Biologische Charakterisierung von LC-FACS-Proteinen in Dictyostelium discoideum

Die Endozytose und die anschließende Verwertung der aufgenommenen Substanzen ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Dabei wird ein besonderes Augenmerk auf die Proteine gelegt, die an diesen Vorgängen beteiligt sind. In der hier vorliegenden Arbeit wird der Lipid-Status der Zelle und Enzyme des Lipid-Stoffwechsels berücksichtigt. Das Ausschalten einer Long Chain-Fatty Acyl CoA Synthetase 1 (LC-FACS), fcsB, in Dictyostelium discoideum hat eine Veränderung der Menge an neutralen Lipiden zur Folge. In diesen LC-FACS2 „Knock-Out“-Zellen wird ein Zusammenhang zwischen neutralen Lipiden und der Phagozytose von Hefen und Bakterien detektiert. Ein Einfluss auf den endozytotischen Transit kann in diesen Zellen nur induziert werden, wenn man zusätzlich den Triglycerid-Hydrolyse-Inhibitor LSD1 in den Zellen exprimiert. Mit Hilfe der Daten wird ein Modell erstellt, indem die Reduktion der Menge an neutralen Lipiden nicht direkt für diesen Phänotyp verantwortlich ist. Es ist vielmehr das Energie-Niveau der Zellen, das die Phagozytoserate beeinflusst. Möglich macht dies ein Pool aus Fettsäuren im Zytoplasma. Dieser besteht aus unaktivierten Fettsäuren und Acyl-CoAs. Auf ihn greifen Kompartimente wie Lipidtropfen, Mitochondrien und Peroxisomen zu, wenn Fettsäuren verstoffwechselt werden sollen. In LC-FACS2 „Knock-Out“-Zellen, wird das Gleichgewicht im Pool in Richtung der unaktivierten Fettsäuren verschoben. Anhand der Größe dieses Pools kann die Zelle ihren Energiestatus messen. Ein höherer Energie-Status führt dann zu einer Reduktion der Phagozytoserate. Vacuolin B Null Zellen (vacB-) zeigen eine extreme Verzögerung im endozytotischen Transit. Schaltet man in diesen Zellen die LC-FACS1 aus (vacB-/fcsA-), so reduziert man ebenfalls die Menge an Triglyceriden. Dies ist darauf zurückzuführen, dass der Acyl-CoA Anteil des Fettsäure-Pools reduziert ist. Diese Reduktion resultiert hier in einer Beschleunigung des endozytotischen Transits. Die Exozytose von vacB--Zellen und vacB-/ fcsA--Zellen unterscheidet sich nicht. Daher wird die Ursache für diese Beschleunigung in veränderten Fusions- bzw. Fissionseigenschaften der Endosomen vermutet. Somit führt das Ausschalten von LC-FACS-Proteinen in Dictyostelium zu einer veränderten Zusammensetzung des Fettsäure-Pools. Dies hat im Fall der LC-FACS1 Modifikationen der Membran-Dynamik und im Fall der LC-FACS2 Änderungen des Energie-Spiegels zur Folge.

Protein-Expressions-Analysen zur Etablierung prädiktiver Biomarker bei der Behandlung fortgeschrittener Tumoren der Mamma und der Prostata

Aktuelle Entwicklungen auf dem Gebiet der zielgerichteten Therapie zur Behandlung maligner Erkrankungen erfordern neuartige Verfahren zur Diagnostik und Selektion geeigneter Patienten. So ist das Ziel der vorliegenden Arbeit die Identifizierung neuer Zielmoleküle, die die Vorhersage eines Therapieerfolges mit targeted drugs ermöglichen. Besondere Aufmerksamkeit gilt dem humanisierten monoklonalen Antikörper Trastuzumab (Herceptin), der zur Therapie Her-2 überexprimierender, metastasierter Mammakarzinome eingesetzt wird. Jüngste Erkenntnisse lassen eine Anwendung dieses Medikamentes in der Behandlung des Hormon-unabhängigen Prostatakarzinoms möglich erscheinen. Therapie-beeinflussende Faktoren werden in der dem Rezeptor nachgeschalteten Signaltransduktion oder Veränderungen des Rezeptors selbst vermutet. Mittels Immunhistochemie wurden die Expressions- und Aktivierungsniveaus verschiedener Proteine der Her-2-assoziierten Signaltransduktion ermittelt; insgesamt wurden 37 molekulare Marker untersucht. In Formalin fixierte und in Paraffin eingebettete korrespondierende Normal- und Tumorgewebe von 118 Mammakarzinom-Patientinnen sowie 78 Patienten mit Prostatakarzinom wurden in TMAs zusammengefasst. Die in Zusammenarbeit mit erfahrenen Pathologen ermittelten Ergebnisse dienten u.a. als Grundlage für zweidimensionales, unsupervised hierarchisches clustering. Ergebnis dieser Analysen war für beide untersuchten Tumorentitäten die Möglichkeit einer Subklassifizierung der untersuchten Populationen nach molekularen Eigenschaften. Hierbei zeigten sich jeweils neue Möglichkeiten zur Anwendung zielgerichteter Therapien, deren Effektivität Inhalt weiterführender Studien sein könnte. Zusätzlich wurden an insgesamt 43 Frischgeweben die möglichen Folgen des sog. shedding untersucht. Western Blot-basierte Untersuchungen zeigten hierbei die Möglichkeit der Selektion von Patienten aufgrund falsch-positiver Befunde in der derzeit als Standard geltenden Diagnostik. Zusätzlich konnte durch Vergleich mit einer Herceptin-sensitiven Zelllinie ein möglicher Zusammenhang eines Therapieerfolges mit dem Phosphorylierungs-/ Aktivierungszustand des Rezeptors ermittelt werden. Fehlende klinische Daten zum Verlauf der Erkrankung und Therapie der untersuchten Patienten lassen keine Aussagen über die tatsächliche Relevanz der ermittelten Befunde zu. Dennoch verdeutlichen die erhaltenen Resultate eindrucksvoll die Komplexität der molekularen Vorgänge, die zu einem Krebsgeschehen führen und damit Auswirkungen auf die Wirksamkeit von targeted drugs haben können. Entwicklungen auf dem Gebiet der zielgerichteten Therapie erfordern Verbesserungen auf dem Gebiet der Diagnostik, die die sichere Selektion geeigneter Patienten erlauben. Die Zukunft der personalisierten, zielgerichteten Behandlung von Tumorerkrankungen wird verstärkt von molekularen Markerprofilen hnlich den hier vorgestellten Daten beeinflusst werden.

Manipulation der Aktin-Hülle später Endosomen durch ektopisches Protein-Targeting und Etablierung einer in vivo-Hierarchie cytoplasmatischer Targeting-Signalstärken

Der Endocytoseweg in Dictyostelium verläuft über definierte endosomale Reifestadien. Dabei werden die reifenden Endosomen im letzten Stadium durch eine Schicht aus filamentösem Aktin umhüllt. Über die biologische Funktion dieser Aktin-Hülle ist derzeit wenig bekannt. Zum weiteren Erkenntnisgewinn sollten daher unterschiedliche Aktin-interagierende Proteine an die endosomale Aktin-Hülle dirigiert und die sich daraus ergebenden Folgen untersucht werden. Dabei wurde der in Drengk et al., 2003 beschriebene Ansatz aufgegriffen, in dem Proteine durch die Fusion an Vacuolin an die späte endosomale Membran transportiert wurden. Die endosomale Lokalisation von DAip1 bewirkte den vollständigen Verlust der endosomalen Aktin-Hülle, ohne dabei das restliche zelluläre Cytoskelett zu beeinträchtigen. Dabei wird die Depolymerisation vermutlich über die nachgewiesene Interaktion von DAip1 mit dem Aktin-depolymerisierenden Protein Cofilin bewirkt. Einhergehend damit trat eine Aggregation der betroffenen Kompartimente, eine Verzögerung des endocytotischen Transits, sowie eine verstärkte Retention lysosomaler Enzyme auf. Diese Ergebnisse ließen auf eine Funktion der endosomalen Aktin-Hülle als Fusionsinhibitor oder in der Regulation von Recycling-Prozessen an späten Endosomen schließen. Die Verlängerung der endosomalen Verweilzeit des den Arp2/3-Komplex negativ regulierenden Proteins Coronin bewirkte dagegen keine offensichtlichen Veränderungen in den betroffenen Zellen. Diese Beoachtung könnte ein Indiz dafür sein, dass nach der Ausbildung der Aktin-Hülle keine weiteren essentiellen Arp2/3-abhängigen mehr an der endosomalen Membran auftreten. Die endosomale Lokalisation des Aktin-Crosslinkers ABP34 induzierte ebenfalls keine Abweichungen vom Wildtyp-Verhalten. Hierbei besteht allerdings die Möglichkeit, dass die Aktivität des Proteins durch die bereits zuvor beschriebene Calcium-Sensitivität beeintächtigt vorliegt. Eine Verstärkung der endosomalen Hülle konnte trotz der Verwendung unterschiedlicher Ansätze nicht hervorgerufen werden. Offensichtlich wirkt die zusätzliche Expression zentraler Regulatoren der Aktin-Polymerisation in der Zelle cytotoxisch. Die Bindung von VASP an die endosomale Membran bewirkte in den Zellen die Ausbildung voluminöser, cytoplasmatischer „Aktin-Bälle“. Diese riefen in den betroffenen Zellen Defekte in unterschiedlichen Aktin-abhängigen Prozessen, wie der Phago- und Pinocytose, sowie der Cytokinese hervor. Dabei gehen die beobachteten Veränderungen vermutlich auf die nachgewiesene Störung im Gleichgewicht zwischen G- und F-Aktin zurück. Obwohl die Aktin-Bälle an der endosomalen Membran entstehen, weisen sie nach vollendeter Entstehung keine inneren oder äußeren Membranen mehr auf und nehmen nicht mehr aktiv am endocytotischen Geschehen teil. Die nähere Charakterisierung offenbarte große Ähnlichkeit zu den mit unterschiedlichen neurodegenerativen Erkrankungen assoziierten Hirano-Bodies. Über das beobachtbare Lokalisationsverhalten der unterschiedlichen im ersten Teil der Arbeit eingesetzten Vacuolin-Hybridproteine ließ sich die Stärke der Lokalisationsinformationen der fusionierten Aktin-interagierenden Proteine miteinander vergleichen. Dies wurde verwendet, um die einzelnen Proteine gemäß ihres Targeting-Potenzials hierarchisch anzuordnen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden dieser Hierarchie die beiden cytoplasmatischen Targeting-Signale für Peroxisomen (PTS1) und den Zellkern (SV40-NLS) hinzugefügt. Der vorgenommene Vergleich dieser in vivo gewonnen Daten aus Dictyostelium mit unterschiedlichen in vitro-Bindungsstudien mit homologen Proteinen anderer Organismen zeigte eine erstaunlich gute Übereinstimmung. Diese Beobachtung lässt auf vergleichbare Targeting-Affinitäten innerhalb der Eukaryoten schließen und belegt, dass die zelluläre Lokalisation eines Proteins relativ sicher anhand der in ihm vorhandenen Bindungs-Affinitäten vorhergesagt werden kann. Durch die Kombination der in vivo- und in vitro-Daten war es auch ohne Kenntnis des Oligomerisierungsgrades und des Interaktionspartners erstmals möglich, die Bindungsstärke von Vacuolin an der endosomalen Membran auf einen definierten Bereich einzugrenzen.

Das RNA-bindende Protein Orb2 und seine regulatorische Funktion in der Spermatogenese von Drosophila melanogaster

Das Protein Orb2, welches zum Xenopus CPEB homolog ist, erfüllt während der Spermatogenese von Drosophila melanogaster eine wesentliche Funktion. Das teilweise Ausschalten von orb2 führt zu Störungen in der Individualisierung der Spermatiden, Veränderung in der Morphologie und Lokalisation der Spermatidenkerne und damit verbunden zu männlicher Sterilität. Der weit gestreute Phänotyp spricht für eine regulatorische Funktion des Proteins, wie es aufgrund der Homologie zu CPEB zu erwarten ist. Orb2 mutante Weibchen zeigen dagegen keinen Phänotyp. Die Sterilität konnte mit spezifischen Rettungskonstrukten rückgängig gemacht werden, wobei die beiden Proteinformen in ihrer Funktion höchstwahrscheinlich äquivalent sind, da eine größere Menge an kleinem Protein das Fehlen des größeren ausgleichen kann. Beide Proteinformen lokalisieren in fast alle Stadien der Spermatogenese, wobei nur das kleinere auch in reifen Spermien persistiert. Zur Untersuchung der regulatorischen Funktion des Proteins Orb2 wurden zunächst drei mögliche Protein-Interaktionskandidaten analysiert. Obwohl ähnliche mutante Phänotypen in Gap und Cup ausgelöst wurden, lässt sich eine Interaktion bis jetzt mit diesen Kandidaten weder ausschließen noch bestätigen. Daneben zeigte das Protein Tob eine ähnliche Lokalisierung und einen deutlich ähnlicheren mutanten Phänotyp, wie er für Orb2 beschrieben wurde. Besonders auffällig ist die Lokalisation der Tob mRNA an die Spermatidenenden und die Verringerung der Transkriptmenge in der orb2-Mutante. Ob dieser Phänotyp durch den Verlust der regulatorischen Funktion von Orb2 hervorgerufen wird oder durch den späten Zeitpunkt der Transkription bedingt ist, muß in späteren Experimenten geklärt werden. Mit Hilfe eines Co-Immunpräzipitations-Experimentes wurde nach weiteren Proteininteraktionspartnern sowie nach Ziel-mRNAs gesucht, die durch Orb2 reguliert werden könnten. Dabei ergaben die massenspektrometrischen Analysen zwar Proteine, die mit der Translation selbst in Zusammenhang stehen, sowie einige regulatorische RNA-bindende Proteine, wiesen aber auch in Gestalt eines häufig nachgewiesenen Anhangsdrüsenproteins auf deutliche systematische Probleme hin. Auf genetischem Wege war bereits der Nachweis gelungen, dass die Protamine und mst77F, die strukturelle Komponenten der kompaktierten Kern-DNA sind, durch Orb2 in ihrer Translation reprimiert werden. Dieses Ergebnis wurde zum Teil bestätigt durch den Nachweis der Protamin mRNAs in den Eluaten aus dem Co-Immunpräzipitationsexperiment. Damit konnte zum ersten Mal in der Drosophila Spermatogenese das regulatorische Protein zu einer translationskontrollierten mRNA identifiziert werden.

Untersuchungen zum Vorkommen und molekularen Mechanismus der Biofilm-Bildung bei Enterokokken aus verschiedenen klinischen Bereichen

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine größere Anzahl an E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen, erstmals insbesondere von Patientinnen, die an Bakterieller Vaginose litten, untersucht und mit E. faecalis Stämme aus verschiedenen anderen klinischen Bereichen auf das Vorkommen von Virulenzfaktoren verglichen. Weiterhin wurden Korrelationen zwischen bestimmten Faktoren und der Menge an produziertem Biofilm erstellt, um mögliche Zusammenhänge zum Mechanismus der Biofilm-Bildung zu erfassen. Mittels statistischer Analysen konnte hinsichtlich der 150 untersuchten E. faecalis Isolate nachgewiesen werden, dass keine signifikanten Unterschiede der Inzidenzen von Virulenzfaktoren (esp, asa1, gelE, GelE, cylA, β-Hämolyse) zwischen den Stämmen der verschiedenen Herkunftsbereiche bestanden. In Bezug auf das Auftreten von Biofilm-Bildung zeigte sich ein erhöhtes Vorkommen bei Stämmen aus Urin sowie invasiver Herkunft (insgesamt jeweils ca. 70 % mäßige und starke Biofilm-Bildner) im Vergleich zu E. faecalis Isolaten aus Wunden oder Faeces (je ca. 40 %). Statistische Auswertungen bzgl. des Zusammenhangs eines oder einer Kombination von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm wiesen darauf hin, dass Isolate, die das esp Gen besaßen, in erhöhtem Maße zur Biofilm-Bildung befähigt waren. Dies zeigte einen gewissen Einfluss des Zellwandproteins auf die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung bei E. faecalis. Allerdings wurden stets auch Stämme identifiziert, die die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung trotz des Fehlens der jeweils untersuchten genetischen Determinante bzw. der Determinanten aufwiesen, so dass auf das Vorhandensein weiterer, unbekannter Einflussfaktoren auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung bei E. faecalis geschlossen werden konnte. Unter 78 untersuchten E. faecium Isolaten aus verschiedenen klinischen Bereichen konnte lediglich ein Stamm (1,3 %) als mäßiger Biofilm-Bildner charakterisiert werden, so dass die Fähigkeit bei dieser Spezies in der hier untersuchten Region unter diesen Bedingungen kaum nachgewiesen werden konnte. Einen Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Untersuchung zum Vorkommen von Virulenzfaktoren und Biofilm-Bildung bei E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen. Bzgl. des Auftretens von Virulenzfaktoren und Biofilm-Produktion konnte kein Unterschied zwischen Stämmen assoziiert mit Bakterieller Vaginose und Isolaten einer Vergleichsgruppe festgestellt werden. Allerdings zeigte eine Gegenüberstellung mit den untersuchten E. faecalis Stämmen aus anderen klinischen Bereichen, dass die 80 Isolate aus Vaginalabstrichen eine ähnlich hohe Inzidenz bestimmter Virulenzfaktoren wie Stämme aus Faeces, Urin, Wunden oder invasiver Herkunft sowie eine mit den Isolaten aus Urin und invasiver Herkunft vergleichbar hohe Fähigkeit zur Biofilm-Bildung aufwiesen (ca. 75 % mäßige und starke Biofilm-Bildner). Dies deutete auf eine Verbreitung der Biofilm-Bildungsfähigkeit bei E. faecalis Stämmen der Vaginalflora und somit auf eine große Bedeutung der Eigenschaft für Isolate dieser Herkunft hin. Die statistische Auswertung der Korrelationen von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm lieferte ähnliche Ergebnisse wie die Analysen bzgl. der 150 E. faecalis Isolate aus anderen klinischen Bereichen und untermauerte die Annahme, dass zusätzliche Faktoren zu den hier untersuchten Determinanten bei E. faecalis vorhanden sein müssen, die Einfluss auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung nehmen. Deshalb konzentrierte sich ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit auf die Herstellung und Charakterisierung von E. faecalis Biofilm-Spontanmutanten, um bisher noch ungeklärte Mechanismen oder neue Faktoren zu erkennen, die Einfluss auf die Biofilm-Bildung bei E. faecalis nehmen. Die Untersuchung einer Mutante (1.10.16) und ihres Wildtypstamms lieferte erstmals den phänotypischen Nachweis des HMW-Komplexes der drei Bee-Proteine sowie die Identifizierung konservierter Pili-Motive dieser Proteine. Des Weiteren schien die in diesem Cluster ebenfalls codierte Sortase-1 dasjenige Enzym zu sein, das höchstwahrscheinlich die Bindung des Proteins Bee-2 innerhalb dieses HMW-Komplexes katalysiert. Insofern lieferten diese Untersuchungen neue, konkrete Hinweise zur Rolle des bee Genclusters bei der Pili-Biogenese und Biofilm-Bildung von E. faecalis. Darüber hinaus stellen Erkenntnisse aus der Charakterisierung von zwei weiteren hergestellten Biofilm-Spontanmutanten viel versprechende Ausgangspunkte für zukünftige Untersuchungen dar, die ein weitergehendes Verständnis der molekularen Mechanismen der Biofilm-Bildung bei E. faecalis erzielen könnten.

Koordinationschemie auf Oberflächen

Oberflächen, die reversibel auf einen externen Stimulus reagieren, werden als intelligente Oberflächen bezeichnet und sind von großem Interesse für Wissenschaft und Technik. Im diesem Rahmen haben wir ein modulares Synthesekonzept entwickelt, das die spontane Selbstorganisation funktionaler Adsorbatmoleküle auf Au(111) und HOPG ausnutzt. Das Design der Adsorbatmoleküle erlaubt eine modulare Synthese. Scheibchenförmige Moleküle wie Phthalocyanine und Porphyrine, die in der Peripherie Thioetherseitenketten tragen, dienen als Anbindungseinheiten. Das zentrale Metallatom dient als Anknüpfungspunkt für starre Einheiten, die aus Abstandshaltern und Funktionsträgern bestehen. Dieses Konzept erlaubt es sowohl die laterale Separation Funktionseinheiten einzustellen um es den Funktionsträgern zu ermöglichen ohne Behinderung durch Nachbarmoleküle ihre Funktion auszuüben. Für diese Arbeit waren Funktionseinheiten wichtig, deren Funktionen unter anderem Redoxaktivität, Photoschaltbarkeit, Komplexierung katalytisch aktiver Metalle und Immobilisierung onkogener Proteine umfassen. Zum Beleg dieses Konzeptes wurde ein starres Ferrocen-Derivat für die Postmodifizierung eines Zn-Phthalocyanin-SAMs verwendet. Die erhaltenen Filme wurden mittels C1s- und Fe2p-NEXAFS-Spektroskopie ebenso untersucht wie mittels TDS. Strukturell verwandte Komplexe konnten durch RSA charakterisiert werden.

Involvements of the Plant 3'-5' Exonuclease ERL1 in Chloroplast Ribosomal RNA Biogenesis and RNA Silencing Pathways

ERI-1 und ihm homologe Proteine sind 3‘-5‘ Exoribonukleasen mit konservierten Funktionen in der Regulation von RNA Silencing sowie der Prozessierung ribosomaler RNA. Caenorhabditis elegans ERI-1 (Enhanced RNAi 1) enthält eine konservierte ERI-1_3’hExo_like EXOIII-Domäne, die siRNAs in vitro bindet und degradiert, und deren Inaktivierung eine RNAi-Hypersensitivität zur Folge hat. ERI-1 ist phylogenetisch konserviert, und homologe Proteine wurden Reiche-übergreifend in einer Vielzahl von Modellorganismen identifiziert. RNA-Silencing-reprimierende Eigenschaften dieser Proteine wurden in einigen Fällen charakterisiert. Zusätzlich wurde für eine Untergruppe ERI-1-homologer Proteine eine Funktion in der Biogenese der 5.8S ribosomalen RNA aufgezeigt: Katalyse des letzten Prozessierungsschritts während der Reifung des 5.8S rRNA 3‘-Endes. Diese Doppelfunktion ERI-1-homologer Proteine schlägt eine interessante Brücke zwischen evolutionär weit entfernten auf nicht-codierender RNA basierenden Mechanismen. In dieser Arbeit werden Ergebnisse präsentiert, die Charakteristika des pflanzlichen ERI-1-Homologs ERL1 in verschiedenen regulatorischen Zusammenhängen zum Gegenstand haben. ERL1 lokalisiert in Chloroplasten und zeigt keinerlei messbare Aktivität in Bezug auf die Regulierung von RNA Silencing. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass ERL1 eine wichtige Rolle während der Reifung der chloroplastischen 5S rRNA spielt. ERL1-supprimierende bzw. -überexprimierende transgene Pflanzen, zeigen unterschiedliche phänotypische Aberrationen. Diese beinhalten vielfarbige Blätter, reduziertes Wachstum und Fruchtbarkeit, sowie den Verlust Photosynthese-kompetenter Chloroplasten in gebleichten Sektoren. Diese Defekte werden dadurch verursacht, dass die Plastid-Entwicklung in einem frühen Stadium blockiert wird. Dies führt zu defekten Plastiden, die keine kanonischen internen Strukturen, einschließlich Grana, bilden können. Die gestörte Plastid-Entwicklung ist ein Resultat fehlerhafter Prozessierung ribosomaler RNAs und dem daraus folgenden Verlust plastidärer Transkription und Translation. Wenn ERL1 runterreguliert oder überexprimiert ist, akkumulieren 3‘-elongierte 5S rRNA-Moleküle, was Störungen in der Produktion der Ribosomen hervorruft. Die Reifung der 5S rRNA ist leit langem als Prozess bekannt, der viele aufeinander folgende endonukleolytische Spaltungen sowie exonukleolytische Rezessionen beinhaltet. Bis dato war die Gesamtheit der Exonukleasen während dieser Reifung jedoch nur lückenhaft bekannt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ERL1 eine wichtige Rolle in der Plastid-Entwicklung spielt, indem ERL1 den finalen Reifungsschritt des 5S rRNA 3‘-Endes katalysiert.

Die Masse macht's!

Die biochemische Beschreibung funktioneller Proteininteraktionsnetzwerke hat in den letzten Jahren einen starken Wandel erfahren. Mittels hochauflösender biologischer Massenspektrometrie(MS) ist es möglich Netzwerkkomponenten, wie Proteine schnell und zuverlässig zu identifizieren und auf ihre Modifikationen hin zu untersuchen. Innerhalb des Promotionskollegs (PK) Proteomics der Universität Kassel bietet die MS neue Ansatzpunkte für die Beantwortung molekularbiologischer Fragestellungen und liefert Ergänzungen zu den bislang genutzten klassischen Methoden der Biochemie.

Nuclear organisation and epigenetic regulation of gene expression in Dictyostelium discoideum

A series of vectors for the over-expression of tagged proteins in Dictyostelium were designed, constructed and tested. These vectors allow the addition of an N- or C-terminal tag (GFP, RFP, 3xFLAG, 3xHA, 6xMYC and TAP) with an optimized polylinker sequence and no additional amino acid residues at the N or C terminus. Different selectable markers (Blasticidin and gentamicin) are available as well as an extra chromosomal version; these allow copy number and thus expression level to be controlled, as well as allowing for more options with regard to complementation, co- and super-transformation. Finally, the vectors share standardized cloning sites, allowing a gene of interest to be easily transfered between the different versions of the vectors as experimental requirements evolve. The organisation and dynamics of the Dictyostelium nucleus during the cell cycle was investigated. The centromeric histone H3 (CenH3) variant serves to target the kinetochore to the centromeres and thus ensures correct chromosome segregation during mitosis and meiosis. A number of Dictyostelium histone H3-domain containing proteins as GFP-tagged fusions were expressed and it was found that one of them functions as CenH3 in this species. Like CenH3 from some other species, Dictyostelium CenH3 has an extended N-terminal domain with no similarity to any other known proteins. The targeting domain, comprising α-helix 2 and loop 1 of the histone fold is required for targeting CenH3 to centromeres. Compared to the targeting domain of other known and putative CenH3 species, Dictyostelium CenH3 has a shorter loop 1 region. The localisation of a variety of histone modifications and histone modifying enzymes was examined. Using fluorescence in situ hybridisation (FISH) and CenH3 chromatin-immunoprecipitation (ChIP) it was shown that the six telocentric centromeres contain all of the DIRS-1 and most of the DDT-A and skipper transposons. During interphase the centromeres remain attached to the centrosome resulting in a single CenH3 cluster which also contains the putative histone H3K9 methyltransferase SuvA, H3K9me3 and HP1 (heterochromatin protein 1). Except for the centromere cluster and a number of small foci at the nuclear periphery opposite the centromeres, the rest of the nucleus is largely devoid of transposons and heterochromatin associated histone modifications. At least some of the small foci correspond to the distal telomeres, suggesting that the chromosomes are organised in a Rabl-like manner. It was found that in contrast to metazoans, loading of CenH3 onto Dictyostelium centromeres occurs in late G2 phase. Transformation of Dictyostelium with vectors carrying the G418 resistance cassette typically results in the vector integrating into the genome in one or a few tandem arrays of approximately a hundred copies. In contrast, plasmids containing a Blasticidin resistance cassette integrate as single or a few copies. The behaviour of transgenes in the nucleus was examined by FISH, and it was found that low copy transgenes show apparently random distribution within the nucleus, while transgenes with more than approximately 10 copies cluster at or immediately adjacent to the centromeres in interphase cells regardless of the actual integration site along the chromosome. During mitosis the transgenes show centromere-like behaviour, and ChIP experiments show that transgenes contain the heterochromatin marker H3K9me2 and the centromeric histone variant H3v1. This clustering, and centromere-like behaviour was not observed on extrachromosomal transgenes, nor on a line where the transgene had integrated into the extrachromosomal rDNA palindrome. This suggests that it is the repetitive nature of the transgenes that causes the centromere-like behaviour. A Dictyostelium homolog of DET1, a protein largely restricted to multicellular eukaryotes where it has a role in developmental regulation was identified. As in other species Dictyostelium DET1 is nuclear localised. In ChIP experiments DET1 was found to bind the promoters of a number of developmentally regulated loci. In contrast to other species where it is an essential protein, loss of DET1 is not lethal in Dictyostelium, although viability is greatly reduced. Loss of DET1 results in delayed and abnormal development with enlarged aggregation territories. Mutant slugs displayed apparent cell type patterning with a bias towards pre-stalk cell types.

Posttranslationale Chromatin-Modifikationen in Dictyostelium discoideum

Die Erforschung posttranslationaler Veränderungen von Chromatin-Komponenten stellt einen wichtigen Pfeiler der Epigenetik dar. Epigenetische Mechanismen verändern die Aussagekraft der DNA-Sequenz und entscheiden somit beispielsweise über die Aktivierung oder Stilllegung von Genen. Ein häufiges Ziel der Stilllegung sind springende genetische Elemente, die ansonsten zur Destabilisierung des Genoms führen können. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche Stilllegungsmechanismen der Transpo-sons DIRS-1 und Skipper aus Dictyostelium discoideum untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, auf welche Weise die RNA-Interferenz (RNAi) zur Zerstörung des DIRS-1 Transkripts führt und dass die Ursache dafür in der Promotor-Aktivität des Elements selbst liegt. Eine überraschende Erkenntnis konnte auch für das zweite Element gewonnen werden. Experimente legen nahe, dass die in der kodierenden Skipper-Sequenz gefundene Chromo-Domäne zu einer gezielten Integration des Elements in bereits stillgelegte heterochromatische Bereiche führt. Diese zeichnen sich vor allem durch eine spezielle posttranslationale Histon-Modifikation, der Methylierung von Lysin 9 des Histons H3 (H3K9), aus. Während zu der Methylierung von H3K9 bereits Arbeiten erschienen sind, war ein Großteil der anderen in Dictyostelium discoideum kodierten Histon-Modifikationen bislang unbekannt. Mit Hilfe der Massenspektrometrie konnte erstmalig eine umfassende Karte der veränderten Aminosäuren erstellt werden. Dabei konnten neue, bislang für keinen Organismus beschriebene Modifikationsziele identifiziert werden. Weitere lassen durch einen Vergleich mit Modellorganismen wie Hefe und Fruchtfliege Schlüsse auf die Evolution des Histon-Codes zu. Die erstellte Karte kann in Zukunft Forschern als Grundlage dienen, um weitergehende Fragestellungen in Bezug auf die Funktionen der hier vorgestellten Modifikationen zu erforschen. Ein weiteres Ergebnis dieser Arbeit stellt die Charakterisierung posttranslationaler Veränderungen des an H3K9 bindenden Heterochromatin-Proteins 1 (HP1) dar. Neben einer ersten Analyse der in Dictyostelium discoideum vorhandenen Modifikationen der beiden Homologe HcpA und HcpB, wurde auch die Funktion der in der Chromoshadow-Domäne lokalisierten Acetylierung erforscht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass ein Fehlen des veränderten Lysins zu einem deutlichen Phänotyp in der Sporenform und im Wachstum der Zellen führt. Als Ursache dafür konnte eine Veränderung in der Fähigkeit zur Gen-Stilllegung durch das mutierte HP1-Protein nachgewiesen werden. Dies gelang mit Hilfe eines dafür etablierten Reporters auf Basis des Gal4/UAS-Systems aus der Fruchtfliege und beweist erstmalig die Funktion einer Acetylierung der HP1-Proteine.

Lipid Droplets in Dictyostelium discoideum

Lipid Droplets dienen zur Speicherung von Neutrallipiden wie z. B. Triglyceriden und Sterolestern. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Bildung dieser zellulären Fettspeicher in D. discoideum untersucht. Es konnte herausgefunden werden, dass Lipid Droplets entstehen, wenn die Zellen entweder in einer Suspension von Bakterien oder in Gegenwart von Palmitinsäure kultiviert werden. Die Bildung der Lipidtröpfchen wird dabei von einem schnelleren Zellwachstum, einem Anstieg des Triglyceridgehalts, einer Reduktion der Phagozytoserate und einer Abnahme des Zellvolumens begleitet. Wurde die Lipid Droplet-Bildung durch Kultivierung der Zellen mit Palmitinsäure angeregt, entsteht neben Triglyceriden noch eine weitere Verbindung, bei der es sich entweder um Fettsäureethylester oder Wachsester handelt. Eine weitere Eigenschaft von Zellen, die in Gegenwart der Palmitinsäure inkubiert wurden, ist die Fähigkeit exogene Fettsäuren schneller aufzunehmen, als normal kultivierte Zellen. Aus der vorliegenden Arbeit wurde gefolgert, dass dies durch eine zusätzliche Aufnahme der Fettsäuren über die Plasmamembran hervorgerufen wird. In Zellen, die ohne Fettsäuren inkubiert wurden, findet hingegen der Fettsäureimport über die Endosomen statt. Ein Protein, das nicht direkt am Prozess der Fettsäureaufnahme beteiligt ist, aber importierte Fettsäuren mit CoA aktiviert, ist die LC-FACS1. Aus Versuchen mit der Knockout-Mutante ging hervor, dass die aktivierten Fettsäuren, in Zellen, die zuvor mit Palmitinsäure oder Bakterien inkubiert wurden, in Triglyceride eingebaut werden. Der reduzierte Triglyceridgehalt im Knockout rief eine Erhöhung der Phagozytoserate hervor. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Lipidtröpfchen mit einem Saccharosegradienten aufgereinigt. Mit Hilfe der Massenspektrometrie konnten 281 Proteine in der Lipid Droplet-Fraktion identifiziert werden. Ein Teil dieser Proteine könnte durch die Interaktion der Lipidtröpfchen mit anderen Organellen in die Lipid Droplet-Fraktion gelangt sein und ist ebenso wenig Teil des Lipid Droplet-Proteoms wie die zytoplasmatischen Proteine, die eine Verunreinigung darstellen. Vier der zehn Proteine aus der Lipid Droplet-Fraktion, die in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden, konnten nach Kultivierung in palmitinsäurehaltigem Medium tatsächlich auf der Oberfläche der Lipidtröpfchen beobachtet werden. Eines dieser Proteine ist LSD1. Es stellt das einzige PAT-Protein in D. discoideum dar und gehört der Kategorie der CPATs an. Analog zu Perilipin/PLIN1 und Adipophilin/PLIN2 könnte LSD1 eine Schutzfunktion der Lipid Droplets vor zytoplasmatischen Lipasen haben. Neben DdLSD1 konnten auch die Proteine ADH und ALI auf den Lipidtröpfchen lokalisiert werden. Bei beiden handelt es sich um 17beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen - Proteine, die eine Funktion im Lipid- oder Fettsäuremetabolismus besitzen können. Das Protein SMT katalysiert die C24-Methylierung des Sterolgerüsts in D. discoideum und war nach Inkubation der Zellen mit exogenen Fettsäuren ebenfalls auf den Lipid Droplets zu beobachten.

Unveiling the components of the signaling pathway between endosomes and the phagocytic uptake machinery in Dictyostelium discoideum

The soil amoebae Dictyostelium discoideum take up particles from their environment in order to obtain nutrition. The particle transits through the cell within a phagosome that fuses with organelles of different molecular compositions, undergoing a gradual degradation by different sets of hydrolytic enzymes. Griffiths’ concept of “phagosome individuality” predicts signaling from phagosomes into the cytoplasm, which might regulate many aspects of cell physiology. The finding that Dictyostelium cells depleted of the lysozyme AlyA or over-expressing the esterase Gp70 exhibit increased uptake of food particles, led to the postulation of a signaling cascade between endocytic compartments and the cytoskeletal uptake machinery at the plasma membrane. Assuming that Gp70 acts downstream of AlyA, gene-expression profiling of both mutants revealed different and overlapping sets of misregulated genes that might participate in this signaling cascade. Based on these results, we analyzed the effects of the artificial misregulation of six candidate genes by over-expression or negative genetic interference, in order to reconstruct at least part of the signaling pathway. SSB420 and SSL793 were chosen as candidates for the first signaling step, as they were up-regulated in AlyA-null cells and remained unaltered in the Gp70 over-expressing cells. The over-expression of SSB420 enhanced phagocytosis and raised the expression levels of Gp70, supporting its involvement in the signaling pathway between AlyA and Gp70 as a positive regulator of phagocytosis. However, this was not the case of cells over-expressing SSL793, as this mutation had no effects on phagocytosis. For the signaling downstream of Gp70, we studied four commonly misregulated genes in AlyA-depleted and Gp70 over-expressing cells. The expression levels of SLB350, SSB389 and TipD were lower in both mutants and therefore these were assumed as possible candidates for the negative regulation of phagocytosis. Cells depleted of SLB350 exhibited an increased phagocytic activity and no effect on Gp70 expression, proving its participation in the signaling pathway downstream of Gp70. Unlike SLB350, the disruption of the genes coding for SSB389 and TipD had no effects on particle uptake, excluding them from the pathway. The fourth candidate was Yipf1, the only gene that was commonly up-regulated in both mutants. Yet, the artificial over-expression of this protein had no effects on phagocytosis, so this candidate is also not included in the signaling pathway. Furthermore, localizing the products of the candidate genes within the cell helped unveiling several cellular organelles that receive signals from the phagosome and transduce them towards the uptake machinery.

Untersuchungen zur Bedeutung der PKA für die Spermatogenese in Drosophila melanogaster

Für die cAMP-abhängige Proteinkinase (Proteinkinase A, PKA) in Drosophila melanogaster sind zwei regulatorische Untereinheiten (R1 und R2) und drei katalytische Untereinheiten (C1, C2 und C3) beschrieben. Außerdem gibt es eine weitere mögliche katalytische Untereinheit mit einer auffälligen Ähnlichkeit zu C2, dementsprechend C2-like genannt. Für R2, C2 und C2-like konnte bereits gezeigt werden, dass sie im Hodengewebe synthetisiert werden. Die Expression der verbleibenden PKA-Untereinheiten im Hodengewebe wurde in dieser Arbeit mit Hilfe von RT-PCR, Northern-Hybridisierungen, GFP-Reporter- bzw. GFP-Fusionskonstrukten untersucht. So konnte gezeigt werden, dass alle PKA-Untereinheiten im Hoden exprimiert werden. Dabei wird von jeder Untereinheit mindestens eine Isoform in den Keimzellen synthetisiert. R2 und C1 treten außerdem in den die Keimzellen umschließenden Zystenzellen auf, wobei R2 während der gesamten Spermatogenese exprimiert wird, C1 jedoch nur am Ende des Prozesses während des Stadiums der elongierten Spermatiden. In BRET-Analysen sind die beiden Untereinheiten in der Lage, miteinander zu interagieren. Somit könnten sie zusammen eine Funktion in den Zystenzellen vermitteln, die während der Differenzierungsphase stattfindet. Die katalytischen Untereinheiten C2, C2-like und zwei Isoformen von C3 (B und B') werden keimzellspezifisch exprimiert. Die BRET-Analysen lassen darauf schließen, dass C2 und C3 B’ möglicherweise keine funktionellen PKA-Untereinheiten sind. Auch der Versuch, durch Antisense- und RNAi-Konstrukte einen mutanten Phänotyp zu erzeugen, schlug fehl. Das könnte ein Hinweis darauf sein, dass die beiden Untereinheiten C2 und C3 B’ gar keine oder zumindest keine essentielle Funktion während der Spermatogenese haben. Das C2-like as-Konstrukt führte hingegen zu einem starken Phänotyp. Schon eine geringe Reduktion der endogenen c2-like-mRNA führte zu einer starken Beeinträchtigung der männlichen Fertilität. Die elongierten Spermatiden zeigten einen Defekt in der Kernmorphologie und waren nicht in der Lage, Individualisierungskomplexe auszubilden. Dementsprechend fand keine Individualisierung statt und es konnten keine reifen Spermien in die Samenblase entlassen werden. Der mutante Phänotyp weist darauf hin, dass C2-like an mehreren Prozessen während der Keimzelldifferenzierung beteiligt ist. Gao et al. veröffentlichten 2008 Listen mit potentiellen PKA-Substraten für alle bekannten katalytischen Untereinheiten verschiedener Organismen. Zwei Substrat-Kandidaten für C2-like sind die testisspezifischen Serin/Threonin-Kinasen (TSSK) CG9222 und CG14305. Beide Proteine werden exklusiv im Hoden exprimiert. CG9222-GFP lokalisierte in die Individualisierungskomplexe (ICs) elongierter Spermatiden. Das entsprechende RNAi-Konstrukt zeigte allerdings keinen Effekt auf den Zusammenbau der ICs. Dagegen zeigte CG14305-GFP keine subzelluläre Lokalisierung, sondern war cytoplasmatisch über die gesamten Spermatiden verteilt. Das entsprechende RNAi-Konstrukt führte aber dazu, dass keine ICs ausgebildet werden. Beide Proteine spielen dementsprechend eine Rolle während der Individualisierung. Dies ist in Übereinstimmung mit dem Phänotyp der C2-like as-mutanten Männchen. So ist es vorstellbar, dass CG9222 und CG14305 von C2-like phosphoryliert werden müssen, um ihre Funktion während der Individualisierung der Spermatiden erfüllen zu können. Ein direkter Nachweis, dass C2-like die beiden Proteine tatsächlich phosphorylieren kann, steht allerdings noch aus.

Charakterisierung potentiell positiver Regulatoren der Phagozytose in Dictyostelium discoideum und deren Funktion in einem Signalweg zwischen endosomaler Verdauung und Partikelaufnahme

Dictyostelium discoideum ernährt sich in seinem natürlichen Habitat, dem Waldboden, vorwiegend von Bakterien. Diese werden aus der Umgebung über Phagozytose aufgenommen und unter anderem mit Hilfe von Lysozymen verdaut. Eines dieser Lysozyme, AlyA, wurde bereits in vorhergehenden Arbeiten detailliert untersucht. Sein Fehlen resultierte in einer zeitabhängigen Vergrößerung der Fresshöfe in Bakterienrasen. Zusätzlich waren in diesen Knockout-Mutanten auch die Phagozytoserate und die Expression eines zweiten lysosomalen Enzyms (Gp70) erhöht. Die Überexpression dieser Esterase in wildtypischen Zellen bewirkte ebenfalls, dass Partikel aus der Umgebung effektiver aufgenommen werden konnten. Da die AlyA-Mutanten und die Gp70-Überexprimierer ähnliche Phänotypen zeigten, die Proteine aber in unterschiedlichen lysosomalen Vesikeln lokalisieren, müssen weitere Proteine an der Ausbildung der Phänotypen beteiligt sein. Aus diesem Grund wurden die Genexpressionen beider Mutanten verglichen. Über Microarray-Analysen sollten auf diese Weise weitere Proteine identifiziert werden, die eine Weiterleitung des Signals von AlyA über Gp70 bis hin zur Plasmamembran vermitteln. Einigen der potentiellen Kandidaten konnte anhand der Untersuchung von Mutanten bereits eine Weiterleitung des Signals zwischen Gp70 und der erhöhten Phagozytose an der Plasmamembran zugeordnet werden. Um jedoch mehr über die Signalkette oberhalb von Gp70 zu erfahren, wurden im Rahmen dieser Arbeit drei Proteine untersucht. Die Expression von DD3-3, SSD673 und SSD485 war in den AlyA-Mutanten erhöht, in den Gp70-Überexprimierern jedoch unverändert. Durch Herstellung und Untersuchung von überexprimierenden Mutanten wurde die Wirkung jedes Proteins auf die Gp70-Expression, das Phagozytoseverhalten und den Durchmesser der Fresshöfe analysiert. Die Markierung der Kandidaten mit dem Myc-Epitop sollte deren subzelluläre Lokalisation klären. Für DD3-3-überexpimierende Klone konnte in dieser Arbeit allerdings keine Veränderung gegenüber wildtypischen Zellen festgestellt werden. Sie zeigt allerdings, dass Medium von SSD673-überexprimierenden Zellen die Phagozytoserate wildtypischer Zellen leicht erhöht. Eine starke SSD673myc-Expression führte auch zu einer verstärkten Aufnahme von Hefezellen. Die Gp70-Expression in Gesamtzelllysaten der SSD673-Mutanten blieb jedoch unverändert. Wurde in Wildtypzellen hingegen SSD485 im Übermaß exprimiert, so führte dies zu einer verstärkten Partikelaufnahme. Diese entwickelte sich ähnlich den AlyA-Knockout-Mutanten in Abhängigkeit der Zeit und ging mit einer erhöhten Gp70-Expression einher. In dieser Arbeit konnte folglich zwei von drei Proteinen eine positive Wirkung auf die Phagozytose nachgewiesen werden. SSD485-Mutanten erfüllten darüber hinaus die Bedingungen für eine Weiterleitung des AlyA-Signals von SSD485 auf Gp70 bis hin zu einer erhöhten Phagozytose.

Untersuchung zum Phosphorylierungsstatus der katalytischen Untereinheit der PKA mittels proteomischer Techniken

ZUSAMMENFASSUNG: Das Phosphorylierungsmuster eines Proteins ist kein statischer Zustand, sondern vielmehr ein dynamischer Status, den es in der modernen funktionellen (Phospho-) Proteomik und Analytik abzubilden gilt. Klassischerweise erfolgt der Nachweis der Proteinphosphorylierung auf Peptid-Ebene mittels MS/MS Sequenzierung. Diese Standardmethode der shotgun Phosphoproteomanalytik vernachlässigt jedoch wegen den in LC MS/MS Analysen oftmals schwer detektierbaren Phosphopeptiden gerade den variablen und oftmals nur geringen Phosphorylierungsgrad vieler Phosphorylierungsstellen (P-Stellen). Mittels phosphospezifischer Anreicherungsstrategien und MS/MS Sequenzierung konnten an der Modellkinase PKA-Cα nach rekombinanter Expression in E. coli insgesamt acht P-Stellen identifiziert werden. Der Phosphorylierungsgrad wurde in Kooperation mit Dr. J. Seidler über quantitative Signalintensitätsmessungen bestimmt und zeigte eine nahezu vollständige Phosphorylierung von pS10, pS139, pT197 und pS338, während der Phosphorylierungsgrad für pS34, pS53, pS65 und pS259 zwischen <5 und 45 % variierte. Neben der Quantifizierung der P-Stellen wurde auch das Auftreten und die Verteilung definierter Phosphoformen der PKA-Cα untersucht und deren Abhängigkeit von der primären Aminosäureabfolge, dem Auftreten von zusätzlichen Modifikationen sowie den gewählten Expressions- und Reinigungsbedingungen aufgezeigt. Endogene, aus Säugergewebe isolierte PKA-Cα wies nur eine einzige Phosphoform mit den P-Stellen pT197 und pS338 auf. Auch in vitro autophosphorylierte rekombinante PKA-Cα, die zuvor dephosphoryliert worden war, wies eine zweifach modifizierte Phosphoform auf. Im Vergleich zum endogenen Protein ließ sich dieses Protein an S10 und S338 exzessiv phosphorylieren, wohingegen an T197 keine Autophosphorylierung nachzuweisen war. Das Ausbleiben weiterer Phosphorylierungen stellt in Frage, ob die Hyperphosphorylierung in E. coli ausschließlich auf Autophosphorylierungsprozessen beruht, was anhand einer nicht phosphorylierten, katalytisch inaktiven Variante von PKA-Cα (PKA-Cα K72H) vermutet wurde. Im Hinblick auf die funktionellen P-Stellen pT197 und pS338 erfordert diese Entdeckung sowie der unabhängige Nachweis, dass zellfrei exprimierte PKA-Cα nur an S338 phosphoryliert ist, eine Modifizierung des sequenziellen Vorhersagemodells, wonach die Phosphorylierung an T197 eine zwingende Voraussetzung für die nachfolgende Phosphorylierung an S338 ist. Ferner konnte über phosphomimetische Mutagenese die Funktionalität der Phosphorylierung an S53 innerhalb der glycinreichen Schleife der PKA-Cα und somit ein potenzieller Weg zur Regulation der enzymatischen Aktivität gezeigt werden. Ein weiterer möglicher upstream Regulator von PKA-Cα ist die Proteinphosphatase 5, die in der Lage war, die bislang als phosphatasestabil beschriebene P Stelle pT197 in vitro zu dephosphorylieren. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass der Phosphorylierungszustand eines Proteins von zahlreichen internen und externen Faktoren abhängt – eine Tatsache, die gerade für rekombinante Proteine, insbesondere enzymatisch aktive Kinasen, oft vernachlässigt wurde. Daher müssen auch in der shotgun Phosphoproteomanalytik P-Stellen nicht mehr nur identifiziert und quantifiziert werden, sondern die resultierenden Proteinphosphoformen differenziert auch in ihrem physiologischen Kontext beschrieben werden.