promising tool in order to deliver therapeutic agents. - Dans le cadre de ce travail de thèse, les nanoparticules superparamagnétiques d'oxyde de fer (SPIONs) ayant un diamètre de 9 nm ont été choisies, afin d'étudier leur éventuelle utilisation dans un système de délivrance d'agents thérapeutiques. Ainsi le but de la thèse est de démontrer la faisabilité de fabriquer un système efficace de délivrance d'agents thérapeutiques, qui serait un outil intéressant dans le cadre d'une utilisation biomédicale, par exemple lors du traitement du cancer, qui pourrait réduire les effets secondaires provoqués par le dosage trop élevé de médicaments. Comme il a été démontré dans une précédente étude, l'invagination des SPIONs par des cellules humaines cancéreuses est améliorée par la présence de groupes fonctionnels amino à leur surface. La stabilisation des SPIONs est ainsi effectuée et optimisée par l'enrobage de poly(vinylalcool) et de (poly(vinylalcool/vinylamine), qui sont connues sous le nom de aminoPVA-SPIONs. La toxicité et la réaction inflammatoire des aminoPVA-SPIONs ont été évaluées dans le but de déterminer leur potentielle utilisation dans le corps humain. Les résultats démontrèrent que les cellules humaines sont capables d'invaginer les aminoPVAS-SPIONs sans induire une réaction toxique ou inflammatoire. L'analyse par la microscopie électronique en transmission électronique (TEM), la microscopie électronique à balayage (SEM), le cryo-microscopie électronique (SEM), la microscopie confocale et la coloration histologique (par ex, le bleu de Prusse) a montré que l'oxyde de fer des SPIONs est localisé dans le cytoplasme des cellules et est concentré dans des vesicules. L'évaluation du méchanisme d'invagination des aminoPVA-SPIONs ont révélé que leur invagination par des monocultures de cellules est effectué par un méchanisme actif, contrôlé par une endocytose induite par les clathrins. Par conséquent, les aminoPVA-SPIONs sont de bons candidats en tant que transporteurs (nanocamers) dans un système de délivrance d'agents thérapeuthique, capable d'atteindre le cytoplasme des cellules. Leur incubation avec des modèles tridimenstionnels imitant les tissues, tels que les aggrégats de cellules de cerveau différenciées et les sphéroïdes, a montré que les aminoPVA-SPIONs sont capable de pénétrer dans les couches profondes des modèles, selon l'état d'avancement de leur croissance. En vue de ces résultats prometteurs, les drug-SPIONs ont été préparés en fonctionalisant les aminoPVA-SPIONs par le biai d'une liaison chimique labile par un des trois agents thérapeutiques, déjà utilisé en pratique : 5-fluorourdine (Fur) (un antimétabolite), or camptothecin (CPT) (un inhibiteur de la topoisomerase) or doxorubicin (DOX) (un anthracycline qui interfère avec le DNA). Les résultats ont montré que les drug-SPIONs sont capable d'être internalisés par les mélanomes, comme il a été attendu d'après les résultats obtenus précédemment avec les aminoPVA-SPIONs, et de plus, les drug-SPIONs sont actifs, ce qui suggère un relargage efficace de l'agent thérapeutique du drug-SPIONs. Les résultats obtenus avec les CPT-SPIONs sont les plus prometteurs, tandis que ceux avec les DOX-SPIONs, ce n'est pas le cas, dont l'activité thérapeutique de DOX n'a pas été aussi efficace. En conclusion, les résultats ont pu démontrer que les nanoparticules d'oxyde de fer fonctionnalisées sont un outil prometteur dans la délivrance d'agents thérapeutiques.

Differential phosphoproteomics of fragmenting yeast vacuoles

Many organelles exist in an equilibrium of fragmentation into smaller units and fusion into larger structures, which is coordinated with cell division, the increase in cell mass, and envi¬ronmental conditions. In yeast cells, organelle homeostasis can be studied using the yeast vacuole (lysosome) as a model system. Yeast vacuoles are the main compartment for degrada¬tion of cellular proteins and storage of nutrients, ions and metabolites. Fission and fusion of vacuoles can be induced by hyper- and hypotonic shock in vivo, respectively, and have also been reconstituted in vitro using isolated vacuoles. The conserved serine/threonine kinase TOR (target of rapamycin) is a central nutrient sensor and regulates cell growth and metabolism. In yeast, there are two TOR proteins, Torlp and Tor2p, which are part of larger protein complexes, TORCI and TORC2. Only TORCI is rapamycin-sensitive. Disregulation of TOR signaling is linked to a multitude of diseases in humans, e.g. cancer, neurodegenerative diseases and metabolic syndrome. It has been shown that TORCI localizes to the vacuole membrane, and recent findings of our laboratory demonstrated that TORCI positively regulates vacuole fragmentation. This suggests that the fragmentation machinery should contain target proteins phosphorylated by TORCI. I explored the rapamycin-and fission-dependent vacuolar phosphoproteome during frag¬mentation, using a label-free mass-spectrometry approach. I identified many vacuolar factors whose phosphorylation was downregulated in a TORCI- and fission-dependent manner. Among them were known protein complexes that are functionally linked to fission or fusion, like the HOPS, VTC and FAB1 complexes. Hence, TORCI-dependent phosphorylations might positively regulate vacuole fission. Several candidates were chosen for detailed microscopic analysis of in vivo vacuole frag-mentation, using deletion mutants. I was able to identify novel factors not previously linked to fission phenotypes, e.g. the SEA complex, Pib2, and several vacuolar amino acid transporters. Transport of neutral and basic amino acids across the membrane seems to control vacuole fission, possibly via TORCI. I analyzed vacuolar fluxes of amino acids in wildtype yeast cells and found evidence for a selective vacuolar export of basic amino acids upon hyperosmotic stress. This leads me to propose a model where vacuolar export of amino acids is necessary to reshape the organelle under salt stress. - Le nombre et la taille de certaines organelles peut être déterminé par un équilibre entre la fragmentation qui produit des unités plus petites et la fusion qui génère des structures plus larges. Cet équilibre est coordonné avec la division cellulaire, l'augmentation de la masse cellulaire, et les conditions environnementales. Dans des cellules de levure, l'homéostasie des organelles peut être étudié à l'aide d'un système modèle, la vacuole de levure (lysosome). Les vacuoles constituent le principal compartiment de la dégradation des protéines et de stockage des nutriments, des ions et des métabolites. La fragmentation et la fusion des vacuoles peuvent être respectivement induites par un traitement hyper- ou hypo-tonique dans les cellules vivantes. Ces processus ont également été reconstitués in vitro en utilisant des vacuoles isolées. La sérine/thréonine kinase conservée TOR (target of rapamycin/cible de la rapamycine) est un senseur de nutriments majeur qui régule la croissance cellulaire et le métabolisme. Chez la levure, il existe deux protéines TOR, Torlp et Tor2p, qui sont les constituants de plus grands complexes de protéines, TORCI et TORC2. TORCI est spécifiquement inhibé par la rapamycine. Une dysrégulation de la signalisation de TOR est liée à une multitude de maladies chez l'homme comme le cancer, les maladies neurodégénératives et le syndrome métabolique. Il a été montré que TORCI se localise à la membrane vacuolaire et les découvertes récentes de notre laboratoire ont montré que TORCI régule positivement la fragmentation de la vacuole. Ceci suggère que le mécanisme de fragmentation doit être contrôlé par la phosphorylation de certaines protéines cibles de TORCI. J'ai exploré le phosphoprotéome vacuolaire lors de la fragmentation, en présence ou absence de rapamycine et dans des conditions provoquant la fragmentation des organelles. La méthode choisie pour réaliser la première partie de ce projet a été la spectrométrie de masse différentielle sans marquage. J'ai ainsi identifié plusieurs facteurs vacuolaires dont la phosphorylation est régulée d'une manière dépendante de TORCI et de la fragmentation. Parmi ces facteurs, des complexes protéiques connus qui sont fonctionnellement liées à fragmentation ou la fusion, comme les complexes HOPS, VTC et FAB1 ont été mis en évidence. Par conséquent, la phosphorylation dépendante de TORCI peut réguler positivement la fragmentation des vacuoles. Plusieurs candidats ont été choisis pour une analyse microscopique détaillée de la fragmentation vacuolaire in vivo en utilisant des mutants de délétion. J'ai été en mesure d'identifier de nouveaux facteurs qui n'avaient pas été encore associés à des phénotypes de fragmentation tels que les complexes SEA, Pib2p, ainsi que plusieurs transporteurs vacuolaires d'acides aminés. Le transport des acides aminés à travers la membrane semble contrôler la fragmentation de la vacuole. Puisque ces transporteurs sont phosphorylés par TORCI, ces résultats semblent confirmer la

Antitumor activities of ATP-competitive inhibitors of mTOR in colon cancer cells

Le cancer colorectal est la 3ème cause de décès liée au cancer dans l'Europe de l'Ouest et nécessite une prise en charge pluridisciplinaire. Les thérapies anticancéreuses récentes développées visent à inhiber les voies de signalisation cellulaires responsables de la prolifération des cellules tumorales. L'inhibition de la voie de signalisation cellulaire mTOR, est une stratégie prometteuse. En effet, mTOR est souvent suractivé dans les cellules du cancer colorectal et régule la croissance, la prolifération et la survie cellulaire. De nombreuses études récentes ont démontrés l'importance de l'activité de mTOR dans le développement du cancer colorectal et l'efficacité anti-tumorale des inhibiteurs allostériques de mTOR, telle que la rapamycine. Récemment, une nouvelle classe d'inhibiteur de mTOR, notamment PP242 et NVP-BEZ235, agissant comme inhibiteur ATP- compétitif a été développée. L'efficacité de ces inhibiteurs n'a pas été démontrée dans le contexte du cancer colorectal. Dans cette étude, nous avons comparé l'effet de PP242, un inhibiteur ATP-compétitif de mTOR et NVP-BEZ235, un inhibiteur dual de PI3K/mTOR par rapport à la rapamycine. Nous avons étudié, in vitro, leur effet sur la croissance, la prolifération et la survie cellulaire sur des lignées cellulaires du cancer du colon (LS174, SW480 et DLD-1) et, in vivo, sur la croissance de xénogreffes dans un modèle murin. Nous avons émis l'hypothèse que l'effet des ces nouveaux inhibiteurs seraient plus importants qu'avec la rapamycine. Nous avons observé que le PP242 et le NVP-BEZ235 réduisent significativement et de façon plus marquée que la rapamycine la croissance, la prolifération et la survie cellulaire des cellules LS174T et DLD-1. Ces inhibiteurs réduisent également la prolifération et la survie cellulaire des cellules SW480 alors que celles-ci étaient résistantes à la rapamycine. Nous avons également observé que les inhibiteurs PP242 et NVP-BEZ235 réduisaient la croissance des xénogreffes avec les lignées cellulaires LS174 et SW480. Finalement, nous avons remarqué que l'effet anti-tumoral des inhibiteurs ATP-compétitifs de mTOR était potentialisé par l'U0126, un inhibiteur de MEK/MAPK, souvent activé dans les voies de signalisation cellulaire du cancer colorectal. En conclusion, nous avons observé que les inhibiteurs ATP-compétitifs de mTOR bloquent la croissance de cellules tumorales du cancer colorectal in vitro et in vivo. Ces résultats démontrent que ces inhibiteurs représentent une option thérapeutique prometteuse dans le traitement du cancer colorectal et méritent d'être évalués dans des études cliniques.

Ecotoxicological approaches to assess the long-term effects of four anticancer drugs and metabolites on Daphnia pulex

The aquatic environment is exposed continuously and increasingly to chemical substances such as pharmaceuticals. These medical compounds are released into the environment after having being consumed and body-excreted by patients. Pharmaceutical residues are synthetic molecules that are not always removed by traditional sewage treatment processes and thus escape degradation. Among pharmaceuticals that escape sewage treatment plants (STPs), the anticancer drugs were measured in STP effluents and natural waters. In the aquatic environment, their long-term effects at low concentrations are sparsely known on non-target species. Tamoxifen is an anticancer drug that is widely prescribed worldwide for the prevention and treatment of hormone receptor-positive breast cancers. Two of its metabolites, i.e., endoxifen and 4-hydroxy- tamoxifen (4OHTam), have high pharmacological potency in vivo and such as tamoxifen, they are excreted via faeces by patients. Tamoxifen was measured in STP effluents and natural waters but, to the best of our knowledge, its metabolites concentrations in waters have never been reported. Imatinib is another and recent anticancer compound that targets specific tumour cells. This pharmaceutical is also body excreted and because of its increasing use in cancer treatment, imatinib may reach the natural water. The effects of tamoxifen and imatinib are unknown upon more than one generation of aquatic species. And the effects of 4OHTam, endoxifen have never been studied in ecotoxicology so far. The aims of this thesis were threefold. First, the sensitivity of D. pulex exposed to tamoxifen, 4OHTam, endoxifen or imatinib was assessed using ecotoxicological experiments. Ecotoxicology is the science that considers the toxic effects of natural or synthetic substances, such as pharmaceuticals, on organisms, populations, community and ecosystem. Acute and multigenerational (2-4 generations) tests were performed on daphnids considering several studied endpoints, such as immobilisation, size, reproduction, viability and intrinsic rate of natural increase. Additional prospective assays were designed to evaluate whether 1) low concentrations of tamoxifen and 4OHTam were able to induce toxic effects when used in combination, and 2) daphnids were able to recover when offspring were withdrawn from solutions carrying the pharmaceutical. Second, the stability of tamoxifen, 4OHTam and endoxifen in incubation medium was evaluated in solution exempted from daphnids. Because the nominal concentrations of tamoxifen, 4OHTam and endoxifen did not correspond to the measured, we provide a predictive method to estimate the concentrations of these chemicals during long-term ecotoxicological tests. Finally, changes in protein expressions were analysed in D. pulex exposed 2 or 7 seven days to tamoxifen using ecotoxicoproteomic experiments with a shot-gun approach inducing a peptide fractionation step. Our results show that tamoxifen, 4OHTam and endoxifen induced adverse effects in D. pulex at environmentally relevant concentrations. At very low concentrations, these molecules displayed unusual and teratogenic effects because morphological abnormalities were observed in offspring, such as thick and short antennas, curved spines, premature neonates and aborted eggs. Tamoxifen was the most toxic compound among the test chemicals, followed by 4OHTam, endoxifen and imatinib. Tamoxifen no-observed effect concentrations (NOECs) that were calculated for size, reproduction and intrinsic rate were below or in the range of the concentrations measured in natural waters, i.e., between 0.12 µg/L and 0.67 µg/L. For instance, the tamoxifen NOECs that were calculated for reproduction were between 0.67 and 0.72 µg/L, whereas the NOEC was < 0.15 µg/L when based on morphological abnormalities. The NOECs of 4OHTam were higher but still in the same order of magnitude as tamoxifen environmental concentrations, with a value of 1.48 µg/L. Endoxifen NOEC for the intrinsic rate of natural increase (r) and the reproduction were 0.4 and 4.3 µg/L, respectively. Daphnids that were withdrawn from tamoxifen and 4OHTam were not able to recover. Also, the reproduction of D. pulex was reduced when the treated animals were exposed to the combination of tamoxifen and 4OHTam while no effects were observed when these chemicals were tested individually at the same concentration. Among the anticancer drugs that were tested during this thesis, imatinib was the less toxic molecule towards D. pulex. No effects on size and reproduction were observed within two generations, except for the first whose reproduction decreased at the highest test concentration, i.e., 626 µg/L. Our results also underline the need to use measured or predicted concentrations instead of the nominal during aquatic experiments, particularly when lipophilic molecules are tested. Indeed, notable differences between nominal (i.e., theoretical) and measured concentrations were found with tamoxifen, 4OHTam and endoxifen at all test concentrations. A cost and time sustainable method was proposed to predict the test exposure levels of these chemicals during long-term experiments. This predictive method was efficient particularly for low concentrations, which corresponded to the test concentrations in multigenerational tests. In the ecotoxicoproteomic experiments a total of 3940 proteins were identified and quantified in D. pulex exposed to tamoxifen. These results are currently the largest dataset from D. pulex that is published and the results of proteomic analyses are available for the scientific community. Among these 3940 proteins, 189 were significantly different from controls. After protein annotation, we assumed that treated daphnids with tamoxifen had shifted cost-energy functions, such as reproduction, to maintain their basic metabolism necessary to survive. This metabolic cost hypothesis was supported by the presence of proteins involved in oxidative stress. Biomarkers for early detection of tamoxifen harmful effects on D. pulex were not discovered but the proteins of the vitellogenin-2 family (E9H8K5) and the ryanodine receptor (E9FTU9) are promising potential biomarkers because their expression was already modified after 2 days of treatment. In this thesis, the effects of tamoxifen, 4OHTam and endoxifen on daphnids raise questions about the potential impact of tamoxifen and 4OHTam in other aquatic ecosystems, and therefore, about metabolites in ecotoxicology. Because the NOECs were environmentally relevant, these results suggest that tamoxifen and 4OHTam may be interesting pharmaceuticals to consider in risk assessment. Our findings also emphasize the importance of performing long-term experiments and of considering multi-endpoints instead of the standard reproductive endpoint. Finally, we open the discussion about the importance to measure test exposures or not, during ecotoxicological studies. -- Les milieux aquatiques sont exposés continuellement à un nombre croissant de substances chimiques, notamment les médicaments issus de la médecine vétérinaire et humaine. Chez les patients, les substances administrées sont utilisées par le corps avant d'être éliminées par l'intermédiaire des excrétas dans le système d'eaux usées de la ville. Ces eaux rejoignent ensuite une station de traitement afin d'y éliminer les déchets. Dans le cas des molécules chimiques, il arrive que les processus de traitement d'eaux usées ne soient pas suffisamment efficaces et que ces molécules ne soient pas dégradées. Elles sont alors libérées dans le milieu aquatique avec les effluents de la station d'épuration. Une fois dans l'environnement, ces résidus de médicaments sont susceptibles d'induire des effets sur la faune et la flore aquatique, dont les conséquences à long terme et à faibles concentrations sont peu connues. Les anticancéreux sont une famille de médicaments qui peuvent échapper aux traitements des stations d'épuration et qui sont retrouvées dans le milieu aquatique naturel. Parmi ces substances, le tamoxifen est une molécule utilisée dans le monde entier pour prévenir et traiter les cancers hormonaux dépendant du sein, notamment. Une fois ingéré, le tamoxifen est transformé par le foie en métabolites dont deux d'entre eux, le 4-hydroxy-tamoxifen (4OHTam) et l'endoxifen, possèdent un affinité pour les récepteurs aux estrogènes et une efficacité sur les cellules tumorales supérieure au tamoxifen lui- même. Tout comme la molécule mère, ces métabolites sont principalement éliminés par l'intermédiaire des fèces. Le tamoxifen a déjà été mesuré dans les effluents de stations d'épuration et dans les eaux naturelles, mais aucune valeur n'a été reportée pour ses métabolites jusqu'à présent. Un autre anticancéreux, également éliminé par voie biliaire et susceptible d'atteindre l'environnement, est l'imatinib. Cette récente molécule a révolutionné le traitement et la survie des patients souffrant de leucémie myéloïde chronique et de tumeur stromales gastrointestinales. Les effets du tamoxifen et de l'imatinib sur plusieurs générations d'organismes aquatiques, tels que les microcrustacés Daphnia, sont inconnus et le 4OHTam et l'endoxifen n'ont même jamais été testés en écotoxicologie. Cette thèse s'est articulée autour de trois objectifs principaux. Premièrement, la sensibilité des D. pulex exposés au tamoxifen, 4OHTam, endoxifen et imatinib a été évaluée par l'intermédiaire de tests aigus et de tests sur deux à quatre générations. La mobilité, la taille, la reproduction, la viabilité et la croissance potentielle de la population ont été relevées au cours de ces expériences. Des tests supplémentaires, à but prospectifs, ont également été réalisés afin d'évaluer 1) la capacité de récupération des daphnies, lorsque leurs descendants ont été placés dans un milieu exempté de tamoxifen ou de 4OHTam, 2) les effets chez les daphnies exposées à une solution contenant de faibles concentration de tamoxifen et de 4OHTam mélangés. Le deuxième objectif a été d'évaluer la stabilité du tamoxifen, 4OHTam et endoxifen dilué dans le milieu des daphnies. Après analyses, les concentrations mesurées ne correspondaient pas aux concentrations nominales (c.-à-d., théoriques) et il a été nécessaire de développer une méthode efficace de prédiction des niveaux d'exposition lors de tests de longue durée réalisés avec ces trois molécules. Finalement, des changements dans l'expression des protéines chez des daphnies exposées au tamoxifen ont été investigués par l'intermédiaire d'expériences écotoxicoprotéomiques avec une approche dite de shot-gun avec une étape de fractionnement des protéines. Les résultats obtenus dans cette thèse montrent que le tamoxifen, le 4OHTam et l'endoxifen induisent des effets indésirables chez les daphnies à des niveaux d'exposition proches ou identiques aux concentrations du tamoxifen mesurées dans l'environnement, c'est-à-dire 0.12 et 0.67 µg/L de tamoxifen. Ces molécules ont induit des effets inhabituels tels que la production de : nouveau-nés anormaux, avec des antennes et des queues déformées, des prématurés et des oeufs avortés. Le tamoxifen fut la molécule la plus toxique pour les D. pulex suivie du 4OHTam, de l'endoxifen et enfin de l'imatinib. Lors des expériences sur plusieurs générations, les concentrations n'ayant statistiquement pas d'effet (c.à.d. NOEC en anglais) sur la taille, la reproduction et la croissance intrinsèque de la population étaient du même ordre de grandeur que les concentrations environnementales du tamoxifen. Par exemple, les NOECs du tamoxifen calculées pour la reproduction étaient de 0.67 et 0.72 µg/L, tandis que celle calculée sur la base des anomalies chez les nouveau-nés était < 0.15 µg/L. Les NOECs du 4OHTam se situaient entre 0.16 et 1.48 µg/L et celles de l'endoxifen pour la croissance intrinsèque de la population, ainsi que pour la reproduction, étaient de 0.4 et 4.3 µg/L, respectivement. Dans l'expérience basée sur la récupération des daphnies, la taille et la reproduction ont diminué bien que la descendance fût placée dans un milieu sans substances chimiques. Les daphnies exposées au mélange de tamoxifen et de 4OHTam ont produit moins de nouveau-nés que les contrôles, alors que ces concentrations n'ont pas induit d'effets lorsque testées individuellement. Finalement, l'imatinib n'a pas montré d'effets sur les deux générations testées. Seule la première génération exposée à la plus haute concentration (626 µg/L) a montré une diminution de la reproduction. Les résultats obtenus lors de l'évaluation de la stabilité du tamoxifen, 4OHTam et endoxifen dans le milieu des daphnies ont souligné l'importance d'utiliser des concentrations mesurées ou prédites en écotoxicologie. En effet, des différences notables entre concentrations nominales et mesurées ont été observées à toutes les concentrations et l'hypothèse d'un phénomène d'adsorption sur le verre des récipients a été posée. De ce fait, il a été nécessaire d'élaborer une méthode prédictive efficace et acceptable, en terme de temps et de coûts. Une régression polynomiale basée sur des concentrations mesurées et nominales a permis de prédire avec efficacité les faibles niveaux d'exposition utilisés lors d'expériences écotoxicologiques à long terme, sur plusieurs générations. Suite aux expériences d'écotoxicoprotéomiques, un total de 3940 protéines ont été identifiées et quantifiées chez des daphnies exposées au tamoxifen. Ce nombre est actuellement la plus large série de données publiées et mises à disposition pour la communauté scientifique. Parmi ces protéines, 189 sont significatives et possiblement reliées à des processus de reproduction et de stress. Sur cette base, nous avons émis l'hypothèse que les individus subissant un stress, lié à l'exposition au tamoxifen, ont utilisé leur énergie de base pour favoriser leur survie plutôt que la reproduction. Enfin, la détermination de bio-marqueurs exprimant des dommages précoces des daphnies exposées au tamoxifen n'a pas abouti en tant que telle, mais des protéines prometteuses, telle que la famille de viellogenin-2 (E9H8K5) et le récepteur à la ryanodine (E9FTU9), ont été exprimées après deux jours d'exposition déjà. Ces protéines pourraient faire l'objet d'investigations écotoxicoprotéomiques futures. Les résultats de cette thèse posent certaines questions quant au risque du tamoxifen, du 4OHTam et de l'endoxifen sur la faune et la flore aquatique et plus particulièrement sur les anticancéreux présents dans l'environnement. Les effets toxiques de ces molécules ont été observés à des concentrations environnementales et sur plusieurs générations. La question de considérer les métabolites, et ainsi les pro-médicaments, en écotoxicologie est soulevée, notamment parce que ces molécules peuvent être plus actives et efficaces que la molécule mère. Les expériences chroniques, sur plusieurs générations sont également à favoriser car elles offrent un meilleur reflet de la réalité environnementale que des essais aigus ou d'une génération. L'utilisation de la protéomique permet d'agrandir les connaissances sur les effets des médicaments à un niveau inférieur de l'organisation biologique et ainsi, de mieux comprendre de potentiels mécanismes d'action ou de déterminer de potentiels biomarqueurs. Finalement, il semble important de discuter de l'opportunité de mesurer les concentrations qui sont testées en écotoxicologie afin de ne pas sous-estimer le risque pour la faune et la flore aquatique.

The role of fungi in the precipitation of calcite : relationships between fungal filaments, nanofibres, and needle fibre calcite

RésuméLes champignons sont impliqués dans les cycles biogéochimiques de différentes manières. En particulier, ils sont reconnus en tant qu'acteurs clés dans la dégradation de la matière organique, comme fournisseurs d'éléments nutritifs via l'altération des minéraux mais aussi comme grands producteurs d'acide oxalique et de complexes oxalo-métalliques. Toutefois, peu de choses sont connues quant à leur contribution à la genèse d'autres types de minéraux, tel que le carbonate de calcium (CaCO3). Le CaCO3 est un minéral ubiquiste dans de nombreux écosystèmes et il joue un rôle essentiel dans les cycles biogéochimiques du carbone (C) et du calcium (Ca). Le CaCO3 peut être d'origine physico-chimique ou biogénique et de nombreux organismes sont connus pour contrôler ou induire sa biominéralisation. Les champignons ont souvent été soupçonnés d'être impliqué dans ce processus, cependant il existe très peu d'informations pour étayer cette hypothèse.Cette thèse a eu pour but l'étude de cet aspect négligé de l'impact des champignons dans les cycles biogéochimiques, par l'exploration de leur implication potentielle dans la formation d'un type particulier de CaCO3 secondaires observés dans les sols et dans les grottes des environnements calcaires. Dans les grottes, ces dépôts sont appelés moonmilk, alors que dans les sols on les appelle calcite en aiguilles. Cependant ces deux descriptions correspondent en fait au même assemblage microscopique de deux habitus particulier de la calcite: la calcite en aiguilles (au sens strict du terme cette fois-ci) et les nanofibres. Ces deux éléments sont des habitus aciculaires de la calcite, mais présentent des dimensions différentes. Leur origine, physico-chimique ou biologique, est l'objet de débats intenses depuis plusieurs années déjà.L'observation d'échantillons environnementaux avec des techniques de microscopie (microscopie électronique et micromorphologie), ainsi que de la microanalyse EDX, ont démontré plusieurs relations intéressantes entre la calcite en aiguilles, les nanofibres et des éléments organiques. Premièrement, il est montré que les nanofibres peuvent être organiques ou minérales. Deuxièmement, la calcite en aiguilles et les nanofibres présentent de fortes analogies avec des structures hyphales, ce qui permet de confirmer l'hypothèse de leur origine fongique. En outre, des expériences en laboratoire ont confirmé l'origine fongique des nanofibres, par des digestions enzymatiques d'hyphes fongiques. En effet, des structures à base de nanofibres, similaires à celles observées dans des échantillons naturels, ont pu être produites par cette approche. Finalement, des enrichissements en calcium ont été mesurés dans les parois des hyphes et dans des inclusions intrahyphales provenant d'échantillons naturels de rhizomorphes. Ces résultats suggèrent une implication de la séquestration de calcium dans la formation de la calcite en aiguilles et/ou des nanofibres.Plusieurs aspects restent à élucider, en particulier la compréhension des processus physiologiques impliqués dans la nucléation de calcite dans les hyphes fongiques. Cependant, les résultats obtenus dans cette thèse ont permis de confirmer l'implication des champignons dans la formation de la calcite en aiguilles et des nanofibres. Ces découvertes sont d'une grande importance dans les cycles biogéochimiques puisqu'ils apportent de nouveaux éléments dans le cycle couplé C-Ca. Classiquement, les champignons sont considérés comme étant impliqués principalement dans la minéralisation de la matière organique et dans l'altération minérale. Cette étude démontre que les champignons doivent aussi être pris en compte en tant qu'agents majeurs de la genèse de minéraux, en particulier de CaCO3. Ceci représente une toute nouvelle perspective en géomycologie quant à la participation des champignons au cycle biologique du C. En effet, la présence de ces précipitations de CaCO3 secondaires représente un court-circuit dans le cycle biologique du C puisque du C inorganique du sol se retrouve piégé dans de la calcite plutôt que d'être retourné dans l'atmosphère.AbstractFungi are known to be involved in biogeochemical cycles in numerous ways. In particular, they are recognized as key players in organic matter recycling, as nutrient suppliers via mineral weathering, as well as large producers of oxalic acid and metal-oxalate. However, little is known about their contribution to the genesis of other types of minerals such as calcium carbonate (CaCO3). Yet, CaC03 are ubiquitous minerals in many ecosystems and play an essential role in the biogeochemical cycles of both carbon (C) and calcium (Ca). CaC03 may be physicochemical or biogenic in origin and numerous organisms have been recognized to control or induce calcite biomineralization. While fungi have often been suspected to be involved in this process, only scarce information support this hypothesis.This Ph.D. thesis aims at investigating this disregarded aspect of fungal impact on biogeochemical cycles by exploring their possible implication in the formation of a particular type of secondary CaC03 deposit ubiquitously observed in soils and caves from calcareous environments. In caves, these deposits are known as moonmilk, whereas in soils, they are known as Needle Fibre Calcite (NFC - sensu lato). However, they both correspond to the same microscopic assemblage of two distinct and unusual habits of calcite: NFC {sensu stricto) and nanofibres. Both features are acicular habits of calcite displaying different dimensions. Whether these habits are physicochemical or biogenic in origin has been under discussion for a long time.Observations of natural samples using microscopic techniques (electron microscopy and micromorphology) and EDX microanalyses have demonstrated several interesting relationships between NFC, nanofibres, and organic features. First, it has shown that nanofibres can be either organic or minera! in nature. Second, both nanofibres and NFC display strong structural analogies with fungal hyphal features, supporting their fungal origin. Furthermore, laboratory experiments have confirmed the fungal origin of nanofibres through an enzymatic digestion of fungal hyphae. Indeed, structures made of nanofibres with similar features as those observed in natural samples have been produced. Finally, calcium enrichments have been measured in both cell walls and intrahyphal inclusions of hyphae from rhizomorphs sampled in the natural environment. These results point out an involvement of calcium sequestration in nanofibres and/or NFC genesis.Several aspects need further investigation, in particular the understanding of the physiological processes involved in hyphal calcite nucleation. However, the results obtained during this study have allowed the confirmation of the implication of fungi in the formation of both NFC and nanofibres. These findings are of great importance regarding global biogeochemical cycles as they bring new insights into the coupled C and Ca cycles. Conventionally, fungi are considered to be involved in organic matter mineralization and mineral weathering. In this study, we demonstrate that they must also be considered as major agents in mineral genesis, in particular CaC03. This is a completely new perspective in geomycology regarding the role of fungi in the short-term (or biological) C cycle. Indeed, the presence of these secondary CaC03 precipitations represents a bypass in the short- term carbon cycle, as soil inorganic C is not readily returned to the atmosphere.

Endogenous and exogenous regulation of monocyte responses

Mononuclear phagocytes are essential for the innate response to pathogens and for the repair of injured tissue. The cells - which can be broadly divided into circulating monocytes and tissue-resident macrophages and dendritic cells - are selectively equipped to protect the host by mediating pleiotropic and tissue-specific functions. The properties of some mononuclear phagocytes, however, also contribute to the development and the progression of inflammatory diseases. Consequently, current research investigates mononuclear phagocytes into greater detail with the aim to clarify their contributions to pathophysiologic inflammation. Recent studies indicate that circulating monocytes can be divided into distinct populations, which differ in their tissue tropism and functional commitment. Also, tissue macrophages and dendritic cells have been found to adopt context-dependent phenotypes, which can range from "pro-" to "anti-" inflammatory. These findings have markedly contributed to our understanding of the functional heterogeneity of mononuclear phagocyte populations. Yet, in many cases, the factors that control the quantity and/or quality of phagocyte responses in vivo remain largely unknown. The goal of this thesis was to identify cell endogenous and cell exogenous factors that dictate the fate of mononuclear phagocyte populations. To this end we made use of the recent identification of phenotypic markers, which permit to track mononuclear cell types and their lineage precursors. A main approach consisted to define candidate regulatory factors of certain types of mononuclear phagocytes and then to manipulate the expression of these factors in mice so as to address their functions and causal contributions on mononuclear phagocyte lineages in vivo. Human patient material was further used to validate findings. First, we investigated a microRNA and a transcription factor as candidate cell endogenous co- regulators of monocyte subset responses. Second, we studied a tumor-derived hormone as a candidate exogenous factor that amplifies the production of a population of mononuclear phagocytes with tumor-promoting functions. The endogenous and exogenous factors identified in this research appear to act as effective regulators of mononuclear phagocyte responses in vivo and thus may be exploited in future therapeutic approaches to regulate disease-associated inflammation. - Les phagocytes mononucléaires sont essentiels pour la réponse innée aux pathogènes et pour la réparation des tissus lésés. Ces cellules - qui peuvent être largement divisées en deux groupes, les monocytes circulant dans le sang et les macrophages et cellules dendritiques résidant dans les tissus - sont capables de protéger l'hôte en exerçant des fonctions pléiotropiques. Cependant, les propriétés de certains phagocytes mononucléaires contribuent également au développement et à la progression des maladies inflammatoires. Par conséquent, la recherche actuelle étudie les phagocytes mononucléaires plus en détail afin de clarifier leurs contributions à l'inflammation pathophysiologique. Des études récentes indiquent que les monocytes circulants peuvent être divisés en populations distinctes, qui diffèrent dans leur tropisme tissulaire et dans leurs fonctions biologiques. En outre, les macrophages et les cellules dendritiques peuvent adopter des phénotypes dépendants de l'environnement dans lequel ils se trouvent; ces phénotypes peuvent aller du type "pro-" au type "anti-" inflammatoire. Ces récentes découvertes ont contribué à notre compréhension sur l'hétérogénéité fonctionnelle des phagocytes mononucléaires. Pourtant, dans de nombreux cas, les facteurs qui contrôlent la quantité et/ou la qualité des réponses produites par ces cellules restent encore largement inconnus. L'objectif de cette thèse a consisté à identifier de nouveaux facteurs (endogènes ou exogènes) qui contrôlent les phagocytes mononucléaires. Dans ce but, nous avons fait usage de l'identification récente de marqueurs qui permettent d'identifier différents types de phagocytes mononucléaires ainsi que des cellules (souches) dont ils sont issus. Notre approche a consisté à définir des facteurs candidats qui pourraient contrôler certains phagocytes mononucléaires, puis à manipuler l'expression de ces facteurs chez la souris de manière à tester leurs fonctions et leur contributions in vivo. Nous avons également utilisé des échantillons biologiques de patients pour vérifier nos résultats chez l'homme. Tout d'abord, nous avons étudié un microARN et un facteur de transcription pour déterminer si ces deux facteurs opèrent en tant que co-régulateurs d'un certain type de monocytes. Deuxièmement, nous avons considéré une hormone produite par certaines tumeurs afin d'examiner son rôle dans la production d'une population de macrophages qui favorisent la progression des tumeurs. Les facteurs endogènes et exogènes identifiés dans cette recherche semblent agir comme régulateurs dominants de réponses produites par certains phagocytes mononucléaires et pourraient donc être exploités dans de futures approches thérapeutiques afin de contrôler les réponses immunitaires inflammatoires associées a certaines maladies.

Regulation of Nav1.7 and Nav1.8 voltage-gated sodium channels by Nedd4-2 and β-subunits and its implication in neuropathic pain

In mammals, the presence of excitable cells in muscles, heart and nervous system is crucial and allows fast conduction of numerous biological information over long distances through the generation of action potentials (AP). Voltage-gated sodium channels (Navs) are key players in the generation and propagation of AP as they are responsible for the rising phase of the AP. Navs are heteromeric proteins composed of a large pore-forming a-subunit (Nav) and smaller ß-auxiliary subunits. There are ten genes encoding for Navl.l to Nav1.9 and NaX channels, each possessing its own specific biophysical properties. The excitable cells express differential combinations of Navs isoforms, generating a distinct electrophysiological signature. Noteworthy, only when anchored at the membrane are Navs functional and are participating in sodium conductance. In addition to the intrinsic properties of Navs, numerous regulatory proteins influence the sodium current. Some proteins will enhance stabilization of membrane Navs while others will favour internalization. Maintaining equilibrium between the two is of crucial importance for controlling cellular excitability. The E3 ubiquitin ligase Nedd4-2 is a well-characterized enzyme that negatively regulates the turnover of many membrane proteins including Navs. On the other hand, ß-subunits are known since long to stabilize Navs membrane anchoring. Peripheral neuropathic pain is a disabling condition resulting from nerve injury. It is characterized by the dysregulation of Navs expressed in dorsal root ganglion (DRG) sensory neurons as highlighted in different animal models of neuropathic pain. Among Navs, Nav1.7 and Nav1.8 are abundantly and specifically expressed in DRG sensory neurons and have been recurrently incriminated in nociception and neuropathic pain development. Using the spared nerve injury (SNI) experimental model of neuropathic pain in mice, I observed a specific reduction of Nedd4-2 in DRG sensory neurons. This decrease subsequently led to an upregulation of Nav1.7 and Nav1.8 protein and current, in the axon and the DRG neurons, respectively, and was sufficient to generate neuropathic pain-associated hyperexcitability. Knocking out Nedd4-2 specifically in nociceptive neurons led to the same increase of Nav1.7 and Nav1.8 concomitantly with an increased thermal sensitivity in mice. Conversely, rescuing Nedd4-2 downregulation using viral vector transfer attenuated neuropathic pain mechanical hypersensitivity. This study demonstrates the significant role of Nedd4-2 in regulating cellular excitability in vivo and its involvement in neuropathic pain development. The role of ß-subunits in neuropathic pain was already demonstrated in our research group. Because of their stabilization role, the increase of ßl, ß2 and ß3 subunits in DRGs after SNI led to increased Navs anchored at the membrane. Here, I report a novel mechanism of regulation of a-subunits by ß- subunits in vitro; ßl and ß3-subunits modulate the glycosylation pattern of Nav1.7, which might account for stabilization of its membrane expression. This opens new perspectives for investigation Navs state of glycosylation in ß-subunits dependent diseases, such as in neuropathic pain. - Chez les mammifères, la présence de cellules excitables dans les muscles, le coeur et le système nerveux est cruciale; elle permet la conduction rapide de nombreuses informations sur de longues distances grâce à la génération de potentiels d'action (PA). Les canaux sodiques voltage-dépendants (Navs) sont des participants importants dans la génération et la propagation des PA car ils sont responsables de la phase initiale de dépolarisation du PA. Les Navs sont des protéines hétéromériques composées d'une grande sous-unité a (formant le pore du canal) et de petites sous-unités ß accompagnatrices. Il existe dix gènes qui codent pour les canaux sodiques, du Nav 1.1 au Nav 1.9 ainsi que NaX, chacun possédant des propriétés biophysiques spécifiques. Les cellules excitables expriment différentes combinaisons des différents isoformes de Navs, qui engendrent une signature électrophysiologique distincte. Les Navs ne sont fonctionnels et ne participent à la conductibilité du Na+, que s'ils sont ancrés à la membrane plasmique. En plus des propriétés intrinsèques des Navs, de nombreuses protéines régulatrices influencent également le courant sodique. Certaines protéines vont favoriser l'ancrage et la stabilisation des Navs exprimés à la membrane, alors que d'autres vont plutôt favoriser leur internalisation. Maintenir l'équilibre des deux processus est crucial pour contrôler l'excitabilité cellulaire. Dans ce contexte, Nedd4-2, de la famille des E3 ubiquitin ligase, est une enzyme bien caractérisée qui régule l'internalisation de nombreuses protéines, notamment celle des Navs. Inversement, les sous-unités ß sont connues depuis longtemps pour stabiliser l'ancrage des Navs à la membrane. La douleur neuropathique périphérique est une condition débilitante résultant d'une atteinte à un nerf. Elle est caractérisée par la dérégulation des Navs exprimés dans les neurones sensoriels du ganglion spinal (DRG). Ceci a été démontré à de multiples occasions dans divers modèles animaux de douleur neuropathique. Parmi les Navs, Nav1.7 et Nav1.8 sont abondamment et spécifiquement exprimés dans les neurones sensoriels des DRG et ont été impliqués de façon récurrente dans le développement de la douleur neuropathique. En utilisant le modèle animal de douleur neuropathique d'épargne du nerf sural (spared nerve injury, SNI) chez la souris, j'ai observé une réduction spécifique des Nedd4-2 dans les neurones sensoriels du DRG. Cette diminution avait pour conséquence l'augmentation de l'expression des protéines et des courants de Nav 1.7 et Nav 1.8, respectivement dans l'axone et les neurones du DRG, et était donc suffisante pour créer l'hyperexcitabilité associée à la douleur neuropathique. L'invalidation pour le gène codant pour Nedd4-2 dans une lignée de souris génétiquement modifiées a conduit à de similaires augmentations de Nav1.7 et Nav1.8, parallèlement à une augmentation à la sensibilité thermique. A l'opposé, rétablir une expression normale de Nedd4-2 en utilisant un vecteur viral a eu pour effet de contrecarrer le développement de l'hypersensibilité mécanique lié à ce modèle de douleur neuropathique. Cette étude démontre le rôle important de Nedd4-2 dans la régulation de l'excitabilité cellulaire in vivo et son implication dans le développement des douleurs neuropathiques. Le rôle des sous-unités ß dans les douleurs neuropathiques a déjà été démontré dans notre groupe de recherche. A cause de leur rôle stabilisateur, l'augmentation des sous-unités ßl, ß2 et ß3 dans les DRG après SNI, conduit à une augmentation des Navs ancrés à la membrane. Dans mon travail de thèse, j'ai observé un nouveau mécanisme de régulation des sous-unités a par les sous-unités ß in vitro. Les sous-unités ßl et ß3 régulent l'état de glycosylation du canal Nav1.7, et stabilisent son expression membranaire. Ceci ouvre de nouvelles perspectives dans l'investigation de l'état de glycosylation des Navs dans des maladies impliquant les sous-unités ß, notamment les douleurs neuropathiques.

Role of notch signalling in mammary gland

ÁBSTRACT : Mammary gland is composed of two main epithelial cell types, myoepithelial and luminal. The mechanisms involved in determination and maintenance of them remain poorly understood. Notch signaling is known to regulate cell fate determination in other tissues like skin and nervous system. It was also shown that it can act as tumor suppressor or oncogene depending on the tissue type. The mouse models overexpressing active Notch receptors indicated that Notch signaling is oncogenic in the mammary gland. This observation was followed by some descriptive and functional studies in human breast cancer and it was reported that Notch signaling activity or expression of its components are increased in some of the breast tumor samples compared to normal tissue. However, the physiological role of the Notch signaling and its downstream mechanisms in mammary gland is poorly defined. p63, a member of p53 family, has been implicated in the cell fate determination of keratinocytes. Knockout mouse models revealed that p63 is required for the formation of the mammary anlagen in embryo and its ΔN isoform is expressed exclusively in the myoepithelial layer of the adult breast. In order to understand its function in normal breast epithelial cells, I activated Notch signaling by expression of Notch1 intracellular domain (NICD) in normal primary human breast epithelial cells (HBECs). In this context, NICD reduced growth of HBECs and led to downmodulation of extracellular matrix-receptor interaction network (ECM) components as well as ΔNp63. Expression of ΔNp63 together with NICD partially rescued Notch induced growth reduction, which was correlated with an increase in ECM components. Moreover, silencing ΔNp63 in myoepithelial HBECs reduced growth similar to Notch activation and it led to downregulation of myoepithelial and upregulation of luminal markers. Complementing this observation, forced expression of ONp63 in luminal HBECs induced myoepithelial phenotype and decreased luminal markers. In vivo, by the analysis of a Notch reporter mouse strain, I showed that Notch is activated during puberty specifically at the sites of ductal morphogenesis, terminal end buds. FAGS analysis revealed that it can be detected in two different populations based on CD24 expression (low (lo) or high (high)): at lower levels in CD24lo, which includes stem/progenitor and myoepithelial cells and higher levels in CD24hi, which contains luminal cells. In parallel with in vitro results, the CD24lo mouse mammary epithelial cells displaying Notch activity have lower levels of p63 expression. Furthermore, deletion of RBPjk, the main mediator of Notch signaling, or the overexpression of ΔNp63 inhibited luminal cell lineage in vivo. Another important point revealed by Notch reporter mouse strain is the simultaneous activation of Notch with estrogen signaling during pubertal development. The expression of FOXA1, the mediator of estrogen receptor (ER) transcriptional activity, is correlated with Notch activation in vivo that it is lower in CD24lo than in CD24hi cells. Moreover, FOXA1 is regulated by NICD in vitro supporting the presence of a link between Notch and ER signaling. Taken together, I report that Notch signaling is involved in luminal cell fate determination and its effects are partially mediated through inhibition of ONp63. Besides, ΔNp63 is required for the maintenance and sufficient for the induction of myoepithelial phenotype in HBECs in vitro and is not compatible with luminal lineage in vivo. Based on these results, I propose a model for epithelial cell hierarchy in mammary gland, whereby there are two different types of luminal progenitors, early and late, displaying different levels of Notch activity. Notch signaling contributes to the determination of luminal cell lineage in these two progenitor steps: In "Early Luminal Progenitor" stage, it inhibits myoepithelial fate by decreasing p63 expression, and in "Late Luminal Progenitor" stage, Notch signaling is involved in induction of luminal lineage by acting on ER-FOXA1 axis. It has to be investigated further whether Notch signaling might behave as an oncogene or tumor suppressor depending on which cell type in the epithelial hierarchy it is modulated and which one is more likely to occur in different human breast cancer types. RÉSUMÉ : La glande mammaire est composée de deux types principaux de cellules: les cellules luminales, qui bordent le lumen et les cellules myoépithéliales, qui se trouvent entre la lame basale et les cellules luminales. Les mécanismes intervenant dans leur différenciation et leur maintenance demeurent encore mal compris. La protéine transmembranaire Notch est connue pour déterminer le destin des cellules dans plusieurs types de tissus comme la peau ou le système nerveux. Selon le type de tissu dans lequel se trouve Notch, il agira soit comme un suppresseur de tumeur soit comme un oncogène. A l'aide de modèles de souris surexprimant les récepteurs actifs de Notch, il a été démontré que la voie de signalisation de Notch est oncogénique au niveau de la glande mammaire. Des études descriptives et fonctionnelles dans le cadre du cancer du sein ont permis de mettre en évidence une augmentation de l'activité de Notch ou de l'expression de ces composants dans certains tissus cancéreux. Toutefois, le rôle physiologique de Notch et des mécanismes qu'il active restent méconnus. P63, une protéine membre de la famille p53, est impliquée dans la différenciation des kératinocytes. Le modèle issu de l'étude des souris p63 knockout a révélé que cette protéine est requise pour la formation des primordia mammaires chez l'embryon et que son isoforme ΔNp63 est exclusivement exprimée dans la couche myoépithéliale de la glande mammaire adulte. Dans le but de comprendre les fonctions physiologiques de Notch, je l'ai activé en exprimant le domaine intracellulaire de Notch 1 (NICD) dans des cellules épithéliales primaires de glande mammaire humaine (HBECs). Le NICD a alors réduit la croissance des HBECs et conduit à la régulation négative non seulement de p63 mais également des composants du réseau d'interaction des récepteurs de la matrice extracellulaire (ECM). En exprimant conjointement ΔNp63 et NICD, il est apparu que la réduction de croissance induite par Notch était partiellement compensée, et qu'il y avait également une augmentation des composants ECM. De plus, lorsque ΔNp63 a été inactivé dans les cellules HBECs myoépithéliales, une réduction de croissance cellulaire identique à celle provoquée par l'activation de Notch a pu être mise en évidence, de même qu'une régulation négative des marqueurs myoépithéliaux ainsi qu'une augmentation des marqueurs luminaux. Afin de compléter ces informations, l'expression de ΔNp63 a été forcée dans les HBECs luminales, ce qui a induit un phénotype myoépithélial et une diminution des marqueurs lumineux. In vivo, par l'analyse de souris ayant un gène rapporteur de l'activité de Notch, j'ai démontré que Notch est activé pendant la puberté au niveau des sites de la morphogenèse canalaire, à savoir les bourgeons terminaux. Les analyses par FACS (Fluorescence-activated cell sorting) basées sur l'expression de l'antigène CD24 ont révélé qu'il peut tre détecté dans deux populations différentes : une population qui l'exprime faiblement, qui regroupe les cellules souches/progéniteurs et les cellules myoépithéliales, et une population qui l'exprime fortement qui est composé des cellules luminales. Parallèlement aux résultats in vitro, j'ai mis en évidence un faible niveau d'expression de p63 dans les cellules épithéliales de la glande mammaire de souris, exprimant faiblement l'antigène CD24 et présentant une activité de Notch. De plus, la délétion de RBPjr~, médiateur principal de la signalisation de Notch, ainsi que la surexpression de ΔNp63 in vivo ont inhibé la lignée des cellules luminales. Un autre point important révélé par les souris rapporteur de l'activité de Notch a été l'activation simultanée de Notch et de la signalisation de l'oestrogène pendant le développement pubertaire. L'expression de FOXA1, médiateur de l'activité transcriptionnelle des récepteurs aux oestrogènes (ER), est en corrélation avec l'activation de Notch in vivo, plus basse dans les cellules avec une faible expression de l'antigène CD24 que dans celles avec une forte expression. De plus, FOXA1 est régulé par NICD in vitro confirmant la présence d'un lien entre Notch et la signalisation des ER. En résumé, la signalisation de Notch est impliquée dans la détermination du destin cellulaire des cellules luminales et ses effets sont partiellement modifiés par l'inhibition de ΔNp63. ΔNp63 est requis pour la maintenance et est suffisant pour l'induction du phénotype myoépithéliale dans les HBECs in vitro et ne peut donc pas se trouver dans les cellules luminales in vivo. Basé sur ces résultats, je propose un modèle de hiérarchisation des cellules épithéliales de la glande mammaire, dans lequel sont présents deux types de progéniteurs des cellules luminales exprimant des niveaux différents d'activité de Notch, les progéniteurs lumineux précoces et tardifs. La signalisation de Notch contribue à la différenciation de la lignée cellulaire luminale au niveau de ces deux progéniteurs : dans la forme précoce, il inhibe la différenciation des cellules myoépithéliales en réduisant l'expression de p63 et dans la forme tardive, Notch est impliqué dans l'induction de la lignée luminale en agissant sur l'axe ER-FOXA1. Il serait nécessaire d'investiguer plus loin si le fait que Notch agisse comme oncogène ou suppresseur de tumeur dépend du stade de différenciation de la cellule dans laquelle il est modulé et laquelle de ces deux fonctions il est le plus probable de rencontrer dans les différents types de cancer du sein.

Reliability of methods used for the risk assessment of mixture of micropollutants in aquatic enviromments : from theoretical concepts to field observations

Ces dernières années, de nombreuses recherches ont mis en évidence les effets toxiques des micropolluants organiques pour les espèces de nos lacs et rivières. Cependant, la plupart de ces études se sont focalisées sur la toxicité des substances individuelles, alors que les organismes sont exposés tous les jours à des milliers de substances en mélange. Or les effets de ces cocktails ne sont pas négligeables. Cette thèse de doctorat s'est ainsi intéressée aux modèles permettant de prédire le risque environnemental de ces cocktails pour le milieu aquatique. Le principal objectif a été d'évaluer le risque écologique des mélanges de substances chimiques mesurées dans le Léman, mais aussi d'apporter un regard critique sur les méthodologies utilisées afin de proposer certaines adaptations pour une meilleure estimation du risque. Dans la première partie de ce travail, le risque des mélanges de pesticides et médicaments pour le Rhône et pour le Léman a été établi en utilisant des approches envisagées notamment dans la législation européenne. Il s'agit d'approches de « screening », c'est-à-dire permettant une évaluation générale du risque des mélanges. Une telle approche permet de mettre en évidence les substances les plus problématiques, c'est-à-dire contribuant le plus à la toxicité du mélange. Dans notre cas, il s'agit essentiellement de 4 pesticides. L'étude met également en évidence que toutes les substances, même en trace infime, contribuent à l'effet du mélange. Cette constatation a des implications en terme de gestion de l'environnement. En effet, ceci implique qu'il faut réduire toutes les sources de polluants, et pas seulement les plus problématiques. Mais l'approche proposée présente également un biais important au niveau conceptuel, ce qui rend son utilisation discutable, en dehors d'un screening, et nécessiterait une adaptation au niveau des facteurs de sécurité employés. Dans une deuxième partie, l'étude s'est portée sur l'utilisation des modèles de mélanges dans le calcul de risque environnemental. En effet, les modèles de mélanges ont été développés et validés espèce par espèce, et non pour une évaluation sur l'écosystème en entier. Leur utilisation devrait donc passer par un calcul par espèce, ce qui est rarement fait dû au manque de données écotoxicologiques à disposition. Le but a été donc de comparer, avec des valeurs générées aléatoirement, le calcul de risque effectué selon une méthode rigoureuse, espèce par espèce, avec celui effectué classiquement où les modèles sont appliqués sur l'ensemble de la communauté sans tenir compte des variations inter-espèces. Les résultats sont dans la majorité des cas similaires, ce qui valide l'approche utilisée traditionnellement. En revanche, ce travail a permis de déterminer certains cas où l'application classique peut conduire à une sous- ou sur-estimation du risque. Enfin, une dernière partie de cette thèse s'est intéressée à l'influence que les cocktails de micropolluants ont pu avoir sur les communautés in situ. Pour ce faire, une approche en deux temps a été adoptée. Tout d'abord la toxicité de quatorze herbicides détectés dans le Léman a été déterminée. Sur la période étudiée, de 2004 à 2009, cette toxicité due aux herbicides a diminué, passant de 4% d'espèces affectées à moins de 1%. Ensuite, la question était de savoir si cette diminution de toxicité avait un impact sur le développement de certaines espèces au sein de la communauté des algues. Pour ce faire, l'utilisation statistique a permis d'isoler d'autres facteurs pouvant avoir une influence sur la flore, comme la température de l'eau ou la présence de phosphates, et ainsi de constater quelles espèces se sont révélées avoir été influencées, positivement ou négativement, par la diminution de la toxicité dans le lac au fil du temps. Fait intéressant, une partie d'entre-elles avait déjà montré des comportements similaires dans des études en mésocosmes. En conclusion, ce travail montre qu'il existe des modèles robustes pour prédire le risque des mélanges de micropolluants sur les espèces aquatiques, et qu'ils peuvent être utilisés pour expliquer le rôle des substances dans le fonctionnement des écosystèmes. Toutefois, ces modèles ont bien sûr des limites et des hypothèses sous-jacentes qu'il est important de considérer lors de leur application. - Depuis plusieurs années, les risques que posent les micropolluants organiques pour le milieu aquatique préoccupent grandement les scientifiques ainsi que notre société. En effet, de nombreuses recherches ont mis en évidence les effets toxiques que peuvent avoir ces substances chimiques sur les espèces de nos lacs et rivières, quand elles se retrouvent exposées à des concentrations aiguës ou chroniques. Cependant, la plupart de ces études se sont focalisées sur la toxicité des substances individuelles, c'est à dire considérées séparément. Actuellement, il en est de même dans les procédures de régulation européennes, concernant la partie évaluation du risque pour l'environnement d'une substance. Or, les organismes sont exposés tous les jours à des milliers de substances en mélange, et les effets de ces "cocktails" ne sont pas négligeables. L'évaluation du risque écologique que pose ces mélanges de substances doit donc être abordé par de la manière la plus appropriée et la plus fiable possible. Dans la première partie de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux méthodes actuellement envisagées à être intégrées dans les législations européennes pour l'évaluation du risque des mélanges pour le milieu aquatique. Ces méthodes sont basées sur le modèle d'addition des concentrations, avec l'utilisation des valeurs de concentrations des substances estimées sans effet dans le milieu (PNEC), ou à partir des valeurs des concentrations d'effet (CE50) sur certaines espèces d'un niveau trophique avec la prise en compte de facteurs de sécurité. Nous avons appliqué ces méthodes à deux cas spécifiques, le lac Léman et le Rhône situés en Suisse, et discuté les résultats de ces applications. Ces premières étapes d'évaluation ont montré que le risque des mélanges pour ces cas d'étude atteint rapidement une valeur au dessus d'un seuil critique. Cette valeur atteinte est généralement due à deux ou trois substances principales. Les procédures proposées permettent donc d'identifier les substances les plus problématiques pour lesquelles des mesures de gestion, telles que la réduction de leur entrée dans le milieu aquatique, devraient être envisagées. Cependant, nous avons également constaté que le niveau de risque associé à ces mélanges de substances n'est pas négligeable, même sans tenir compte de ces substances principales. En effet, l'accumulation des substances, même en traces infimes, atteint un seuil critique, ce qui devient plus difficile en terme de gestion du risque. En outre, nous avons souligné un manque de fiabilité dans ces procédures, qui peuvent conduire à des résultats contradictoires en terme de risque. Ceci est lié à l'incompatibilité des facteurs de sécurité utilisés dans les différentes méthodes. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons étudié la fiabilité de méthodes plus avancées dans la prédiction de l'effet des mélanges pour les communautés évoluant dans le système aquatique. Ces méthodes reposent sur le modèle d'addition des concentrations (CA) ou d'addition des réponses (RA) appliqués sur les courbes de distribution de la sensibilité des espèces (SSD) aux substances. En effet, les modèles de mélanges ont été développés et validés pour être appliqués espèce par espèce, et non pas sur plusieurs espèces agrégées simultanément dans les courbes SSD. Nous avons ainsi proposé une procédure plus rigoureuse, pour l'évaluation du risque d'un mélange, qui serait d'appliquer d'abord les modèles CA ou RA à chaque espèce séparément, et, dans une deuxième étape, combiner les résultats afin d'établir une courbe SSD du mélange. Malheureusement, cette méthode n'est pas applicable dans la plupart des cas, car elle nécessite trop de données généralement indisponibles. Par conséquent, nous avons comparé, avec des valeurs générées aléatoirement, le calcul de risque effectué selon cette méthode plus rigoureuse, avec celle effectuée traditionnellement, afin de caractériser la robustesse de cette approche qui consiste à appliquer les modèles de mélange sur les courbes SSD. Nos résultats ont montré que l'utilisation de CA directement sur les SSDs peut conduire à une sous-estimation de la concentration du mélange affectant 5 % ou 50% des espèces, en particulier lorsque les substances présentent un grand écart- type dans leur distribution de la sensibilité des espèces. L'application du modèle RA peut quant à lui conduire à une sur- ou sous-estimations, principalement en fonction de la pente des courbes dose- réponse de chaque espèce composant les SSDs. La sous-estimation avec RA devient potentiellement importante lorsque le rapport entre la EC50 et la EC10 de la courbe dose-réponse des espèces est plus petit que 100. Toutefois, la plupart des substances, selon des cas réels, présentent des données d' écotoxicité qui font que le risque du mélange calculé par la méthode des modèles appliqués directement sur les SSDs reste cohérent et surestimerait plutôt légèrement le risque. Ces résultats valident ainsi l'approche utilisée traditionnellement. Néanmoins, il faut garder à l'esprit cette source d'erreur lorsqu'on procède à une évaluation du risque d'un mélange avec cette méthode traditionnelle, en particulier quand les SSD présentent une distribution des données en dehors des limites déterminées dans cette étude. Enfin, dans la dernière partie de cette thèse, nous avons confronté des prédictions de l'effet de mélange avec des changements biologiques observés dans l'environnement. Dans cette étude, nous avons utilisé des données venant d'un suivi à long terme d'un grand lac européen, le lac Léman, ce qui offrait la possibilité d'évaluer dans quelle mesure la prédiction de la toxicité des mélanges d'herbicide expliquait les changements dans la composition de la communauté phytoplanctonique. Ceci à côté d'autres paramètres classiques de limnologie tels que les nutriments. Pour atteindre cet objectif, nous avons déterminé la toxicité des mélanges sur plusieurs années de 14 herbicides régulièrement détectés dans le lac, en utilisant les modèles CA et RA avec les courbes de distribution de la sensibilité des espèces. Un gradient temporel de toxicité décroissant a pu être constaté de 2004 à 2009. Une analyse de redondance et de redondance partielle, a montré que ce gradient explique une partie significative de la variation de la composition de la communauté phytoplanctonique, même après avoir enlevé l'effet de toutes les autres co-variables. De plus, certaines espèces révélées pour avoir été influencées, positivement ou négativement, par la diminution de la toxicité dans le lac au fil du temps, ont montré des comportements similaires dans des études en mésocosmes. On peut en conclure que la toxicité du mélange herbicide est l'un des paramètres clés pour expliquer les changements de phytoplancton dans le lac Léman. En conclusion, il existe diverses méthodes pour prédire le risque des mélanges de micropolluants sur les espèces aquatiques et celui-ci peut jouer un rôle dans le fonctionnement des écosystèmes. Toutefois, ces modèles ont bien sûr des limites et des hypothèses sous-jacentes qu'il est important de considérer lors de leur application, avant d'utiliser leurs résultats pour la gestion des risques environnementaux. - For several years now, the scientists as well as the society is concerned by the aquatic risk organic micropollutants may pose. Indeed, several researches have shown the toxic effects these substances may induce on organisms living in our lakes or rivers, especially when they are exposed to acute or chronic concentrations. However, most of the studies focused on the toxicity of single compounds, i.e. considered individually. The same also goes in the current European regulations concerning the risk assessment procedures for the environment of these substances. But aquatic organisms are typically exposed every day simultaneously to thousands of organic compounds. The toxic effects resulting of these "cocktails" cannot be neglected. The ecological risk assessment of mixtures of such compounds has therefore to be addressed by scientists in the most reliable and appropriate way. In the first part of this thesis, the procedures currently envisioned for the aquatic mixture risk assessment in European legislations are described. These methodologies are based on the mixture model of concentration addition and the use of the predicted no effect concentrations (PNEC) or effect concentrations (EC50) with assessment factors. These principal approaches were applied to two specific case studies, Lake Geneva and the River Rhône in Switzerland, including a discussion of the outcomes of such applications. These first level assessments showed that the mixture risks for these studied cases exceeded rapidly the critical value. This exceeding is generally due to two or three main substances. The proposed procedures allow therefore the identification of the most problematic substances for which management measures, such as a reduction of the entrance to the aquatic environment, should be envisioned. However, it was also showed that the risk levels associated with mixtures of compounds are not negligible, even without considering these main substances. Indeed, it is the sum of the substances that is problematic, which is more challenging in term of risk management. Moreover, a lack of reliability in the procedures was highlighted, which can lead to contradictory results in terms of risk. This result is linked to the inconsistency in the assessment factors applied in the different methods. In the second part of the thesis, the reliability of the more advanced procedures to predict the mixture effect to communities in the aquatic system were investigated. These established methodologies combine the model of concentration addition (CA) or response addition (RA) with species sensitivity distribution curves (SSD). Indeed, the mixture effect predictions were shown to be consistent only when the mixture models are applied on a single species, and not on several species simultaneously aggregated to SSDs. Hence, A more stringent procedure for mixture risk assessment is proposed, that would be to apply first the CA or RA models to each species separately and, in a second step, to combine the results to build an SSD for a mixture. Unfortunately, this methodology is not applicable in most cases, because it requires large data sets usually not available. Therefore, the differences between the two methodologies were studied with datasets created artificially to characterize the robustness of the traditional approach applying models on species sensitivity distribution. The results showed that the use of CA on SSD directly might lead to underestimations of the mixture concentration affecting 5% or 50% of species, especially when substances present a large standard deviation of the distribution from the sensitivity of the species. The application of RA can lead to over- or underestimates, depending mainly on the slope of the dose-response curves of the individual species. The potential underestimation with RA becomes important when the ratio between the EC50 and the EC10 for the dose-response curve of the species composing the SSD are smaller than 100. However, considering common real cases of ecotoxicity data for substances, the mixture risk calculated by the methodology applying mixture models directly on SSDs remains consistent and would rather slightly overestimate the risk. These results can be used as a theoretical validation of the currently applied methodology. Nevertheless, when assessing the risk of mixtures, one has to keep in mind this source of error with this classical methodology, especially when SSDs present a distribution of the data outside the range determined in this study Finally, in the last part of this thesis, we confronted the mixture effect predictions with biological changes observed in the environment. In this study, long-term monitoring of a European great lake, Lake Geneva, provides the opportunity to assess to what extent the predicted toxicity of herbicide mixtures explains the changes in the composition of the phytoplankton community next to other classical limnology parameters such as nutrients. To reach this goal, the gradient of the mixture toxicity of 14 herbicides regularly detected in the lake was calculated, using concentration addition and response addition models. A decreasing temporal gradient of toxicity was observed from 2004 to 2009. Redundancy analysis and partial redundancy analysis showed that this gradient explains a significant portion of the variation in phytoplankton community composition, even when having removed the effect of all other co-variables. Moreover, some species that were revealed to be influenced positively or negatively, by the decrease of toxicity in the lake over time, showed similar behaviors in mesocosms studies. It could be concluded that the herbicide mixture toxicity is one of the key parameters to explain phytoplankton changes in Lake Geneva. To conclude, different methods exist to predict the risk of mixture in the ecosystems. But their reliability varies depending on the underlying hypotheses. One should therefore carefully consider these hypotheses, as well as the limits of the approaches, before using the results for environmental risk management

High-dose therapy and autologous hematopoietic stem cell transplantation in T-cell lymphoma : a single centre experience

Le diagnostic de lymphome représente 4% de tous les cancers et a une incidence particulièrement élevée dans les pays industrialisés. La proportion de lymphomes T, évaluée en Europe et aux Etats Unis, représente environ 5 à 10% des lymphomes. Alors que des progrès très sensibles ont été apportés dans la prise en charge et le pronostic des lymphomes B agressifs durant ces dernières décennies et en particulier depuis le début des années 2000 avec l'utilisation des anticorps anti-CD20 associés à la chimiothérapie, le pronostic des lymphomes T reste très décevant. La survie globale des lymphomes T à 5 ans est estimée entre 28% et 38%. Le bénéfice réel d'une chimiothérapie intensive suivie d'une autogreffe de cellules souches hématopoïétiques périphériques au terme d'un traitement de chimiothérapie d'induction dans le lymphome T périphérique reste débattu. Les résultats des rares études prospectives et des études rétrospectives à disposition sont discordants. Nous avons donc analysé rétrospectivement 43 patients successifs de mars 2000 à mars 2011, atteints de lymphome T, issus de notre base de données du programme autogreffe lausannois. Nos analyses statistiques permettent, sur la base d'un suivi médian de 63 mois, une estimation à 12 ans, de la survie globale de nos patients à 40%, de la survie sans progression à 34% et de la survie sans événement à 30%. Ces chiffres s'inscrivent parfaitement dans les résultats des études prospectives qui montrent un bénéfice de l'autogreffe dans le lymphome T. Parmi les différents paramètres pronostiques habituellement évalués, l'âge et l'absence de symptômes B au diagnostic sont les seuls paramètres statistiquement significatifs en analyse univariée dans notre cohorte. En effet, Les patients de moins de 50 ans et ceux qui ne présentent pas de symptômes B au diagnostic ont un meilleur pronostic. Nous concluons de cette analyse que les patients traités par chimiothérapie intensive et autogreffe de cellules souches hématopoïétiques périphériques ont une survie moyenne supérieure aux résultats rapportés dans la littérature avec des traitements de chimiothérapie conventionnelle de type CHOP. En effet, on estime à environ 50% les patients répondant à une chimiothérapie conventionnelle de type CHOP.

Ultrastructural changes of the internal limiting membrane removed during indocyanine green assisted peeling versus conventional surgery for idiopathic macular epiretinal membrane

Résumé : Introduction : L'objectif de cette étude était d'une part d'évaluer les caractéristiques histologiques des fragments cellulaires rétiniens attachés à la limitante interne après vitrectomie et pelage d'une membrane epirétinienne, et d'autre part de mettre en évidence des différences histologiques entre les cas opérés avec ou sans l'aide d'ICG dilué dans du glucose 5%. Méthodes Nous avons examiné rétrospectivement l'histologie de 88 spécimens de membranes épimaculaires contenant la limitante interne de la rétine, qui ont été enlevés chirurgicalement entre 1995 et 2003. L'analyse histologique a centré principalement l'attention sur la présence et les caractéristiques des fragments cellulaires rétiniens attachés à la limitante interne. L'analyse statistique a comparé les résultats entre le groupe I (chirurgie conventionnelle sans l'aide de l'ICG) et le groupe II (chirurgie à l'aide de l'ICG). Résultats Soixante et onze patients ont eu une vitrectomie sans l'aide de l'ICG (groupe I) et 17 avec l'aide de l'ICG (groupe II). Le nombre de débris de cellules de Müller à la surface rétinienne de la limitante interne était plus important dans le groupe I (sans ICG) que dans le groupe II (avec ICG) (40.8% versus 11.8% ; p = 0.024). Des larges fragments cellulaires rétiniens attachés à la limitante interne ont été plus fréquemment observés dans le groupe I (sans ICG) que dans le groupe II (avec ICG) (63.4% versus 23.5%; p= 0.003). Dans cinq (7%) cas du groupe I, de gros éléments cellulaires rétiniens ont été mis en évidence (des axones neuraux ou des vaisseaux sanguins). De tels éléments n'ont pas été retrouvés dans les spécimens du groupe II (avec ICG). Conclusions L'utilisation de l'ICG dilué dans du glucose 5% pour faciliter le pelage d'une membrane épimaculaire et notamment l'ablation de la limitante interne de la rétine semble diminuer de manière significative le nombre et la taille des débris des cellules de Muller adhérents à la face rétinienne de la membrane limitante interne de la rétine. Cette observation suggère que l'utilisation per-opératoire d'ICG dilué dans du glucose 5% facilite l'ablation de la limitante interne pendant la chirurgie de la membrane epirétinienne en diminuant l'adhérence de la limitante interne à la rétine.

Evaluation des pratiques d'irrigation, de fertilisation et d'application de pesticides dans l'agriculture périurbaine de Dakar, Sénégal

RESUMEL'agriculture urbaine et périurbalne - nommée ci-après AU - est un thème fort de recherche transversale, au vu des nombreux enjeux économiques, sociaux et environnementaux. L'objectif de cette recherche était de contribuer à une meilleure connaissance des processus de transfert de polluants et du cycle des nutriments à l'échelle locale, afin de déterminer sous quelles conditions l'AU de Dakar peut être pratiquée sans porter atteinte à la santé et à l'environnement.Une approche basée sur l'étude des processus géochimiques dans ie sol jusqu'à la nappe a été choisie, à l'échelle de la parcelle cultivée et à une échelle un peu plus large de la zone périurbaine de Dakar pour déterminer les influences du type d'occupation du sol.L'évaluation des impacts de l'irrigation avec des eaux usées brutes et des eaux de nappe saumâtres sur la qualité des sols (chapitre 2) a montré que l'alcalinité et les teneurs en calcium élevées des eaux saumâtres induisent la précipitation de CaC03 dans l'horizon superficiel du sol. Na remplace consécutivement Ca sur le complexe argilo-humique du sol et les bicarbonates diminuent dans la solution du sol. Le carbone organique dissout (COD) augmente significativement dans la solution du sol et dans la nappe sous-jacente. Malgré l'alcalinité et les teneurs très élevées en calcium des eaux usées, il y a peu de précipitation de CaC03 dans l'horizon superficiel du sol et une faible augmentation du sodium échangeable ESP. La nitrification de l'ammonium des eaux usées (moy 190mg/L à Pikine) produit des protons, qui ne sont plus tamponnés par les bicarbonates exportés hors du profil. Il y a alors une nette baisse de pH des sols irrigués par des eaux usées non traitées. Les sols irrigués par des eaux usées et saumâtres stockent moins de C et Ν que les sols de référence.L'évaluation de l'influence de l'occupation des sols en zone périurbaine sur à la nappe phréatique peu profonde (chapitre 3) a permis de déterminer les traceurs représentatifs de l'occupation du sol, à savoir Br/CI, NO3/CI et δ180-Ν03 pour l'irrigation par des eaux usées, pH et δ15Ν-Ν03 pour l'irrigation par des eaux de nappe, et Rb+Cr et Κ pour les lixiviats de fosses septiques. Ce chapitre a mis en évidence des points importants de la dynamique de l'azote en zone périurbaine sous deux occupations du sol : (1) la dénitrification est un processus important dans l'agrosystème périurbain de Dakar en bas de dune, dans les gleysols où l'on trouve des conditions temporairement réduites et un substrat organique favorables aux microorganismes de la dénitrification. Les teneurs en nitrates sont presque nulles avec irrigation d'eau de nappe. (2) en bas de pente, mais avec irrigation quotidienne par les eaux usées, l'apport continu d'ammonium inhibe probablement la dénitrification, mais favorise la volatilisation. (3) la nitrification de l'ammonium dans la nappe lors de la lixiviation des fosses septiques se distingue de la nitrification de l'ammonium dans la zone non saturée dans la zone d'agriculture périurbaine par la composition isotopique de l'oxygène de l'eau. Une comparaison des flux d'azote entre l'agrosystème et les quartiers périurbains de Dakar (chapitre 4) ont révélé que ces derniers étaient du même ordre de grandeur par unité de surface, à savoir 2-4 tonnes Ν /ha/an.L'évaluation des flux de pesticides dans l'agrosystème et des risques induits pour les eaux souterraines (chapitre 5) a révélé un fiux total de pesticides de 60kg/ha/an, totalisant 15 matières actives. Seules deux de ces matières actives sont autorisées par le comité des pesticides sahélien. Les pesticides les plus utilisés par les producteurs sont l'organochloré dicofol, les organophosphorés methamidophos, dimethoate et fenithrotion ainsi que le cabamate methomyl. Les flux les plus importants sont de 9 à 7 kg/ha/an (methomyl, methamidophos, ethoprophos et dicofol). Les pesticides qui présentent un risque élevé de contamination des eaux souterraines et qui devraient être prioritaires pour un suivi analytique sont : le carbofuran, le dimethoate, l'ethoprophos et le methomyl.En conclusion, une meilleure gestion de la fertilisation est nécessaire dans la zone d'AU de Dakar, afin de (1) réduire les pertes gazeuses qui contribuent à l'effet de serre, (2) de ralentir la minéralisation du carbone et de l'azote organiques pour créer un stock de C et Ν dans ces sols, (3) de limiter le lessivage dans la nappe et enfin, 4) d'augmenter l'efficacité d'utilisation de Ν par les plantes. Une optimisation de l'irrigation devrait limiter l'alcalinisation secondaire. Enfin, la mise en place d'une lutte intégrée ou biologique contre les ravageurs est indispensable afin de minimiser les risques pour les eaux souterraines et les mares permanentes.ABSTRACTUrban and periurban agriculture (UA) is an important issue in southern countries, because of its key role in their social and economical development and its environmental concern. The goal of this study was to contribute to a better understanding of pollutant transfer and nutrient cycling at the local scale, in order to implement the necessary improvements to guarantee the sustainability of this practice.An approach based on geochemical processes occurring in the vadose zone from the surface down to the groundwater level was chosen, at the scale of cultivated plots and at the regional scale of Dakar periurban areas, to determine the influence of land use.The assessment of irrigation with untreated domestic wastewater and brackish water on soil quality (chapter 2) showed: (1) that the high alkalinity and calcium contents of brackish water induce CaC03 precipitation in the top layer of the soil and therefore a replacement of Ca by Na on the clay- humic complexes, strongly marked during the dry season. Dissolved organic carbon (DOC) increased significantly in the soil solution and in the underlying groundwater. (2) in spite of the similarly high alkalinity and Ca contents of waste water, there is only little CaC03 precipitation and a low increase of the percentage of exchangeable sodium (ESP) in the soil top layer. The nitrification of the ammonium of wastewater (mean 190 mg/L in Pikine) produces protons, which are not any more buffered by bicarbonates exported out of the soil profile, which leads to a net decline of soil pH. Both soils irrigated with untreated wastewater and brackish water store less of C and Ν than soils irrigated with non saline groundwater.The assessment of the impact of land use on the shallow groundwater (chapter 3) allowed determining representative tracers of the land use. Low Br/CI ratio, high NO3/CI ratio and low δ1βΟ- nitrate indicated the influence of wastewater; high pH and high 515N-nitrates indicated the influence of brackish water together with high amendments of organic fertilizers; high Rb+Cr and Κ indicated the influence of poor sanitation facilities in periurban districts (septic tank leakage). This chapter also pointed out the following facts about the nitrogen dynamics : (1) denitrification is a key-process in the Dakar UA agrosystem in the gleysols irrigated with groundwater. The underlying groundwater is almost nitrate free. (2) in the Gleysols irrigated with waste water, ammonium inhibits denitrification but facilitate ammoniac volatilization. A comparison of nitrogen balance between the UA agrosystem and the periurban districts of Dakar (chapter 4) revealed similar flows per surface unit, namely 2-4 tons Ν / ha / year.The evaluation of pesticides use in the UA agrosystem and the risk assessment for the groundwater (chapter 5) revealed a total flow of pesticides of 60kg / ha / year, totalizing 15 active substances. Only two of these are authorized by the Sahelian Pesticides Committee. The most used pesticides are dicofol (organochlorinated), methamidophos, dimethoate and fenithrotion (organophosphate) as well as methomyl. (carbamate). The most important flows vary between 9 to 7 kg / ha / year. Pesticides with a high risk of groundwater contamination - according to SIRIS and EPRIP 2 indicators - are: carbofuran, dimethoate, ethoprophos and methomyl. These substances should be established as a priority for an analytical follow-up in the different environmental compartments.In conclusion, a better management of the fertilization is necessary in the Dakar UA, (1) to reduce the gaseous losses which contribute to greenhouse emissions (2) to slow down the mineralization of the organic carbon and the nitrogen, in order to enhance the C and Ν stock in these soils, (3) to limit the nitrate leaching in the groundwater and finally, 4) to increase the N-use efficiency of plants. An optimization of the irrigation scheme should limit the secondary sodisation if coupled with an increase the stable organic matter of the soil. An integrated or biologic crop pest strategy is urgently needed to minimize risks with respect to ground and surface water (ponds used for fishing).RESUME LARGE PUBLICL'agriculture mondiale connaît actuellement une crise majeure, affectée par les changements climatiques, la sécurité alimentaire et les dégradations de l'environnement. Elle n'a plus le rôle unique de produire, mais devient un élément essentiel de la protection des ressources naturelles et du paysage. Les politiques agricoles basées sur les marchés mondiaux devront se réorienter vers une agriculture locale basée sur le développement durable.La production alimentaire située dans l'enceinte des villes, nommée agriculture urbaine ou périurbaine (AU ci-après) joue un rôle important dans le contexte actuel d'accroissement de la population et de la pauvreté urbaines. L'AU concerne en effet la majorité des mégapoies du monde, fait vivre plus de 200 millions de personnes dans les pays du Sud, fournit jusqu'à 80% de la demande urbaine en certains produits frais, fait barrière à l'extension urbaine et permet un recyclage de certains déchets urbains. L'AU a pour particularité d'être à cheval entre des politiques rurales et urbaines, d'où un délaissement ce cette activité au secteur informel. Ce qui a développé de nombreuses stratégies à risques, comme à Dakar, où les petits producteurs périurbains irriguent quotidiennement avec des eaux usées domestiques par manque d'accès à une eau de bonne qualité et pour raccourcir les cycles de production. L'extrême précarité foncière des acteurs de l'AU de Dakar les empêchent d'investir à long terme et induit des pratiques inadéquates d'irrigation, d'usage de pesticides et de fertilisation de ces sols sableux.L'objectif de cette recherche était de contribuer à une meilleure connaissance des processus de transfert de polluants et du cycle des nutriments à l'échelle des parcelles cultivées par des eaux usées et des eaux saumâtres, afin de déterminer sous quelles conditions l'AU de Dakar peut être pratiquée et surtout maintenue sans porter atteinte à la santé et à l'environnement. Pour cela, une approche basée sur l'étude des processus géochimiques dans le sol jusqu'à la nappe a été choisie, à l'échelle de la parcelle cultivée et à une échelle un peu plus large de la zone périurbaine de Dakar pour déterminer les influences du type d'occupation du sol.Les résultats principaux de cette étude ont montré que (1) il y a un processus de salinisation anthropique des sols (sodisation) lors d'irrigation avec des eaux de nappe saumâtres, un processus accentué en saison sèche et lors d'années à pluviométrie déficitaire. Bien que les eaux usées soient aussi salines que les eaux de nappe, la salinisation des sols irrigués' par des eaux usées est limitée par l'ammonium présent dans les eaux usées (moy 190mg NH4/L à Pikine) qui produit de l'acidité lors de la transformation en nitrates dans le sol (nitrification). (2) les sols irrigués par des eaux usées (EU) stockent moins de C et Ν que les sois de référence, ce qui montrent bien que l'azote des eaux usées n'est pas disponible pour les plantes, mais est lessivé dans la nappe (100 à 450 mg/L N03 sous irrigation par EU, alors que la limite de OMS est de 50mg/L). (3) l'utilisation des isotopes stables des nitrates et des éléments traces, notamment le bore et le brome, ont permis de distinguer l'influence de l'irrigation par des eaux usées, de l'irrigation par des eaux de nappe et des lixiviats de fosses septiques sur les propriétés de la nappe. (4) Le processus de la dénitrification (atténuation naturelle des concentrations en nitrates de la nappe par biotransformation en azote gazeux) est important dans les zones basses de l'agrosystème périurbain de Dakar, sous irrigation par eaux naturelles (ΝΟ3 < 50mg/L). Tandis que sous habitat sans assainissement adéquat, les nitrates atteignent 300 à 700 mg/L. (5) Le flux total de pesticides dans l'AU est énorme (60kg/ha/an) totalisant 15 pesticides, dont deux seulement sont autorisés. Les pesticides les plus utilisés sont des insecticides organophosphorés et organochlorés classés extrêmement dangereux à dangereux par l'OMS, appliqués à des doses de 2 à 9 kg/ha/an. Les pesticides qui ont montré un risque élevé de contamination des eaux souterraines avec les indicateurs SIRIS et EPRIP2 sont : le carbofuran, le dimethoate, l'ethoprophos et le methomyl.En conclusion, nous recommandons la reconstitution d'un horizon superficiel des sols riche en matière organique stable et structuré par production locale de compost. Cette mesure réduira les pertes gazeuses contribuant à l'effet de serre, augmentera le stock de Ν dans ces sols, alors utilisable par les plantes et permettra de diminuer l'irrigation car la capacité de rétention de l'eau dans le sol sera accru, ce qui limitera le lessivage des nitrates dans la nappe et l'alcalinisation secondaire. Enfin, la mise en place d'une lutte intégrée ou biologique contre les ravageurs est indispensable afin de minimiser les risques pour les eaux souterraines et lesmares permanentes.

Effects of neuroinflammation on demyelination and remyelination: an in vitro study in aggregating brain cell cultures

La neuroinflammation joue un rôle important dans de nombreuses maladies neurodégéneratives dont la sclérose en plaques. Les microglies et les astrocytes sont les cellules effectrices de la réponse inflammatoire dans le cerveau et sont impliquées dans les processus de démyélinisation et de remyélinisation. Dans ce travail, nous avons étudié les réactions inflammatoires accompagnant la démyélinisation et leurs conséquences sur la remyélinisation. Dans ce but, trois différents traitements démyélinisants ont été appliqués sur des cultures en agrégats de télencéphales de rats, à savoir (i) la lysophosphatidylcholine, (ii) l'interféron-γ (IFN-γ) combiné avec du lipopolysaccharide (LPS), et (iii) des anticorps dirigés contre la MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein) en présence de complément. Nous avons montré que ces traitements induisent différents types de démyélinisation, de réponses inflammatoires et d'effets secondaires sur les neurones. Nous avons ensuite examiné les effets de l'atténuation de la réponse inflammatoire sur la démyélinisation et la remyélinisation, en utilisant la minocycline, un antibiotique bloquant la réactivité microgiale, et le GW 5501516, un agoniste de PPAR-β (peroxisome proliferator-activated receptor-β). Nous avons montré que la minocycline prévient l'activation microgliale induite par le traitement avec l'IFN-γ et le LPS, mais qu'elle ne protège pas de la démyélinisation. Néanmoins, elle induit une remyélinisation, probablement en favorisant la maturation d'oligodendrocytes immatures. Le GW 501516 diminue l'expression de l'IFN-γ après une démyélinisation induite par les anticorps anti-MOG, mais il ne prévient pas la démyélinisation et ne favorise pas la remyélinisation. Ces résultats indiquent que la démyélinisation induite par le traitement avec l'IFN-γ et le LPS n'est pas une conséquence directe de l'activation microgliale, et que l'augmentation de l'expression de l'IFN-γ ne participe pas à la démyélinisation induite par les anticorps anti-MOG. Ces résultats suggèrent que l'atténuation de l'activation microgliale est bénéfique pour la remyélinisation.

Fluid-rock-strain feedbacks in extensional shear zones

La présence de fluide météorique synchrone à l'activité du détachement (Farmin, 2003 ; Mulch et al., 2007 ; Gébelin et al., 2011), implique que les zones de cisaillement sont des systèmes ouverts avec des cellules de convections à l'échelle crustale et un intense gradient géothermique au sein du détachement (Morrison et Anderson, 1998, Gottardi et al., 2011). De plus, les réactions métamorphiques liées à des infiltrations fluides dans les zones de cisaillement extensionnel peuvent influencer les paramètres rhéologiques du système (White and Knipe, 1978), et impliquer la localisation de la déformation dans la croûte. Dans ce manuscrit, deux zones de cisaillement infiltrées par des fluides météoriques sont étudiées, l'une étant largement quartzitique, et l'autre de nature granitique ; les relations entre déformation, fluides, et roches s'appuient sur des approches structurales, microstructurales, chimiques et isotopiques. L'étude du détachement du Columbia river (WA, USA) met en évidence que la déformation mylonitique se développe en un million d'années. La phase de cisaillement principal s'effectue à 365± 30°C d'après les compositions isotopiques en oxygène du quartz et de la muscovite. Ces minéraux atteignent l'équilibre isotopique lors de leur recristallisation dynamique contemporaine à la déformation. La zone de cisaillement enregistre une baisse de température, remplaçant le mécanisme de glissement par dislocation par celui de dissolution- précipitation dans les derniers stades de l'activité du détachement. La dynamique de circulation fluide bascule d'une circulation pervasive à chenalisée, ce qui engendre localement la rupture des équilibres d'échange isotopiques. La zone de cisaillement de Bitterroot (MT, USA) présente une zone mylonitique de 600m d'épaisseur, progressant des protomylonites aux ultramylonites. L'intensité de la localisation de la déformation se reflète directement sur l'hydratation des feldspaths, réaction métamorphique majeure dite de « rock softening ». Une étude sur roche totale indique des transferts de masse latéraux au sein des mylonites, et d'importantes pertes de volume dans les ultramylonites. La composition isotopique en hydrogène des phyllosilicates met en évidence la présence (1) d'une source magmatique/métamorphique originelle, caractérisée par les granodiorites ayant conservé leur foliation magmatique, jusqu'aux protomylonites, et (2) une source météorique qui tamponne les valeurs des phyllosilicates des fabriques mylonitiques jusqu'aux veines de quartz non-déformées. Les compositions isotopiques en oxygène des minéraux illustrent le tamponnement de la composition du fluide météorique par l'encaissant. Ce phénomène cesse lors du processus de chloritisation de la biotite, puisque les valeurs des chlorites sont extrêmement négatives (-10 per mil). La thermométrie isotopique indique une température d'équilibre isotopique de la granodiorite entre 600-500°C, entre 500-300°C dans les mylonites, et entre 300 et 200°C dans les fabriques cassantes (cataclasites et veines de quartz). Basé sur les résultats issus de ce travail, nous proposons un modèle général d'interactions fluide-roches-déformation dans les zones de détachements infiltrées par des fluides météoriques. Les zones de détachements évoluent rapidement (en quelques millions d'années) au travers de la transition fragile-ductile ; celle-ci étant partiellement contrôlée par l'effet thermique des circulations de fluide météoriques. Les systèmes de détachements sont des lieux où la déformation et les circulations fluides sont couplées ; évoluant rapidement vers une localisation de la déformation, et de ce fait, une exhumation efficace. - The presence of meteoric fluids synchronous with the activity of extensional detachment zones (Famin, 2004; Mulch et al., 2007; Gébelin et al., 2011) implies that extensional systems involve fluid convection at a crustal scale, which results in high geothermal gradients within active detachment zones (Morrison and Anderson, 1998, Gottardi et al., 2011). In addition, the metamorphic reactions related to fluid infiltration in extensional shear zones can influence the rheology of the system (White and Knipe, 1978) and ultimately how strain localizes in the crust. In this thesis, two shear zones that were permeated by meteoric fluids are studied, one quartzite-dominated, and the other of granitic composition; the relations between strain, fluid, and evolving rock composition are addressed using structural, microstructural, and chemical/isotopic measurements. The study of the Columbia River detachment that bounds the Kettle core complex (Washington, USA) demonstrates that the mylonitic fabrics in the 100 m thick quartzite- dominated detachment footwall developed within one million years. The main shearing stage occurred at 365 ± 30°C when oxygen isotopes of quartz and muscovite equilibrated owing to coeval deformation and dynamic recrystallization of these minerals. The detachment shear zone records a decrease in temperature, and dislocation creep during detachment shearing gave way to dissolution-precipitation and fracturing in the later stages of detachment activity. Fluid flow switched from pervasive to channelized, leading to isotopic disequilibrium between different minerals. The Bitterroot shear zone detachment (Montana, USA) developed a 600 m thick mylonite zone, with well-developed transitions from protomylonite to ultramylonite. The localization of deformation relates directly to the intensity of feldspar hydration, a major rock- softening metamorphic reaction. Bulk-rock analyses of the mylonitic series indicate lateral mass transfer in the mylonite (no volume change), and significant volume loss in ultramylonite. The hydrogen isotope composition of phyllosilicates shows (1) the presence of an initial magmatic/metamorphic source characterized by the granodiorite in which a magmatic, and gneissic (protomylonite) foliation developed, and (2) a meteoric source that buffers the values of phyllosilicates in mylonite, ultramylonite, cataclasite, and deformed and undeformed quartz veins. The mineral oxygen isotope compositions were buffered by the host-rock compositions until chloritization of biotite started; the chlorite oxygen isotope values are negative (-10 per mil). Isotope thermometry indicates a temperature of isotopic equilibrium of the granodiorite between 600-500°C, between 500-300°C in the mylonite, and between 300 and 200°C for brittle fabrics (cataclasite and quartz veins). Results from this work suggest a general model for fluid-rock-strain feedbacks in detachment systems that are permeated by meteoric fluids. Phyllosilicates have preserved in their hydrogen isotope values evidence for the interaction between rock and meteoric fluids during mylonite development. Fluid flow generates mass transfer along the tectonic anisotropy, and mylonites do not undergo significant volume change, except locally in ultramylonite zones. Hydration of detachment shear zones attends mechanical grain size reduction and enhances strain softening and localization. Self-exhuming detachment shear zones evolve rapidly (a few million years) through the transition from ductile to brittle, which is partly controlled by the thermal effect of circulating surface fluids. Detachment systems are zones in the crust where strain and fluid flow are coupled; these systems. evolve rapidly toward strain localization and therefore efficient exhumation.