921 resultados para Stickstoffmonoxyd (NO), endotheliale NO-Synthase (eNOS), NADPH-Oxidase, oxidativer Stress, Herzkreislauferkrankungen
Resumo:
Larthrose (OA) est une maladie dgnrative et multifactorielle caractrise par une destruction de cartilage, une formation dostophytes et une inflammation au niveau de la membrane synoviale. Le 4-hydroxynonnal (HNE), un produit final de la peroxydation lipidique, a t identifi rcemment comme un facteur catabolique et un mdiateur inflammatoire dans le cartilage arthrosique humain. Notre projet vise tudier leffet du HNE sur la rgulation de la prostaglandine E2 synthase-1 microsomale (mPGES-1) et de la protine activante 5-lipoxygnase (FLAP)/5-lipoxygnase (5-LOX) dans les chondrocytes arthrosiques humains. Lorsque les cellules sont traites une seule fois avec 10 M HNE, les rsultats de Western blot et de PCR en temps rel montrent que lexpression de la cyclooxygnase-2 (COX-2) et de la mPGES-1 augmente de manire significative et atteint respectivement le maximum aprs 8 et 16 heures dincubation puis diminue graduellement. Cependant, lorsque les cellules sont traites plusieurs fois avec 10 M HNE 2 heures dintervalle, lexpression de la COX-2 et de la mPGES-1 augmente en fonction du temps sans subir une baisse aprs 24 heures dincubation. Le HNE induit lactivit du promoteur de la mPGES-1 via lactivation du facteur de transcription Egr-1. Linvestigation de la 2me voie du mtabolisme de lacide arachidonique, savoir 5-LOX/FLAP, montre que le HNE induit lexpression de FLAP aprs 24 heures de stimulation et celle de 5-LOX seulement aprs 48 heures. Ceci semble survenir ltape de transcription au cours de laquelle HNE induit lexpression de lARNm et lactivit du promoteur du gne 5-LOX. Nous avons dmontr aussi que le niveau de leukotrine B4 (LTB4) augmente et suit le mme profil que celui de la 5-LOX. Ltude des mcanismes molculaires susceptibles dtre impliqus dans la rgulation de la 5-LOX/FLAP par le HNE montre que ce dernier stimule leur expression via laction de prostaglandine E2 (PGE2) et du facteur de croissance transformant-beta 1 (TGF-1). En conclusion, notre tude dmontre que le HNE induit court-terme dincubation la voie de COX-2/mPGES-1 puis par la suite stimule celle de FLAP/5-LOX long-terme dincubation dans les chondrocytes arthrosiques humains. Ces rsultats suggrent que la mPGES-1 et 5-LOX/FLAP sont des potentielles cibles thrapeutiques intressantes pour contrler la production de PGE2 et LTB4 dans OA.
Resumo:
Lactivit catalytique du cytochrome P450 dpend de la disponibilit dlectrons produits par la NADPH P450 rductase (NPR). Notre tude a pour but de dterminer comment lexpression de la NPR est module chez le lapin. Afin de comprendre comment lexpression de la NPR est module, des hpatocytes de lapins tmoins ont t incubs pendant 2, 4, 24 et 48 heures en prsence de plusieurs activateurs de facteurs de transcription connus du cytochrome P450. De plus, des lapins ayant reu une injection sous-cutane de trbenthine afin de produire une raction inflammatoire aseptique sont sacrifis 48 heures plus tard dans le but dtudier les effets de linflammation sur lexpression de la NPR. La rosiglitazone, le fnofibrate, lactate de plomb et le chlorure de cobalt (des inducteurs des PPAR, PPAR, AP-1 et HIF-1), aprs 48 heures dincubation, nont provoqu aucun changement dexpression ou dactivit de la NPR. Aprs 48 heures dincubation, la dexamthasone (Dexa) a augment la quantit dARNm (QT-PCR), lexpression et lactivit de la NPR (p<0,05), en plus daugmenter lARNm des rcepteurs nuclaires CAR (rcepteur constitutif landrostane) et PXR (rcepteur X prgnane) (p<0.05). Le phnobarbital (PB) a augment seulement lactivit de la NPR (p<0.05). Par contre, aprs 48 heures dincubation, la combinaison PB et Dexa a augment la quantit dARNm, ainsi que lexpression et lactivit de la NPR (p<0.05). La combinaison de PB et Dexa a induit une augmentation dARNm des rcepteurs nuclaires CAR, PXR et RXR (rcepteur X du rtinode) plus prcocement, soit aprs 2 heures dincubation (p<0.05). Le PD098059 (PD), un bloqueur de lactivation de MAPK1 (mitogen-activated protein kinase), et lacide okadaque (OA), un inhibiteur de la protine phosphatase 2A (PP2A), ont bloqu l'augmentation d'expression et d'activit de la NPR induite par le PB aprs 48 heures dincubation. La raction inflammatoire aseptique a diminu lexpression et lactivit de la NPR aprs 48 heures dincubation (p<0.05). On conclue que la dexamthasone et le phnobarbital sont des inducteurs potentiels de la NPR et que les voies de signalisation de CAR, PXR et RXR semblent tre impliques dans le contrle de cette induction. Des tudes supplmentaires devront tre compltes afin de confirmer ces rsultats prliminaires.
Resumo:
Mmoire numris par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral
Resumo:
La sclrodermie (sclrose systmique, ScS) est une maladie auto-immune du tissu conjonctif caractrise par lpaississement de la peau, lapparition spontane de lsions cicatricielles, des maladies des vaisseaux sanguins, divers degrs dinflammation, en association avec un systme immunitaire hyperactif. La pathognse exacte de cette maladie est inconnue et aucun traitement appropri nest disponible. La fibrose est un lment distinctif de la maladie de ScS et est considre rsulter dune incapacit mettre fin de faon approprie la rponse normale de rparation des plaies. Lanalyse histologique du stade initial de la ScS rvle une infiltration privasculaire de cellules mononuclaires dans le derme, associe une synthse accrue de collagne dans les fibroblastes environnants. Ainsi, la comprhension des moyens de contrler le stade inflammatoire de la ScS pourrait tre bnfique pour contrler la progression de la maladie peu aprs son apparition. La mPGES-1 est une enzyme inductible qui agit en aval de la cyclo- oxygnase (COX) pour catalyser spcifiquement la conversion de la prostaglandine (PG) H2 en PGE2. La mPGES-1 joue un rle cl dans linflammation, la douleur et larthrite;; toutefois, le rle de la mPGES-1 dans les mcanismes de fibrose, spcifiquement en rapport avec la ScS humaine, est inconnu. Mon laboratoire a prcdemment montr que les souris mPGES-1 nulle sont rsistantes la fibrose cutane induite par la blomycine, linflammation, lpaississement cutan, la production de collagne et la formation de myofibroblastes. Sur la base de ces rsultats, jai formul lhypothse que linhibition pharmacologique de la mPGES-1 rgulera la baisse la production de mdiateurs pro-inflammatoires et pro-fibreux au cours de la maladie de ScS. Afin dexplorer le rle de la mPGES-1 dans linflammation et la fibrose associes la maladie de ScS, jai dabord examin lexpression de la mPGES-1 dans la peau normale comparativement des biopsies de peau extraites de patients atteints de ScS. Mes rsultats ont montr que la mPGES-1 est nettement leve dans la peau de patients atteints de ScS en comparaison avec la peau humaine normale. De plus, les niveaux de PGE2 drivs de la mPGES-1 taient galement significativement plus levs dans les fibroblastes cutans isols de patients atteints de ScS comparativement aux fibroblastes isols de tmoins sains. Jai galement tudi leffet de linhibition pharmacologique de la mPGES-1 sur lexpression de marqueurs pro- fibreux. Mes tudes ont montr que lexpression de mdiateurs pro-fibreux cls (-SMA, endothline-1, collagne de type 1 et facteur de croissance du tissu conjonctif (FCTC)) est leve dans les fibroblastes cutans ScS en comparaison avec les fibroblastes cutans normaux. Un traitement avec un inhibiteur de la mPGES-1 a eu pour effet de rduire significativement lexpression de l-SMA, de lendothline-1, du collagne de type 1 mais pas du FCTC dans les fibroblastes ScS, sans effet significatif sur les fibroblastes normaux. Jai en outre examin leffet de linhibition de la mPGES-1 sur des cytokines pro-inflammatoires cls impliques dans la pathologie de la ScS, incluant IL-6, IL-8 et MCP-1. Linhibition pharmacologique de la mPGES- 1 a eu pour effet de rduire significativement les niveaux de production de cytokines pro- inflammatoires IL6, IL8 et MCP-1 dans les fibroblastes avec lsion ScS comparativement des fibroblastes non traits. De plus, les patients atteints de ScS ont prsent des niveaux plus levs de p-AKT, de p-FAK et de p-SMAD3 en comparaison avec les fibroblastes cutans normaux. Linhibiteur de la mPGES-1 a pu rguler la baisse cette expression accrue de p-AKT et de p- FAK, mais pas de p-SMAD3, dans les fibroblastes ScS. Ces rsultats ont suggr que linhibition de la mPGES-1 pourrait tre une mthode viable pour rduire le dveloppement de sclrose cutane et constituent une cible thrapeutique potentielle pour contrler les mcanismes fibreux et inflammatoires associs la pathophysiologie de la maladie de ScS. Lun des autres processus critiques relis lvolution de la rponse fibreuse associe la maladie de ScS est la diffrenciation des fibroblastes en des cellules actives spcialises iii iv appeles myofibroblastes, responsables de dclencher une signalisation adhsive excessive et le dpt excessif de matrice extracellulaire, conduisant la destruction de larchitecture de lorgane. Ainsi, lidentification des facteurs endognes qui initient/ favorisent la diffrenciation fibroblaste-myofibroblaste peut mener des stratgies thrapeutiques prometteuses pour contrler lexcs de signalisation adhsive et de fibrose associ la maladie de ScS. Des tudes antrieures dans le domaine de la biologie du cancer ont suggr que lphrine B2, une protine transmembranaire appartenant la famille des phrines, est implique dans la signalisation adhsive et le remodelage extracellulaire. Cependant, son rle dans la fibrose na jamais t explor. Dans la deuxime partie de mon tude, jai donc tudi le rle de lphrine B2 dans la fibrose. Mes tudes montrent que lexpression de lphrine B2 est significativement augmente dans la peau humaine ScS comparativement la peau normale. Plus important encore, le traitement in vitro de fibroblastes de la peau humaine normale avec de lphrine B2 recombinante est capable de transformer des fibroblastes en cellules myofibroblastiques manifestant toutes les caractristiques myofibroblastiques typiques, incluant la formation accrue de fibres de tension, des adhrences focales, lactivation accrue de la FAK, un accroissement de lexpression et de la migration de fibroblastes et de leur adhrence la fibronectine la fois chez les fibroblastes cutans normaux et ScS. En outre, jai trait des souris avec de lphrine B2 recombinante et montr que ces souris ont dvelopp une fibrose cutane significative associe une paisseur dermique et une synthse de collagne augmentes, une teneur en hydroxyproline (teneur en collagne) accrue et un nombre accru de myofibroblastes exprimant de l-SMA, une activation augmente de la FAK et de marqueurs pro-fibreux incluant le collagne de type 1 et le FCTC. Dans lensemble, mes tudes ont identifi deux mdiateurs endognes cruciaux impliqus dans la propagation de linflammation et de la fibrose associes la maladie de ScS. Linhibition de la mPGES-1 pourrait reprsenter une bonne stratgie alternative pour contrer linflammation et la fibrose au moins durant les stades prcoces de la maladie de ScS. De plus, une signalisation excessive de lphrine B2 favorise la signalisation adhsive et fibreuse en dclenchant la diffrenciation de fibroblastes en myofibroblastes par lactivation de la voie de signalisation de la FAK. Ainsi, linhibition dphrine B2 bloquera la formation de fibroblastes-myofibroblastes et rgulera la baisse la fibrose associe la maladie de ScS. En somme, la mPGES-1 et lphrine B2 semblent toutes deux des cibles attrayantes pour le traitement de la ScS et des troubles fibreux qui y sont relis.
Resumo:
UNE EXPOSITION NONATALE LOXYGNE MNE DES MODIFICATIONS DE LA FONCTION MITOCHONDRIALE CHEZ LE RAT ADULTE Introduction: Lexposition loxygne (O2) des ratons nouveau-ns a des consquences lge adulte dont une hypertension artrielle (HTA), une dysfonction vasculaire, une nphropnie et des indices de stress oxydant. En considrant que les reins sont encore en dveloppement actif lors des premiers jours aprs la naissance chez les rats, jouent un rle cl dans le dveloppement de lhypertension et quune dysfonction mitochondriale est associ une augmentation du stress oxydant, nous postulons que les conditions dltres nonatales peuvent avoir un impact significatif au niveau rnal sur la modulation de lexpression de protines cls du fonctionnement mitochondrial et une production mitochondriale excessive despces ractives de l O2. Mthodes: Des ratons Sprague-Dawley sont exposs 80% dO2 (H) ou 21% O2 (Ctrl) du 3e au 10e jr de vie. En considrant que plusieurs organes des rats sont encore en dveloppement actif la naissance, ces rongeurs sont un modle reconnu pour tudier les complications dune hyperoxie nonatale, comme celles lies une naissance prmature chez lhomme. 4 et 16 semaines, les reins sont prlevs et les mitochondries sont extraites suivant une mthode dextraction standard, avec un tampon contenant du sucrose 0.32 M et diffrentes centrifugations. Lexpression des protines mitochondriales a t mesure par Western blot, tandis que la production d H202 et les activits des enzymes cls du cycle de Krebs ont t values par spectrophotomtrie. Les rsultats sont exprims par la moyenne SD. Rsultats: Les rats mles H de 16 semaines (n=6) prsentent une activit de citrate synthase (considr standard interne de lexpression protique et de labondance mitochondriales) augmente (12.4 8.4 vs 4.1 0.5 mole/mL/min), une diminution de lactivit daconitase (enzyme sensible au redox mitochondrial) (0.11 0.05 vs 0.20 0.04 moles/min/mg mitochondrie), ainsi quune augmentation dans la production de H202 (7.0 1.3 vs 5.4 0.8 moles/mg protines mitochondriales) comparativement au groupe Ctrl (n=6 mles et 4 femelles). Le groupe H (vs Ctrl) prsente galement une diminution dans lexpression de peroxiredoxin-3 (Prx3) (H 0.610.06 vs. Ctrl 0.780.02 unit relative, -23%; p<0.05), une protine implique dans llimination d H202, de lexpression du cytochrome C oxidase (Complexe IV) (H 1.020.04 vs. Ctrl 1.200.02 unit relative, -15%; p<0.05), une protine de la chaine de respiration mitochondriale, tandis que lexpression de la protine de dcouplage (uncoupling protein)-2 (UCP2), implique dans la dispersion du gradient proton, est significativement augmente (H 1.050.02 vs. Ctrl 0.900.03 unit relative, +17%; p<0.05). Les femelles H (n=6) (vs Ctrl, n=6) de 16 semaines dmontrent une augmentation significative de lactivit de laconitase (0.330.03 vs 0.170.02 moles/min/mg mitochondrie), de lexpression de lATP synthase sous unit (H 0.730.02 vs. Ctrl 0.590.02 unit relative, +25%; p<0.05) et de lexpression de MnSOD (H 0.890.02 vs. Ctrl 0.740.03 unit relative, +20%; p<0.05) (superoxide dismutase mitochondriale, important antioxidant), tandis que lexpression de Prx3 est significativement rduite (H 1.10.07 vs. Ctrl 0.850.01 unit relative, -24%; p<0.05). 4 semaines, les mles H (vs Ctrl) prsentent une augmentation significative de lexpression de Prx3 (H 0.720.03 vs. Ctrl 0.560.04 unit relative, +31%; p<0.05) et les femelles prsentent une augmentation significative de lexpression dUCP2 (H 1.220.05 vs. Ctrl 1.030.04 unit relative, +18%; p<0.05) et de lexpression de MnSOD (H 1.360.01 vs. 1.190.06 unit relative, +14%; p<0.05). Conclusions: Une exposition nonatale lO2 chez le rat adulte mne des indices de dysfonction mitochondriale dans les reins adultes, associe une augmentation dans la production despces ractives de loxygne, suggrant que ces modifications mitochondriales pourraient jouer un rle dans lhypertension artrielle et dun stress oxydant, et par consquent, tre un facteur possible dans la progression vers des maladies cardiovasculaires. Mots-cls: Mitochondries, Reins, Hypertension, Oxygne, Stress Oxydant, Programmation
Resumo:
Il est dsormais accept qu'un environnement foetal dfavorable prdispose des maladies chroniques qui surviennent l'ge adulte. Il a t dmontr dans notre laboratoire qu'une diminution de perfusion placentaire induit une redistribution du dbit sanguin vers le coeur chez le foetus ainsi quune restriction de croissance intrautrine. De plus, un remodelage et une diminution de la contractilit des cardiomyocytes ont t observs chez les femelles devenues adultes. En priode prinatale, lutilisation des acides gras comme substrat nergtique devient plus importante que celle du glucose au niveau des cardiomyocytes. Considrant qu'un mcanisme s'est mis en place in utero, nous mettons lhypothse que le transfert de la voie de lutilisation du glucose vers lutilisation des acides gras se fait plus tt chez les foetus en restriction de croissance. Lobjectif de cette tude est de mesurer, dans les coeurs foetaux, les constituants du mtabolisme des acides gras, soit le transporteur principal des acides gras, la carnitine palmitoyltransfrase1alpha, ainsi que ses protines associes soit lacylCoenzymeA synthtase1 et le canal anionique voltagedpendant de type 1. Nous mesurerons lactivit du cytochrome c oxydase et le nombre de mitochondries. Linfluence du sexe et la condition foetale (restriction de croissance intrautrine vs contrle) seront compars. Nous avons observ que lexpression protique de la carnitine palmitoytransfrase1 et de lacylCoenzymeA synthtase1 est significativement augmente, mais pas celle du canal anionique voltagedpendant de type 1, dans les coeurs de foetus en restriction de croissance intrautrine femelles. Le nombre et lactivit des mitochondries est semblable dans tous les groupes. Ces rsultats suggrent que la condition foetale et le sexe altrent la quantit du transporteur des acides gras, la carnitine palmitoytransfrase1, au niveau traductionnel sans toutefois affecter lactivit du cytochrome c oxydase et le nombre de mitochondries. long terme, nos tudes permettront de mieux comprendre les consquences et causes de la RCIU afin den permettre la prvention.
Resumo:
L'arthrose est une maladie multifactorielle complexe. Parmi les facteurs impliqus dans sa pathognie, les certains prostaglandines exercent un rle inflammatoire et dautres un rle protecteur. La prostaglandine D2 (PGD2) est bien connue comme une PG anti-inflammatoire, qui est rgule par lenzyme Lipocalin prostaglandine D-synthase. Avec linflammation de l'arthrose, les chondrocytes essaient de protger le cartilage en activant certaines voies de rcupration dont l'induction du gne L-PGDS. Dans cette tude, nous tudions la voie de signalisation implique dans la rgulation de l'expression du (L-PGDS) sur les chondrocytes traits avec diffrents mdiateurs inflammatoires. Le but de projet: Nous souhaitons tudier la rgulation de la L-PGDS dans le but de concevoir des approches thrapeutiques qui peuvent activer la voie intrinsque anti-inflammatoire. Mthode et conclusions: In vivo, l'arthrose a t suivie en fonction de lge chez la souris ou chirurgicalement suivant une intervention au niveau des genoux de souris. Nous avons confirm les niveaux dexpression de L-PGDS histologiquement et par immunohistochimie. In vitro, dans les chondrocytes humains qui ont t traits avec diffrents mdiateurs de l'inflammation, nous avons observ une augmentation de lexpression de la L-PGDS dose et temps dpendante. Nous avons montr, in vivo et in vitro que linflammation induit une scrtion chondrocytaire de la L-PGDS dans le milieu extracellulaire. Enfin, nous avons observ la production de diffrentes isoformes de la L-PGDS en rponse l'inflammation.
Resumo:
La voie de signalisation des phosphoinositides joue un rle cl dans la rgulation du tonus vasculaire. Plusieurs tudes rapportent une production endogne de langiotensin II (Ang II) et de lendothline-1 (ET-1) par les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) de rats spontanment hypertendus (spontaneously hypertensive rats : SHR). De plus, lAng II exogne induit son effet prohypertrophique sur les CMLVs selon un mcanisme dpendant de la protine Gq et de la PKC. Cependant, le rle de laxe Gq/PLC/PKC dans lhypertrophie des CMLVs provenant dun modle animal de lhypertension artrielle nest pas encore tudi. Lobjectif principal de cette thse est dexaminer le rle de laxe Gq/PLC1 dans les mcanismes molculaires de lhypertrophie des CMLVs provenant dun modle animal dhypertension artrielle essentielle (spontaneously hypertensive rats : SHR). Nos premiers rsultats indiquent que contrairement aux CMLVs de SHR gs de 12 semaines (absence dhypertrophie cardiaque), les CMLVs de SHR gs de 16 semaines (prsence dhypertrophie cardiaque) prsentent une surexpression protique endogne de Gq et de PLC1 par rapport aux CMLVs de rats WKY apparis pour lge. Linhibition du taux dexpression protique de Gq et de PLC1 par des siRNAs spcifiques diminue significativement le taux de synthse protique lev dans les CMLVs de SHR. De plus, la surexpression endogne des Gq et PLC1, lhyperphosphorylation de la molcule ERK1/2 et le taux de synthse protique lev dans les CMLVs de SHR de 16 semaines ont t attnus significativement par des antagonistes des rcepteurs AT1 (losartan) et ETA (BQ123), mais pas par lantagoniste du rcepteur ETB (BQ788). Linhibition pharmacologique des MAPKs par PD98059 diminue significativement la surexpression endogne de Gq/PLC1 et le taux de synthse protique lev dans les CMLVs de SHR. Dun ct, linhibition du stress oxydatif (par DPI, inhibiteur de la NAD(P)H oxidase, et NAC , molcule anti-oxydante), de la molcule c-Src (PP2) et des rcepteurs de facteurs de croissance (AG1024 (inhibiteur de lIGF1-R), AG1478 (inhibiteur de lEGFR) et AG1295 (inhibiteur du PDGFR)) a permis dattnuer significativement la surexpression endogne leve de Gq/PLC1 et lhypertrophie des CMLVs de SHR. Dun autre ct, DPI, NAC et PP2 attnuent significativement lhyperphosphorylation de la molcule c-Src, des RTKs (rcepteurs activit tyrosine kinase) et de la molcule ERK1/2. Dans une autre tude, nous avons aussi dmontr que la PKC montre une hyperphosphorylation en Tyr311 dans les CMLVs de SHR compares aux CMLVs de WKY. La rottlerin, utilise comme inhibiteur spcifique de la PKC, inhibe significativement cette hyperphosphorylation en Tyr311 dpendamment de la concentration. Linhibition de lactivit de la PKC par la rottlerin a t aussi associe une attnuation significative de la surexpression protique endogne de Gq/PLC1 et lhypertrophie des CMLVs de SHR. De plus, linhibition pharmacologique de lactivit de la PKC, en amont du stress oxydatif, a permis dinhiber significativement lactivit de la NADPH, le taux de production leve de lion superoxyde ainsi que lhyperphosphorylation de la molcule ERK1/2, de la molcule c-Src et des RTKs. notre surprise, nous avons aussi remarqu une surexpression protique de lEGFR et de lIGF-1R dans les CMLVs de SHR lge de 16 semaines. Linhibition pharmacologique de lactivit de la PKC, de la molcule c-Src et du stress oxydatif a permis dinhiber significativement la surexpression protique endogne de ces RTKs. De plus, linhibition de lexpression protique de lEGFR et de la molcule c-Src par des siRNA spcifiques attnue significativement le taux dexpression protique lev de Gq et de PLC1 ainsi que le taux de synthse protique lev dans les CMLVs de SHR. Des siRNAs spcifiques la PKC ont permis dattnuer significativement le taux de synthse protique lev dans les CMLVs de SHR et confirment le rle important de la PKC dans les mcanismes molculaires de lhypertrophie des CMLVs selon une voie dpendante du stress oxydatif. En conclusion, ces rsultats suggrent un rle important de lactivation endogne de laxe Gq-PLC-PKC dans le processus dhypertrophie vasculaire selon un mcanisme impliquant une activation endogne des rcepteurs AT1/ETa, de la molcule c-Src, du stress oxidatif, des RTKs et des MAPKs.
Resumo:
Soil microorganisms have evolved two possible mechanisms for their uptake of organic N: the direct route and the mobilization-immobilization-turnover (MIT) route. In the direct route, simple organic molecules are taken up via various mechanisms directly into the cell. In the MIT route, the deamination occurs outside the cell and all N is mineralized to NH4+ before assimilation. A better understanding of the mechanisms controlling the different uptake routes of soil microorganisms under different environmental conditions is crucial for understanding mineralization processes of organic material in soil. For the first experiment we incubated soil samples from the long term trial in Bad Lauchstdt with corn residues with different C to N ratios and inorganic N for 21 days at 20 C. Under the assumption that all added amino acids were taken up or mineralized, the direct uptake route was more important in soil amended with corn residues with a wide C to N ratio. After 21 days of incubation the direct uptake of added amino acids increased in the order addition of corn residue with a: C to N ratio of 40 & (NH4)2SO4 and no addition (control) (69% and 68%, respectively) < C to N ratio of 20 (73%) < C to N ratio of 40 (95%). In all treatments the proportion of the added amino acids that were mineralized increased with time, indicating that the MIT route became more important over time. To investigate the effects of soil depth on the N uptake route of soil microorganisms (experiment II), soil samples in two soil depths (0-5 cm; 30-40 cm) were incubated with corn residues with different C to N ratios and inorganic N for 21 days at 20 C and 60% (WHC). The addition of corn residue resulted in a marked increase of protease activity in both depths due to the induction from the added substrate. Addition of corn residue with a wide C to N ratio resulted in a significantly greater part of the direct uptake (97% and 94%) than without the addition of residues (85% and 80%) or addition of residue with a small C to N ratio (90% and 84%) or inorganic N (91% and 79% in the surface soil and subsoil, respectively), suggesting that under conditions of sufficient mineralizable N (C to N ratio of 20) or increased concentrations of NH4+, the enzyme system involved in the direct uptake is slightly repressed. Substrate additions resulted in an initially significantly higher increase of the direct uptake in the surface soil than in the subsoil. As a large proportion of the organic N input into soil is in form of proteinaceous material, the deamination of amino acids is a key reaction of the MIT route. Therefore the enzyme amino acid oxidase contribute to the extracellular N mineralization in soil. The objective of experiment III was to adapt a method to determine amino acid oxidase in soil. The detection via synthetic fluorescent Lucifer Yellow derivatives of the amino acid lysine is possible in soil. However, it was not possible to find the substrate concentration at which the reaction rate is independent of substrate concentration and therefore we were not able to develop a valid soil enzyme assay.
Resumo:
This paper studies the role of nitric oxide (NOS 1, NOS 2, and NOS 3 genes) in the mouse cochlea and in noise-induced hearing loss (NIHL). Mice genetically deficient of the NOS 2 and NOS 3 genes were protected from NIHL, indicating that one or both of these genes may be responsible for producing nitric oxide that damages the inner ear when exposed to harmful levels of noise.
Resumo:
Terpene synthases are responsible for the biosynthesis of the complex chemical defense arsenal of plants and microorganisms. How do these enzymes, which all appear to share a common terpene synthase fold, specify the many different products made almost entirely from one of only three substrates? Elucidation of the structure of 1,8-cineole synthase from Salvia fruticosa (Sf-CinS1) combined with analysis of functional and phylogenetic relationships of enzymes within Salvia species identified active-site residues responsible for product specificity. Thus, Sf-CinS1 was successfully converted to a sabinene synthase with a minimum number of rationally predicted substitutions, while identification of the Asn side chain essential for water activation introduced 1,8-cineole and alpha-terpineol activity to Salvia pomifera sabinene synthase. A major contribution to product specificity in Sf-CinS1 appears to come from a local deformation within one of the helices forming the active site. This deformation is observed in all other mono- or sesquiterpene structures available, pointing to a conserved mechanism. Moreover, a single amino acid substitution enlarged the active-site cavity enough to accommodate the larger farnesyl pyrophosphate substrate and led to the efficient synthesis of sesquiterpenes, while alternate single substitutions of this critical amino acid yielded five additional terpene synthases.
Resumo:
Germin is a hydrogen peroxide generating oxalate oxidase with extreme thermal stability; it is involved in the defense against biotic and abiotic stress in plants. The structure, determined at 1.6 A resolution, comprises beta-jellyroll monomers locked into a homohexamer (a trimer of dimers), with extensive surface burial accounting for its remarkable stability. The germin dimer is structurally equivalent to the monomer of the 7S seed storage proteins (vicilins), indicating evolution from a common ancestral protein. A single manganese ion is bound per germin monomer by ligands similar to those of manganese superoxide dismutase (MnSOD). Germin is also shown to have SOD activity and we propose that the defense against extracellular superoxide radicals is an important additional role for germin and related proteins.
Resumo:
This review summarizes the recent discovery of the cupin superfamily (from the Latin term "cupa," a small barrel) of functionally diverse proteins that initially were limited to several higher plant proteins such as seed storage proteins, germin (an oxalate oxidase), germin-like proteins, and auxin-binding protein. Knowledge of the three-dimensional structure of two vicilins, seed proteins with a characteristic beta-barrel core, led to the identification of a small number of conserved residues and thence to the discovery of several microbial proteins which share these key amino acids. In particular, there is a highly conserved pattern of two histidine-containing motifs with a varied intermotif spacing. This cupin signature is found as a central component of many microbial proteins including certain types of phosphomannose isomerase, polyketide synthase, epimerase, and dioxygenase. In addition, the signature has been identified within the N-terminal effector domain in a subgroup of bacterial AraC transcription factors. As well as these single-domain cupins, this survey has identified other classes of two-domain bicupins including bacterial gentisate 1, 2-dioxygenases and 1-hydroxy-2-naphthoate dioxygenases, fungal oxalate decarboxylases, and legume sucrose-binding proteins. Cupin evolution is discussed from the perspective of the structure-function relationships, using data from the genomes of several prokaryotes, especially Bacillus subtilis. Many of these functions involve aspects of sugar metabolism and cell wall synthesis and are concerned with responses to abiotic stress such as heat, desiccation, or starvation. Particular emphasis is also given to the oxalate-degrading enzymes from microbes, their biological significance, and their value in a range of medical and other applications.
Resumo:
The oxalate oxidase enzyme expressed in barley roots is a thermostable, protease-resistant enzyme that generates H2O2. It has great medical importance because of its use to assay plasma and urinary oxalate, and it has also been used to generate transgenic, pathogen-resistant crops. This protein has now been purified and three types of crystals grown. X-ray analysis shows that the symmetry present in these crystals is consistent with a hexameric arrangement of subunits, probably a trimer of dimers. This structure may be similar to that found in the related seed storage proteins.
Resumo:
It is known that germin, which is a marker of the onset of growth in germinating wheat, is an oxalate oxidase, and also that germins possess sequence similarity with legumin and vicilin seed storage proteins. These two pieces of information have been combined in order to generate a 3D model of germin based on the structure of vicilin and to examine the model with regard to a potential oxalate oxidase active site. A cluster of three histidine residues has been located within the conserved beta-barrel structure. While there is a relatively low level of overall sequence similarity between the model and the vicilin structures, the conservation of amino acids important in maintaining the scaffold of the beta-barrel lends confidence to the juxtaposition of the histidine residues. The cluster is similar structurally to those found in copper amine oxidase and other proteins, leading to the suggestion that it defines a metal-binding location within the oxalate oxidase active site. It is also proposed that the structural elements involved in intermolecular interactions in vicilins may play a role in oligomer formation in germin/oxalate oxidase.
