Rôle des protéoglycanes à héparane sulfate dans le transfert de gène des cellules CHO et HEK293

La possibilité de programmer une cellule dans le but de produire une protéine d’intérêt est apparue au début des années 1970 avec l’essor du génie génétique. Environ dix années plus tard, l’insuline issue de la plateforme de production microbienne Escherichia coli, fut la première protéine recombinante (r-protéine) humaine commercialisée. Les défis associés à la production de r-protéines plus complexes et glycosylées ont amené l’industrie biopharmaceutique à développer des systèmes d’expression en cellules de mammifères. Ces derniers permettent d’obtenir des protéines humaines correctement repliées et de ce fait, biologiquement actives. Afin de transférer le gène d’intérêt dans les cellules de mammifères, le polyéthylènimine (PEI) est certainement un des vecteurs synthétiques le plus utilisé en raison de son efficacité, mais aussi sa simplicité d’élaboration, son faible coût et sa stabilité en solution qui facilite son utilisation. Il est donc largement employé dans le contexte de la production de r-protéines à grande échelle et fait l’objet d’intenses recherches dans le domaine de la thérapie génique non virale. Le PEI est capable de condenser efficacement l’ADN plasmidique (vecteur d’expression contenant le gène d’intérêt) pour former des complexes de petites tailles appelés polyplexes. Ces derniers doivent contourner plusieurs étapes limitantes afin de délivrer le gène d’intérêt au noyau de la cellule hôte. Dans les conditions optimales du transfert de gène par le PEI, les polyplexes arborent une charge positive nette interagissant de manière électrostatique avec les protéoglycanes à héparane sulfate (HSPG) qui décorent la surface cellulaire. On observe deux familles d’HSPG exprimés en abondance à la surface des cellules de mammifères : les syndécanes (4 membres, SDC1-4) et les glypicanes (6 membres, GPC1-6). Si l’implication des HSPG dans l’attachement cellulaire des polyplexes est aujourd’hui largement acceptée, leur rôle individuel vis-à-vis de cet attachement et des étapes subséquentes du transfert de gène reste à confirmer. Après avoir optimisées les conditions de transfection des cellules de mammifères CHO et HEK293 dans le but de produire des r-protéines secrétées, nous avons entrepris des cinétiques de capture, d’internalisation des polyplexes et aussi d’expression du transgène afin de mieux comprendre le processus de transfert de gène. Nous avons pu observer des différences au niveau de ces paramètres de transfection dépendamment du système d’expression et des caractéristiques structurelles du PEI utilisé. Ces résultats présentés sous forme d’articles scientifiques constituent une base solide de l’enchaînement dans le temps des évènements essentiels à une transfection efficace des cellules CHO et HEK293 par le PEI. Chaque type cellulaire possède un profil d’expression des HSPG qui lui est propre, ces derniers étant plus ou moins permissifs au transfert de gène. En effet, une étude menée dans notre laboratoire montre que les SDC1 et SDC2 ont des rôles opposés vis-à-vis du transfert de gène. Alors que tous deux sont capables de lier les polyplexes, l’expression de SDC1 permet leur internalisation contrairement à l’expression de SDC2 qui l’inhibe. De plus, lorsque le SDC1 est exprimé à la surface des cellules HEK293, l’efficacité de transfection est augmentée de douze pourcents. En utilisant la capacité de SDC1 à induire l’internalisation des polyplexes, nous avons étudié le trafic intracellulaire des complexes SDC1 / polyplexes dans les cellules HEK293. De plus, nos observations suggèrent une nouvelle voie par laquelle les polyplexes pourraient atteindre efficacement le noyau cellulaire. Dans le contexte du transfert de gène, les HSPG sont essentiellement étudiés dans leur globalité. S’il est vrai que le rôle des syndécanes dans ce contexte est le sujet de quelques études, celui des glypicanes est inexploré. Grâce à une série de traitements chimiques et enzymatiques visant une approche « perte de fonction », l’importance de la sulfatation comme modification post-traductionnelle, l’effet des chaînes d’héparanes sulfates mais aussi des glypicanes sur l’attachement, l’internalisation des polyplexes, et l’expression du transgène ont été étudiés dans les cellules CHO et HEK293. L’ensemble de nos observations indique clairement que le rôle des HSPG dans le transfert de gène devrait être investigué individuellement plutôt que collectivement. En effet, le rôle spécifique de chaque membre des HSPG sur la capture des polyplexes et leur permissivité à l’expression génique demeure encore inconnu. En exprimant de manière transitoire chaque membre des syndécanes et glypicanes à la surface des cellules CHO, nous avons déterminé leur effet inhibiteur ou activateur sur la capture des polyplexes sans pouvoir conclure quant à l’effet de cette surexpression sur l’efficacité de transfection. Par contre, lorsqu’ils sont présents dans le milieu de culture, le domaine extracellulaire des HSPG réduit l’efficacité de transfection des cellules CHO sans induire la dissociation des polyplexes. Curieusement, lorsque chaque HSPG est exprimé de manière stable dans les cellules CHO, seulement une légère modulation de l’expression du transgène a pu être observée. Ces travaux ont contribué à la compréhension des mécanismes d'action du vecteur polycationique polyéthylènimine et à préciser le rôle des protéoglycanes à héparane sulfate dans le transfert de gène des cellules CHO et HEK293.

Bcl-xL (S49) and (S62) sequential phosphorylation/dephosphorylation during mitosis prevents chromosome instability and aneuploidy

Une caractéristique intéressante de la protéine Bcl-xL est la présence d'un domaine en boucle non-structurée entre les hélices α1 and α2 de la protéine. Ce domaine protéique n'est pas essentiel pour sa fonction anti-apoptotique et absent chez CED-9, la protéine orthologue chez Caenorhabditis elegans. A l'intérieur de ce domaine, Bcl-xL subit une phosphorylation et déphosphorylation dynamique sur les résidus Ser49 et Ser62 en phase G2 du cycle cellulaire et lors de la mitose. Lorsque ces résidus sont mutés et les protéines exprimées dans des cellules cancéreuses, les cellules démontrent plusieurs défauts mitotiques liés à l'instabilité chromosomique. Pour analyser les effets de Bcl-xL Ser49 et Ser62 dans les cellules normales, les présentes études ont été réalisées dans des cellules diploïdes humaines normales, et in vivo chez Caenorhabditis elegans. Dans une première étude, nous avons utilisé la lignée cellulaire de cellules fibroblastiques diploïdes humaines normales BJ, exprimant Bcl-xL (type sauvage), (S49A), (S49D), (S62A), (S62D) et les double (S49/62A) et (S49/62D) mutants. Les cellules exprimant les mutants de phosphorylation ont montré des cinétiques de doublement de la population cellulaire réduites. Ces effets sur la cinétique de doublement de la population cellulaire corrèle avec l'apparition de la sénescence cellulaire, sans impact sur les taux de mort cellulaire. Ces cellules sénescentes affichent des phénotypes typiques de sénescence associés notamment à haut niveau de l'activité β-galactosidase associée à la sénescence, la sécrétion d' interleukine-6, l'activation de p53 et de p21WAF1/ Cip1, un inhibiteur des complexes kinase cycline-dépendant, ainsi que la formation de foyers de chromatine nucléaire associés à γH2A.X. Les analyses de fluorescence par hybridation in situ et des caryotypes par coloration au Giemsa ont révélé que l'expression des mutants de phosphorylation de Bcl-xL provoquent de l'instabilité chromosomique et l'aneuploïdie. Ces résultats suggèrent que les cycles de phosphorylation et déphosphorylation dynamiques de Bcl-xL Ser49 et Ser62 sont importants dans le maintien de l'intégrité des chromosomes lors de la mitose dans les cellules normales. Dans une deuxième étude, nous avons entrepris des expériences chez Caenorhabditis elegans pour comprendre l'importance des résidus Ser49 et Ser62 de Bcl-xL in vivo. Les vers transgéniques portant les mutations de Bcl-xL (S49A, S62A, S49D, S62D et S49/62A) ont été générés et leurs effets ont été analysés sur les cellules germinales des jeunes vers adultes. Les vers portant les mutations de Bcl-xL ont montré une diminution de ponte et d'éclosion des oeufs, des variations de la longueur de leurs régions mitotiques et des zones de transition, des anomalies chromosomiques à leur stade de diplotène, et une augmentation de l'apoptose des cellules germinales. Certaines de ces souches transgéniques, en particulier les variants Ser/Ala, ont également montré des variations de durée de vie par rapport aux vers témoins. Ces observations in vivo ont confirmé l'importance de Ser49 et Ser62 à l'intérieur du domaine à boucle de Bcl-xL pour le maintien de la stabilité chromosomique. Ces études auront une incidence sur les futures stratégies visant à développer et à identifier des composés qui pourraient cibler non seulement le domaine anti-apoptotique de la protéine Bcl-xL, mais aussi son domaine mitotique pour la thérapie du cancer.

Rôles de deux corécepteurs impliqués dans le maintien des cellules T mémoires CD8+ et la maturation des cellules dendritiques

La reconnaissance d’un antigène présenté par les cellules présentatrices d’antigène induit la prolifération et la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes T effecteurs et mémoires. Cette reconnaissance se fait par l’interaction du récepteur des cellules T (TCR) des lymphocytes T et le complexe CMH-peptide présent à la surface des DC. Cependant, des signaux additionnels sont requis, une meilleure activation des lymphocytes T implique des corécepteurs présents à la surface de ces deux types cellulaires. Après l’élimination de l’antigène, la plupart des lymphocytes T effecteurs vont mourir. Une petite population de lymphocytes T va persister pour se différencier en lymphocytes T mémoires capables de protéger l’organisme contre une réinfection. Les signaux qui contrôlent le maintien des lymphocytes T mémoires sont encore mal compris. Pour comprendre le rôle de la molécule de costimulation 4-1BB dans le maintien des lymphocytes T CD8 mémoires, nous avons émis l’hypothèse que l’état de phosphorylation de la protéine adaptatrice TRAF1, qui se lie à 4-1BB, module le maintien des lymphocytes T CD8 mémoires. Ainsi, nous avons montré par des expériences de spectrométrie de masse que TRAF1 s’associe préférentiellement à TBK1 lorsqu’elle n’est pas phosphorylée. Nous avons aussi montré que la présence de TRAF1 est requise pour stabiliser TBK1 au récepteur 4-1BB après stimulation des lymphocytes T. Par ailleurs, les lymphocytes T CD8 OT-I TRAF1-/- reconstituées avec un mutant phospho-déficient de TRAF1 (S139A) et ensuite différenciées en lymphocytes T mémoires in vitro induisent une activation de la voie de signalisation NF-ĸB contrairement à ceux exprimant la forme phospho-mimétique de TRAF1 (S139D). Ces premières études démontrent l’importance de l’état de phosphorylation de TRAF1 en aval de 4-1BB dans les cellules T. Dans la seconde partie, nous avons évalué le rôle d’un autre corécepteur; la neuropiline 1, dans la maturation des DC. A cet effet, nous avons émis l’hypothèse que l’interaction de la neuropiline 1 et ses ligands contribuerait à la fonction des DC. Nous avons démontré que l’absence de la neuropiline 1 n’a pas d’effet sur la maturation au LPS des DC. Cependant, la présence du VEGF (un ligand de Nrp-1) inhibe la maturation des DC dérivées de la moelle osseuse. Notre étude a démontré que VEGF inhibe l’expression des molécules de costimulation, la sécrétion des cytokines pro inflammatoires et la signalisation TLR4 principalement les voies MAP Kinase et NF-ĸB. Contrairement aux résultats avec les cellules WT, VEGF n’est pas capable d’affecter la maturation, la sécrétion des cytokines et la signalisation TLR4 des DC Nrp1-Lyz où la neuropiline 1 est délétée. Ainsi, nos résultats ont démontré que VEGF inhibe la maturation des DC de façon Nrp1-dépendante. Enfin, l’analyse des molécules partenaires de la neuropiline 1 montre que Nrp1, VEGF et TLR4 se retrouvent dans le même complexe. Nos résultats démontrent que VEGF, en présence de la neuropiline 1 est capable d’interagir avec TLR4 pour inhiber la maturation des DC. Toutefois, en absence de la neuropiline1, VEGF n’est pas capable de recruter TLR4 pour réduire l’expression des molécules de costimulation. Ces études sur les corécepteurs pourraient être importantes dans l’élaboration de nouvelles approches vaccinales.

Régulation épigénétique de la défense antioxydante et de l'Angiopoietin-like 2 dans le contexte du vieillissement et des maladies cardiovasculaires

Suite à l’exposition à des facteurs de risque incluant la malnutrition, la dyslipidémie, la sédentarité et les désordres métaboliques, les maladies cardiovasculaires (MCV) sont caractérisées par un état pro-oxydant et pro-inflammatoire, et une dérégulation de l’expression de divers facteurs responsables de l’homéostasie de l’environnement rédox et inflammatoire. L’implication d’enzymes antioxydantes telles que les superoxyde dismutases (SOD) et les glutathion peroxydases (Gpx), ainsi que la contribution de médiateurs pro-inflammatoires tels que l’angiopoietin-like 2 (Angptl2) ont été rapportées dans le cadre des MCV. Toutefois, les mécanismes moléculaires sensibles aux facteurs de risque et menant au développement des MCV sont peu connus. L’épigénétique est un mécanisme de régulation de l’expression génique sensible aux stimuli extracellulaires et pourrait donc contribuer au développement des MCV. La méthylation de l’ADN est un des mécanismes épigénétiques pouvant varier tant de manière gène-spécifique qu’à l’échelle génomique, et la conséquence de tels changements sur l’expression des gènes ciblés dépend du site de méthylation. Puisqu’il a été démontré que des variations au niveau de la méthylation de l’ADN peuvent être associées à divers contextes pathologiques incluant les MCV, le but de nos travaux était d’étudier le lien entre la méthylation de gènes antioxydants et pro-inflammatoires avec leurs répercussions fonctionnelles biologiques en présence de facteurs de risques associés aux MCV, tels que le vieillissement, la dyslipidémie et la sédentarité. Dans la première étude, nous avons observé que dans l’artère fémorale de souris vieillissantes, la méthylation au niveau du promoteur du gène Sod2, codant pour l’enzyme antioxydante superoxyde dismutase de type 2 (SOD2 ou MnSOD), diminue avec l’âge. Ceci serait associé à l’induction de l’expression de MnSOD, renforçant ainsi la défense antioxydante endogène. Le vieillissement étant associé à une accumulation de la production de radicaux libres, nous avons étudié la vasodilatation dépendante de l’endothélium qui est sensible au stress oxydant. Nous avons observé que la capacité vasodilatatrice globale a été maintenue chez les souris âgées, aux dépens d’une diminution des facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF) et d’une contribution accentuée de la voie du monoxyde d’azote (NO). Nous avons ensuite utilisé deux approches visant à réduire les niveaux de stress oxydant in vivo, soit la supplémentation avec un antioxydant, la catéchine, et l’exposition chronique à de l’exercice physique volontaire. Ces interventions ont permis de prévenir à la fois les changements au niveau de la fonction endothéliale et de l’hypométhylation de Sod2. Cette première étude démontre donc la sensibilité de la méthylation de l’ADN à l’environnement rédox. Dans la deuxième étude, nous avons démontré une régulation de l’expression de l’enzyme antioxydante glutathion peroxydase 1 (Gpx1) en lien avec la méthylation de son gène codant, Gpx1, dans un contexte de dyslipidémie sévère. Nos résultats démontrent que dans le muscle squelettique de souris transgéniques sévèrement dyslipidémiques (LDLr-/-; hApoB+/+), Gpx1 est hyperméthylé, ce qui diminue l’expression de Gpx1 et affaiblit la défense antioxydante endogène. Chez ces souris, l’exercice physique chronique a permis d’augmenter l’expression de Gpx1 en lien avec une hypométhylation transitoire de son gène. Cette étude démontre que le stress oxydant associé à la dyslipidémie sévère altère les mécanismes de défense antioxydante, en partie via un mécanisme épigénétique. De plus, on observe également que l’exercice physique permet de renverser ces effets et peut induire des changements épigénétiques, mais de manière transitoire. La troisième étude avait pour but d’étudier la régulation de l’Angptl2, une protéine circulante pro-inflammatoire, dans le contexte des MCV. Nous avons observé que chez des patients coronariens, la concentration circulante d’Angptl2 est significativement plus élevée que chez des sujets sains et ce, en lien avec une hypométhylation de son gène, ANGPTL2, mesurée dans les leucocytes circulants. Nous sommes les premiers à démontrer qu’en réponse à l’environnement pro-inflammatoire associé à une MCV, l’expression de l’Angptl2 est stimulée par un mécanisme épigénétique. Nos études ont permis d’identifier des nouvelles régions régulatrices différentiellement méthylées situées dans les gènes impliqués dans la défense antioxydante, soit Sod2 en lien avec le vieillissement et Gpx1 en lien avec la dyslipidémie et l’exercice. Nous avons également démontré un mécanisme de régulation de l’Angptl2 dépendant de la méthylation d’ANGPTL2 et ce, pour la première fois dans un contexte de MCV. Ces observations illustrent la nature dynamique de la régulation épigénétique par la méthylation de l’ADN en réponse aux stimuli environnementaux. Nos études contribuent ainsi à la compréhension et l’identification de mécanismes moléculaires impliqués dans le développement du phénotype pathologique suite à l’exposition aux facteurs de risque, ce qui ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

Déterminer le rôle de C1orf106, un gène associé aux maladies inflammatoires de l’intestin

Les maladies inflammatoires de l’intestin (MIIs, [MIM 266600]) sont caractérisées par une inflammation chronique au niveau du tube gastro-intestinal. Les deux principales formes sont la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU). Les MIIs résulteraient d’un défaut du système immunitaire et de l’épithélium intestinal. Ce dernier forme une barrière physique et biochimique qui sépare notre système immunitaire des microorganismes commensaux et pathogènes de la microflore intestinale. Un défaut dans la barrière épithéliale intestinale pourrait donc mener à une réponse immunitaire soutenue contre notre microflore intestinale. Les études d’association pangénomiques (GWAS) ont permis d’identifier 201 régions de susceptibilité aux MIIs. Parmi celles-ci, la région 1q32 associée à la MC (p<2x10-11) et à la CU (p<6x10-7) contient 4 gènes, dont C1orf106, un gène codant pour une protéine de fonction inconnue. Le re-séquençage de la région 1q32 a permis d’identifier une variante génétique rare de C1orf106 (MAF˂1%) associée aux MIIs (p=0,009), Y333F. Nous avons démontré que la substitution de la tyr333 par une phénylalanine semble avoir un effet sur la stabilité protéique de C1orf106 tel que démontré lors de l’inhibition de la synthèse protéique induite par le cycloheximide. Nous avons déterminé que C1orf106 est exprimé dans le côlon et l’intestin grêle. De plus, son expression est augmentée lors de la différenciation des cellules épithéliales Caco-2 en épithélium intestinal polarisé. Son profil d’expression correspond aux types cellulaires et tissulaires affectés dans les MIIs. De plus, C1orf106 est partiellement co-localisée avec le marqueur des jonctions serrées, ZO-1. Toutefois, son marquage reproduit parfaitement celui du marqueur des jonctions adhérentes, E-cadhérine. Les jonctions serrées et adhérentes sont localisées du côté apical de la jonction intercellulaire et sont toutes deux impliquées dans l’établissement de la barrière épithéliale. Nous avons donc testé l’impact de C1orf106 sur la perméabilité de l’épithélium intestinal. Nous avons observé une augmentation de la perméabilité épithéliale chez un épithélium intestinal formé par des cellules Caco-2 sous-exprimant C1orf106. Nos résultats suggèrent que C1orf106 pourrait être le gène causal de la région 1q32.

Création de mutants cdc5 en vue de l’identification des substrats de PLK/Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN.

Les kinases de la famille Polo (PLK) jouent un rôle majeur durant le cycle cellulaire, notamment en promouvant des processus essentiels tels que l’entrée en phase M et la sortie du cycle cellulaire. Elles sont également impliquées dans plusieurs cancers et ont un fort pouvoir tumorigène. Notre laboratoire a récemment montré que Cdc5 (la kinase PLK chez Saccharomyces cerevisiae) est également nécessaire pour l'adaptation aux dommages à l'ADN, et que la cible critique de Cdc5 au cours de ce processus pourrait être une cible peu conventionnelle localisée aux centrosomes de levures. Dans le but d’identifier ce substrat, une analyse intégrale du phosphoprotéome de PLK/Cdc5 par spectrométrie de masse devra être réalisée. Pour ce faire, un allèle CDC5 sensible à la température, c’est-à-dire une version mutante qui devient inactive à température élevée, devra être utilisée. Cet allèle devra être thermosensible à 30°C, afin de s’assurer qu’il sera le seul à être inactivé à cette température et que, par conséquent, seuls les substrats de Cdc5 seront identifiés. À cet effet, nous avons généré deux allèles cdc5 thermosensibles à 30°C : cdc5-17 et cdc5-18, puis analysé leur cycle cellulaire à 32°C. Les résultats de cette analyse ont montré que l’exposition des cellules à 32°C résulte en leur blocage en fin de mitose sous la forme bourgeonnée, témoignant d’un défaut dans la promotion de la sortie de la mitose. Ce défaut est causé par la mutation du gène CDC5 dont la protéine favorise la sortie de la mitose via deux voies : la voie du MEN (Mitotic Exit Network) et la voie du FEAR (Cdc Fourteen Early Anaphase Release). cdc5-17 et cdc5-18 représentent des outils biologiques précieux qui permettront de mieux analyser le phosphoprotéome de PLK/Cdc5 et de mener à l’identification des cibles de Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN. Étant donné que l’adaptation aux dommages à l’ADN causés par des chimiothérapies représente l’un des facteurs permettant la prolifération des tumeurs cancéreuses, cette découverte serait un grand pas dans la lutte contre le cancer.

Étude des voies de signalisation activées par la prostaglandine F2α dans les cellules de cancer colorectal

Le cancer colorectal représente la troisième forme de cancer la plus fréquente au Canada. Malgré les récents développements, aucun traitement curatif n’est disponible pour les patients diagnostiqués à un stade avancé de la maladie. Plusieurs évidences supportent un rôle important des prostaglandines dans cette maladie. En effet, une surexpression des récepteurs de type EP et FP est remarquée. Ces derniers ainsi que les molécules de signalisations intracellulaires qu’ils activent représentent donc de nouvelles cibles pour traiter ce cancer. Nous et d’autres groupes avons démontré que les protéines G monomériques sont des petits interrupteurs moléculaires importants dans la signalisation intracellulaire engagée par les récepteurs dans des cellules saines mais qu’un dérèglement de celles-ci est associé au cancer. L’objectif principal de ce projet de recherche vise donc à identifier les voies de signalisations par lesquelles le récepteur FP contribue aux capacités invasives des cellules tumorales d’origine colorectale. Notre hypothèse est que la protéine ARF6, une des 6 isoformes des ARFs, et la protéine RhoA, agissent pour coordonner l’activation des voies de signalisations associées à la migration et l’invasion cellulaire. Nos résultats ont indiqué que la stimulation des cellules HEK293 exprimant de façon stable le récepteur FP (HA-FP) ainsi que les cellules SW480, une lignée invasive de cancer colorectal, par le PGF2α augmentait les niveaux d’activation d’ARF6 mais également de la protéine RhoA. De plus, d’autres médiateurs et intermédiaires associés à la réorganisation du cytosquelette comme la cofiline et la chaine légère de la myosine (MLC) ont été hautement phosphorylés suite à la stimulation par la prostaglandine. Ces observations sont associées avec une augmentation des fibres de stress dans les cellules. Nous avons tenté de déterminer si l’inhibition de ces protéines G affectait la capacité du PGF2α à activer ces intermédiaires de signalisation ainsi que certains effets biologiques. Ainsi, nos expériences contribueront à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du cancer colorectal.

Understanding the role of CAP proteins in the polarization process of C. elegans

La division cellulaire asymétrique est un processus crucial dans le développement des organismes multicellulaires puisqu’elle permet la génération de la diversité cellulaire. Les cellules qui se divisent de façon asymétrique doivent tout d’abord se polariser et correctement orienter leur fuseau mitotique pour ségréger des déterminants cellulaires en deux entités distinctes. L’embryon du nématode C. elegans est un modèle robuste et largement utilisé pour étudier la division cellulaire asymétrique. Dans cet embryon, le point d'entrée du spermatozoïde détermine l'axe de polarité antéro-postérieur. Suite à la fécondation, le cortex embryonnaire est uniformément contractile et un complexe conservé formé des protéines PAR-3, PAR-6 et PKC-3 (nommé complexe PAR-3 ci-dessous) est localisé sur l'ensemble du cortex. La complétion de la méiose maternelle induit une relaxation corticale au postétieur et un flux cortical vers l’antérieur de l’embryon. Ces contractions corticales asymétriques mènent à la formation d'un domaine antérieur contenant le complexe PAR-3, tandis que le cortex postérieur, dont le complexe PAR-3 s’est délocalisé, est enrichi avec les protéines PAR-2 et PAR-1. Par conséquent, les domaines formés par les protéines PAR définissent un pôle antérieur et un pôle postérieur dans l'embryon suite au remodelage du cytosquelette. Les protéines PAR-4 et PAR-5 restent localisées de façon uniforme dans l'embryon. Curieusement, les protéines PAR exercent une régulation par rétroaction sur la contractilité corticale. Il a été montré qu’une des protéines PAR récemment identifiée, PAR-5, est orthologue à la protéine adaptatrice 14-3-3 et joue un rôle important dans la contractilité corticale. En dépit de son rôle central dans la contractilité corticale et le processus de polarisation cellulaire, le mécanisme par lequel PAR-5 régule la contractilité corticale n’est pas bien compris. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment PAR-5 et ses interacteurs contrôlent la régulation des contractions corticales et, de ce fait, la polarité cellulaire. Dans un essai de capture de la protéine GST (GST pull-down), nous avons identifié plusieurs nouveaux interacteurs de PAR-5. Parmi ceux-ci, nous avons trouvé CAP-2 (protéine de coiffage de l'actine), qui a été identifiée dans des éxpériences de capture de 14-3-3 dans trois systèmes modèles différents. CAP-2 est un hétérodimère des protéines CAP, qui sont impliquées dans la régulation de l'actine. Nous avons trouvé que la déplétion des protéines CAP par interférence à l’ARN dans des vers de type sauvage mène à une augmentation létalité embryonnaire, ce qui suggère que ces protéines jouent un rôle important dans le développement embryonnaire. L'imagerie en temps réel d'embryons déplétés pour les protéines CAP montre qu’ils ont une diminution des contractions corticales avec un sillon de pseudoclivage mois stable, suggérant un défaut dans la régulation du cytosquelette d'actine-myosine. Ceci a également été confirmé par la diminution de la vitesse et du nombre de foci de NMY-2::GFP. En outre, ces embryons montrent une légère diminution de la taille du croissant cortical de PAR-2 lors de la phase d’établissement de la polarité. Les embryons déplétés en CAP-2 montrent également un retard dans la progression du cycle cellulaire, mais le lien entre ce phénotype et la régulation des contractions corticales reste à être précisé. La caractérisation des protéines CAP, des régulateurs du remodelage du cytosquelette, permettra d'améliorer notre compréhension des mécanismes qui sous-tendent l'établissement et le maintien de la polarité cellulaire, et donc la division cellulaire asymétrique.

L'hepcidine : un possible lien entre l'inflammation chronique et le métabolisme du fer dans les maladies rénales chroniques félines

Le rôle de l'inflammation dans le développement et la progression des maladies rénales chroniques (MRC) chez le chat a été peu étudié. L'hepcidine est une protéine de la phase aigue (PPA) de l'inflammation qui contribue au développement des anémies lors de MRC chez l'homme. Les objectifs de cette étude sont de comparer les concentrations en PPAs, en erythropoietine (EPO) ainsi que le statut en fer entre un groupe de chats sains et en MRC. 18 chats sains et 38 chats en MRC ont été recrutés de façon prospective. Les examens réalisés incluaient hématologie, biochimie, analyse d'urine, Serum amyloid A (SAA), haptoglobine (HAP), EPO, hepcidine,fer, TIBC et ferritinne. Nous avons observé une augmentation significative des concentrations en SAA et en hepcidine ainsi qu'une diminution significative du fer et du TIBC dans le groupe MRC (P < .05). Une corrélation positive entre la créatinine et certaines PPAs (SAA and hepcidin; P < .05) était présente. L'augmentation de SAA et hepcidine était significativement associé avec une diminution du TIBC et de l'hématocrite dans le groupe MRC. Les 14 (37%) chats anémiques du groupe MRC avaient une concentration significativement plus basse en fer et en TIBC (P < .05), changements compatibles avec une déficience fonctionelle en fer. Aucun chat n'avait un panel de fer compatible avec une carence en fer absolue. En conclusion, les résultats de cette étude suggèrent que les MRC chez le chat sont des conditions pro-inflammatoires, ayant un impact sur le métabolisme du fer.

The human organic cation transporter OCT1 mediates high affinity uptake of the anticancer drug daunorubicin

Les anthracyclines tels que la doxorubicin et la daunorubicin sont une famille de médicaments anticancéreux hydrophiles qui doivent être transportés dans les cellules afin d’exercer leur action par intercalation à l’ADN dans le noyau cellulaire. Ceci mène à la perturbation du métabolisme de l’ADN et entraine la mort cellulaire. Les anthracyclines sont utilisés pour le traitement d’une variété de cancers incluant la leucémie, les lymphomes, le cancer du sein, le cancer des poumons et le cancer des ovaires. Étant donné que le transport actif des anthracyclines dans les cellules a partiellement été démontré, le transporteur spécifique impliqué dans ce processus n’est pas encore connu. En utilisant un modèle de cancer des ovaires, la lignée cellulaire TOV2223G, nous avons démontré que des substrats spécifiques au transporteur de cations organiques 1 (OCT1), notamment la ergothionéine, la thiamine et la phenformin, ont partiellement inhibé l’absorption de la daunorubicin en différence de la carnitine qui est un substrat de haute affinité des transporteurs CT2 et OCTN2. Ces résultats suggèrent que les transporteurs organiques spécifiques au transport de la carnitine ne sont pas impliqués dans le transport des anthracyclines. Ainsi, nos résultats ont démontré que l’absorption de la daunorubicin est orchestrée par le transporteur OCT1 dans les cellules TOV2223G (Km ~ 5 μM) et des concentrations micromolaires de choline ont complètement abolies l’absorption de la drogue. De plus, un ARN sh dirigé contre OCT1 a réprimé son expression protéique, ce qui a été confirmé par la technique d’immuno-buvardage en utilisant un anti-OCT1 anticorps. Les cellules déficientes en OCT1 n’ont pas été capables d’absorber la daunorubicin et ont été plus résistantes à l’action de la drogue par rapport aux cellules contrôle. La transfection des cellules HEK293T avec un plasmide construit de façon à faire exprimer OCT1 comme protéine de fusion avec la protéine fluorescente EYFP a montré que celle-ci est localisée dans la membrane plasmique. Les cellules transfectées ont été capables d’absorber cinq fois plus de daunorubicin comparé aux cellules contrôles. Cette étude est, selon nous, la première à démontrer que OCT1 est un transporteur de haute affinité des anthracyclines. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que des défauts de OCT1 peuvent contribuer à l’efficacité de la réponse des cellules cancéreuses à la chimiothérapie avec les anthracyclines.

Étude du rôle de la membrane basale spécialisée dans la maturation de l'émail

Les cellules épithéliales qui produisent l’émail, les améloblastes, sont séparées de l'émail au niveau de la zone de maturation par une membrane basale spécialisée (MBS) enrichie en laminine 332 (LM-332). Cette protéine hétérotrimérique (composée des chaînes α3, ß3 et γ2) assure l'intégrité structurelle des membranes basales (MB) et influence divers processus cellulaires épithéliaux tels que l'adhésion et la différenciation cellulaire. Des modèles de souris « knockout » (KO), où les gènes codant pour LM-332 ont été supprimés, meurent peu après la naissance. Néanmoins, ce phénotype létal peut être contourné en substituant chez la souris le gène produisant la chaîne γ2 de la laminine (LAMC2) par sa forme humaine, sous le contrôle de l’expression du promoteur-rtTA, de la cytokératine 14, inductible par la prise de doxycycline (Dox) - (Tet-on). Le but de ce projet est d’examiner si l’utilisation de cette protéine humaine chez la souris a un effet sur la structuration de la MBS ainsi que sur la maturation de l'émail. La phase de maturation de l’organe de l’émail chez la souris transgénique a été sévèrement altérée par rapport à une souris normale (WT). La MBS n’est plus visible, une matrice dystrophique s’est formée dans la couche d'émail dans la phase de maturation, et la présence d’une matrice résiduelle de l'émail est observée durant la phase tardive de maturation. Des micro-analyses tomographiques ont révélé une usure excessive des surfaces occlusales des molaires, un écroulement de l'émail sur les pointes des incisives et une hypominéralisation de l'émail. Cependant, aucune altération structurale due à cette recombinaison transgénique n’a été observée dans d'autres sites épithéliaux, tels que la peau, le palais et la langue. Ces résultats indiquent que, bien que ce modèle de souris humanisée soit capable de rétablir ses fonctions dans divers tissus épithéliaux, il est incapable de soutenir la structuration d'une MBS à l'interface entre les améloblastes et l’émail en maturation. Cet échec peut être lié à la composition spécifique de la MBS dans la phase de maturation et supporte l’hypothèse que la MBS est essentielle pour la maturation adéquate de l'émail.

Régulation de la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires par l’activation in vivo du récepteur natriurétique de type C.

Le remodelage vasculaire dû à l’hyper-prolifération cellulaire des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) observé chez les rats spontanément hypertendus (RSH) est associé à l’hypertension artérielle. Nous avons précédemment démontré que le traitement in vivo des RSH par l’agoniste spécifique du récepteur du peptide natriurétique de type C (NPR-C), le C-ANP4-23 atténue l’hyper-prolifération des CMLVs. Nous avons entrepris cette étude afin d’investiguer si l’effet antiprolifératif du C-ANP4-23 agit par l’entremise de l’inhibition de la surexpression des protéines du cycle cellulaire, et afin d’en explorer les mécanismes sous-jacents. Pour cette étude, des RSH et des rats Wistar Kyoto (WKYs) âgés de deux semaines ont été injectés en intra-péritonéale par le C-ANP4-23 de 2 jusqu’à 8 semaines d’âge, deux fois par semaine et sacrifiés à la 9ème semaine. La pression artérielle a été mesurée par méthode Queue-coiffe, la prolifération des CMLVs a été déterminée par incorporation de thymidine et par test MTT, et l’expression des protéines a été quant à elle déterminée par technique d’immunobuvardage de type Western. Les CMLVs des RSH ont démontré une prolifération élevée en comparaison avec celles des WKYs, et le traitement par le C-ANP4-23 a atténué l’hyperprolifération à un niveau de contrôle. De plus, la surexpression des cyclines D1/A/E, des kinases cyclines dépendantes 2 et 4 (cdk2, cdk4), de la forme phosphorylée de la protéine du rétinoblastome et des protéines Gαi des CMLV des RSH a été atténuée à un niveau de contrôle. Par ailleurs, l’hyperphosphorylation d’ERK1/2, AKT, EGF-R, PDGF-R, IGF-R et de c-Src a significativement diminué par le traitement au C-ANP4-23. En outre, le niveau élevé de l’anion superoxyde (O2-), l’activité de la NADP(H) oxydase et de ses sous unités chez les RSH ont été atténués par le C-ANP4-23 .Ces résultats indiquent que l’activation in vivo de NPR-C atténue la surexpression des protéines du cycle cellulaire via l’inhibition de l’activité élevée du stress oxydatif, de c-Src et de l’activation de EGF-R, PDGF- R, IGF-R, de la signalisation de MAPK et la surexpression des protéines Gαi résultant ainsi en l’inhibition de l’hyperprolifération des CMLVs des RSH. Ainsi, il peut être suggéré que le C-ANP4-23 pourrait être utilisé comme agent thérapeutique pour le traitement des complications vasculaires associées à l’hypertension et à l’athérosclérose.

Déterminer le rôle de C1orf106, un gène associé aux maladies inflammatoires de l’intestin

Les maladies inflammatoires de l’intestin (MIIs, [MIM 266600]) sont caractérisées par une inflammation chronique au niveau du tube gastro-intestinal. Les deux principales formes sont la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU). Les MIIs résulteraient d’un défaut du système immunitaire et de l’épithélium intestinal. Ce dernier forme une barrière physique et biochimique qui sépare notre système immunitaire des microorganismes commensaux et pathogènes de la microflore intestinale. Un défaut dans la barrière épithéliale intestinale pourrait donc mener à une réponse immunitaire soutenue contre notre microflore intestinale. Les études d’association pangénomiques (GWAS) ont permis d’identifier 201 régions de susceptibilité aux MIIs. Parmi celles-ci, la région 1q32 associée à la MC (p<2x10-11) et à la CU (p<6x10-7) contient 4 gènes, dont C1orf106, un gène codant pour une protéine de fonction inconnue. Le re-séquençage de la région 1q32 a permis d’identifier une variante génétique rare de C1orf106 (MAF˂1%) associée aux MIIs (p=0,009), Y333F. Nous avons démontré que la substitution de la tyr333 par une phénylalanine semble avoir un effet sur la stabilité protéique de C1orf106 tel que démontré lors de l’inhibition de la synthèse protéique induite par le cycloheximide. Nous avons déterminé que C1orf106 est exprimé dans le côlon et l’intestin grêle. De plus, son expression est augmentée lors de la différenciation des cellules épithéliales Caco-2 en épithélium intestinal polarisé. Son profil d’expression correspond aux types cellulaires et tissulaires affectés dans les MIIs. De plus, C1orf106 est partiellement co-localisée avec le marqueur des jonctions serrées, ZO-1. Toutefois, son marquage reproduit parfaitement celui du marqueur des jonctions adhérentes, E-cadhérine. Les jonctions serrées et adhérentes sont localisées du côté apical de la jonction intercellulaire et sont toutes deux impliquées dans l’établissement de la barrière épithéliale. Nous avons donc testé l’impact de C1orf106 sur la perméabilité de l’épithélium intestinal. Nous avons observé une augmentation de la perméabilité épithéliale chez un épithélium intestinal formé par des cellules Caco-2 sous-exprimant C1orf106. Nos résultats suggèrent que C1orf106 pourrait être le gène causal de la région 1q32.

Création de mutants cdc5 en vue de l’identification des substrats de PLK/Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN

Les kinases de la famille Polo (PLK) jouent un rôle majeur durant le cycle cellulaire, notamment en promouvant des processus essentiels tels que l’entrée en phase M et la sortie du cycle cellulaire. Elles sont également impliquées dans plusieurs cancers et ont un fort pouvoir tumorigène. Notre laboratoire a récemment montré que Cdc5 (la kinase PLK chez Saccharomyces cerevisiae) est également nécessaire pour l'adaptation aux dommages à l'ADN, et que la cible critique de Cdc5 au cours de ce processus pourrait être une cible peu conventionnelle localisée aux centrosomes de levures. Dans le but d’identifier ce substrat, une analyse intégrale du phosphoprotéome de PLK/Cdc5 par spectrométrie de masse devra être réalisée. Pour ce faire, un allèle CDC5 sensible à la température, c’est-à-dire une version mutante qui devient inactive à température élevée, devra être utilisée. Cet allèle devra être thermosensible à 30°C, afin de s’assurer qu’il sera le seul à être inactivé à cette température et que, par conséquent, seuls les substrats de Cdc5 seront identifiés. À cet effet, nous avons généré deux allèles cdc5 thermosensibles à 30°C : cdc5-17 et cdc5-18, puis analysé leur cycle cellulaire à 32°C. Les résultats de cette analyse ont montré que l’exposition des cellules à 32°C résulte en leur blocage en fin de mitose sous la forme bourgeonnée, témoignant d’un défaut dans la promotion de la sortie de la mitose. Ce défaut est causé par la mutation du gène CDC5 dont la protéine favorise la sortie de la mitose via deux voies : la voie du MEN (Mitotic Exit Network) et la voie du FEAR (Cdc Fourteen Early Anaphase Release). cdc5-17 et cdc5-18 représentent des outils biologiques précieux qui permettront de mieux analyser le phosphoprotéome de PLK/Cdc5 et de mener à l’identification des cibles de Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN. Étant donné que l’adaptation aux dommages à l’ADN causés par des chimiothérapies représente l’un des facteurs permettant la prolifération des tumeurs cancéreuses, cette découverte serait un grand pas dans la lutte contre le cancer.

Étude des voies de signalisation activées par la prostaglandine F2α dans les cellules de cancer colorectal

Le cancer colorectal représente la troisième forme de cancer la plus fréquente au Canada. Malgré les récents développements, aucun traitement curatif n’est disponible pour les patients diagnostiqués à un stade avancé de la maladie. Plusieurs évidences supportent un rôle important des prostaglandines dans cette maladie. En effet, une surexpression des récepteurs de type EP et FP est remarquée. Ces derniers ainsi que les molécules de signalisations intracellulaires qu’ils activent représentent donc de nouvelles cibles pour traiter ce cancer. Nous et d’autres groupes avons démontré que les protéines G monomériques sont des petits interrupteurs moléculaires importants dans la signalisation intracellulaire engagée par les récepteurs dans des cellules saines mais qu’un dérèglement de celles-ci est associé au cancer. L’objectif principal de ce projet de recherche vise donc à identifier les voies de signalisations par lesquelles le récepteur FP contribue aux capacités invasives des cellules tumorales d’origine colorectale. Notre hypothèse est que la protéine ARF6, une des 6 isoformes des ARFs, et la protéine RhoA, agissent pour coordonner l’activation des voies de signalisations associées à la migration et l’invasion cellulaire. Nos résultats ont indiqué que la stimulation des cellules HEK293 exprimant de façon stable le récepteur FP (HA-FP) ainsi que les cellules SW480, une lignée invasive de cancer colorectal, par le PGF2α augmentait les niveaux d’activation d’ARF6 mais également de la protéine RhoA. De plus, d’autres médiateurs et intermédiaires associés à la réorganisation du cytosquelette comme la cofiline et la chaine légère de la myosine (MLC) ont été hautement phosphorylés suite à la stimulation par la prostaglandine. Ces observations sont associées avec une augmentation des fibres de stress dans les cellules. Nous avons tenté de déterminer si l’inhibition de ces protéines G affectait la capacité du PGF2α à activer ces intermédiaires de signalisation ainsi que certains effets biologiques. Ainsi, nos expériences contribueront à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du cancer colorectal.